CN101701194A - 一种泡盛曲霉菌株发酵生产纤维素酶和多肽蛋白饲料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种泡盛曲霉菌株发酵生产纤维素酶和多肽蛋白饲料的制备方法。曲霉属中的泡盛曲霉1042-2菌，CCTCC M209142。步骤是：A.菌种筛选；B.菌种鉴定；C.菌种活化；D.种子液的培养；E.固体发酵；F.后处理。经泡盛曲霉1042-2菌接种于固体培养基上发酵后所得固态培养物，经烘干干燥，粉碎，过筛，并检测酶活和多肽蛋白含量。方法可行，工艺简单，生产的纤维素酶粉剂酶活单位CMC法为31397.1～41826.7U/g和FPA法为1779.3～2212.1U/g；生产的多肽蛋白饲料蛋白质达35％以上。制剂稳定性好，易于大批量生产。将用于棕榈仁粕、其它粕和植物纤维的发酵，可生产生物饲料、生物肥料、生物燃料以及用于食品、化工和医药等行业。利用该菌种发酵产生的多肽蛋白饲料可用于各种饲料的蛋白添加剂。

Description

一种泡盛曲霉菌株发酵生产纤维素酶和多肽蛋白饲料的制备方法

技术领域

本发明涉及微生物制品领域，更具体涉及一种高产纤维素酶的泡盛曲霉菌株，同时还涉及泡盛曲霉菌株发酵生产纤维素酶和多肽蛋白饲料的制备方法。该菌株适用于农林植物的纤维素降解，生产出燃料乙醇、生物饲料、生物肥料、食品、环境治理、纺织服装、化工医药等行业。

背景技术

纤维素酶是一种在分解纤维素时能起催化作用的酶，它广泛存在于真菌、细菌和动物等生物体内。目前，主要应用真菌发酵产生纤维素酶，所用菌株属木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)。纤维素酶难于纯化。实际应用时多为混合酶类。它主要用于食品工业、环境行业、酿造业、饲料工业、纺织服装业、医药业、造纸、日用化工、工业洗涤、烟草、石油开采等各个领域，其应用前景十分广阔(高伦江等，2007)。2007年12月，美国总统布什签署了《2007年能源独立和安全法案》，该法案要求到2020年美国至少年产360亿加仑的可再生燃料，这几乎是现在的5倍。其中以农业废弃物、木屑和牧草等植物纤维素制造的生物燃料要占到160亿加仑，占总量的44.44％。

据美国《技术评论》评出2008年最激动人心的技术中，纤维素酶技术名列前茅。因为纤维素酶可以将全世界产生的植物体纤维[约为1.55×10¹¹吨干物质，其中纤维素和半纤维素约为0.85×10¹¹吨，我国有农林植物纤维及工业性纤维15亿吨(张健泉等，2003；赵林果等，2007)]降解成单糖、寡糖等。且可供微生物利用，转化为燃料、食品、饲料、药品、化工原料等无疑解决了人类能源、粮食、资源和环境危机的重要途径(Duff STB.1966)。

纤维素酶根据其催化反应功能的不同可分为1，4-β-D-glucanophydrolase或endo-1，4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4(内切葡聚糖酶)，1，4-β-D-glucanase cellobilhydrolase或exo-1，4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91(外切葡聚糖酶)和β-1，4-glucosidase，EC3.2.1.21(β-葡萄糖苷酶)。内切葡聚糖酶随机地在纤维素分子内部酶切β-1，4糖苷键；外切葡萄糖酶能从纤维素分子的还原或非还原端切割糖苷键，生产纤维二糖；纤维二糖经β-葡萄糖苷酶(纤维二糖酶)酶切成为单个的葡萄糖分子。只有在这三种酶的协同作用，最终才能将纤维素酶降解成葡萄糖。微生物特别是真菌能产生这类复合酶。从而将纤维素大分子降解为葡萄糖小分子为自己或其他微生物利用(刘树立等，2007；杨永彬等，2004)。

纤维素酶主要来源于植物、动物和微生物。纤维素酶广泛存在于植物中，在植物发育的不同阶段发挥着水解细胞壁的作用，如果实成熟、蒂柄脱落等过程。但在植物中提取纤维素酶比较困难，且含量不高。1924年，cleveland提出食木性的节肢动物和食草性动物之所以以植物为食料，是因为其体内含有大量的可以水解纤维素的共生菌的缘故。1963年，marshall等检测到蜗牛体内含有纤维素酶。Scrivener等发现蟑螂的中胸和前胸有纤维素酶的存在。1998年，Smant等和Watanabe等用分子生物学的方法，从植物线虫和蚂蚁中分别获得β-1，4-葡萄糖苷酶的DNA，从而进一步证明了动物体内确实存在内源性纤维素酶。但利用动物生产纤维素酶是极其困难的。

根据不完全统计，20世纪60年代以来，国内外共记录了产纤维素酶的菌株大约有53个属的几千个菌株。由放线菌产纤维素酶的产量最低，所以很少研究。细菌产纤维素酶产量也不高，且为胞内酶，生产难度很大，所以工业是很少用细菌作为生产菌种。目前，在工业化生产纤维素酶的菌株主要为丝状真菌，其中酶活力较强的菌株为木霉、曲霉、根霉和青霉。以木霉属和曲霉属中最多，如里氏木霉、绿色木霉、康氏木霉、黑曲霉。现已制成制剂的有绿色木霉、黑曲霉、镰刀霉、拟青霉和斜卧青霉等生产的纤维素酶(高伦江等，2007)。

为了获得高产纤维素酶的高产菌株，国内外科学家花费了大量时间、智慧和金钱进行高产纤维素酶菌株的筛选和研究。1909年，Dale，Eligabeth；1926年，Thom，C等研究了曲霉属中的Asperillius菌。在中国，1921年胡先骕，以及戴芳澜、魏景超、俞大绂等学者相继发表研究论文，并在高等院校开设真菌学课程。在抗日战争中，武汉大学赵学慧先生于1942～1945年采样、筛选Aspergillius(麴菌属即曲霉属)中63株菌；研究了它们的形态结构、生长特性、来源、产色等特征，并进行了分类。这可能是我国系统研究曲霉属菌最早的论文(华中农业大学食品微生物研究室，2008.)。但真正将微生物与纤维素酶联系在一起的仍是上世纪60～70年代的事，当时只是为了解决养猪等饲料缺乏而分离筛选高产纤维素酶菌株来发酵青贮植物茎叶等，制作成可供猪、牛等食用的饲料。中国科学院武汉微生物所(现武汉病毒所)组织了十多人的攻关小组，研究纤维素酶发酵饲料，但因难度太大而不能继续。随着现代生物科学和生物技术的发展，从上世纪90年代开始，筛选高产纤维素酶菌株和诱变育种高产纤维素酶菌株，以及发酵生产纤维素酶有了突破性进展，在近十年已有商品纤维素酶出售。

为了生产出高质量的纤维素酶产品，除自然筛选获得的产纤维素酶菌株外，许多研究者引进产纤维素酶菌株，经紫外线、γ射线、亚硝基胍等进行诱变，其中木霉NT-15突变株固体培养物经轻工业部食品质量监督检测中心南京站检测表明，滤纸酶活3670U/g，C-1酶活24460U/g，Cx酶活1800U/g，已达到国际先进水平(王家林，1996)。张苓花等(1998)用硫酸乙酯和紫外光复合诱变康氏木酶W-925菌，获得了诱变菌株Wu-932株，CMC酶活达2975U/g和滤纸酶活达到531U/g，比出发菌株分别提高了100％和51％。胡婷婷、邱雁临(2008)以绿色木酶为出发菌株，经原生质体紫外光诱变，获得突变菌株UVT12，其CMC酶活达到1020.24U/g，比出发菌株提高了124.3％。在我国，董志杨等(2001)、冯培勇等(2008)、张秋民(2008)、屈二军(2008)、刘春芳(2008)、兰时乐(2007)、邱向峰(2006)等都将原产纤维素酶的菌株进行物理、化学及二者结合的诱变，筛选到高产纤维素酶的突变株。

