CN104861084B - 香椿子多糖提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明适用于天然产物提取工艺技术领域，提供了一种香椿子多糖提取方法，包括以下步骤：A：将香椿子脱脂处理，除去脂溶性成分；B：将脱脂后的香椿子加水回流提取，并进行抽滤减压处理获得浓缩液；C：将所述浓缩液进行脱蛋白处理，获得脱蛋白溶液；D：向所述脱蛋白溶液中加入乙醇，并控制乙醇的含量为70％～90％；E：将所述乙醇和脱蛋白溶液组成的混合溶液在1℃～5℃的环境下静置预定时间；F：将静置处理的上述混合溶液抽滤处理，再用无水乙醇进行洗涤后进行干燥处理，获得香椿子多糖。本发明的方法可以高效的提取香椿子中的多糖，多糖具有免疫调节、抗炎、抗氧化等功效，且毒性相对较低。

Description

香椿子多糖提取方法

技术领域

本发明涉及天然产物提取工艺技术领域，尤其涉及一种香椿子多糖提取方法。

背景技术

香椿子为楝科香椿属香椿的果实。香椿，始收载于《唐本草》^[1]，在我国广泛分布，是著名药食同源植物，其根皮、树皮、芽、叶、果实均可作为药用。香椿子是我国传统中药材,具有祛风、散寒、止痛之功效,主治风寒外感、心胃气痛、风湿性关节疼痛、病气、胸痛、痔漏、慢性胃炎、治疗头痛、偏头痛等症^[1-2]。

目前，研究发现香椿子中含有酚类、鞣质、生物碱、皂苷、甾体、萜类、挥发油及油脂等活性成分^[3-6]。多糖具有免疫调节、抗氧化、降血糖血脂、抗炎、镇痛、抗辐射等特殊功效^[7]，毒性相对较低，故越来越受到研究人员重视^[8,9]。目前对于香椿子多糖的研究尚少，对其药理作用及在保健品、食品、农业等领域的应用也处于探索阶段。本研究采用在体实验，研究香椿子多糖免疫调节、抗炎以及镇痛等作用。基于此，对香椿子多糖生物活性的研究具有重要现实意义。

多糖是由至少10个以上的单糖由糖苷键结合组成的聚合糖高分子碳水化合物，可用通式(C₆H₁₀O₅)_n表示。其不仅是生物体的重要组成部分，在向生命体提供能量和参与组织构成的同时，还具有许多重要的生理功效，如抗肿瘤、调节机体免疫力、降血糖血脂、抗氧化^[10]、抗炎、镇痛、抗辐射等。

香椿子多糖具有广泛的生物学活性，对其进行产品的深入研发，具有广阔的市场前景。

综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。

[参考文献]

[1]邢莎莎，陈超.香椿化学成分及研究进展[J].安徽农业科学，2010，38(17)：8978-8979.

[2]贺正阳，林丽.香椿子化学成分与药理作用研究进展[J].甘肃中医学院学报，2013，30(4)：64-66.

[3]陈铁山，罗忠萍.香椿化学成分的初步研究[J].陕西林业科技，2000(2)：1-2,20.

[4]王茂丽，涂炳坤，何丹.香椿的化学成分研究进展[J].湖北林业科技，2006(140)：38-40.

[5]陈玉丽，阮志鹏，林立珊，等.香椿的化学成分及药理作用研究进展[J].长治医学院学报，2008，22(4)：315-317.

[6]邢莎莎，陈超.香椿化学成分及研究进展[J].安徽农业科学，2010，38(17)：8978-8979.

[7]贺新怀，习孝贤.中医药免疫学[M].北京：人民军医出版社，2002:266.

[8]黄芳，蒙义文.活性多糖的研究进展[J].天然产物研究与开发，1999，11(5)：90-98.

[9]王健，龚兴国.多糖的抗肿瘤研究及免疫调节作用研究进展[J].中国生化药物杂志，2001,22(1)：52-54.

[10]王茂丽，涂炳坤，何丹.香醇的化学成分研究进展[J].湖北林业科技，2006，(140)：38-40.

