CN104849271B - 一种基于花菁的探针用于检测痕量二价铜离子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用有机探针材料进行环境检测领域。具体地说是一种利用L‑半胱氨酸与基于花菁的探针用于检测痕量二价铜离子的方法。在待测样品中加入缓冲液和L‑半胱氨酸溶液在室温下进行亲核反应，而后再加入基于花菁的探针在室温下继续进行亲核反应，通过亲核反应的变化即可定性的检测样品中二价铜离子，再将亲核反应获取反应液在785nm的紫外分光光度计的吸光度，再通过标准曲线，即定量的获得待测样品中二价铜离子的浓度。本发明操作简单方便、肉眼可视、费用低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及利用有机探针材料进行环境检测领域。具体地说是一种利用L-半胱氨酸与基于花菁的探针用于检测痕量二价铜离子的方法。
背景技术
铜是生命必需的微量元素之一，作为多种酶的组成因子和辅助因
子，参与很多新陈代谢过程。但是，过量的铜会引起肝硬化、皮肤病以及神经紊乱等问题。对低等动物比如水生生物的毒性就更为严重，就会阻滞水体的自净过程，蓝藻及其它一些水生微生物不能顺利生长发育。Cu2+可以破坏鱼体中的盐水平衡，引起鱼体粘液过量地分泌，使鱼鳃严重脱水而死亡。一般(Nriagu，1979)非铜污染自然水体中，浓度低于2μg/kg。根据中国环境监测站制定的《中国土壤元素背景值》(赵其国，1990)，我国土壤含铜量大多在4-150mg/kg，而一些矿区、冶炼厂附近土壤中，土壤中铜浓度可超过8000mg/kg(黄长干等，2004；杨洪英等，2007)。而这些铜都可能通过自然或者人为原因进入周围的水环境，危害自然生物及人类的健康。目前检测Cu2+的方法主要有原子吸收法，比色法，荧光猝灭法，极谱仪法，电化学发光分析法，电修饰法。但是以上方法有的需要大型仪器，有的需要专业人员，有的检出限较高。
因此现急需操作简单，可在现场快速，肉眼可视而且具有较低的检出限，可用于污染水体中Cu2+的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于花菁的探针用于检测痕量二价铜离子的方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种基于花菁的探针用于检测痕量二价铜离子的方法，在待测样品中加入缓冲液和L-半胱氨酸溶液在室温下进行亲核反应，而后再加入基于花菁的探针在室温下继续进行亲核反应，通过亲核反应的变化即可定性的检测样品中二价铜离子，再将亲核反应获取反应液在785nm的紫外分光光度计的吸光度，再通过标准曲线，即定量的获得待测样品中二价铜离子的浓度。
具体为：
1)在865μL待测样品中加入100μL缓冲液和20μL L-半胱氨酸溶液在室温下进行亲核反应5-20min；
2)在1)中所得溶液加入10μL基于花菁的探针在室温下继续进行亲核反应5-20min，即可定性的检测样品中二价铜离子；
3)所得反应液在785nm的紫外分光光度计进行吸光度检测，再通过标准曲线，即定量的获得待测样品中二价铜离子的浓度。
所述缓冲液为浓度为1-80mM的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，pH 6-8；
所述L-半胱氨酸溶液为5mM的L-半胱氨酸水溶液；
所述基于花菁的探针为50-500μg的基于花菁的探针，溶于10mL二甲亚砜中。其中探针的结构式如图1所示。
标准曲线的获取：
(1)二价铜离子母液的配制：将2.497g Cu2SO4·5H2O在100ml容量瓶中用去离子水定容。获得0.1M母液。
(2)构建缓冲条件：将不同浓度梯度的的二价铜离子溶液分别与100μl缓冲液混合，并用去离子水将溶液总体积补足到960μl，充分混匀，最终二价铜离子的浓度为40nM,80nM,100nM,200nM,400nM,600nM,800nM,1μM,2.5μM,5μM,10μM。