在纤维素酶的生产中，可进行液体发酵和固体发酵两种方法。但液体发酵产生的酶活不如固体发酵的酶活高。段金柱、曹淡君(2000)研究结果显示，固体发酵产率(FPA 742～827U/g)比液体发酵产率(640～663U/g)高25％。并且液体发酵利用植物纤维的数量较少，影响下一步菌株发酵产生生物燃料乙醇、蛋白质、脂肪、有机酸等产品。因而目前的纤维素酶发酵多采用固体发酵的生产方法。我国固体发酵历史悠久，其源头可追溯到几千年以前。固体发酵用途很广，如危险化合物的生物修复与降解、工农业废渣的生物脱毒，富集蛋白质生产动物饲料、生物制浆、农作物的综合管理及利用、生产食用真菌和生物燃料、生产生物杀虫剂和代谢产品的生产(抗生素、生长素和酶)。在固体发酵和液体发酵生产相同产物的比较中发现，前者生产的β-葡萄糖酶含有17％的木聚糖酶，而后者只有12％，约下降30％；又如前者生产的半乳糖醛酸酶大约含有90％的果胶酯酶，而相同的菌株用液体发酵仅产有10％的果胶酯酶(吴振强，2006；汪世华等，2006)。

蛋白质饲料主要指饲料中自然含水量小于45％，干物质中粗纤维含量小于18％，而干物质中粗蛋白质含量大于或等于20％的一类饲料为蛋白质类饲料。粗蛋白质含量越高的蛋白质饲料在市场上具有更大的竞争力。

蛋白饲料又分为植物蛋白饲料、动物蛋白饲料和单细胞蛋白质(缩写SCP)饲料。植物类蛋白饲料主要是指大豆粕、棉籽粕、菜籽粕、花生粕、芝麻粕等高蛋白植物原料；动物性蛋白质饲料主要指来自水产品、肉类、乳和蛋品加工副产品，及屠宰厂和皮革厂的废弃物及缫丝厂的蚕蛹等，如鱼粉、肉骨粉、羽毛粉、血粉等高蛋白动物原料；单细胞蛋白是指大规模培养细菌、酵母菌、霉菌、藻类和担子霉获得的微生物蛋白(或菌体蛋白)，是食品工业和饲料工业的重要蛋白质来源。与豆粉相比，单细胞蛋白的蛋白质含量高出10％～20％，可利用的氮高出20％，在有蛋氨酸添加时可利用氮达95％以上，富含多种维生素。

市场需求量的持续增大和饲料源的短缺加剧了市场的供需矛盾。据专家测算，目前，我国饲料工业能量饲料短缺3000万吨；蛋白饲料短缺则更为严重，按我国人均月摄入25克动物蛋白质换算成畜禽精饲料蛋白质计，13亿人口一年需要3700万吨蛋白，以蛋白饲料(粗蛋白含量为43％)计算相当于我国全年约需8600万吨蛋白饲料，但由于能量类精饲料能提供约10％粗蛋白，因此我国全年需植物蛋白饲料和动物蛋白饲料为6000万吨以上，但我国目前的蛋白饲料供应量只有不到3000万吨，其蛋白饲料缺口相当的大。

在动物蛋白饲料方面，虽然有鱼粉、血粉、肉骨粉、蹄甲羽毛粉等多种蛋白源，但由于生物安全问题，动物蛋白饲料以鱼粉为主，而我国自产鱼粉不足10万吨，大量鱼粉靠进口，是世界鱼粉最大的消费市场，实际使用鱼粉量占全球水产饲料鱼粉使用总量的近50％。近年来，受全球渔业自然资源衰退的影响，世界鱼粉产量逐年下降。而目前，我国水产饲料中鱼粉的使用比例偏高(普通淡水鱼饲料鱼粉占10％左右，淡水名特优种类和海水鱼虾类饲料的鱼粉比例超过50％)，且浪费现象较为严重。以大菱鲆饲料为例，国产饲料中鱼粉用量比欧洲高20％。日益下降的世界鱼粉资源与日益短缺的供给市场造成动物蛋白饲料成本的上升。

在植物蛋白饲料源方面，国内蛋白粕年产量超过4500万吨，其中豆粕产量超过2928万吨，花生粕产量近300万吨。由于花生粕中氨基酸组成欠佳，易染黄曲霉产黄曲霉毒素等，使花生粕的饲用量也受到一定限制；菜籽粕中含有硫葡萄糖甙、芥酸等有毒物质，使得菜籽饼粕的应用受到了很大的限制，大多用作肥料，用于饲料的还不足30％；棉籽粕中含有棉酚等有毒物质，可造成动物生长受阻、生产能力下降、贫血、呼吸困难、繁殖能力下降甚至不育，严重时可造成死亡。因此，棉籽饼(粕)在饲料中的添加量很少，一般为3％～4％；所以植物蛋白饲料源以大豆粕主。虽然我国是豆粕的生产大国，豆粕产量位于美国之后，居世界第二位，但随着饲料工业对蛋白粕的需求增大，1996年以后，我国已成为大豆粕净进口国。

巴西、阿根廷由于国内豆粕消费量较小，所产豆粕大部分用于出口。巴西自七十年代初取代美国成为世界头号豆粕出口大国后，年出口量稳步上扬。九十年代以来，阿根廷豆粕出口量异军突起，1998年以后出口量超过巴西，居世界首位。美国豆粕尽管年产量位于世界首位，但由于国内豆粕消费量大，出口量仅占其总产的1/5左右。同出口国的相对集中不同，豆粕进口国比较分散，欧盟、中国和美国是全球豆粕的三个主要消费市场，2008/09年度，欧盟的豆粕消费量比较稳定，在3250-3400万吨之间；美国是全球最大的豆粕生产国，也是全球较大的豆粕消费国，全年的消费量在2900-3100万吨之间；印度全年豆粕总用量为210万吨；日本、韩国和东盟等其他亚洲各国的豆粕进口量近年来也保持了强劲的增长势头。由于全球豆粕市场需求以两位数的增长，而2008年度的豆粕产量相对于2007年度增加量却只有0.8％。据联合国粮农组织(FAO)统计，在20世纪末，全球的纯蛋白质短缺量约为2500万吨，折合成蛋白饲料(粗蛋白含量为40％)约为6300万吨。全球畜牧业已经过10年的快速发展，其蛋白饲料的缺口更大。(注：以上数据来源于国家统计局、中国畜牧工业信息网、中国海关、商务部、银河期货跟踪统计、美国农业部、联合国粮农组织(FAO)、德国《油世界》。)