发明内容

针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种香椿子多糖提取方法，其方法可以高效的提取香椿子中的多糖，多糖具有免疫调节、抗氧化、降血糖血脂、抗炎、镇痛、抗辐射等功效，且毒性相对较低。

为了实现上述目的，本发明提供一种香椿子多糖提取方法。

本发明提供一种香椿子多糖提取方法，包括以下步骤：步骤A：将香椿子脱脂处理，除去脂溶性成分；步骤B：将脱脂后的香椿子加水回流提取，并进行抽滤减压处理获得浓缩液；步骤C：将所述浓缩液进行脱蛋白处理，获得脱蛋白溶液；步骤D：向所述脱蛋白溶液中加入乙醇，并控制乙醇的含量为70％～90％；步骤E：将所述乙醇和脱蛋白溶液组成的混合溶液在1℃～5℃的环境下静置预定时间；步骤F：将静置处理的上述混合溶液抽滤处理，再用无水乙醇进行洗涤后进行干燥处理，获得香椿子多糖。

根据本发明的香椿子多糖提取方法，所述步骤A之前还包括：将所述香椿子粉碎处理。

根据本发明的香椿子多糖提取方法，所述步骤A中，所述香椿子通过95％乙醇或石油醚脱脂处理。

根据本发明的香椿子多糖提取方法，所述步骤D中，控制乙醇的含量为85％。

根据本发明的香椿子多糖提取方法，所述步骤E具体为：将所述混合液在4℃的环境下静置12h。

根据本发明的香椿子多糖提取方法，所述步骤F中，将所述混合溶液抽滤处理后用无水乙醇洗涤至少三次。

根据本发明的香椿子多糖提取方法，所述步骤B中，加水回流提取的料液比为1：12g/ml。

根据本发明的香椿子多糖提取方法，所述步骤B中，提取时间为120min。

根据本发明的香椿子多糖提取方法，所述步骤B中，提取次数为3次。

本发明提供的一种香椿子多糖提取方法，包括以下步骤：步骤A：将香椿子脱脂处理，除去脂溶性成分；步骤B：将脱脂后的香椿子加水回流提取，并进行抽滤减压处理获得浓缩液；步骤C：将所述浓缩液进行脱蛋白处理，获得脱蛋白溶液；步骤D：向所述脱蛋白溶液中加入乙醇，并控制乙醇的含量为70％～90％；步骤E：将所述乙醇和脱蛋白溶液组成的混合溶液在1℃～5℃的环境下静置预定时间；步骤F：将静置处理的上述混合溶液抽滤处理，再用无水乙醇进行洗涤后进行干燥处理，获得香椿子多糖。通过所述方法可以高效的提取香椿子中的多糖，其中的香椿子多糖具有免疫调节、抗氧化、降血糖血脂、抗炎、镇痛、抗辐射等功效，且毒性相对较低。