(3)与L-半胱氨酸溶液温浴：将步骤(2)一系列缓冲体系中分别加入20μl L-半胱氨酸溶液并在室温下反应20min。
(4)与基于花菁的探针反应：将步骤(3)所得不同液体中分别加入10μl基于花菁的探针并在室温下反应10min。
(5)紫外分光光度计测定：将步骤(5)所得不同液体用紫外分光光度计进行测定，测定波长：785nm。
(6)标准曲线的绘制：用origin对数据进行处理绘图，获得标准曲线。
与现有技术相比，本发明的积极效果是：
目前，测定痕量二价铜离子以ICP/MS为主，现有的检测二价铜离子比色反应检出限较高。本发明反应利用L-半胱氨酸与基于花菁的探针的亲核反应对二价铜离子进行方便快速的检测，具有检测速度快、费用低、操作步骤简单、肉眼可视等优点，为方便快捷的现场检测二价铜离子提供了可能。
附图说明
图1为本发明实施例提供的所用的基于花菁的探针的结构式。
图2为本发明实施例提供的利用L-半胱氨酸与基于花菁的探针的亲核反应对二价铜离子进行方便快速的检测效果图，图中绿色瓶为含有二价铜离子，红色瓶为不有二价铜离子。
图3为本发明实施例提供的标准浓度梯度二价铜离子溶液用该方法测定后获得的标准曲线。
图4为本发明实施例提供的在其他水溶离子的干扰下对铜离子进行检测的特异性图。其中铜离子的浓度为10μM,其他金属离子的浓度为100μM。
图5为本发明实施例提供的采用本发明方法检测铜离子的流程图示。
具体实施方式
本发明以L-半胱氨酸与基于花菁的探针为反应材料。两种反应材料可以在室温下颜色由绿色转变为红色。在二价铜离子的存在下，半胱氨酸的反应位点被二价铜离子占据，抑制了反应的进行从而颜色不发生改变。采用本发明可以检测实际水样中加标的二价铜离子。
实施例1：自来水中二价铜离子的加标浓度测定。
(1)样品的获取：自来水取自烟台市莱山区自来水水龙头。
(2)自来水的加标处理：将二价铜离子加入自来水至终浓度为0.5μM。
(3)将加标处理的自来水865μl与100μl A液充分混匀
(4)与B液温浴：将步骤(1)所得液与20μl B液在室温下温浴5min。
(5)加入C液反应：将步骤(2)所得液中加入10μl C液。在室温下反应10min。
(6)二价铜离子浓度的计算：将步骤(5)最终所得液体用紫外分光光度计进行吸光度检测，检测波长：785nm。并将所得数据与标准曲线进行比对计算，获得自来水中二价铜离子的浓度(参见表1)。
(7)将以上步骤反复三次。
(8)最终该反法的测试结果为：0.56±0.07μM。
(9)用ICP/MS的方法对自来水中的二价铜离子进行检测，结果为：0.52±0.04μM。
所述A液的配方为：浓度为10mM的HEPES缓冲液，pH 7.4。
所述B液的配方为：5mM的L-半胱氨酸，溶于去离子水中，现用现配。
所述C液的配方为：50μM的如图1所示的探针，溶于二甲亚砜中。
所述探针的结构式如图1所示，同时可按照申请号为201410322590.X文献中记载制备获得。
所述标准曲线的获取：
(1)二价铜离子母液的配制：将2.497g Cu2SO4·5H2O在100ml容量瓶中用去离子水定容。获得0.1M母液。
(2)构建缓冲条件：将不同浓度梯度的的二价铜离子溶液分别与100μl缓冲液混合，并用去离子水将溶液总体积补足到960μl，充分混匀，最终二价铜离子的浓度为40nM,80nM,100nM,200nM,400nM,600nM,800nM,1μM,2.5μM,5μM,10μM。
(3)与L-半胱氨酸溶液温浴：将步骤(2)一系列缓冲体系中分别加入20μl L-半胱氨酸溶液并在室温下反应20min。
(4)与基于花菁的探针反应：将步骤(3)所得不同液体中分别加入10μl基于花菁的探针并在室温下反应10min。
(5)紫外分光光度计测定：将步骤(5)所得不同液体用紫外分光光度计进行测定，测定波长：785nm。
