CN104857011B - 树莓多糖预防或治疗化疗药物毒副作用的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了树莓多糖在制备预防或治疗化疗药物所致毒副作用的药物中的用途。人体在使用化疗药物后,的确会产生毒副作用,如肝脏、肾脏或/和脾脏损伤等,本发明研究发现,使用树莓多糖能够有效降低化疗药物带来的上述器官损伤等毒副作用,并且,在特定的用量配比下,树莓多糖既能降低毒副作用,又不会降低化疗药物的疗效,甚至有增强作用,为癌症患者的临床用药提供了新的选择。
Description
技术领域
本发明属于医药科技领域,具体涉及树莓多糖的新用途。
技术背景
恶性肿瘤仍然是严重威胁人类生命的重大疾病。最近统计资料表明,我国每年新发现的癌症患者约2000万人,其中150万人死于癌症。癌症的死亡人数占总死亡人数的1/5。
当前,治疗癌症最常用的方法依然是化疗。但是,由于化学药物非特异性的细胞毒性,会产生骨髓抑制、黏膜炎、皮炎、腹泻、器官损伤等严重的副作用。由于严重毒副作用的存在,很多患者都不愿坚持治疗。如何降低化疗药物带来的毒副作用,一直是医药人员密切关注的问题。
树莓(Rubus idaeus L.)又名山莓、悬钩子、覆盆子等,属蔷薇科悬钩子属。树莓主要分布于北半球温带和寒带,其果实为多浆小聚合果,味甜微酸。树莓含有多糖、有机酸、黄酮、花青素,多酚、维生素、矿质元素、挥发油、鞣质等多种活性成分,具有极高的营养价值和医疗保健作用,被誉为“黄金水果”。目前,国内市场上的树莓产品仍然以食品类为主,如以树莓为主要原料的果汁、果酱、果酒等。而提取树莓活性成分,并将这些有效成分应用于保健品乃至医药科技领域的例子非常少。
目前尚未见树莓多糖对化疗药物有影响的相关研究。
发明内容
本发明的目的在于提供树莓多糖的新用途。
具体地,本发明提供了树莓多糖在制备预防或治疗化疗药物所致毒副作用的药品、食品或保健品中的用途。
进一步地,所述毒副作用为器官损伤。
更进一步地,本发明具体实施方式中,所述器官为肝、脾或肾。
其中,所述化疗药物选自紫杉醇、顺铂或/和多西他赛。
其中,所述化疗药物采用注射剂型。其中,所述注射剂型可以选自皮下注射、肌肉注射或静脉注射等各种肿瘤治疗过程中的常用方式。
其中,所述树莓多糖采用口服剂型。其中,所述口服剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、散剂、浸膏剂或口服液。
其中,树莓多糖与化疗药物的使用剂量比为10~40∶1w/w,优选为20~40∶1w/w,更优选为40∶1w/w。当然,这一比例是以动物实验进行的确认,在人体实际使用过程中可能会出现剂量使用比例的偏差。
其中,所述树莓多糖中,多糖纯度在50%以上;进一步地,多糖纯度在80%以上;更进一步地,多糖纯度在85%以上;优选地,多糖纯度为85~95%w/w,如本发明中纯度为90~92%。上述纯度是采用硫酸苯酚法测定。
其中,所述树莓多糖采用水提醇沉法制备得到。
进一步地,所述水提醇沉法具体操作如下:取干燥树莓,石油醚或乙醚脱脂后,用浓度75%~95%v/v乙醇提取,过滤,滤渣加水提取,取水提液浓缩后,加乙醇至含醇量达到75%~85%,冷却、静置,取固形物即为树莓多糖。
其中,树莓提取前去籽或不去籽。
其中,所述树莓为蔷薇科悬钩子属植物的果实。
进一步地,所述树莓选自红树莓或黑树莓。
人体在使用化疗药物后,的确会产生毒副作用,如肝脏、肾脏或/和脾脏损伤等,本发明研究发现,使用树莓多糖能够有效降低化疗药物带来的上述器官损伤等毒副作用,并且,在特定的用量配比下,树莓多糖既能降低毒副作用,又不会降低化疗药物的疗效,甚至有增强作用,为癌症患者的临床用药提供了新的选择。
附图说明:
附图1多西他赛~树莓多糖对黑色素瘤B16F10小鼠移植肿瘤生长抑制作用;
附图2顺铂~树莓多糖对人肺癌H460裸鼠异种移植瘤生长抑制作用;
附图3紫杉醇~树莓多糖对人肝癌Bel~7402裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用;
附图4紫杉醇~树莓多糖对人胃癌MGC~803裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用;
附图5紫杉醇~树莓多糖对人乳腺癌MDA~MB~231裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用;
附图6紫杉醇~树莓多糖对人肾癌A498裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用;
附图7紫杉醇~树莓多糖对人结肠癌HT~29裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用;
附图8紫杉醇~树莓多糖对人子宫内膜癌HHUA裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用;
附图9化疗药物~树莓多糖联合对荷瘤小鼠肝脏组织形态的影响;
附图10化疗药物~树莓多糖联合对荷瘤小鼠肾脏组织形态的影响;
附图11化疗药物~树莓多糖联合对C57BL/6小鼠脾脏指数的影响;
附图12树莓多糖对荷瘤小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响;
附图13化疗药物~树莓多糖联合对荷瘤小鼠脾细胞内免疫相关酶活性的影响;
附图14化疗药物~树莓多糖联合对荷瘤小鼠血清中CD4、CD8、IL~2、INF~γ以及TNF~α含量的影响。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的树莓多糖采用常规的多糖提取、纯化方式制备得到,在本发明中具体操作如下:
树莓多糖制备:取干树莓,粉碎去籽后,加5倍石油醚(沸程60~90℃)脱脂,除尽石油醚后加入75%~95%v/v乙醇于60℃回流,将过滤后的滤渣加10倍纯净水超声提取(功率60W,温度:80℃,处理时间:100min),离心取上清,滤渣按原条件再提取两次,合并滤液,减压浓缩至原体积的1/4,加入95%乙醇使溶液含醇量达75%v/v,于4摄氏度静置24h,过滤收集滤渣,滤渣烘干得树莓多糖。
经测定,本发明制备的树莓多糖得率为10.4%~11.6%,经硫酸苯酚法检测得到多糖纯度为90.8%~91.2%。
本发明从抑瘤作用、减毒增效和免疫调节三个方面对树莓多糖含片的主要成分树莓多糖进行了辅助肿瘤化疗的药效学研究,各实施例中树莓多糖剂量以多糖计。
实施例1
多西他赛~树莓多糖联合对黑色素瘤B16F10小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
取对数生长期的黑色素瘤细胞B16F10,在无菌条件下制备成5×107/ml细胞悬液,以0.1ml接种于C57BL/6小鼠右侧腋窝皮下。5天后用游标卡尺测量小鼠移植瘤直径,待肿瘤生长至60~90mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法,动态观察被试药物的抗肿瘤效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1次,每次测量同时还需称量鼠重。分组及给药方式如下:多西他赛组采用皮下注射,10mg/kg,每三天给药1次。多西他赛~树莓多糖低中高联合给药组,多西他赛采用皮下注射,10mg/kg,每三天给药1次,树莓多糖采用灌胃,给药剂量分别为100mg/kg,200mg/kg、400mg/kg,每天给药1次。阴性对照组注射等量生理盐水,每天1次。肿瘤体积计算公式:TV=0.52×a×b2,其中a、b分别表示长宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(%),计算公式:T/C(%)=TRTV/CRTV×100%,TRTV:治疗组RTV;CRTV:阴性对照组RTV。
表1.多西他赛~树莓多糖联合用药对C57BL/6小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
结果:见表1和图1,多西他赛10mg/kg组对黑色素瘤B16F10小鼠移植瘤的抑瘤率为66.49%联合给药组对黑色素瘤B16F10小鼠移植瘤的抑瘤率分别为40.95%,70.90%和74.30%。联合使用时对黑色素瘤的抑制效果高于多西他赛单独使用。并且多西他赛毒性较大,动物体重下降明显,实验过程中动物有死亡。两者联合使用后,实验动物体重无明显下降,且实验过程中未出现动物死亡。
因此,黑色素瘤B16F10小鼠移植瘤生长抑制试验结果表明,与阴性对照组相比,各个给药组组对黑色素瘤B16F10小鼠移植瘤的生长具有显著性的抑制作用(*P<0.05,**P<0.01)。多西他赛~树莓多糖低中高联合给药组对黑色素瘤B16F10小鼠移植瘤的生长具有显著性的抑制作用,且多西他赛~树莓多糖高联合给药组的抑制效果高于多西他赛单独用药组(△P<0.05)。说明树莓多糖能增强多西他赛的抗肿瘤能力。此外,与多西他赛相比,树莓多糖对实验动物的体重无明显影响,未见明显的毒副反应。
实施例2
顺铂~树莓多糖联合对人肺癌H460裸鼠异种移植瘤生长抑制试验
取对数生长期的肿瘤细胞,在无菌条件下制备成5×107/ml细胞悬液,以0.1ml接种于裸鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径,待肿瘤生长至100~200mm3后动物随机分组。使用测量瘤径的方法,动态观察抗肿瘤效果。肿瘤直径的测量次数为每2天1次,每次测量同时还需称量鼠重。给药方式如下:阴性对照组注射等量生理盐水,每天1次;顺铂组10mg/kg,每周给药1次;顺铂~树莓多糖低中高联合给药组,顺铂采用皮下注射,10mg/kg,每周给药1次,树莓多糖采用灌胃,给药剂量分另为100mg/kg,200mg/kg、400mg/kg,每天给药1次。肿瘤体积计算公式:
TV=0.52×a×b2
其中a、b分别表示长宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(%),计算公式如下:
T/C(%)=TRTV/CRTV×100%
TRTV:治疗组RTV;CRTV:阴性对照组RTV
表2.顺铂~树莓多糖联合用药对人肺癌H460裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
结果:见表2和图2,顺铂10mg/kg组对人肺癌H460裸鼠移植瘤的抑瘤率为61.49%;顺铂~树莓多糖联合低、中、高剂量组对人肺癌H460裸鼠移植瘤的抑瘤率分别为40.95%,65.90%,72.30%。其中,顺铂~树莓多糖高联合给药组的抑制效果高于顺铂单独用药组。此外,顺铂毒性较大,动物体重下降明显,实验过程中动物有死亡。两者联合使用后,实验动物体重无明显下降,且实验过程中未出现动物死亡。
因此,对人肺癌H460裸鼠移植瘤生长抑制试验结果表明,与阴性对照组相比,顺铂10mg/kg组、顺铂~树莓多糖高中联合给药组对人肺癌H460移植瘤的生长具有极显著性的抑制作用(*P<0.05,**P<0.01)。与阳性对照顺铂相比,顺铂~树莓多糖高联合给药组对H460移植瘤的生长具有显著性的抑制作用(△P<0.05),且实验动物的体重无明显影响,未见明显的毒副反应。
实施例3
紫杉醇~树莓多糖联合对人肝癌Bel~7402裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制试验
具体实施方案参照实施例2。给药方案如下:阴性对照组注射等量生理盐水,每天1次;紫杉醇组10mg/kg,每周给药1次;紫杉醇~树莓多糖低中高联合给药组,紫杉醇采用皮下注射,10mg/kg,每周给药1次,树莓多糖采用灌胃,给药剂量分别为100mg/kg,200mg/kg、400mg/kg,每天给药1次。
表3.紫杉醇~树莓多糖对人肝癌Bel~7402裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