附图说明

图1为Vc总还原力测定图；

图2为香椿子多糖总还原力测定；

图3为Vc对DPPH清除作用图；

图4为香椿子多糖对DPPH清除作用图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

香椿子多糖提取方法的实施例(实施例1～实施例3)：

实施例1：

步骤A：将预选的香椿子进行脱脂处理，以除去脂溶性成分。具体地，可将上述香椿子通过95％乙醇或石油醚进行脱脂处理。

优选的是，在步骤A对香椿子脱脂处理前，可以对香椿子进行粉碎处理，以使香椿子具有更高的脱脂率。

步骤B：将脱脂后的香椿子加水回流提取，并进行抽滤减压处理获得浓缩液。在该步骤中，加水回流提取的料液比为1：13g/ml、提取时间为119min、提取次数为3次。

步骤C：将所述浓缩液进行脱蛋白处理，获得脱蛋白溶液。本发明优选采用sevage法脱蛋白。

步骤D：向所述脱蛋白溶液中加入乙醇，并控制乙醇的含量为70％；

步骤E：将所述乙醇和脱蛋白溶液组成的混合溶液在3℃的环境下静置8h；

步骤F：将静置处理的上述混合溶液抽滤处理，再用无水乙醇进行洗涤后进行干燥处理，获得香椿子多糖，称重得质量为18.64mg。

实施例2：

步骤A：将预选的香椿子进行脱脂处理，以除去脂溶性成分。具体地，可将上述香椿子通过95％乙醇或石油醚进行脱脂处理。

优选的是，在步骤A对香椿子脱脂处理前，可以对香椿子进行粉碎处理，以使香椿子具有更高的脱脂率。

步骤B：将脱脂后的香椿子加水回流提取，并进行抽滤减压处理获得浓缩液。在该步骤中，加水回流提取的料液比为1：12g/ml、提取时间为120min、提取次数为3次。

步骤C：将所述浓缩液进行脱蛋白处理，获得脱蛋白溶液。本发明优选采用sevage法脱蛋白。

步骤D：向所述脱蛋白溶液中加入乙醇，并控制乙醇的含量为85％；

步骤E：将所述乙醇和脱蛋白溶液组成的混合溶液在4℃的环境下静置12小时；

步骤F：将静置处理的上述混合溶液抽滤处理，再用无水乙醇进行洗涤后进行干燥处理，获得香椿子多糖，称重得质量为19.02mg。

实施例3：

步骤A：将预选的香椿子进行脱脂处理，以除去脂溶性成分。具体地，可将上述香椿子通过95％乙醇或石油醚进行脱脂处理。

优选的是，在步骤A对香椿子脱脂处理前，可以对香椿子进行粉碎处理，以使香椿子具有更高的脱脂率。

步骤B：将脱脂后的香椿子加水回流提取，并进行抽滤减压处理获得浓缩液。在该步骤中，加水回流提取的料液比为1：11g/ml、提取时间为122min、提取次数为3次。

步骤C：将所述浓缩液进行脱蛋白处理，获得脱蛋白溶液。本发明优选采用sevage法脱蛋白。

步骤D：向所述脱蛋白溶液中加入乙醇，并控制乙醇的含量为90％；

步骤E：将所述乙醇和脱蛋白溶液组成的混合溶液在2℃的环境下静置10h；

步骤F：将静置处理的上述混合溶液抽滤处理，再用无水乙醇进行洗涤后进行干燥处理，获得香椿子多糖，称重得质量为17.95mg。

正交实验设计及结果

以香椿子粗多糖含量指标，选择提取次数、提取时间、料液比三因素三水平进行正交试验，运用正交表L₉(3⁴)，优选提取香椿子多糖工艺条件，因素与水平数见表1，正交试验及结果见表2。

表1 水提工艺因素水平表

表2 L₉(3⁴)正交试验结果

表3 方差分析

注：F_0.05(2,2)＝19.0

由表2可知，以多糖含量为指标，各因素作用主次顺序为A＞B＞C，其中因素A有显著性意义(p＜0.05)，因素B、C影响无显著性意义(p＞0.05)，所以优化的香椿子多糖提取方案为A₃B₃C₃，即提取3次，提取120分min，料液比为1：12。

验证试验：根据正交试验所得出的优化条件，取同一批香椿子3份(各15克)，按A₃B₃C₃进行提取。香椿子多糖平均含量为18.54mg(上述3份香椿子提取出的香椿子多糖质量分别为18.64mg，19.02mg，17.95mg)，RSD为2.92％(n＝3)，说明提取工艺稳定，确定较优方案为A₃B₃C₃。

香椿子多糖应用于生物免疫功能的实施例：

实施例4～实施例6：

其中，在本次试验中，低剂量组为实施例4，中剂量组为实施例5，高剂量组为实施例6。

1、取雄性昆明种小鼠，体重(20±2)g。采用自由采食与饮水方式(室温控制在18～22℃，湿度45％～55％，每周换垫料3次，适应性饲喂。随机分为5组，每组12只，即正常对照组(生理盐水，0.2mL/d)、模型组(环磷酰胺，CTX，80mg/kg bw，ip，1/d，连续3d)、模型小鼠粗多糖低剂量组(100mg/kg bw)、模型小鼠粗多糖中剂量组(200mg/kg bw)、模型小鼠粗多糖高剂量组(400mg/kg bw)，香椿子多糖灌胃10d，每次按0.2ml/10g。