(6)标准曲线的绘制：用origin对数据进行处理绘图，获得标准曲线。
实施例2：自来水中二价铜离子的加标浓度测定。
与实施例1不同之处在于：
(1)样品的获取：自来水取自烟台市莱山区自来水水龙头。
(2)自来水的加标处理：将二价铜离子加入自来水至终浓度为1μM。
(3)将加标处理的自来水865μl与100μl A液充分混匀
(4)与B液温浴：将步骤(1)所得液与20μl B液在室温下温浴5min。
(5)加入C液反应：将步骤(2)所得液中加入10μl C液。在室温下反应10min。
(6)二价铜离子浓度的计算：将步骤(5)最终所得液体用紫外分光光度计进行吸光度检测，检测波长：785nm。并将所得数据与标准曲线进行比对计算，获得自来水中二价铜离子的浓度(参见表1)。
(7)将以上步骤反复三次。
(8)最终该反法的测试结果为：1.05±0.09μM。
(9)用ICP/MS的方法对自来水中的二价铜离子进行检测，结果为：0.97±0.05μM。
所述A液的配方为：浓度为10mM的HEPES缓冲液，pH 7.4。
所述B液的配方为：5mM的L-半胱氨酸，溶于去离子水中，现用现配。
所述C液的配方为：50μM的基于花菁的探针，溶于二甲亚砜中。
实施例3：海水中二价铜离子的加标浓度测定。
与实施例1不同之处在于：
(1)样品的获取：海水购买于国家海洋局第二海洋研究所，商品号：GBW(E)080040。
(2)海水的加标处理：将二价铜离子加入海水至终浓度为0.5μM。
(3)将加标处理的海水865μl与100μl A液充分混匀
(4)与B液温浴：将步骤(1)所得液与20μl B液在室温下温浴5min。
(5)加入C液反应：将步骤(2)所得液中加入10μl C液。在室温下反应10min。
(6)二价铜离子浓度的计算：将步骤(5)最终所得液体用紫外分光光度计进行吸光度检测，检测波长：785nm。并将所得数据与标准曲线进行比对计算，获得海水中二价铜离子的浓度(参见表1)。
(7)将以上步骤反复三次。
(8)最终该反法的测试结果为：0.58±0.07μM。
(9)用ICP/MS的方法对自来水中的二价铜离子进行检测，结果为：0.51±0.09μM。
所述A液的配方为：浓度为10mM的HEPES缓冲液，pH 7.4。
所述B液的配方为：5mM的L-半胱氨酸，溶于去离子水中，现用现配。
所述C液的配方为：50μM的基于花菁的探针，溶于二甲亚砜中。
实施例4：海水中二价铜离子的加标浓度测定。
与实施例1不同之处在于：
(1)样品的获取：海水购买于国家海洋局第二海洋研究所，商品号：GBW(E)080040。
(2)海水的加标处理：将二价铜离子加入海水至终浓度为1μM。
(3)将加标处理的海水865μl与100μl A液充分混匀
(4)与B液温浴：将步骤(1)所得液与20μl B液在室温下温浴5min。
(5)加入C液反应：将步骤(2)所得液中加入10μl C液。在室温下反应10min。
(6)二价铜离子浓度的计算：将步骤(5)最终所得液体用紫外分光光度计进行吸光度检测，检测波长：785nm。并将所得数据与标准曲线进行比对计算，获得海水中二价铜离子的浓度(参见表1)。
(7)将以上步骤反复三次。
(8)最终该反法的测试结果为：1.14±0.12μM。
(9)用ICP/MS的方法对自来水中的二价铜离子进行检测，结果为：1.07±0.16μM。
所述A液的配方为：浓度为10mM的HEPES缓冲液，pH 7.4。
所述B液的配方为：5mM的L-半胱氨酸，溶于去离子水中，现用现配。
所述C液的配方为：50μM的基于花菁的探针，溶于二甲亚砜中。
实施例5：菲律宾蛤仔中Cu2+的浓度测定。
与实施例1不同之处在于：
(1)样品的获取：菲律宾蛤仔取自烟大市场水产部。
(2)样品预处理：将取来的生物样品清洗移去外壳，获得需检测的有效部位待用，再用二次水清洗三次，然后放入冰箱冷冻成冰，然后再放入冷冻干燥器去除水分，干燥后，再研钵中磨成粉状待用。