结果:见表3和图3,紫杉醇10mg/kg组对人肝癌Bel~7402裸鼠移植瘤的抑瘤率为68.55%;紫杉醇~树莓多糖联合低、中、高剂量组对人肝癌Bel~7402裸鼠移植瘤的抑瘤率分别达45.31%,72.47%,76.47%。其中,紫杉醇~树莓多糖高中联合给药组的抑制效果高于紫杉醇单独用药组(△P<0.05)。且紫杉醇毒性较大,动物体重下降明显,实验过程中动物有死亡。两者联合使用后,实验动物体重无明显下降,且实验过程中未出现动物死亡。
因此,紫杉醇~树莓多糖对人肝癌Bel~7402裸鼠移植瘤生长抑制试验结果表明,与阴性对照组相比,紫杉醇10mg/kg组、紫杉醇~树莓多糖高中联合给药组对人肝癌Bel~7402移植瘤的生长有极显著性的抑制作用(*P<0.05,**P<0.01)。与阳性对照组紫杉醇相比,紫杉醇~树莓多糖高中联合给药对实验动物的体重没有明显影响,未见明显的毒副反应。
实施例4
紫杉醇~树莓多糖联合对人胃癌MGC~803裸鼠异种移植肿瘤生长抑制试验
具体实施方案参照实施例2。给药方案如下:阴性对照组注射等量生理盐水,每天1次;紫杉醇组10mg/kg,每周给药1次;紫杉醇~树莓多糖低中高联合给药组,紫杉醇采用皮下注射,10mg/kg,每周给药1次,树莓多糖采用灌胃,给药剂量分别为100mg/kg,200mg/kg、400mg/kg,每天给药1次。
表4.紫杉醇~树莓多糖对人胃癌MGC~803裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
结果:见表4和图4,紫杉醇10mg/kg组对人胃癌MGC~803裸鼠移植瘤的抑瘤率为65.26%;紫杉醇~树莓多糖联合低、中、高剂量组对人胃癌MGC~803裸鼠移植瘤的抑瘤率分别达47.45%,70.35%,72.48%。其中,紫杉醇~树莓多糖高中联合给药组的抑制效果高于紫杉醇单独用药组(△P<0.05)。且紫杉醇毒性较大,动物体重下降明显,实验过程中动物有死亡。两者联合使用后,实验动物体重无明显下降,且实验过程中未出现动物死亡。
因此,紫杉醇~树莓多糖对人胃癌MGC~803裸鼠移植瘤生长抑制试验结果表明,与阴性对照组相比,紫杉醇10mg/kg组、紫杉醇~树莓多糖高中联合给药组对人胃癌MGC~803移植瘤的生长有极显著性的抑制作用(*P<0.05,**P<0.01)。与阳性对照组紫杉醇相比,紫杉醇~树莓多糖高中联合给药对实验动物的体重没有明显影响,未见明显的毒副反应。
实施例5
紫杉醇~树莓多糖联合对人乳腺癌MDA~MB~231裸鼠异种移植肿瘤生长抑制试验
具体实施方案参照实施例2。给药方案如下:阴性对照组注射等量生理盐水,每天1次;紫杉醇组10mg/kg,每周给药1次;紫杉醇~树莓多糖低中高联合给药组,紫杉醇采用皮下注射,10mg/kg,每周给药1次,树莓多糖采用灌胃,给药剂量分别为100mg/kg,200mg/kg、400mg/kg,每天给药1次。
表5.紫杉醇~树莓多糖对人乳腺癌MDA~MB~231裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
结果:见表5和图5,紫杉醇10mg/kg组对人乳腺癌MDA~MB~231裸鼠移植瘤的抑瘤率为70.87%;紫杉醇~树莓多糖联合低、中、高剂量组对人乳腺癌MDA~MB~231裸鼠移植瘤的抑瘤率分别达41.32%,50.09%,75.36%。其中,紫杉醇~树莓多糖高联合给药组的抑制效果高于紫杉醇单独用药组(△P<0.05)。且紫杉醇毒性较大,动物体重下降明显,实验过程中动物有死亡。两者联合使用后,实验动物体重无明显下降,且实验过程中未出现动物死亡。
因此,紫杉醇~树莓多糖对人乳腺癌MDA~MB~231裸鼠移植瘤生长抑制试验结果表明,与阴性对照组相比,紫杉醇10mg/kg组、紫杉醇~树莓多糖高中联合给药组对人乳腺癌MDA~MB~231移植瘤的生长有极显著性的抑制作用(*P<0.05,**P<0.01)。与阳性对照组紫杉醇相比,紫杉醇~树莓多糖高中联合给药对实验动物的体重没有明显影响,未见明显的毒副反应。
实施例6
紫杉醇~树莓多糖联合对人肾癌A498裸鼠异种移植肿瘤生长抑制试验
具体实施方案参照实施例2。给药方案如下:阴性对照组注射等量生理盐水,每天1次;紫杉醇组10mg/kg,每周给药1次;紫杉醇~树莓多糖低中高联合给药组,紫杉醇采用皮下注射,10mg/kg,每周给药1次,树莓多糖采用灌胃,给药剂量分别为100mg/kg,200mg/kg、400mg/kg,每天给药1次。
表6.紫杉醇~树莓多糖对人肾癌A498裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
结果:见表6和图6,紫杉醇10mg/kg组对人肾癌A498裸鼠移植瘤的抑瘤率为60.21%;紫杉醇~树莓多糖联合低、中、高剂量组对人肾癌A498裸鼠移植瘤的抑瘤率分别达54.58%,69.55%,72.19%。其中,紫杉醇~树莓多糖中高联合给药组的抑制效果高于紫杉醇单独用药组(△P<0.05)。且紫杉醇毒性较大,动物体重下降明显,实验过程中动物有死亡。两者联合使用后,实验动物体重无明显下降,且实验过程中未出现动物死亡。
因此,紫杉醇~树莓多糖对人肾癌A498裸鼠移植瘤生长抑制试验结果表明,与阴性对照组相比,紫杉醇10mg/kg组、紫杉醇~树莓多糖高中联合给药组对人肾癌A498移植瘤的生长有极显著性的抑制作用(*P<0.05,**P<0.01)。与阳性对照组紫杉醇相比,紫杉醇~树莓多糖高中联合给药对实验动物的体重没有明显影响,未见明显的毒副反应。
实施例7
紫杉醇~树莓多糖联合对人结肠癌HT~29裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制试验
具体实施方案参照实施例2。给药方案如下:阴性对照组注射等量生理盐水,每天1次;紫杉醇组10mg/kg,每周给药1次;紫杉醇~树莓多糖低中高联合给药组,紫杉醇采用皮下注射,10mg/kg,每周给药1次,树莓多糖采用灌胃,给药剂量分别为100mg/kg,200mg/kg、400mg/kg,每天给药1次。
表7.紫杉醇~树莓多糖对人结肠癌HT~29裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
结果:见表7和图7,紫杉醇10mg/kg组对人结肠癌HT~29裸鼠移植瘤的抑瘤率为62.88%;紫杉醇~树莓多糖联合低、中、高剂量组对人结肠癌HT~29裸鼠移植瘤的抑瘤率分别达45.33%,53.13%,68.23%。其中,紫杉醇~树莓多糖高联合给药组的抑制效果高于紫杉醇单独用药组(△P<0.05)。且紫杉醇毒性较大,动物体重下降明显,实验过程中动物有死亡。两者联合使用后,实验动物体重无明显下降,且实验过程中未出现动物死亡。
因此,紫杉醇~树莓多糖对人结肠癌HT~29裸鼠移植瘤生长抑制试验结果表明,与阴性对照组相比,紫杉醇10mg/kg组、紫杉醇~树莓多糖高中联合给药组对人结肠癌HT~29移植瘤的生长有极显著性的抑制作用(*P<0.05,**P<0.01)。与阳性对照组紫杉醇相比,紫杉醇~树莓多糖高联合给药对实验动物的体重没有明显影响,未见明显的毒副反应。
实施例8
紫杉醇~树莓多糖联合对人子宫内膜癌HHUA裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制试验
具体实施方案参照实施例2。给药方案如下:阴性对照组注射等量生理盐水,每天1次;紫杉醇组10mg/kg,每周给药1次;紫杉醇~树莓多糖低中高联合给药组,紫杉醇采用皮下注射,10mg/kg,每周给药1次,树莓多糖采用灌胃,给药剂量分别为100mg/kg,200mg/kg、400mg/kg,每天给药1次。
表8.紫杉醇~树莓多糖对人子宫内膜癌HHUA裸鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
结果:见表8和图8,紫杉醇10mg/kg组对人子宫内膜癌HHUA裸鼠移植瘤的抑瘤率为58.77%;紫杉醇~树莓多糖联合低、中、高剂量组对人子宫内膜癌HHUA裸鼠移植瘤的抑瘤率分别达45.25%,67.21%,69.34%。其中,紫杉醇~树莓多糖中高联合给药组的抑制效果高于紫杉醇单独用药组(△P<0.05)。且紫杉醇毒性较大,动物体重下降明显,实验过程中动物有死亡。两者联合使用后,实验动物体重无明显下降,且实验过程中未出现动物死亡。
因此,紫杉醇~树莓多糖对人子宫内膜癌HHUA裸鼠移植瘤生长抑制试验结果表明,与阴性对照组相比,紫杉醇10mg/kg组、紫杉醇~树莓多糖高中联合给药组对人子宫内膜癌HHUA移植瘤的生长有极显著性的抑制作用(*P<0.05,**P<0.01)。与阳性对照组紫杉醇相比,紫杉醇~树莓多糖中高联合给药对实验动物的体重没有明显影响,未见明显的毒副反应。
实施例9
树莓多糖对荷瘤小鼠肝脏、肾脏组织形态的影响
将实施例1~8抗肿瘤实验中的各组荷瘤小鼠麻醉后,分离肝脏和肾脏。将肝脏、肾脏浸泡于10%的甲醛溶液中固定。将固定好的组织经乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片贴片,二甲苯脱蜡,HE染色,脱水透明,封固后于光学显微镜下观察并拍照。
各组小鼠的肝组织切片如图9所示,正常小鼠的肝细胞边缘清晰,细胞质充盈,细胞核清晰,细胞排列整齐。相比之下,化疗药物组小鼠的肝细胞高度肿胀,部分区域肝组织灶性坏死,间质灶性炎细胞浸润。而化疗药物~树莓多糖联合组小鼠的肝细胞有明显恢复,其中化疗药物~树莓多糖高剂量联合组小鼠的肝细胞与正常小鼠肝细胞相似。可见,树莓多糖对化疗药物造成的荷瘤小鼠肝损伤有一定的修复作用。
各组小鼠的肾组织切片如图10所示,正常小鼠的肾小球形状规则,肾小球囊间隙小,肾小球基底膜完整。相比之下,化疗药物组小鼠的肾小球出现一定的退化和损伤,具体表现在肾小球基底膜扭曲,肾小囊间隙明显加宽。化疗药物~树莓多糖联合组小鼠的肾小球恢复非常明显,主要表现在肾小囊间隙较化疗药物组明显变小。可见,树莓多糖对化疗药物造成的荷瘤小鼠肾损伤也有一定的修复作用。
以上结果说明,树莓多糖能修复化疗药物治疗后引起的肝肾损伤,化疗药物与树莓多糖联合使用后毒副作用有所减小。
实施例10
树莓多糖对荷瘤小鼠脾脏指数的影响
实施例1~8抗肿瘤实验结束后,将小鼠麻醉,分离肿瘤组织和脾脏,称重。根据称重结果计算脾脏指数。计算公式:脾脏指数=脾脏重量(g)/净体重(kg),其中,净体重=体重~瘤重。试验得到的结果以mean±SD表示,并进行统计T检验,P<0.05为显著性差异,P<0.01为极显著性差异(*:与阴性对照组相比,#与化疗药物组相比)。
结果见图11。与化疗药物组相比,化疗药物~树莓多糖低中高联合给药组的脾脏指数均显著增加。
实施例11
树莓多糖对小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响
颈椎脱臼处死小鼠,于75%乙醇中浸泡1~2分钟,在无菌操作台内迅速取出脾脏,至于预先置有400目尼龙筛网盛有冰冷PBS的平皿中。在筛网上用无菌针芯轻捻脾组织,使单个细胞滤过筛网进入平皿。用PBS冲洗筛网后收集细胞悬液,于4℃离心(1000r/min)5分钟。弃上清,用含2%FBS的RPMI~1640培养基重悬细胞并在显微镜下计数,将细胞浓度调整为1×107个/ml,将细胞悬液接种到96孔板中,100μl/孔,并向孔内加入5μg/ml的ConA,于37℃,5%CO2培养箱中培养过夜。次日,将树莓多糖用培养液稀释到各个预定浓度后分别加入96孔板中(100μl/孔)。以未加入ConA的作为空白对照组,以只加ConA未加树莓多糖的组为阳性对照组。在37℃,5%CO2培养箱孵育48小时。向96孔板中加入5mg/ml的MTT,每孔20μl,继续培养4h。吸掉培养基,每孔加入150μl DMSO溶解,摇床10分钟轻轻混匀。用酶标仪在测定波长为570nm,参比波长为630nm处测定吸光值。试验得到的结果以mean±SD表示,并进行统计T检验,P<0.05为显著性差异,P<0.01为极显著性差异(*:与阴性对照组相比,#与阳性对照组相比)。
结果如图12所示,树莓多糖各组的吸光值均显著高于阴性对照组,并呈现剂量依赖关系。
此外,从64μg/ml开始,显著高于阳性对照组。由此说明,树莓多糖能显著刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖。
实施例12
树莓多糖对荷瘤小鼠脾细胞内免疫相关酶活性的影响
将实施例1~8各组荷瘤小鼠的脾脏在冰浴条件下用细胞破碎仪破碎(400安培,每次5秒,重复3次),破碎介质为pH7.4,0.01mol/L Tris~HCl,0.0001mol/L EDTA~2Na,0.01mol/L蔗糖,0.8%NaCl。于4℃离心(5000r/min)10分钟后收集上清液,用测试盒分别检测脾细胞中四种免疫相关酶AKP、ACP、LDH以及SOD的活性。试验得到的结果以mean±SD表示,并进行统计T检验,P<0.05为显著性差异,P<0.01为极显著性差异(*:与阴性对照组相比,#与阳性对照组相比)。
结果如图13所示,与阴性对照组相比,树莓多糖能显著提升4种酶的活性,并呈现剂量依赖关系。与化疗药物组相比,化疗药物~树莓多糖中高联合组显著性的提高了ACP的活性。由此说明,化疗药物与树莓多糖联合使用后,其对ACP活性的提高能力得到了增强。
实施例13
树莓多糖对荷瘤小鼠血清中CD4、CD8、IL~2、INF~γ以及TNF~α含量的影响
将实施例1~8抗肿瘤实验中的各组荷瘤小鼠麻醉后摘除眼球取血。血液静置片刻后于4℃离心(2500r/min)10分钟后收集血清。用酶联免疫检测试剂盒分别检测血清中CD4、CD8、IL~2、INF~γ以及TNF~α含量。试验得到的结果以mean±SD表示,并进行统计T检验,P<0.05为显著性差异,P<0.01为极显著性差异(*:与阴性对照组相比,#与阳性对照组相比)。
结果如图14所示,与阳性对照组相比,化疗药物~树莓多糖中高联合组均能显著或极显著性的提高5种蛋白的含量。由此说明,多西他赛与树莓多糖联合使用后,其对此五种蛋白含量的提高能力得到了增强。
以上各免疫实验结果进一步说明,树莓多糖能够增强荷瘤小鼠的免疫力,并且大大提高了化疗药物的治疗效果。
Claims (17)
1.树莓多糖在制备预防或治疗化疗药物所致毒副作用的药品或保健品中的用途;所述毒副作用为器官损伤。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述器官为肝、脾或肾。
3.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述化疗药物选自紫杉醇、顺铂或/和多西他赛。
4.根据权利要求1~3任意一项所述的用途,其特征在于:所述化疗药物采用注射剂型。
5.根据权利要求1~3任意一项所述的用途,其特征在于:所述树莓多糖采用口服剂型。
6.根据权利要求1~3任意一项所述的用途,其特征在于:树莓多糖与化疗药物的使用剂量比为10~40∶1w/w。
7.根据权利要求6所述的用途,其特征在于:树莓多糖与化疗药物的使用剂量比为20~40∶1w/w。
8.根据权利要求7所述的用途,其特征在于:树莓多糖与化疗药物的使用剂量比为40∶1w/w。
9.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述树莓多糖中,多糖纯度在50%以上。
10.根据权利要求9所述的用途,其特征在于:多糖纯度在80%以上。
11.根据权利要求10所述的用途,其特征在于:多糖纯度在85%以上。
12.根据权利要求11所述的用途,其特征在于:多糖纯度为85~95%w/w。
13.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述树莓多糖采用水提醇沉法制备得到。
14.根据权利要求13所述的用途,其特征在于:所述水提醇沉法具体操作如下:取干燥树莓,石油醚或乙醚脱脂后,用浓度75%~95%v/v乙醇提取,过滤,滤渣加水提取,取水提液浓缩后,加乙醇至含醇量达到75%~85%,冷却、静置,取固形物即为树莓多糖。
15.根据权利要求13或14所述的用途,其特征在于:树莓提取前去籽或不去籽。
16.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述树莓为蔷薇科悬钩子属植物的果实。
17.根据权利要求16所述的用途,其特征在于:所述树莓选自红树莓或黑树莓。
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