CN104855696A

CN104855696A - 一种发酵豆粕、菌株及其应用

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Publication number: CN104855696A
Application number: CN201510152254.XA
Authority: CN
Inventors: 何艮; 张蓓莉; 皮雄娥; 王欣; 费迪波; 周慧慧; 刘伟; 麦康森
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences; Ocean University of China
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences; Ocean University of China
Priority date: 2015-04-01
Filing date: 2015-04-01
Publication date: 2015-08-26
Anticipated expiration: 2035-04-01
Also published as: CN104855696B

Abstract

本发明公开了一种发酵豆粕，用于制备发酵豆粕的菌株以及发酵豆粕在制备肉食性鱼类饲料添加剂中的应用；本发明制备的发酵豆粕蛋白含量高，含的小分子物质如游离氨基酸、小肽含量高，抗营养因子含量少，有发酵香味，适口性好的特点，发酵豆粕粗蛋白提高至60.5-61.7％，小肽含量由3.9-4.3％提高至18.6-19.8％，大豆胰蛋白酶抑制因子已经完全消除，氨基酸含量也有所提高；本发明制备的发酵豆粕替代鱼粉来制备肉食性鱼类饲料添加，特别是用于制备大菱鲆饲料，本发明制备的含高蛋白的发酵豆粕在大菱鲆饲料中能有效替代全鱼粉饲料中45％的鱼粉蛋白。

Description

一种发酵豆粕、菌株及其应用

(一)技术领域

本发明涉及鱼类饲料添加剂，特别涉及一种发酵豆粕的制备方法、制备发酵豆粕所用菌株及制备肉食性鱼类饲料添加剂的应用。

(二)背景技术

养殖鱼类对蛋白质的营养需求量约为其饲料干重的35％-55％，比鸟类及哺乳类高150％-300％，而鱼粉是水产饲料工业中最主要的蛋白质来源。肉食性鱼类，肉质细嫩、鲜美，营养价值高，但是对鱼粉的需求量大。近年来，随着集约化养殖的迅猛发展，鱼粉的需求量急剧上升，鱼粉价格的不断上扬，严重阻碍了水产养殖业的发展。因此，开发新型蛋白源，降低饲料成本，成为人们亟待解决的课题。

肉食性鱼类对植物蛋白利用率很低，因其必需氨基酸含量较低且缺乏某种或某几种必需氨基酸，含有多种抗营养因子以及适口性差等缺点会影响水产动物对植物蛋白源的摄取、消化和吸收，严重的还会危害动物的健康和生长发育。而微生物发酵能绿色环保高效地解决许多问题。因此，有关发酵豆粕的研究也很多：吴胜华等人采用枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、植物乳酸菌及酵母菌对普通豆粕进行二元混菌固态发酵，试验结果表明：豆粕经过混菌发酵后小肽含量显著提高，当采用枯草芽孢杆菌和植物乳酸菌(KC-RS)组合，接种量4％，料水比1：1.2，通气量60g/mL，发酵温度40℃时，发酵产品中的小肽含量可达12.01％，凝集素，植酸的含量明显降低，抗胰蛋白酶因子完全消除。蔡国林、杨旭等人研究某些微生物菌种对豆粕进行发酵后对豆粕的营养价值的影响中看出，经过有益微生物菌种发酵的豆粕与未发酵的豆粕相比，豆粕中的粗蛋白含量从46.2％能够提高到49.7％，同时他们研究发酵豆粕饲喂动物的实验中也证明，实验组猪的日增重与对照组相比，日增重增加了7.6％，同时料水比和下痢率也都显著下降，这样发酵豆粕的饲喂价值和品质都有显著提高。Twibell和Wilson的研究也表明：随着饲料中大豆蛋白添加量的提高，鱼类的摄食率逐渐下降。罗智等在石斑鱼配合饲料中用发酵豆粕部分替代白鱼粉后发现，在饲料中添加14％发酵豆粕，对石斑鱼的生长和鱼体组成不会造成显著影响。冷向军等证实，发酵豆粕可取代凡纳滨对虾、南美白对虾饲料中鱼粉用量的20％，而不会对虾体增重率、虾体肌肉组成产生显著影响。因此，寻求一种蛋白含量更高、抗营养因子含量少而且有利于水产动物特别是肉食性鱼类摄食及消化吸收的高效廉价蛋白至关重要。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种高蛋白含量的发酵豆粕的制备方法，用于制备发酵豆粕的新菌株--泡盛曲霉(Aspergillus awamori strain)42，以及发酵豆粕在制备肉食性鱼类饲料中的应用，用于解决植物蛋白源在替代鱼粉过程中的蛋白含量低、蛋白利用率低，抗营养因子含量过高，适口性差等问题，以弥补现有技术的不足。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种发酵豆粕，所述发酵豆粕按如下方法制备：(1)将豆粕浸泡在营养液制成发酵基质(通常25℃浸泡15min)；所述营养液终浓度组成为：K₂HPO₄ 1-8g/L、NaCl 1-6g/L、(NH₄)₂SO₄ 2-6g/L、葡萄糖1-7g/L，溶剂为水；

(2)将泡盛曲霉(优选泡盛曲霉42)经扩大培养后的孢子接种至发酵基质中，在温度20～50℃、湿度85-100％条件下发酵培养30-60h，取出培养物干燥(优选50-55℃干燥)，粉碎(优选过80目筛)，获得发酵豆粕。

进一步，优选步骤(1)中营养液的体积用量以豆粕重量计为 0.5-0.7ml/g。

进一步，优选步骤(1)中营养液终浓度组成为：K₂HPO₄ 1-4g/L、NaCl 1-2g/L、(NH₄)₂SO₄ 2-5g/L、葡萄糖1-3g/L，溶剂为水，最优选K₂HPO₄ 2g/L、NaCl 2g/L、(NH₄)₂SO₄ 2g/L、葡萄糖2g/L，溶剂为水。

进一步，优选步骤(2)泡盛曲霉孢子接种前先将发酵基质在100℃条件下灭菌10-30min。

进一步，步骤(2)中所述泡盛曲霉扩大培养方法为：将泡盛曲霉接种至PDA培养基，在28℃培养3天，获得斜面菌体；将斜面菌体接种至种子培养基，在25-30℃培养2-3天，获得扩大培养后的泡盛曲霉孢子；所述种子培养基终浓度组成为：麸皮1000g/L、豆粕200g/L，溶剂为水，pH自然；PDA培养基组成为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15-20g/L，溶剂为自来水，pH自然。

进一步，步骤(2)泡盛曲霉孢子按如下方法接种：将扩大培养后的泡盛曲霉孢子用无菌水冲洗，收集泡盛曲霉孢子，将泡盛曲霉孢子用无菌水配制成孢子悬液，按照每千克豆粕干重接种1.5g-5g孢子湿重的比例，将孢子悬液接种至发酵基质中。

进一步，优选步骤(2)中发酵培养是在温度25～30℃、湿度90-100％条件下发酵培养30-50h。

本发明所述泡盛曲霉为泡盛曲霉strain42(Aspergillus awamori strain42)，所述泡盛曲霉strain42保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2015155，保藏日期为2015年3月24日，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编430072，泡盛曲霉strain42的18S DNA序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种所述发酵豆粕在制备肉食性鱼类饲料添加剂中的应用。

进一步，优选所述发酵豆粕在肉食性鱼类饲料中的质量添加量为30％-60％。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一株新菌株--泡盛曲霉(Aspergillus awamori)42，利用泡盛曲霉42高效发酵豆粕制备含高蛋白的发酵豆粕及该发酵豆粕用于饲料添加剂的应用；本发明制备的发酵豆粕蛋白含量高，含的小分子物质如游离氨基酸、小肽含量高，抗营养因子含量少，有发酵香味，适口性好的特点。发酵豆粕粗蛋白提高至60.5-61.7％，小肽含量由3.9-4.3％提高至18.6-19.8％，大豆胰蛋白酶抑制因子含量降低了90％，氨基酸含量也有所提高。本发明制备的发酵豆粕替代鱼粉来制备肉食性鱼类饲料添加，特别是用于制备大菱鲆饲料，结果表明：本发明制备的含高蛋白的发酵豆粕在大菱鲆饲料中能有效替代全鱼粉饲料中45％的鱼粉蛋白；不影响大菱鲆的存活、末体重、特定生长率、肝体比，脏体比和肥满度；不影响大菱鲆常规鱼体体成分组成，达到了降低饲料价格、节约养殖成本的目的，为水产养殖的可持续发展提供了理论依据。

(四)附图说明

图1为不同发酵时间对发酵豆粕总蛋白含量的影响。

图2为不同营养因子对发酵豆粕总蛋白含量的影响。

图3为泡盛曲霉42的18S DNA序列。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明实施例所用豆粕购自青岛七好生物科技有限公司。本发明所用泡盛曲霉42经种子培养基培养后检测的各项酶活为：纤维素酶活10097μ/g(pH＝5.5)，木聚糖酶活286000μ/g(pH＝4.8)，蛋白酶酶活11229μ/g (pH＝3.0)。

实施例1泡盛曲霉的扩大培养

将泡盛曲霉42接种至PDA培养基，在25-30℃培养2-3天，获得斜面菌体；将斜面菌体接种至种子培养基，在25-30℃培养2-3天，将扩大培养后的泡盛曲霉孢子用无菌水冲洗，收集孢子，将孢子用无菌水配制成孢子悬液；种子培养基终浓度组成为：麸皮1000g/L、豆粕200g/L，溶剂为水，pH自然。PDA培养基组成为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15-20g/L，溶剂为自来水，pH自然。

实施例2发酵豆粕的制备

(1)将1kg豆粕浸泡在0.5L营养液中，25℃浸泡15min，于柜式灭菌锅中100℃灭菌20min，获得发酵基质；所述营养液终浓度组成为：K₂HPO₄ 7g/L、NaCl 5g/L、(NH₄)₂SO₄ 4g/L、葡萄糖6g/L、溶剂为水。

(2)按照每千克豆粕(干重)接种1.5g孢子湿重的比例，将实施例1制备的孢子悬液接种至步骤(1)发酵基质中，在温度28-30℃、湿度100％条件下发酵培养33h，取出培养物在50℃干燥，粉碎，过80目筛子，获得发酵豆粕。

实施例3

(1)将1kg豆粕浸泡在0.5L营养液中，25℃浸泡15min，于柜式灭菌锅中100℃灭菌20min，获得发酵基质；所述营养液终浓度组成为：K₂HPO₄ 5/L、NaCl 3/L、(NH₄)₂SO₄ 4/L、葡萄糖6g/L、溶剂为水。

(2)按照每千克豆粕干重接种1.5g孢子湿重的比例，将实施例1制备的孢子悬液接种至发酵基质中，在温度28℃、湿度100％条件下分别发酵培养0、24、33、42、51、60小时，每个处理3个重复。培养结束后取出培养物在50℃干燥，粉碎，过80目筛子，获得发酵豆粕。用凯氏定氮法检测各组发酵豆粕蛋白含量，结果见图1所示，发现各处理组的蛋白含量显著高于未处理组(0h)。

实施例4

(1)将1kg豆粕浸泡在0.5L营养液中，25℃浸泡15min，于柜式灭菌锅中100℃灭菌20min，获得发酵基质；营养液组成为：K₂HPO₄ 2g/L、NaCl 2g/L、(NH₄)₂SO₄ 2g/L、葡萄糖2g/L、溶剂为水，图2中全物质组。

分别设置下列对照：未添加营养盐组(即用去离子水替代营养液)(图2中未添加组)，3g/L K₂HPO₄+1g/L NaCl+水、4g/L(NH₄)₂SO₄+水、2g/L葡萄糖+水。

(2)按照每千克豆粕干重接种1.5g孢子湿重的比例，将实施例1制备的孢子悬液接种至发酵基质中，在温度28℃、湿度70％条件下发酵培养50小时，每个处理3个重复。培养结束后取出培养物在50℃干燥，粉碎，过80目筛子，获得发酵豆粕。用凯氏定氮法检测各组发酵豆粕蛋白含量(结果见图2所示)。结论除葡萄糖组外，其他各处理组的粗蛋白含量显著高于未处理组(即为添加营养盐组)。

实施例5

(1)将100kg豆粕浸泡在50L营养液中，25℃浸泡15min，于柜式灭菌锅中100℃灭菌20min，获得发酵基质；所述营养液终浓度组成为：K₂HPO₄ 2g/L、NaCl 2g/L、(NH₄)₂SO₄ 2g/L、葡萄糖2g/L、溶剂为水。

(2)按照每千克豆粕(干重)接种3g泡盛曲霉孢子(孢子湿重计量)的比例，将实施例1制备的孢子悬液接种至步骤(1)发酵基质中，在温度28-30℃、湿度100％条件下发酵培养33h，取出培养物在50℃干燥，粉碎，过80目筛子，获得发酵豆粕。

经检测，该发酵豆粕粗蛋白(凯氏定氮法)提高至60.5-61.7％，小肽含量由3.9-4.3％提高至18.6-19.8％，大豆胰蛋白酶抑制因子(GB/T 21498-2008)已经完全消除，氨基酸(氨基酸分析仪)含量也有所提高，结果见表1。

表1 发酵前后豆粕的氨基酸质量组成

实施例7

实验在中国海洋大学实验基地进行，使用实施例5制备的发酵豆粕作为原料，分别替代现有的全鱼粉大菱鲆饲料中30wt％，45wt％，60wt％的鱼粉中的蛋白(全鱼粉大菱鲆饲料组成见表2)，制成等氮等能的饲料进行63天养殖实验，结果如表3-表5。实验前，先将幼鱼用商业饲料(七好生物科技有限公司)暂养2周以适应养殖环境。实验所采用养殖桶(总体积400L，水体体积300L)均为玻璃纤维桶。养殖所用海水为沙滤水，采用循环流水系统，每桶进水量为1.0L/min。实验期间水温控制为19-22℃，盐度为28.5-32‰，溶氧维持在7mg/l左右。

实验正式开始前，大菱鲆禁食24h。选择大小均匀(8.53±0.01g)、体格健壮的大菱鲆幼鱼，随机分配于12个养殖桶(4个试验处理组，每组3个重复)，每桶30尾。

每天早晚投饵2次(08:30和18:30)，至饱食水平(鱼儿不再进食，水桶底部出现残饵，可分2轮进行投喂)，投喂结束后30min，换水70％左右，排除残饵。记录每天的摄食量，如有死鱼记录数量并称重，监测海水温度、盐度和溶氧变化。

特定生长率(SGR)＝(Ln末重-Ln初重)×100/饲喂天数

成活率(SR)＝100×(实验结束时活鱼数/实验开始时活鱼数)

摄食率(FI)＝消耗的饲料(g)/(((鱼体末重+鱼体初重)/2)×饲喂天数)

饲料效率(FER)＝鱼体湿增重(g)/采食干饲料重(g)

蛋白质效率(PER)＝鱼体湿增重(g)/采食蛋白量(g)

净蛋白利用率(PPV)＝(鱼体末重×实验结束时鱼体蛋白含量—鱼体初重×初始鱼体蛋白含量)/(采食干饲料重×饲料蛋白含量)

肝体比(hepotasomatic index，HSI)＝肝重/体重×l00

脏体比＝100×内脏团重/体重；

肝脏肥满度CF(condition factor)＝100×(live weight,g)/(body length，cm)³

表2 全鱼粉大菱鲆饲料质量组成(单位为g)

实验饲料配方及化学成分分析见表2。配制饲料前，所有原料必需经过粉碎，过80目筛。将所有粉碎好的饲料原料按表2饲料配方混合均匀，然后再加入鱼油和大豆卵磷脂，于V型立式混合机(上海天祥V-0.5型)中混合均匀，最后再加入蒸馏水形成硬团，用6mol/L NaOH溶液调整饲料pH至7.0-7.4，于单螺杆制粒机中制粒，制3mm粒径的饲料。全自动渔用饵料机(260，山东威海友谊机械厂)中将饲料挤压成直径3mm粒径的颗粒，在50℃恒温下干燥12h，干燥颗粒置-20℃冰箱备用。

表3 发酵豆粕替代鱼粉后对大菱鲆生长指标的影响

表4 发酵豆粕替代鱼粉后对大菱鲆饲料利用情况的影响

表5 发酵豆粕替代鱼粉后对大菱鲆体组成的影响

实验表明30wt％和45wt％替代组的大菱鲆存活、末体重、特定生长率、肝体比，脏体比和肥满度与鱼粉对照组(鱼粉添加量60wt％)相比均无显著差异；60wt％替代组的存活率、肝体比、脏体比和肥满度与鱼粉对照组相比没有显著差异，但是末体重和特定生长率与鱼粉对照组相比显著下降，饲料饲料系数显著升高；实验组和对照组的鱼体常规组成没有显著差异。从而证明本发明的发酵豆粕可以有效的替代大菱鲆饲料中的鱼粉。

试验数据以平均值±标准差(X±SD)表示，试验结果用SPSS16.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)分析，当差异显著时(P<0.05)，进行Tukey多重比较。上述表中数据后面不同的字母表示有显著差异，没有字母标识表明没有显著差异。

此实验结果中，用本发明的发酵豆粕替代鱼粉蛋白后，并没有影响大菱鲆的存活率和摄食率，表明大菱鲆幼鱼对本实验条件下的饲料和养殖条件较为适应。初体重没有显著差异的大菱鲆幼鱼在投喂实验组饲料63天后，生长略微下降，但是30wt％和45wt％替代组仍显示出末体重和特定生长率并未与对照组出现明显的差异，然而60wt％组的末体重和特定生长率却显著下降，显示此发酵豆粕蛋白不能过高的替代饲料中的鱼粉；另外，我们还分析了鱼体肝体比，脏体比以及肥满度，借以反映替代后是否会影响鱼体的组织器官，统计学分析结果显示各实验组并没有与对照组出现显著差异。

随着替代比例的升高，大菱鲆鱼体水分，粗蛋白，粗脂肪，粗灰分与鱼粉对照组相比没有显著差异，说明发酵豆粕蛋白替代后饲料对鱼体常规组成没有影响。

综合上述指标，表明在不影响生长的情况下本发明的发酵豆粕可以有效的替代大菱鲆饲料中的鱼粉。

Claims

1.一种发酵豆粕，其特征在于所述发酵豆粕按如下方法制备：(1)将豆粕浸泡在营养液中制成发酵基质；所述营养液终浓度组成为：K₂HPO₄ 1-8g/L、NaCl 1-6g/L、(NH₄)₂SO₄ 2-6g/L、葡萄糖1-7g/L，溶剂为水；

(2)将泡盛曲霉经扩大培养获得的泡盛曲霉孢子接种至发酵基质中，在温度20～50℃、湿度85-100％条件下发酵培养30～60h，取出培养物干燥，粉碎，获得发酵豆粕。

2.如权利要求1所述发酵豆粕，其特征在于步骤(1)中营养液的体积用量以豆粕重量计为0.5-0.7ml/g。

3.如权利要求1所述发酵豆粕，其特征在于步骤(1)中营养液终浓度组成为：K₂HPO₄ 1-4g/L、NaCl 1-2g/L、(NH₄)₂SO₄ 2-5g/L、葡萄糖1-3g/L，溶剂为水。

4.如权利要求1所述发酵豆粕，其特征在于步骤(2)泡盛曲霉孢子接种前先将发酵基质在100℃条件下灭菌10-30min。

5.如权利要求1所述发酵豆粕，其特征在于步骤(2)中所述泡盛曲霉扩大培养方法为：将泡盛曲霉接种至PDA培养基，在28℃培养3天，获得斜面菌体；将斜面菌体接种至种子培养基，在25-30℃培养2-3天，获得扩大培养后的泡盛曲霉孢子；所述种子培养基终浓度组成为：麸皮1000g/L、豆粕200g/L，溶剂为水，pH自然。

6.如权利要求1所述发酵豆粕，其特征在于步骤(2)中泡盛曲霉孢子按如下方法接种：将扩大培养后的泡盛曲霉孢子用无菌水冲洗，收集泡盛曲霉孢子，将泡盛曲霉孢子用无菌水配制成孢子悬液，按照每千克豆粕干重接种1.5g-5g孢子湿重的比例，将孢子悬液接种至发酵基质中。

7.如权利要求1所述发酵豆粕，其特征在于步骤(2)中发酵培养是在温度25～30℃、湿度90-100％条件下发酵培养30-50h。

8.一种用于制备权利要求1所述发酵豆粕的泡盛曲霉strain42(Aspergillus awamori strain42)，所述泡盛曲霉strain42保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2015155，保藏日期为2015年3月24日，保藏地址为中国武汉武汉大学，邮编430072。

9.一种权利要求1所述发酵豆粕在制备肉食性鱼类饲料添加剂中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述发酵豆粕在肉食性鱼类饲料中的质量添加量为30％～60％。