(3)菲律宾蛤仔样品的加标处理：将二价铜离子加入样品至终浓度为0.5μM。
(4)将加标处理的样品865μl与100μl A液充分混匀；
(5)与B液温浴：将步骤(1)所得液与20μl B液在室温下温浴5min。
(6)加入C液反应：将步骤(2)所得液中加入10μl C液。在室温下反应10min。
(7)二价铜离子浓度的计算：将步骤(5)最终所得液体用紫外分光光度计进行吸光度检测，检测波长：785nm。并将所得数据与标准曲线进行比对计算，获得菲律宾蛤仔海水中二价铜离子的浓度(参见表1)。
(8)将以上步骤反复三次。
(9)最终该反法的测试结果为：0.52±0.03μM。
(10)用ICP/MS的方法对自来水中的二价铜离子进行检测，结果为：0.47±0.05μM。
所述A液的配方为：浓度为10mM的HEPES缓冲液，pH 7.4。
所述B液的配方为：5mM的L-半胱氨酸，溶于去离子水中，现用现配。
所述C液的配方为：50μM的基于花菁的探针，溶于二甲亚砜中。
实施例6：菲律宾蛤仔中Cu2+的浓度测定。
与实施例1不同之处在于：
(1)样品的获取：菲律宾蛤仔取自烟大市场水产部。
(2)样品预处理：将取来的生物样品清洗移去外壳，获得需检测的有效部位待用，再用二次水清洗三次，然后放入冰箱冷冻成冰，然后再放入冷冻干燥器去除水分，干燥后，再研钵中磨成粉状待用。
(3)菲律宾蛤仔样品的加标处理：将二价铜离子加入样品至终浓度为1μM。
(4)将加标处理的样品865μl与100μl A液充分混匀；
(5)与B液温浴：将步骤(1)所得液与20μl B液在室温下温浴5min。
(6)加入C液反应：将步骤(2)所得液中加入10μl C液。在室温下反应10min。
(7)二价铜离子浓度的计算：将步骤(5)最终所得液体用紫外分光光度计进行吸光度检测，检测波长：785nm。并将所得数据与标准曲线进行比对计算，获得菲律宾蛤仔中二价铜离子的浓度(参见表1)。
(8)将以上步骤反复三次。
(9)最终该反法的测试结果为：1.07±0.09μM。
(10)用ICP/MS的方法对自来水中的二价铜离子进行检测，结果为：1.05±0.06μM。
所述A液的配方为：浓度为1-80mM的HEPES缓冲液，pH 7.4。
所述B液的配方为：5mM的L-半胱氨酸，溶于去离子水中，现用现配。
所述C液的配方为：50μM的基于花菁的探针，溶于二甲亚砜中。
表1
Claims (3)
1.一种基于花菁的探针用于检测痕量二价铜离子的方法，其特征在于：在待测样品中加入缓冲液和L-半胱氨酸溶液在室温下进行亲核反应，而后再加入基于花菁的探针在室温下继续进行亲核反应，通过亲核反应的变化即可定性的检测样品中二价铜离子，再用紫外分光光度计检测亲核反应获取反应液在波长785nm的吸光度,再通过标准曲线，即定量的获得待测样品中二价铜离子的浓度。
2.按权利要求1所述的基于花菁的探针用于检测痕量二价铜离子的方法，其特征在于：
1)在865μL待测样品中加入100μL缓冲液和20μL L-半胱氨酸溶液在室温下进行亲核反应5-20min；
2)在1)中所得溶液加入10μL基于花菁的探针在室温下继续进行亲核反应5-20min，即可定性的检测样品中二价铜离子；
3)用紫外分光光度计检测亲核反应获取反应液在波长785nm的吸光度,再通过标准曲线，即定量的获得待测样品中二价铜离子的浓度。
3.按权利要求1或2所述的基于花菁的探针用于检测痕量二价铜离子的方法，其特征在于：
所述缓冲液为浓度为1-80mM的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，pH 6-8；
所述L-半胱氨酸溶液为5mM的L-半胱氨酸水溶液；
所述基于花菁的探针Cy-NB为50-500μM的基于花菁的探针，溶于二甲亚砜中。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |