一种离体人造血干细胞扩增培养液配方
技术领域
本发明属于生物医学领域;更具体地,本发明涉及一种离体人造血干细胞扩增培养液配方。
背景技术
干细胞(Stem Cells)是一类具有自我更新及多向分化潜能的细胞群体,即这些细胞可以通过细胞分裂维持自身细胞群的大小,同时又可以进一步分化成为各种不同的组织细胞,从而医学界称之为“万能细胞”。这种独一无二的特性使其成为再生医学和移植医学的一个不可缺少的细胞来源。也使它成为众多疾病,如血液疾病、帕金森病,糖尿病,脊髓损伤、癌症和心脏病等细胞治疗的最佳候选者,因此对于干细胞的研究在临床应用领域意义重大。
造血干细胞(Hematopoietic Stem Cell,HSC)是存在于造血组织中的一群原始造血细胞,它不是组织固定细胞,可存在于造血组织及血液中。造血干细胞在人胚胎2周时可出现于卵黄囊,妊娠5个月后,骨髓开始造血,出生后骨髓成为造血干细胞的主要来源。在造血组织中,干细胞所占比例甚少。现代医学中,造血干细胞在骨髓移植和疾病治疗方面有重要作用。
造血干细胞在应用过程中一个瓶颈是不能够有效的体外扩增并且在体外扩增中会失去其干性。可用数量的细胞非常少,根本不能满足临床医治的需求。已知的造血干细胞的扩增方法有使用饲养层细胞的方法,此方法不能使子干细胞维持与母干细胞相同的成熟状态,最佳可以扩增干细胞5倍左右,且引入了外源性的细胞干扰,不利于扩增后用于临床移植,易提高移植物抗宿主反应(GVHD)发生风险。
因此,本领域迫切需要提供针对造血干细胞的有效培养和扩增的试剂和方法。
发明内容
本发明的目的在于提供高效离体人造血干细胞扩增培养液配方。
在本发明的第一方面,提供一种用于造血干细胞扩增培养的细胞因子组合物,所述的组合物是细胞因子组合物2,包括:
在一个优选例中,所述的细胞因子组合物2包括:
在另一优选例中,所述的细胞因子组合物2包括:
在本发明的另一方面,提供所述的细胞因子组合物2的用途,用于制备造血干细胞扩增培养的培养基。
在本发明的另一方面,提供一种用于造血干细胞扩增培养的培养基,所述的培养基是培养基2,包括:IMDM培养基;和前面任一所述的细胞因子组合物2。
在一个优选例中,该培养基还包括胎牛血清。
在另一优选例中,所述的胎牛血清是按照体积8-12%,较佳地10%的用量。
在本发明的另一方面,提供所述的培养基2的用途,用于扩增培养(为离体培养)造血干细胞。
在一个优选例中,所述的造血干细胞是人脐带血造血干细胞。
在本发明的另一方面,提供一种用于造血干细胞扩增培养的试剂盒,所述的试剂盒中包括:前面任一所述的细胞因子组合物2。
在一个优选例中,所述试剂盒中还包括:细胞因子组合物1,该细胞因子组合物1包括:
在另一优选例中,所述的细胞因子组合物1包括:
在另一优选例中,所述的试剂盒中还包括:IMDM培养基;所述的细胞因子组合物2和/或细胞因子组合物1与IMDM培养基分开于不同的容器中放置,或被配制于IMDM培养基中。
在本发明的另一方面,提供一种扩增培养造血干细胞的方法,所述方法包括:
(1)应用培养基1培养CD34+的造血干细胞,培养期间更换1-2次新鲜的培养基1(较佳地在起始后第3±0.5天,更换1次新鲜的培养基1);
(2)培养起始后第6±1天(较佳地6±0.5天),将培养基更换为所述的培养基2,培养期间更换1-2次新鲜的培养基2(较佳地在起始后第9±1天(较佳地9±0.5天),更换1次新鲜的培养基2);
其中,所述的培养基1包括IMDM培养基和细胞因子组合物1,该细胞因子组合物1包括:
在一个优选例中,在培养起始后第12±1天,终止培养,收获造血干细胞。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、干细胞分离纯化后不同培养时间总有核细胞扩增效果图。
图2、干细胞分离纯化后不同培养时间CD34+细胞扩增效果图。
图3、使用细胞因子组合扩增造血干细胞显微镜图。
具体实施方式