本产品多肽蛋白饲料是以PKC为基料，通过霉菌、酵母和细菌共同发酵的方法，降低PKC中粗纤维含量来增加其作为动物饲料的适口性；提高蛋白含量达40％及其以上，并将植物蛋白转化为菌体蛋白，改善其氨基酸组成、增加蛋白质的消化吸收和利用率；水解蛋白为多肽，增加动物对饲料中的氨基酸的利用和蛋白质的转化。同时，饲料中含有酵母、芽孢杆菌等益生菌和纤维素酶、蛋白酶等有益物质。21世纪是“多肽”世纪。“多肽”是生命科技发展产物，“多肽、蛋白饲料”产品的开发是养殖业的福音，将推动饲料工业高效发展。《发酵棕榈仁粕(PKC)制备多肽饲料的研究》项目是一项填补世界棕榈仁粕利用技术的空白，降低了PKC中的粗纤维，提高蛋白质和多肽的含量。产品中蛋白质含量高，特别是蛋白质被水解成活性多肽，生物吸收快，生物利用率高，生物效价高，饲料报酬高。具有促生长未知因子、调节免疫、防病抗病等作用。饲用范围广，市场空间巨大。

世界油棕榈收获面积有950多万公顷，马来西亚有约400万公顷，印度尼西亚约为400万公顷，我国约有5万公顷。马来西亚油棕榈果约为7600万吨，约占世界产量的40％以上；印尼油棕榈产量约为6500万吨，约占世界产量的35％以上；我国产量只有70万吨，约占总产量的0.4％。油棕果经过加工去油后，剩下大量的油棕榈仁粕(即PKC)。在马来西亚和印度尼西亚等东南亚国家产生大量的PKC，每年约为320万吨以上。由于PKC含有木质纤维素及其纤维长和粗，适口性较差，难于配制成动物饲料(谢龙，2007；中马两个棕榈油业的合作建议，2007)。因而需要将PKC经丝状真菌发酵产生纤维素酶，另外由于纤维素酶对其进行酶切降解成单糖或者寡糖，供其他微生物如酵母和枯草芽孢杆菌等利用，可用来生产多肽蛋白饲料。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种高产纤维素酶的泡盛曲霉菌株，其菌号为1042-2。该菌能在广大植物纤维作为唯一的碳源基料(特别是PKC)中良好生长，并且生长迅速，纤维素酶的产率高、酶活高。

本发明的另一个目的是在于提供了一种泡盛曲霉菌株发酵生产纤维素酶和多肽蛋白饲料的制备方法，本方法简单易行，适用于工业化生产。采用本方法生产纤维素酶产率高、酶活高。采用本方法生产多肽蛋白饲料产率高、多肽蛋白含量高。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

纤维素酶系是泡盛曲霉1042-2菌株产生的胞外酶，它可以酶解纤维素、半纤维素成单糖或者寡糖。将摇瓶培养和半自动发酵罐培养的液体种子接种于以PKC为主要碳源的固体培养基或液体培养基液中，控温控湿摇床培养，或固体浅盘发酵培养发酵生产高含量的纤维素酶制剂。国内外已有报道关于该酶的产生菌、发酵生产等技术，但未见从PKC中筛选的高产纤维素酶的菌株，以PKC为主要碳源的基质上发酵生产高含量纤维素酶和多肽蛋白饲料的制备技术。

用来生产本发明所述的纤维素酶和多肽蛋白饲料的菌种是本发明从棕榈粕中通过反复筛选获得的在有性阶段分类为子囊菌亚门(Ascomycotina)、不整囊菌纲(Plectomycetes)、散囊菌目(Eurotiales)、散囊菌科(Eurotiaceae)或在无性阶段分类为半知菌亚门(Deuteromycotina)、丝孢菌纲(Hyphomycates)、丝孢目(Hyphomycatales)、淡色菌科(Moniliaceae)的曲霉属(Aspergillus)的菌株。其具有高产纤维素酶的能力，该菌株已于2009年7月13日经中国典型培养物保藏中心保藏，菌株编号为CCTCCNO：M209142。

该菌株经活化，斜面培养产生分生孢子，以分生孢子接种于液体摇瓶培养基中(土豆汁液体培养基)，培养24～100小时，接种于以棕榈粕为主要碳源(其他碳源包括少量的麸皮)的固体发酵培养中，于控温室(20～45℃)中培养发酵，使之生长，代谢产生纤维素酶。经冷冻干燥后，进行后处理，获得的酶活单位CMC法31397.1U/g和FPA法1779.3U/g。

菌种如前所述，本发明使用的菌种1042-2在有性阶段分类为子囊菌亚门(Ascomycotina)、不整囊菌纲(Plectomycetes)、散囊菌目(Eurotiales)、散囊菌科(Eurotiaceae)或在无性阶段分类为半知菌亚门(Deuteromycotina)、丝孢菌纲(Hyphomycates)、丝孢目(Hyphomycatales)、淡色菌科(Moniliaceae)的曲霉属(Aspergillus)中的泡盛曲霉(Aspergillus awamori 1042-2)。已于2009年7月13日经中国典型培养物保藏中心保藏，菌株编号为CCTCC NO：M209142，是高产纤维素酶的新菌株。

一种泡盛曲霉菌株的制备方法，其步骤如下：

1.菌种筛选。从采集的土样、树枝叶(柏树、松树、棕榈树等)腐烂样、棕榈粕样共70个，经过五种(PDA、CMC-Na、CMC-Na+刚果红、PKC+刚果红、牛肉膏蛋白胨)不同培养基的分离纯化和鉴别处理，获得146株丝状真菌。经CMC-Na+刚果红法、PKC+刚果红法和滤纸条法筛选出19株有效菌株(筛选过程见附图1)。再经过进一步的CMC-Na+刚果红和PKC+刚果红培养基培养，根据水解圈大小选出9株产纤维素较高的菌株，再用摇瓶培养发酵液检测其CMC酶活和FPA酶活选出3株高产纤维素的菌株。3～5次土豆培养液摇瓶发酵测定其生物量和PKC液体培养测定其产纤维素酶的动力学研究，最终选出三株高产纤维素酶的菌株，菌株编号分别是1042-2、2221-P和13005。其中1042-2和2221-P为申请人新筛选的菌株，13005为申请人保存菌株，属于康宁(氏)木霉(trichodorma koningii)。

2.菌种鉴定。通过菌种生长特性、菌丝体发育及光学显微镜、电子扫描镜的形态观察、产色、产酶动力学和18SrDNA分子生物学等鉴定得1042-2在PDA平板上，菌丝初为白色、绒毛状，向四周辐射稀疏生长；渐变为黄灰色，菌落则异常厚密，随后，菌落又褐色变为棕红褐色或深咖啡色；分生孢子棕红褐色或深咖啡色、数量极多，分生孢子窝头状、有一开口、外有刺，分生孢子直径为3.5μm；分生孢子橞，外壳破裂，露出串状分生孢子和成熟分生孢子(图像资料如附图4)；将1042-2鉴定为曲霉属(Aspergillus)的泡盛曲霉(Aspergillus awamori，1042-2)。已于2009年7月13日经中国典型培养物保藏中心保藏，菌株编号为CCTCC M209142，是高产纤维素酶的新菌株。

3.菌种活化。用含有0.01～0.10％(体积比)吐温-80无菌水将孢子制成菌悬液。用微移液器吸0.5ml孢子悬浮液于PDA培养基的平皿中在20～45℃培养24～100h，产生孢子。

4.1042-2菌株种子液的培养。将活化好的菌种用0.01～0.10％(体积比)吐温无菌水洗成孢子悬浮液，按5～20％(质量比)的接种量接种于PKC液体培养基中，该培养基为2～15％(质量比)的PKC、0.1～0.4％(质量比)蛋白胨、0.1～1.0％(质量比)葡萄糖、0.1～0.5％(质量比)硫酸铵，pH 5.5～7.5。将接种的摇瓶置于控温摇床20～35℃，220rpm培养24～100h得1042-2菌株种子液。

5.固体发酵。固体培养基是以PKC(购买于马来西亚)为基本碳源基质，具体配方是经高温150～300℃一定湿度20～60％膨化的PKC粉75～90％、大豆粕2～10％、麸皮2～10％、葡萄糖0.4～2.0％、蛋白胨0.4～2.0％、硫酸铵0.1～0.6％、碳酸钙0.1～0.5％，料∶水＝1∶1.0～2.5，pH4～8。先将PKC粉、大豆粕、麸皮和碳酸钙按量称重，干抖匀，加水再抖匀，分装于布袋中在高压灭菌锅中115～126℃灭菌15～40min时，再闷1～2h；将上述固体培养基配方中的其它原料(葡萄糖、蛋白胨、硫酸铵)按量称好，加固体培养基10～50％水配制成悬浮液，115℃灭菌20～30min，冷却至40～50℃待接种用。将灭菌好的固体料置于无菌培养室内，待冷却至40～50℃时，接种液体种子和葡萄糖等悬浮液，液体种子接种量按固体培养基量的5～20％接种并拌匀，最终，培养基的固体料∶液体水＝1∶1.0～2.5，液体为拌干料的水，菌种子液和葡萄糖的悬浮液的总量，将接种好的固体料分装于浅盘内，厚度1～10cm，浅盘底层用无菌棉布铺垫，料上面再用无菌棉布遮盖，在无菌培养室中保温20～45℃和保湿RH40～90％培养2～12天，培养48小时后每天取样检测纤维素酶活。

6.后处理。经泡盛曲霉1042-2菌接种于固体培养基上发酵后所得固态培养物，经20～120℃烘干干燥，干燥后经粉碎，过50～200目筛，并检测酶活。该制剂是为黄褐色至酱色或黑色、疏松、润滑、无异味，检测酶活可达CMC法31397.1～41826.7U/g和FPA法1779.3～2212.1U/g。

一种泡盛曲霉菌株发酵生产多肽蛋白饲料的制备方法，其步骤如下：

A.菌种筛选：从采集的土样、树枝叶腐烂样、棕榈粕样，经过五种不同培养基的分离纯化和鉴别处理，获得146株丝状真菌，经CMC-Na刚果红法、PKC刚果红法和滤纸条法筛选出菌株，再经过进一步的CMC-Na刚果红和PKC刚果红培养基培养，根据水解圈大小选出9株产纤维素的菌株，再用摇瓶培养发酵液检测其CMC酶活和FPA酶活选出高产纤维素的菌株，3～5次土豆培养液摇瓶发酵测定其生物量和棕榈仁粕液体，选出三株高产纤维素酶的菌株，菌株编号分别是1042-2、2221-P和13005；

B.菌种鉴定：通过菌种生长特性、菌丝体发育及光学显微镜、电子扫描镜的形态观察、产色、产酶动力学和18SrDNA分子生物学等鉴定得1042-2在PDA平板上，菌丝初为白色、绒毛状，向四周辐射稀疏生长；渐变为黄灰色，菌落则异常厚密，随后，菌落又褐色变为棕红褐色或深咖啡色；分生孢子棕红褐色或深咖啡色，分生孢子窝头状、有一开口、外有刺，分生孢子直径为3.5μm；分生孢子橞，外壳破裂，露出串状分生孢子和成熟分生孢子，鉴定为曲霉属的泡盛曲霉；

C.菌种活化：用含有0.01～0.10％体积比吐温-80无菌水将孢子制成菌悬液，用微移液器吸0.5ml孢子悬浮液于PDA培养基的平皿中在20～45℃培养24～100小时，产生孢子；

D.1042-2菌株种子液的培养：将活化好的菌种用0.01～0.10％体积比吐温-80无菌水洗成孢子悬浮液，按5～20％质量比的接种量接种于液体培养基中，该培养基为5～15％质量比的PKC，0.1～0.4％质量比蛋白胨，0.5～1.5％质量比葡萄糖，0.1～0.5％质量比硫酸铵，pH 4～8，将接种的摇瓶置于控温摇床，20～45℃，220rpm培养24～100h；

E.固体发酵：固体培养基是以PKC为基本碳源基质，具体配方是经高温150～300℃湿度20～60％膨化的PKC粉75～90％、大豆粕2～10％、麸皮2～10％、葡萄糖0.4～2.0％、蛋白胨0.4～2.0％、硫酸铵0.1～0.6％、碳酸钙0.1～0.5％，料∶水＝1∶1.0～2.5，pH4～8，先将PKC粉、大豆粕、麸皮和CaCO₃按量称重，干拌匀，加水再拌匀，分装于布袋中在高压灭菌锅中115～126℃灭菌30min时，再闷1～2h；将上述固体培养基按量称好，加固体培养基10～80％水配制成悬浮液，115℃灭菌20～30min，冷却至40～50℃待接种用，将灭菌好的固体料置于无菌培养室内，待冷却至40～50℃时，接种液体种子和葡萄糖等悬浮液，液体种子接种量按固体培养基量的5～20％接种并拌匀，最终，培养基的固体料∶液体水＝1∶1.0～2.5，液体为拌干料的水，菌种子液和葡萄糖的悬浮液的总量，将接种好的固体料分装于浅盘内，厚度1～10cm，浅盘底层用无菌棉布铺垫，料上面再用无菌棉布遮盖，在无菌培养室中保温20～45℃和保湿RH40～90％。培养24～72小时，按固体培养基量的5～20％接种已在PDA培养基培养好的酵母种子液，培养24～72小时，按固体培养基量的5～20％接种已在牛肉肉汤培养基培养好的枯草芽孢杆菌种子液，继续培养直到预定时间，整个培养3～12天；

F.后处理：经泡盛曲霉1042-2菌株接种于固体培养基上发酵后所得固态培养物，经20～120℃烘干干燥，干燥后经粉碎，过50～200目筛，并检测多肽蛋白含量。

由此，申请人以PKC为底物，经过科学的系统的研究分离筛选到一株泡盛曲霉1042-2菌能高产纤维素酶的菌株，经鉴定为：在有性阶段分类为子囊菌亚门(Ascomycotina)、不整囊菌纲(Plectomycetes)、散囊菌目(Eurotiales)、散囊菌科或在无性阶段分类为半知菌亚门(Deuteromycotina)、丝孢菌纲(Hyphomycates)、丝孢目(Hyphomycatales)、丛梗孢科的曲霉属(Aspergillus)中的泡盛曲霉(Aspergillus awamori1042-2)。并经固体发酵，测定其制剂的CMC酶活高达31397.1～41826.7U/g，FPA酶活高达1779.3～2212.1U/g。这为工业生产纤维素酶奠定了良好的基础。

本发明具有以下优点和效果：具有自主知识产权的高产纤维素酶的新菌株，用于培养发酵，工艺简单，成本低和制剂性能稳定黄褐色至酱色、疏松、润滑和无异味，适合于大批量生产。该制剂的CMC酶活高达31397.1～41826.7U/g和FPA酶活高达1779.3～2212.1U/g以上(详悉数据见附表1)。经用该制剂发酵PKC为主要碳源的基质，同时接种酵母菌和Bacillus Subtilis可生产出多肽蛋白最高含量高于40％，其中多肽含量高于80％的多肽饲料，将有良好的市场前景。

表1 1042-2菌株5批固体发酵所得酶制剂的CMC酶活、滤纸酶活和还原糖

注：表1中“1042-2¹”表示1042-2第一批发酵，“1042-2²”表示第二批发酵，其余类推。

附图说明

图1菌种分离筛选流程示意图

图1显示的是本发明的菌株分离筛选流程。从不同的地点、不同的样品来源(土样、枯枝烂叶、棕榈迫等)中共采集到70个样品。后经过CMC-Na、CMC-Na+刚果红、PKC+刚果红、牛肉膏蛋白胨、PDA等5中培养基将富集后的样品划线分离。经过反复多次的分离纯化，共获得真菌146株，并扩大斜面保存。用CMC-Na刚果红法、PKC+刚果红法和滤纸条崩溃法等三种方法平行筛选，根据水解透明圈大小和滤纸条崩溃腐烂程度等指标选出有效菌株19株，有效得率为13％。将这19株菌以4中不同方法预处理的PKC为唯一碳源，在其液体培养基中发酵，检测发酵液的CMC酶活和FPA酶活，从中选择213-B、623-2、912-2、1042-2、1633、2221-P、6612、6922和13005作为下轮的筛选菌株。以PKC为唯一碳源，以发酵产纤维素酶酶活和发酵液中还原糖含量等指标，从9株菌中筛选出3株高产纤维素酶及发酵性能好的菌株1042-2、2221-P和13005。其中，13005(康氏木霉)为申请人保藏的菌株。对1042-2和2221-P两菌进行分类鉴定，经菌株生长特性、菌落发育及形态结构观察、产色、产酶动力学和18SrDNA分子生物学鉴定，将1042-2分类鉴定为泡盛曲霉(Aspergillus awamori，1042-2)。为了更好的利用该菌，对固体发酵试验进行研究，经以PKC为基本碳源的固体发酵，获得菌剂为黄褐色至酱色或黑色，疏松、润滑、无异味，检测得CMC酶活31591.7～40916.3U/g和FPA酶活1768.3～2200.7U/g以上。

图2 1042-2菌株CMC-Na-刚果红法水解圈图

图2为1042-2菌株在CMC-Na培养基上生长48h后用刚果红染色，再用氯化钠溶液脱色后所得水解圈图片。从图中可知，1042-2菌株脱色后都有明显的水解圈，并且水解圈直径较大，显示1042-2菌株能很好的利用CMC。

图3 1042-2菌株滤纸条法崩溃图

在图3中，右侧试管为对照样，左侧为样品管。从图中可知，1042-2菌株在滤纸条培养基中培养7天后，滤纸条有明显的变软、弯曲、折叠凳现象；培养液浑浊，长有大量菌体；液面及其以上滤纸条上长有大量菌落，并产生大量孢子。

图4 1042-2菌电镜扫描形态结构图

4-1菌丝初为白色、绒毛状，向四周辐射稀疏生长。

4-2分生孢子窝头状、有一方开口、外有刺，分生孢子直径平均为3.5μm。

4-3分生孢子橞，外壳破裂，露出串状分生孢子和成熟分生孢子。

具体实施方式

结合实施方案和实例对本发明作进一步的详细描述。实施中的技术方法，有些是参考了微生物学、微生物学实验技术方法、生物技术、生物工艺学、工业微生物学、真菌学及其分类学、酶学等的教材、资料和论文，有些是参照国家有关标准制定的方法，有些是我们自己创新的技术，如PKC的预处理和目的菌的筛选技术。下面进行实施方式详细描述。

实施例1：菌株的分离、纯化和筛选

A采样和富集：首先是采样，从采集到样品共70个，样品来自于土样，枯枝烂叶样(柏树、松树、棕榈树等)、PKC样、腐烂的植物茎叶样(竹叶、草等)等。采样后用无菌袋包装。置于0～4℃冰箱保存。其次是富集，用经挤压膨化和气爆两种方法预处理的PKC为唯一碳源，再配以无机盐配置成富集培养基，每试管装4ml，灭菌。经无菌试验后再接入1g样品，置于20～45℃，220r/min振荡富集培养5～7天。每种培养基接种重复一次，共280个培养管。

B菌株的分离纯化：a、分离，待富集培养后，每支试管均在PDA、CMC-Na+刚果红、PKC、PKC+刚果红、牛肉膏蛋白胨共5种培养基划线三个平皿，并每次设有对照皿，这样共划平皿5000个以上。并于20～35℃培养箱中培养3～5天。b、纯化，在划线分离培养的皿中，选择生长旺盛、有纤维素酶水解圈、有产生色素圈、形态和颜色等特殊的菌进行纯化。经2～6次反复纯化，获得146株菌。并以1×4的比例保存于PDA斜面培养基上。

C菌株筛选：一级筛选，所获得的146株菌均能在PKC作为唯一碳源的培养基中生长，但差异较大。将146株分别用CMC-Na+刚果红法、PKC+刚果红法和液体滤纸条法三种方法平行筛选，每处理重复三次，直到得到稳定可靠的结果，共用平皿2000多套。CMC-Na+刚果红法和PKC+刚果红法均为培养48h后，用刚果红染色，1mol/L的NaCl溶液脱色，记录水解圈透明圈并拍照。液体滤纸条法培养7天，看其菌生长情况及其对滤纸条浸蚀、崩溃和水解情况，记录并拍照。经过上述筛选，从146株菌中选出有效菌株19株，有效得率为13.0％；二级筛选，将一级筛选所获得的19株菌，通过发酵产酶试验和检测发酵液中还原糖含量等指标进行二级筛选。19株菌在经碱处理(1％氢氧化钠溶液)、高温蒸煮处理(115～200℃、0.5～1.5Mpa)、挤压膨化和气体膨化4种方法预处理的PKC液体培养基摇瓶发酵实验，检测其CMC酶活和FPA酶活，从中选出213-B、623-2、912-2、1042-2、1633、2221-P、6612、6922和13005作为下轮筛选的9株菌；三级筛选，通过二级筛选所获得的9株菌经以PKC为唯一碳源的培养基中，以发酵产纤维素酶酶活及其发酵液还原糖含量等指标进行三级筛选。纤维素酶酶活是以CMC酶活和FPA酶活来判别的，经过3～5重复试验，从中选出3株产纤维素酶含量高的菌株，他们编号为1042-2、2221-P和13005。其中1042-2和2221-P为新筛选菌株，13005为实验室保存菌株，属于康宁(氏)木霉(Trichodorma koningii)。1042-2发酵9天的CMC酶活和FPA酶活分别为2782U/ml和142U/ml，2221-P的CMC酶活和FPA酶活分别为1654U/ml和76U/ml，13005的CMC酶活和FPA酶活分别为1151U/ml和76U/ml。

实施例2：菌株分类鉴定

在分离筛选的过程中，就注意到1042-2菌株的培养生长特征、形态结构及产色等。除上述研究外，还增加了培养基利用，生物量和产酶动力学研究，电子显微镜和扫描电镜观察和18SrDNA的分子生物学鉴定，获得结果如下。

1042-2在PDA平皿培养基上，菌丝初为白色、绒毛状，向四周辐射稀疏生长；渐变为黄灰色，菌落则异常厚密，如图4-1；随后，菌落又褐色变为棕红褐色或深咖啡色；分生孢子棕红褐色或深咖啡色、数量极多，分生孢子窝头状、有一开口、外有刺，分生孢子直径为3.5μm，如图4-2；分生孢子橞，外壳破裂，露出串状分生孢子和成熟分生孢子，如图4-3。

通过以上研究及查阅(魏景超遗著，真菌鉴定手册，1979；戴芳澜遗著，真菌的形态学分类，1987；姚一建、李玉主译，菌物学概论(C.J阿罗素保罗等著)，2002；陆家云主编，植物病原真菌学，2004；中国食品发酵工业研究院，2008；中国科学院微生物菌种库，2009；辽宁省微生物菌种保藏中心，2007，2009；江南大学中国高校工业微生物资源数据库平台，2009；广东省微生物研究所微生物菌种保减中心，2009)等相关文献资料，鉴定1042-2在有性阶段分类为子囊菌亚门(Ascomycotina)、不整囊菌纲(Plectomycetes)、散囊菌目(Eurotiales)、散囊菌科(Eurotiaceae)或在无性阶段分类为半知菌亚门(Deuteromycotina)、丝孢菌纲(Hyphomycates)、丝孢目(Hyphomycatales)、淡色菌科(Moniliaceae)的曲霉属(Aspergillus)中的泡盛曲霉(Aspergillus awamori 1042-2)。

实施例3：固体发酵产酶试验

将三级筛选获得的1042-2、2221-P和13005三株菌经浅盘固体发酵产酶试验，浅盘固体培养基配方如发明内容所述。经试验，1042-2和2221-P两菌所产的CMC酶活和FPA酶活均比13005所产生的高，申请人选择1042-2和2221-P两菌进一步作浅盘发酵试验。检测结果平均为1042-2的CMC酶活为20331.3U/g，FPA酶活为1116.6U/g；2221-P的CMC酶活为23431.0U/g，FPA酶活为966.4U/g；13005的CMC酶活为6299.4U/g，FPA酶活为679.9U/g，经过综合评价和分析，将新筛选的1042-2和2221-P两株菌继续进行了试验。

实施例4：PKC预处理

由于木质纤维结构中的纤维素被木质素和半纤维素包裹着，为使微生物所产纤维素酶对纤维素有更多的接触位点，必须对PKC中木质纤维进行预处理，改变其晶体结构，让纤维素和半纤维素更多的暴露于环境中，使其更充分的被酶解成单糖或寡糖，供微生物利用。

预处理方法采用了碱处理、高温高压蒸煮处理、膨化处理、和汽爆处理共4种方法。经采用沉降性检测、颗粒度检测、显微镜检测、纤维素酶酶解试验和发酵产酶试验共5项研究，综合其结果，选择膨化处理作为PKC的预处理方法。这不但达到研究所需的材料要求，而且膨化技术和设备均较成熟并可以用于工业化生产。不对环境造成污染。

实施例5：摇瓶种子液浅盘固体发酵生产纤维素酶制剂

1、菌种活化。用含有0.02％(体积比)吐温-80的无菌水配制成悬浮液，用微移液器吸0.5ml泡盛曲霉1042-2菌的孢子悬浮液于PDA培养基的平皿中，在20～45℃培养3～5天，产生丰满的孢子。

2、1042-2菌株种子液的培养。将活化好的菌种用0.01～0.10％体积比的吐温-80无菌水将孢子制成悬浮液，按5～20％质量比的接种量接种于液体培养基中，该培养基为5～15％质量比的PKC，0.1～0.4％质量比蛋白胨，0.5～1.5％质量比葡萄糖，0.1～0.5％质量比(NH₄)₂SO₄，pH 4～8，将接种的摇瓶置于控温摇床，20～45℃，220rpm培养24～72h。

3、固体发酵。固体培养基是以PKC为基本碳源基质。具体配方1：经高温高湿膨化的PKC粉80％、大豆粕10％、麸皮8％、葡萄糖0.5％、蛋白胨0.5％、硫酸铵0.5％、碳酸钙0.5％，料∶水＝1∶1，pH 6.0；或具体配方2：经高温高湿膨化的PKC粉82％、大豆粕7％、麸皮9％、葡萄糖0.7％、蛋白胨0.3％、硫酸铵0.6％、碳酸钙0.4％，料∶水＝1∶1.5，pH 6.0。先将PKC粉、大豆粕、麸皮和碳酸钙按量称重，干抖匀，加水再抖匀。分装于布袋中在高压灭菌锅中121℃灭菌30min，再闷2小时，上述培养基所需其它原料(葡萄糖、蛋白胨、硫酸铵)按量称好，加固体培养基10％水份配制悬浮液115℃灭菌20或21或22或24或26或28或30min即可。冷却待接种用。将灭菌好的固体料置于无菌培养室内，待冷却50℃时，抢温接种液体种子和葡萄糖，等悬浮液，液体种子接种量5％拌匀。这样，固体干料∶液体(水)＝1∶1，液体为拌干料的水，菌种子液和葡萄糖的悬浮液的总量。将接种好的固体料分装于浅盘内，深度1cm，浅盘底层用无菌棉布铺垫，料上面再用无菌棉布遮盖，将浅盘置于放料架上，保温24℃和保湿RH 40％，接种培养4天，取料检测酶活。本批次共投入固体料40kg。

4、后处理。固体培养物，经60℃真空干燥，干燥后经粉碎，过200目筛，并检测酶活。该菌为黄褐色至酱色、疏松、润滑、无异味，检测酶活可达CMC法15831.8～24864.2U/g和PFA法958.0～1273.2U/g以上。本批次获得干制剂30kg。

实施例6：15L罐发酵种子液浅盘固体发酵生产纤维素酶制剂

1.液体种子。菌种活化方法同实施例5，将泡盛曲霉1042-2菌种接种于15L的半自动种子发酵罐中培养48～60h，温度20～35℃，种子罐为半气升式低速搅拌罐，通气量1∶1.5，搅拌速度60～80rpm。检测种子液菌种粗壮，无杂菌，待备用。

2.固体发酵。本批次固体干料为100kg，具体配方1：经高温高湿膨化的PKC粉78％、大豆粕8％、麸皮10％、葡萄糖1.5％、蛋白胨1.5％、硫酸铵0.6％、碳酸钙0.4％，料∶水＝1∶1.6，pH 7.0；或具体配方2：经高温高湿膨化的PKC粉84％、大豆粕8％、麸皮6％、葡萄糖0.9％、蛋白胨0.6％、硫酸铵0.3％、碳酸钙0.2％，料∶水＝1∶1.4，pH 6.8。首先将PKC、大豆粕、麸皮和CaCO₃按量称好，拌匀经125℃高压灭菌30min，再闷1.5小时。其它原料称好配制成悬浮液经115℃灭菌20或21或22或24或26或28或30min即可，冷却备用。将灭菌好的固体料冷却50℃时，接种葡萄糖等悬浮液和菌种子液，最终干料∶液体(水)＝1∶1.6，液体为拌干料的水，菌种子液和葡萄糖的悬浮液的总和。接种的固体培养基分装于浅盘内，浅盘底层用无菌棉布铺垫，料上面再用无菌棉布遮盖，置于无菌室的盘架上，保温23℃和保湿RH 50％培养1～9天。并于第3天后每天取样检测纤维素酶活，其酶活可达CMC法23431.0U/g和PFA法1286.5U/g以上。

3.后处理。将发酵后的固体料在80℃真空干燥。经粉碎，200目筛分装封口。本批次获得泡盛曲霉1042-2菌固体发酵所产纤维素酶酶制剂78kg。

实施例7：摇瓶种子液和罐发酵种子液共用浅盘固体发酵生产纤维素酶制剂

1.液体种子。菌种活化同实施例5，液体种子是实施例5和实施例6中的摇瓶培养法和15L半自动发酵罐的培养法共同培养液体种子。所用菌种为泡盛曲霉1042-2菌，其培养方法同实施例5和实施例6中所述的方法。

2.固体发酵。本批次用固体培养基140kg。具体配方1：经高温高湿膨化的PKC粉86％、大豆粕4.0％、麸皮7.5％、葡萄糖1.3％、蛋白胨0.7％、硫酸铵0.4％、碳酸钙0.1％，料∶水＝1∶1.7，pH 6.1；或具体配方2：经高温高湿膨化的PKC粉83％、大豆粕7％、麸皮8％、葡萄糖0.9％、蛋白胨0.6％、硫酸铵0.2％、碳酸钙0.3％，料∶水＝1∶1.3，pH 6.4。将PKC、大豆粕、麸皮、CaCO₃按固体∶水＝1∶3加水拌匀。装袋在121～126℃高压灭菌30min，再闷2h。其它原料称好配制成悬浮液经115℃灭菌20或21或或22或23或25或27或30min即可，冷却备用。将灭菌好的固体料冷却40℃时，抢温接种，最终使干料∶液体(水)＝1∶1.3，液体为干料的水、菌种子液和葡萄糖的悬浮液的总和。接种的固体培养分装于浅盘内，浅盘底层用无菌棉布铺垫，料上用无菌棉布遮盖，置于无菌室的盘架上，控温33℃和保温RH 80％培养6天。检测得CMC酶活为31591.7～40916.3U/g和FPA酶活为1768.3～2200.7U/g。

3.后处理。将发酵后的固体料在70℃抽风干燥。经粉碎，160目筛分装封口。本批次获得泡盛曲霉1042-2菌固体发酵所产纤维素酶酶制剂120kg。

实施例8：15L罐发酵种子液浅盘固体发酵生产多肽蛋白饲料制剂

1.液体种子。

1.1 1042-2种子液：菌种活化方法同实施例5，将泡盛曲霉1042-2菌种接种于15L的半自动种子发酵罐中培养48～60h，温度20～35℃，种子罐为半气升式低速搅拌罐，通气量1∶1.5，搅拌速度60～80rpm。检测种子液菌种粗壮，无杂菌，待备用。

1.2酵母菌种子液：

1.2.1菌种活化。取酵母菌1-2环用含有0.02％(体积比)吐温-80的无菌水配制成悬浮液，用微移液器吸0.5ml酵母菌悬浮液于PDA培养基的平皿中，在20～45℃培养1～5天。

1.2.2酵母菌种子液的培养。将活化好的菌种用0.01～0.10％体积比的吐温-80无菌水将孢子制成悬浮液，按5～20％质量比的接种量接种于液体培养基中，于15L的半自动种子发酵罐中培养24～60h，温度20～45℃，种子罐为半气升式低速搅拌罐，通气量1∶1.5，搅拌速度60～80rpm。检测种子液菌种粗壮，无杂菌，待备用。该培养基配方为5～25％马铃薯浸汁，0.5～2.5％葡萄糖，pH自然。

1.3枯草芽孢杆菌种子液：

1.3.1菌种活化。取枯草芽孢杆菌1-2环用含有0.02％(体积比)吐温-80的无菌水配制成悬浮液，用微移液器吸0.5ml酵母菌悬浮液于PDA培养基的平皿中，在20～45℃培养1～5天。

1、3.2酵母菌种子液的培养。将活化好的菌种用0.01～0.10％体积比的吐温-80无菌水将孢子制成悬浮液，按5～20％质量比的接种量接种于液体培养基中，于15L的半自动种子发酵罐中培养24～60h，温度20～45℃，种子罐为半气升式低速搅拌罐，通气量1∶1.5，搅拌速度60～80rpm。检测种子液菌种粗壮，无杂菌，待备用。该培养基配方为0.2～1％牛肉膏，0.5～1.5％蛋白胨，0.2～1％NaCl，pH自然。

2、固体发酵。本批次固体干料为100kg，具体配方1：经高温高湿膨化的PKC粉78％、大豆粕8％、麸皮10％、葡萄糖1.5％、蛋白胨1.5％、硫酸铵0.6％、碳酸钙0.4％，料∶水＝1∶1.6，pH 7.0；或具体配方2：经高温高湿膨化的PKC粉84％、大豆粕8％、麸皮6％、葡萄糖0.9％、蛋白胨0.6％、硫酸铵0.3％、碳酸钙0.2％，料∶水＝1∶1.4，pH 6.8。首先将PKC、大豆粕、麸皮和CaCO₃按量称好，拌匀经125℃高压灭菌30min，再闷1.5小时。其它原料称好配制成悬浮液经115℃灭菌20或21或22或24或26或28或30min即可，冷却备用。将灭菌好的固体料冷却50℃时，接种葡萄糖等悬浮液和菌种子液，最终干料∶液体(水)＝1∶1.6，液体为拌干料的水，菌种子液和葡萄糖的悬浮液的总和。接种的固体培养基分装于浅盘内，浅盘底层用无菌棉布铺垫，料上面再用无菌棉布遮盖，置于无菌室的盘架上，保温23℃和保湿RH 50％培养2天。培养48h后按固体培养基量12％接种酵母种子液，继续培养3天，培养3天后再接种枯草芽孢杆菌种子液，最后再培养四天。

3.后处理。将发酵后的固体料在80℃真空干燥。经粉碎，200目筛分装封口。本批次获得多肽蛋白饲料制剂80kg。

实施例9：摇瓶种子液和罐发酵种子液共用浅盘固体发酵生产多肽蛋白饲料制剂

1.液体种子。1042-2、酵母菌和枯草芽孢杆菌菌种活化同实施例8，将活化好的种子液接种到摇瓶并置于控温摇床，20～45℃，220rpm培养24～72h。

2.固体发酵。本批次用固体培养基140kg。具体配方1：经高温高湿膨化的PKC粉86％、大豆粕4.0％、麸皮7.5％、葡萄糖1.3％、蛋白胨0.7％、硫酸铵0.4％、碳酸钙0.1％，料∶水＝1∶1.7，pH 6.1；或具体配方2：经高温高湿膨化的PKC粉83％、大豆粕7％、麸皮8％、葡萄糖0.9％、蛋白胨0.6％、硫酸铵0.2％、碳酸钙0.3％，料∶水＝1∶1.3，pH 6.4。将PKC、大豆粕、麸皮、CaCO₃按固体∶水＝1∶3加水拌匀。装袋在121～126℃高压灭菌30min，再闷2h。其它原料称好配制成悬浮液经115℃灭菌20或21或或22或23或25或27或30min即可，冷却备用。将灭菌好的固体料冷却40℃时，抢温接种，最终使干料∶液体(水)＝1∶1.3，液体为干料的水、菌种子液和葡萄糖的悬浮液的总和。接种的固体培养分装于浅盘内，浅盘底层用无菌棉布铺垫，料上用无菌棉布遮盖，置于无菌室的盘架上，控温33℃和保温RH 80％共培养8天。当培养72h后按固体培养基量12％接种酵母种子液，继续培养3天，培养3天后再接种枯草芽孢杆菌种子液，最后再培养3天。

3.后处理。将发酵后的固体料在70℃抽风干燥。经粉碎，160目筛分装封口。本批次获得多肽蛋白饲料制剂120kg。

Claims (3)

1.一种高产纤维素酶的泡盛曲霉菌株，其特征在于：曲霉属(Aspergillus)中的泡盛曲霉(Aspergillus awamori)1042-2，CCTCC NO：M209142。