2、指标检测

(1)免疫器官指数的检测

末次给药后禁食不禁水12h，称重后，水合氯醛麻醉，心脏取血于无抗凝剂离心管中，静置凝固，3000r/min离心，15min分出血清；取出脾脏和胸腺，滤纸吸干表面血迹，称脾脏和胸腺质量，分别计算脾脏指数＝脾脏重量(mg)/体重(g)；胸腺指数＝胸腺重量(mg)/体重(g)。

与模型组比较*表示p<0.05，**表示p<0.01

(2)吞噬指数的检测

尾静脉给小鼠注射用生理盐水稀释5倍印度墨汁(或20％印度墨汁，)，0.1mL/10g体重，注入后立即计时，于第2min、10min，分别从内眦静脉丛取血20μL，加到2mL 0.1％Na₂CO₃溶液中摇匀。以Na₂CO₃溶液作空白，以酶标仪630nm测光密度A值。计算吞噬指数α。α＝(K^1/3×体质量)/(肝质量+脾质量)，式中：K＝(LogA₁－logA₂)/(t₂－t₁)，其中A₁、A₂代表采血样测得吸光度，t₂、t₁分别代表两次采血时间间隔。

与模型组比较**表示p<0.01

通过上述免疫器官指数检测数据和吞噬指数监测数据表格可知，

香椿子多糖应用于生物抗炎功能的实施例：

实施例7～实施例9：

其中，在本次试验中，低剂量组为实施例7，中剂量组为实施例8，高剂量组为实施例10。

末次给药后1h，按0.1mL/10g于小鼠右耳前后两面涂抹二甲苯，1h后处死小鼠，剪下双耳，用直径8mm打孔器于耳廓相同部位取下圆耳片，称重并计算耳肿胀度和抑制率。肿胀度＝右耳质量－左耳质量；抑制率(％)＝(模型组肿胀程度－药物组肿胀程度)/模型组肿胀程度×100％。

与模型组比较*表示p<0.05

香椿子多糖应用于体外抗氧化性的实施例：

实施例10～实施例15：

其中，在本次试验中，实施例10～实施例12为香椿子多糖总还原力测定的三组实验数据所对应的试验；实施例13～实施例15为香椿子多糖Vc总还原力测定的三组实验数据所对应的试验。

1、试液配制

⑴样品液制备精密称取香椿子多糖适量，于50ml容量瓶中加水定容，制成5mg/ml母液备用；精密移取多糖母液适量于10ml容量瓶，定容，摇匀，即得系列浓度的多糖溶液。

⑵对照品溶液精密称取Vc适量，加水溶解，制成0.2mg/ml溶液；精密移取Vc母液适量于10ml容量瓶，定容，摇匀，即得不同浓度Vc溶液。

2、香椿子多糖总还原力测定

⑴实验方法

采用普鲁士蓝法测定香椿子多糖总还原力。分别移取不同浓度Vc溶液与香椿子多糖1.0ml于10ml离心管中，加入2.5ml 0.2mol/L pH 6.6磷酸缓冲溶液和2.5ml 1％铁氰化钾溶液混匀，50℃水浴保温20min，加入2.5ml 10％三氯乙酸溶液混匀，3000r/min离心10min，精密移取上清2.5ml，加蒸馏水2.5ml和0.1％三氯化铁0.5ml，静置10min，于700nm处测定吸光度，以蒸馏水为参比，测定3次，分别为实施例10、实施例11、实施例12，结果见图1、图2。

⑵实验结果

①Vc总还原力测定

由图1可知：Vc总还原力随浓度增加而增加，在0.02～0.2mg/ml浓度范围呈线性关系，回归方程为：y＝5.4105x+0.00371，r＝0.9996；可知当Vc＝0.091mg/ml时，吸光度为0.500，总还原力达到50％。

②香椿子多糖总还原力测定

由图2可知：香椿子多糖具有一定还原力，总还原力随多糖浓度增加而增加，且呈剂量依赖关系，在0.2～1.6mg/ml浓度范围内具有良好线性关系，回归方程为：y＝0.4838x+0.0202，r＝0.9995。当香椿子多糖总还原力为50％时，多糖的浓度为0.991mg/ml。

3、香椿子多糖对DPPH清除率测定

(1)实验方法

精密移取2.0ml不同浓度香椿子多糖溶液和Vc溶液于试管中，加入2.0ml0.04mg/ml DPPH溶液混匀，暗处反应30min，517nm处测定吸光度A_i，同时测定2.0ml 0.04mg/mlDPPH溶液于等体积蒸馏水混合溶液的吸光度A₀，不同浓度香椿子多糖溶液与等体积无水乙醇混合液的吸光度A_j，Vc为阳性对照，平行测定3次，取平均值。根据公式DPPH清除率(％)＝(A₀-A_i+A_j)/A₀*100％计算。

(2)实验结果

由图3、图4可知，在一定浓度范围内，香椿子多糖对DPPH自由基有一定清除能力，清除能力随多糖浓度增加而增加，但明显低于Vc对DPPH自由基清除能力。

(3)方程拟合

在0.002～0.007mg/ml范围内，根据Vc清除率，Excel 2010对曲线进行拟合，所得方程为y＝0.0058e^385.03x，r＝0.9987，可知Vc对DPPH自由基的IC₅₀是0.0057mg/ml；在0.2～1.6mg/ml范围内，同法拟合方程为y＝0.3268lnx+0.7794，r＝0.9860，可知香椿子多糖对DPPH自由的IC₅₀为0.43mg/ml。

综上所述，本发明提供的一种香椿子多糖提取方法，包括以下步骤：步骤A：将香椿子脱脂处理，除去脂溶性成分；步骤B：将脱脂后的香椿子加水回流提取，并进行抽滤减压处理获得浓缩液；步骤C：将所述浓缩液进行脱蛋白处理，获得脱蛋白溶液；步骤D：向所述脱蛋白溶液中加入乙醇，并控制乙醇的含量为70％～90％；步骤E：将所述乙醇和脱蛋白溶液组成的混合溶液在1℃～5℃的环境下静置预定时间；步骤F：将静置处理的上述混合溶液抽滤处理，再用无水乙醇进行洗涤后进行干燥处理，获得香椿子多糖。通过所述方法可以高效的提取香椿子中的多糖，其中的香椿子多糖具有免疫调节、抗氧化、降血糖血脂、抗炎、镇痛、抗辐射等功效。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (4)

1.一种香椿子多糖提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤A：将香椿子通过95％乙醇或石油醚脱脂处理，除去脂溶性成分；

步骤B：将脱脂后的香椿子加水回流提取，并进行抽滤减压处理获得浓缩液，加水回流提取的料液比为1：12g/ml，加水回流提取的提取时间为120min，加水回流提取的提取次数为3次；

步骤C：将所述浓缩液进行脱蛋白处理，获得脱蛋白溶液；

步骤D：向所述脱蛋白溶液中加入乙醇，并控制乙醇的含量为85％；

步骤E：将所述乙醇和脱蛋白溶液组成的混合溶液在1℃～5℃的环境下静置预定时间；

步骤F：将静置处理的上述混合溶液抽滤处理，再用无水乙醇进行洗涤后进行干燥处理，获得香椿子多糖。

2.根据权利要求1所述的香椿子多糖提取方法，其特征在于，所述步骤A之前还包括：

将所述香椿子粉碎处理。

3.根据权利要求1所述的香椿子多糖提取方法，其特征在于，所述步骤E具体为：

将所述混合液在4℃的环境下静置12h。

4.根据权利要求1所述的香椿子多糖提取方法，其特征在于，所述步骤F中，将所述混合溶液抽滤处理后用无水乙醇洗涤至少三次。