针对现有技术中难以实现造血干细胞高效扩增的技术问题,本发明人经过深入的研究,开发了一种离体扩增造血干细胞的培养基和培养方法,通过所述培养基和培养方法可使造血干细胞在保持原来干性特征的基础上进行有效和大量的扩增,大大提高造血干细胞的体外扩增效率。
如本文所用,术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成(制成)”“基本上由……构成”、和“由……构成”。
细胞因子组合物及培养基
本发明人优化了用于离体扩增造血干细胞的细胞因子。根据造血干细胞扩增的不同阶段,提供了不同的细胞因子组合物,包括细胞因子组合物1和细胞因子组合物2。
所述的细胞因子组合物1包括:干细胞因子(SCF)、flt3-配体(FLT-3L)、血小板因子(TPO)、中性粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白介素3(IL3)、白介素6(IL6)和Sall样蛋白4B(Sall4B)。上述各细胞因子以适合的比例添加到细胞生长培养基中,可为造血干细胞提供适合的离体生长环境的培养基,促进造血干细胞的生长和扩增。作为本发明的优选方式,用于配制本发明的培养基的各组分的用量如表1所示。
表1
|
含量 |
优选量 |
更优选量 |
最优选量 |
Sall样蛋白4B |
1-10ng/ml |
1.5-8ng/ml |
2-6ng/ml |
3ng/ml |
干细胞因子 |
50-500ng/ml |
60-300ng/ml |
80-150ng/ml |
100ng/ml |
flt3-配体 |
50-500ng/ml |
60-300ng/ml |
80-150ng/ml |
100ng/ml |
血小板因子 |
5-100ng/ml |
6-70ng/ml |
8-30ng/ml |
20ng/ml |
中性粒细胞集落刺激因子 |
5-100ng/ml |
6-70ng/ml |
8-30ng/ml |
12.5ng/ml |
白介素3 |
10-250ng/ml |
15-150ng/ml |
20-50ng/ml |
25ng/ml |
白介素6 |
5-100ng/ml |
6-70ng/ml |
8-30ng/ml |
12.5ng/ml |
表1配方的细胞因子被溶于细胞培养基中,得到培养基1,从而为造血干细胞提供适宜的生长和扩增环境。所述的细胞培养基可以选择IMDM培养基或类似的细胞培养基。
所述的细胞因子组合物2包括:Sall样蛋白4B、干细胞因子、flt3-配体、血小板因子。上述各细胞因子以适合的比例添加到细胞生长培养液中,可为造血干细胞培养基配方2。作为本发明的优选方式,用于配制本发明的培养基的各组分的用量如表2所示。
表2
|
含量 |
优选量 |
更优选量 |
最优选量 |
Sall样蛋白4B |
1-10ng/ml |
1.5-8ng/ml |
2-6ng/ml |
3ng/ml |
干细胞因子 |
50-500ng/ml |
60-300ng/ml |
80-150ng/ml |
100ng/ml |
flt3-配体 |
50-500ng/ml |
60-300ng/ml |
80-150ng/ml |
100ng/ml |
血小板因子 |
3-50ng/ml |
5-30ng/ml |
6-20ng/ml |
10ng/ml |
表2配方的细胞因子被溶于细胞培养基中,得到培养基2,从而为造血干细胞提供了优选的简化的培养基配方。
经本发明人优化后的上述培养基配方1和2,含有足够且合理的促进细胞生长和扩增的成份,有利于造血干细胞的培养。
用于配制培养基的Sall4B、SCF、TPO、Flt-3L、G-CSF、IL3和IL6均是本领域技术人员易于获得的,例如可通过商业途径购买,或可通过人工合成或重组表达获得。
培养方法