2.权利要求1所述的一种泡盛曲霉菌株发酵生产纤维素酶的制备方法，其步骤如下：

A.菌种筛选：从采集的土样、树枝叶腐烂样、棕榈粕样，经过五种不同培养基的分离纯化和鉴别处理，获得146株丝状真菌，经CMC-Na刚果红法、PKC刚果红法和滤纸条法筛选出菌株，再经过进一步的CMC-Na刚果红和PKC刚果红培养基培养，根据水解圈大小选出9株产纤维素的菌株，再用摇瓶培养发酵液检测其CMC酶活和FPA酶活选出高产纤维素的菌株，3～5次土豆培养液摇瓶发酵测定其生物量和棕榈仁粕液体，选出三株高产纤维素酶的菌株，菌株编号分别是1042-2、2221-P和13005；

B.菌种鉴定：通过菌种生长特性、菌丝体发育及光学显微镜、电子扫描镜的形态观察、产色、产酶动力学和18SrDNA分子生物学等鉴定得1042-2在PDA平板上，菌丝初为白色、绒毛状，向四周辐射稀疏生长；渐变为黄灰色，菌落则异常厚密，随后，菌落又褐色变为棕红褐色或深咖啡色；分生孢子棕红褐色或深咖啡色，分生孢子窝头状、有一开口、外有刺，分生孢子直径为3.5μm；分生孢子橞，外壳破裂，露出串状分生孢子和成熟分生孢子，鉴定为曲霉属的泡盛曲霉；

C.菌种活化：用含有0.01～0.10％体积比吐温-80无菌水将孢子制成菌悬液，用微移液器吸0.5ml孢子悬浮液于PDA培养基的平皿中在20～45℃培养24～100小时，产生孢子；

D.1042-2菌株种子液的培养：将活化好的菌种用0.01～0.10％体积比吐温-80无菌水洗成孢子悬浮液，按5～20％质量比的接种量接种于液体培养基中，该培养基为5～15％质量比的PKC，0.1～0.4％质量比蛋白胨，0.5～1.5％质量比葡萄糖，0.1～0.5％质量比硫酸铵，pH 4～8，将接种的摇瓶置于控温摇床，20～45℃，220rpm培养24～100h；

E.固体发酵：固体培养基是以PKC为基本碳源基质，具体配方是经高温150～300℃湿度20～60％膨化的PKC粉75～90％、大豆粕2～10％、麸皮2～10％、葡萄糖0.4～2.0％、蛋白胨0.4～2.0％、硫酸铵0.1～0.6％、碳酸钙0.1～0.5％，料∶水＝1∶1.0～2.5，pH4～8，先将PKC粉、大豆粕、麸皮和CaCO₃按量称重，干拌匀，加水再拌匀，分装于布袋中在高压灭菌锅中115～126℃灭菌30min时，再闷1～2h；将上述固体培养基配方中的按量称好，加固体培养基10～50％水配制成悬浮液，115℃灭菌20～30min，冷却至40～50℃待接种用，将灭菌好的固体料置于无菌培养室内，待冷却至40～50℃时，接种液体种子和葡萄糖等悬浮液，液体种子接种量按固体培养基量的5～20％接种并拌匀，最终，培养基的固体料∶液体水＝1∶1.0～2.5，液体为拌干料的水，菌种子液和葡萄糖的悬浮液的总量，将接种好的固体料分装于浅盘内，厚度1～10cm，浅盘底层用无菌棉布铺垫，料上面再用无菌棉布遮盖，在无菌培养室中保温20～45℃和保湿RH40～90％培养2～12天，培养48小时后每天取样检测纤维素酶活；

F.后处理：经泡盛曲霉1042-2菌株接种于固体培养基上发酵后所得固态培养物，经20～120℃烘干干燥，干燥后经粉碎，过50～200目筛，并检测酶活。

3.权利要求1所述的一种泡盛曲霉菌株发酵生产多肽蛋白饲料的制备方法，其步骤如下：

A.菌种筛选：从采集的土样、树枝叶腐烂样、棕榈粕样，经过五种不同培养基的分离纯化和鉴别处理，获得146株丝状真菌，经CMC-Na刚果红法、PKC刚果红法和滤纸条法筛选出菌株，再经过进一步的CMC-Na刚果红和PKC刚果红培养基培养，根据水解圈大小选出9株产纤维素的菌株，再用摇瓶培养发酵液检测其CMC酶活和FPA酶活选出高产纤维素的菌株，3～5次土豆培养液摇瓶发酵测定其生物量和棕榈仁粕液体，选出三株高产纤维素酶的菌株，菌株编号分别是1042-2、2221-P和13005；

B.菌种鉴定：通过菌种生长特性、菌丝体发育及光学显微镜、电子扫描镜的形态观察、产色、产酶动力学和18SrDNA分子生物学等鉴定得1042-2在PDA平板上，菌丝初为白色、绒毛状，向四周辐射稀疏生长；渐变为黄灰色，菌落则异常厚密，随后，菌落又褐色变为棕红褐色或深咖啡色；分生孢子棕红褐色或深咖啡色，分生孢子窝头状、有一开口、外有刺，分生孢子直径为3.5μm；分生孢子橞，外壳破裂，露出串状分生孢子和成熟分生孢子，鉴定为曲霉属的泡盛曲霉；

C.菌种活化：用含有0.01～0.10％体积比吐温-80无菌水将孢子制成菌悬液，用微移液器吸0.5ml孢子悬浮液于PDA培养基的平皿中在20～45℃培养24～100小时，产生孢子；

D.1042-2菌株种子液的培养：将活化好的菌种用0.01～0.10％体积比吐温-80无菌水洗成孢子悬浮液，按5～20％质量比的接种量接种于液体培养基中，该培养基为5～15％质量比的PKC，0.1～0.4％质量比蛋白胨，0.5～1.5％质量比葡萄糖，0.1～0.5％质量比硫酸铵，pH 4～8，将接种的摇瓶置于控温摇床，20～45℃，220rpm培养24～100h；

E.固体发酵：固体培养基是以PKC为基本碳源基质，具体配方是经高温150～300℃湿度20～60％膨化的PKC粉75～90％、大豆粕2～10％、麸皮2～10％、葡萄糖0.4～2.0％、蛋白胨0.4～2.0％、硫酸铵0.1～0.6％、碳酸钙0.1～0.5％，料∶水＝1∶1.0～2.5，pH4～8，先将PKC粉、大豆粕、麸皮和CaCO₃按量称重，干拌匀，加水再拌匀，分装于布袋中在高压灭菌锅中115～126℃灭菌30min时，再闷1～2h；将上述固体培养基按量称好，加固体培养基10～80％水配制成悬浮液，115℃灭菌20～30min，冷却至40～50℃待接种用，将灭菌好的固体料置于无菌培养室内，待冷却至40～50℃时，接种液体种子和葡萄糖等悬浮液，液体种子接种量按固体培养基量的5～20％接种并拌匀，最终，培养基的固体料∶液体水＝1∶1.0～2.5，液体为拌干料的水，菌种子液和葡萄糖的悬浮液的总量，将接种好的固体料分装于浅盘内，厚度1～10cm，浅盘底层用无菌棉布铺垫，料上面再用无菌棉布遮盖，在无菌培养室中保温20～45℃和保湿RH40～90％。培养24～72小时，按固体培养基量的5～20％接种已在PDA培养基培养好的酵母种子液，培养24～72小时，按固体培养基量的5～20％接种已在牛肉肉汤培养基培养好的枯草芽孢杆菌种子液，继续培养直到预定时间，整个培养3～12天；

F.后处理：经泡盛曲霉1042-2菌株接种于固体培养基上发酵后所得固态培养物，经20～120℃烘干干燥，干燥后经粉碎，过50～200目筛，并检测多肽蛋白含量。

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