本发明还提供了一种扩增培养造血干细胞的方法,所述方法包括:应用所述的细胞因子组合物添加到细胞生长培养基中,培养造血干细胞。较佳地,所述方法包括:(1)应用培养基1培养CD34+的造血干细胞,培养期间更换1-2次新鲜的培养基1;较佳地在起始后第3±0.5天,更换1次新鲜的培养基1;(2)培养起始后第6±1天,将培养基更换为培养基2,培养期间更换1-2次新鲜的培养基2,较佳地在起始后第9±1天,较佳地9±0.5天,更换1次新鲜的培养基2。
本发明将造血干细胞通过优化的干细胞生长培养基(培养基1和培养基2)于体外安全高效扩增,不仅可以大量获得可供干细胞研究实验室的科研需要,更重要的是可以满足干细胞临床移植和战备储存的需要。
本领域临床实验中,已经存在一些方案来扩增造血干细胞,但在干细胞的分裂过程当中,一个子细胞保留与母干细胞相同成熟状态,但另一个则出现了分化的情况,已经存在的方案就是会使干细胞扩增仅仅一代或两代,在此之后保持原来干性的细胞数量大大下降。本发明使用含有Sall4B、SCF、TPO、Flt-3L、G-CSF、IL3和IL6的体外扩增造血干细胞的配方来高效扩增造血干细胞的技术,与传统的造血干细胞扩增方法相比,具有如下几个主要特点和优势:第一,不引入外源性基因表达,因此不改变原干细胞的基因组稳定性,无致瘤风险;第二,不涉及饲养层细胞等外源性细胞混杂而导致的干细胞移植安全问题;第三,本发明可使干细胞体外培养9天内将CD34+干祖细胞数量增加接近70倍,总有核细胞总数在培养9天时增加至少160倍,培养16天时总有核细胞可增加数百倍或更多。
目前使用已经发明的离体干细胞的培养基扩增干细胞其扩增效率目前报道的为5倍左右,需要引入外源性基因表达而进行的干细胞扩增最佳可以达到160倍至200倍的扩增效果,并且对于造血干细胞的干性和基因稳定性造成了干扰。而本发明因使用了特定配方的培养物扩增造血干细胞使扩增效率大大提高,与传统培养配方相比具有显著的更高的扩增效率,而且能够很好的保持干细胞自我更新和多能分化等基本特征。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著,分子克隆实验指南,第三版,科学出版社,2002中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、配方A联合配方A1培养人造血干细胞
按照配制200ml扩增培养基的量,在超净台下按以下顺序并转移下列成分:Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM)(分别为含10%(v/v)胎牛血清及不含胎牛血清)200ml。从所述的培养基中取出100ml加入细胞因子,使细胞因子终浓度为IL325ng/ml,IL612.5ng/ml、TPO20ng/ml和G-CSF为12.5ng/ml,SCF为100ng/ml,FLT-3L为100ng/ml,Sall4B3ng/ml作为生长培养基(含10%胎牛血清------配方A;不含胎牛血清------配方B);剩余的不含细胞因子的作为基础培养基(含10%胎牛血清------配方C;不含胎牛血清------配方D)。
取新鲜脐带血,使用美天旎公司MACS磁珠分选系统分离CD34+细胞,获得细胞数量为0.36×106个细胞,流式鉴定CD34+细胞群体纯度为93.3%。计算培养基的体积使得在培养基中的细胞浓度为5×103个细胞/ml,取其中一半的细胞加入培养基配方A36ml,并平均分装到康宁公司低吸附六孔培养板6个孔中培养,每孔6ml培养基A(或B)含细胞3×104个,并将此培养板标记为I号板;剩余一半的细胞分别加入培养基配方C和配方D并进行同样的操作,标记为П号板。用显微镜观察然后将管置于培养箱中(37℃,5%CO2)。
第3天,从培养箱中取出培养板,对I号板每孔更换A或B,1200rpm离心5分钟,收集细胞沉淀并重悬于6ml新鲜培养基。对П号板每孔更换C或者D,1200rpm离心5分钟,收集细胞沉淀并重悬于6ml新鲜培养基。再次将培养板置于培养箱中培养。
再次按照配制200ml扩增培养基的量,在超净台下按以下顺序并转移下列成分:培养基Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium200ml,从所述的培养基中取出100ml加入细胞因子,使细胞因子终浓度为SCF100ng/ml,FLT-3L100ng/ml,TPO10ng/ml,Sall4B3ng/ml作为生长培养基(含胎牛血清------配方A1;不含胎牛血清------配方B1);剩余的不含细胞因子的作为基础培养基(含胎牛血清------配方C;不含胎牛血清------配方D)。
第6天,对I号板每孔以上述方式更换A1或B1培养基。对П号板每孔更换C或者D培养基。再次将培养板置于培养箱中。
第9天进行与第6天同样的操作。
第12天扩增完成。在超净台内,无菌条件下离体制备含有2%(w/v)人白蛋白生理溶液,作为洗涤缓冲液。从培养箱中收集所有含有扩增细胞的孔对每孔进行目视和显微镜观察。观察之后,分别将每孔的内容物抽吸均匀后转移至15ml离心管中,室温下1200rpm离心5分钟。加入5ml洗涤缓冲液重悬细胞沉淀,再次在室温下1200rpm离心5分钟。重悬所得细胞沉淀并加至5ml洗涤缓冲液以形成最终管,根据每块培养板的1-6孔进行标号。从所述的最终管中取出细胞悬液用流式细胞仪进行有核细胞总量的计数。
使用流式细胞仪对总细胞群体进行综合分析,如图1-2,I号培养板配方A:总有核细胞平均扩增倍数为354.1154,其中CD34+细胞平均扩增倍数为75.65921倍;I号培养板配方B:总有核细胞平均扩增倍数为85.84615,其中CD34+细胞平均扩增倍数为12.09833倍。П号培养板配方C:总有核细胞平均扩增倍数为12.11538,其中CD34+细胞平均扩增倍数为2.988812倍;П号培养板配方D:总有核细胞平均扩增倍数为6.576923,其中CD34+细胞平均扩增倍数为5.153649倍。图3分别是配方A,B,C,D在第6天显微镜观察到的造血干细胞形态。
因此可见,配方A联合配方A1的应用,可有效扩增人造血干细胞。不加胎牛血清的配方B及配方B1联合应用,扩增效果也较为理想。
实施例2、其它配方培养人造血干细胞
基于所述的细胞因子,发明人还配制了其它一些配方,以IMDM10%(v/v)胎牛血清)作为细胞培养基,其中分别加入如表3-表4所示配方的细胞因子。获得配方E/E1;配方F/F1;配方G/G1;配方H/H1。
表3、培养基1(单位:ng/ml)
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配方E |
配方F |
配方G |
配方H |
Sall4B |
6 |
3 |
3 |
3 |
SCF |
200 |
150 |
150 |
100 |
FLT-3L |
200 |
200 |
150 |
150 |
TPO |
100 |
50 |
50 |
25 |
G-CSF |
100 |
50 |
25 |
12.5 |
IL3 |
150 |
100 |
50 |
25 |
IL6 |
100 |
50 |
50 |
25 |
表4、培养基2(单位:ng/ml)
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配方E1 |
配方F1 |
配方G1 |
配方H1 |
Sall4B |
6 |
3 |
3 |
3 |
SCF |
200 |
200 |
150 |
150 |
FLT-3L |
300 |
200 |
150 |
100 |
TPO |
50 |
25 |
25 |
12.5 |
采用如实施例1相同的培养条件,分别应用配方E/E1,配方F/F1,配方G/G1,配方H/H1作为培养基,培养人造血干细胞。
结果,CD34+细胞平均扩增倍数高位数为65倍,低位数为32倍;因此,扩增效果较为理想。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。