CN104840476B - 人参稀有皂苷c‑k的抗急性缺血性脑卒中的神经保护和损伤修复应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域。特别涉及人参稀有皂苷C‑K的抗急性缺血性脑卒中的神经保护和损伤修复应用。体内研究证明，人参稀有皂苷C‑K可以有效降低大脑中动脉阻塞在灌注后脑梗死面积、减少脑水肿，其有效性成剂量依赖性。在体外研究中，人参稀有皂苷C‑K能明显增强因氧糖剥夺/复氧糖损伤后神经元细胞活性、降低细胞损伤、减少细胞凋亡率，同时，可以增强大脑毛细血管内皮细胞屏障功能，从而可以有效的防止缺血再灌后血液内免疫细胞、炎性因子等通过血脑屏障进入脑内所造成的二次打击。人参稀有皂苷C‑K抗急性缺血性脑卒中的神经保护和损伤修复效应明显，起效快。

Description

人参稀有皂苷C-K的抗急性缺血性脑卒中的神经保护和损伤 修复应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。特别涉及人参稀有皂苷C-K的抗急性缺血性脑卒中的神经保护和损伤修复应用。

背景技术

“百草药王”人参是我国传统珍贵药材，雅称为黄精、地精、神草，具有多种祛病养生功效。人参皂苷是人参主要有效成分，人参皂苷是一种固醇类化合物，能够改善脑缺氧缺血时的血流供应，促进ATP生成，阻断Ca²⁺通道及减少Ca²⁺内流，并具有清除自由基、抗氧化等作用。到目前为止已经确定大约30种不同的人参皂苷，主要包括人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rg1及Re，占人参皂苷总量80％以上，其它只占人参皂苷总量的少部分，被称为人参稀有皂苷，如Rd、Rh2、Rg3和C-K。人参稀有皂苷C-K(结构式如下所示)在天然人参中并不存在，是原人参二醇型皂苷Rh1、Rh2和Rc等在人体肠道内的代谢产物，是人参皂苷被吸收到血液并发挥作用的主要活性分子。人参稀有皂苷C-K被报道在抗癌、抗炎、抗过敏、抗糖尿病、抗皮肤衰老以及增强免疫力等方面具有多种潜在药用价值。在神经系统方面，目前人参稀有皂苷C-K被发现能够增强神经递质释放，调节包括学习和记忆在内的神经元活动。

发明内容

本发明的目的是提供人参二醇型皂苷在肠道内的代谢产物之一——人参稀有皂苷C-K在抗急性缺血性脑卒中的神经元损伤及改善大脑毛细血管内皮细胞紧密连接屏障功能的应用，具有神经保护和损伤修复效应。

本发明利用中国专利号为CN200810052882.0的发明专利“丹酚酸酶及丹酚酸酶和人参皂苷混合酶及其转化药材的方法”公开的一种转化方法，提取出高活性人参稀有皂苷C-K。选取中国专利号为CN201410571197.4的发明专利“脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型的构建方法”中的基础细胞网络模型作为体外模拟正常大脑血管神经单元模型，脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型作为体外模拟急性缺血性脑卒中模型，模型中的立体的培养环境可以同时观察多种脑细胞变化。同时本发明以线栓法大鼠大脑中动脉阻断(MCAO)模型作为体内模拟急性缺血性脑卒中模型。通过体内外两种模型同时观察人参稀有皂苷C-K在抗急性缺血性脑卒中神经元损伤及改善大脑毛细血管内皮细胞紧密连接屏障功能的效应。

本发明首次揭示了人参稀有皂苷C-K在抗急性缺血性脑卒中神经元损伤及改善大脑毛细血管内皮细胞紧密连接屏障功能的应用。体内研究证明，人参稀有皂苷C-K可以有效降低大脑中动脉阻塞在灌注后脑梗死面积、减少脑水肿，其有效性成剂量依赖性。在体外研究中，人参稀有皂苷C-K能明显增强因氧糖剥夺/复氧糖损伤后神经元细胞活性、降低细胞损伤、减少细胞凋亡率，同时，可以增强大脑毛细血管内皮细胞屏障功能，从而可以有效的防止缺血再灌后血液内免疫细胞、炎性因子等通过血脑屏障进入脑内所造成的二次打击。人参稀有皂苷C-K抗急性缺血性脑卒中的神经保护和损伤修复效应明显，起效快。

附图说明

图1各实验组中插件内侧面大脑毛细血管内皮细胞跨膜电阻值比较，氧糖剥夺/复氧糖损伤后，测量各组内皮细胞跨膜电阻值，与损伤组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01；

图2大脑毛细血管内皮细胞层Na-F透过率比较，氧糖剥夺/复氧糖损伤后，测量各组内皮细胞Na-F透过率，和损伤组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01；

图3是氧糖剥夺/复氧糖损伤后，正常组神经元倒置相差显微镜图片；

图4是氧糖剥夺/复氧糖损伤后，氧糖剥夺/复氧糖损伤组；

图5是氧糖剥夺/复氧糖损伤后，人参稀有皂苷C-K(15μmol/L)组神经元倒置相差显微镜图片；

图6是氧糖剥夺/复氧糖损伤后，人参稀有皂苷C-K(30μmol/L)组神经元倒置相差显微镜图片；

图7是氧糖剥夺/复氧糖损伤后，人参稀有皂苷C-K(60μmol/L)组神经元倒置相差显微镜图片；

图8神经元活性比较‘氧糖剥夺/复氧糖损伤后，MTT法测定各组神经元细胞活性，和损伤组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01；

图9神经元LDH漏出率比较。氧糖剥夺/复氧糖损伤后，比较各组神经元LDH漏出率，和损伤组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

图10神经元凋亡率比较。氧糖剥夺/复氧糖损伤后，利用TUNEL法检测各组神经元凋亡率，和损伤组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

图11人参稀有皂苷C-K对大鼠脑梗死面积百分比的影响。MCAO再灌注24小时以后，测量各组脑梗死面积百分比，和损伤组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

图12人参稀有皂苷C-K对大鼠脑梗死面积百分比的影响。MCAO再灌注24小时以后，测量各组脑梗死面积百分比，和损伤组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

具体实施方式

实施例1

一、人参稀有皂苷C-K抗急性缺血性脑卒中的神经保护与损伤修复效应的体外研究

(一)实验方法

1.药品与试剂：人参稀有皂苷C-K以DMSO溶解，各样本的终浓度均以μM(μmol/L)表示。实验用SD大鼠均由大连医科大学实验动物中心提供。MTT(Sigma)，Tritonx100(Solarbio)，Na-F(Sigma)，LDH试剂盒(自南京建成)，TUNEL细胞凋亡试剂盒(Roche)生物技术有限公司，Transwell插件(Millipore)，抗体均购自Abcam公司。

1.实验分组：分为正常组、损伤组、人参稀有皂苷C-K(15μM)组、人参稀有皂苷C-K(30μM)组、人参稀有皂苷C-K(60μM)组。

2.大鼠急性缺血性脑卒中体外氧糖剥夺/复氧糖损伤细胞网络模型构建

根据中国专利申请号为CN201410571197.4的发明专利公开的一种“脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型的构建方法”，提取SD大鼠大脑皮质(脑缺血损伤时，皮质和纹状体均存在核心区和半暗带，其定位相对恒定，故选择皮层神经元进行实验)的毛细血管内皮细胞(endothelial cells,E)、星形胶质细胞(astrocytes,A)及神经元(neurons,N)(其中A和N取自新生24小时SD大鼠，E取自成年220～280g雄性SD大鼠)并分别进行原代培养；将原代培养5-9天已成熟的E种植到已包被胶原蛋白的插件底膜内侧面，大约2-6天，将原代培养10天左右已经纯化的A植于插件底膜外侧面。待EA共培养4-5天，将EA共培养的插件放置于生长1周左右已经成熟稳定的N培养孔中。三种细胞共培养1-2天，在人参稀有皂苷C-K组插件内腔分别加入15、30、60μmol/L人参稀有皂苷C-K，其余组相应加入等体积DMSO。3小时以后，除对照组外，其余组均放入低氧调控系统(美国，Coy)中，以无糖无氧E、N培养液分别完全置换插件内、外腔的E、N完全培养液，再将细胞置于37℃，95％N₂和5％CO₂混合气培养舱中开始氧糖剥夺处理2小时。之后将插件内、外腔无糖细胞培养液分别更换为正常的E和N完全培养液，同时将细胞模型重新置于普通细胞培养系统内继续培养3小时，整个过程模拟急性缺血性脑卒中发生时大脑急性缺血后再灌注损伤。

3.大脑毛细血管内皮细胞跨膜电阻值测定

氧糖剥夺/复氧糖损伤后，利用电阻仪(Millicell ERS-2，美国)测定各组大脑毛细血管内皮细胞跨膜电阻值，每个插件至少测量三次，取平均值，同时减去空白插件电阻值。大脑毛细血管内皮细胞跨膜电阻值可以间接反映内皮细胞的屏障功能，电阻值越高，其屏障功能越好。

4.大脑毛细血管内皮细胞层荧光素钠(Na-F)透过率测定

氧糖剥夺/复氧糖损伤后，插件内培养液更换为Ring-Hepes Buffer(136mM NaCl、0.9mM CaCl2、0.5mM MgCl2、2.7mM KCl、1.5mM KH2PO4、10mM NaH2PO4、25mM glucose、10mMHepes，pH 7.4)，同时加入200μl Na-F工作液，分别在30min、60min、90min、120min、150min五个时间点将插件放入一个新的含有Ring-Hepes Buffer的培养孔中。取出对应时间点的下室液体用于荧光酶标仪的测量。根据渗透性系数公式：渗透性系数Pe(cm/s)＝VB/(A×60×t)×B/T，VB为下室总体积(ml)；A为滤膜的表面积(cm2)；t为所测样品时间点(min)；B为下室的液体浓度(μg/ml)；T为检测物质的初浓度(μg/ml)。Na-F的透过率，由下列公式得出：1/Pe内皮＝1/Pe总-1/Pe空白。通过检测经大脑毛细血管内皮细胞层Na-F的透过率可反映毛细血管内皮细胞的屏障功能，其中Na-F的透过率越小，则表示大脑毛细血管内皮细胞层屏障功能越好、细胞状态越好；反之则表示大脑毛细血管内皮细胞层屏障功能越差、细胞状态越差。

5.倒置相差显微镜观察神经元状态

利用显微镜粗调螺旋调节物镜高度，观察氧糖剥夺/复氧糖损伤后各组神经元的形态，显微镜相机拍照(Nikon，日本)。

6.MTT检测神经元细胞活性

氧糖剥夺/复氧糖损伤后，取出插件，弃去外腔培养液，换入新培养液(每1ml培养液中加入100μl MTT)，孵箱继续培养3h后将待测液吸出，加入与MTT等量DMSO，在摇床上震荡混匀10min，按组别分别加入96孔板中，用酶标仪(490nm波长)测量各孔的吸光值。MTT吸光值可间接反映活细胞数量，在一定范围内，MTT吸光值越高，代笔被检测的神经元活细胞数量越多，神经元细胞活性越强。

7.神经元乳酸脱氢酶(LDH)漏出率测定

氧糖剥夺/复氧糖损伤后，收集各组插件外腔神经元细胞培养上清，按试剂盒说明书检测上清中LDH含量，LDH漏出率(％)＝上清液LDH活性/(上清液LDH活性+裂解液细胞LDH活性)×100％。通过细胞漏出率可以间接判断细胞损伤程度，漏出率越高，细胞损伤越严重。

8.TUNEL法神经元凋亡检测

氧糖剥夺/复氧糖损伤后，取出插件，弃去外腔培养液，PBS漂洗，多聚甲醛溶液固定2，加入1％Triton X-100，室温下放置30min。按照TUNEL检测试剂盒步骤进行操作。最后在荧光显微镜下观察，计数凋亡小体数和总细胞数量，计算各组神经元凋亡率(％)＝凋亡细胞数/总细胞数×100％。

9.统计学方法

实验所得数据以均数±标准差形式表示，各组间利用SPSS13.0软件中单一因素方差分析进行统计学分析，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

(二)实验结果

1.大脑毛细血管内皮细胞屏障功能检测

通过比较各组中插件内侧面大脑毛细血管内皮细胞跨膜电阻值和Na-F透过率可以间接判断各组间内皮细胞屏障功能。其中电阻值越高，同时Na-F透过率越低，则表示内皮细胞屏障功能越好。糖氧剥夺2h，复氧糖3h后插件内侧面大脑毛细血管内皮细胞跨膜电阻值显著下降，Na-F透过率显著增加，提示内皮细胞屏障功能严重受损；人参稀有皂苷C-K预处理可以改善因此而导致的内皮细胞屏障功能损伤，并且呈现剂量依赖性(见图1，2)。

2.从相差显微镜图片观察，正常组神经元状态良好，胞体饱满透亮，突起细长且交织成网状(见图3)；氧糖剥夺/复氧糖损伤后，神经元折光性变差，细胞间隙增大，贴壁能力下降，胞体由圆润开始变形，突起扭曲、断裂(见图4)。人参稀有皂苷C-K不同剂量预处理后，可以减少因氧糖剥夺/复氧糖损伤导致神经元形态改变，图5-7是分别是15、30、60μmol/L人参稀有皂苷C-K预处理，氧糖剥夺/复氧糖损伤后，神经元倒置相差显微镜图片，从图中可以看到，和损伤组相比，神经元胞体更加圆润、突起扭曲、断裂情况改善，而且随着剂量的增加，神经元形态更加接近于正常组。

3.MTT法检测神经元细胞活性

氧糖剥夺/复氧糖处理后，利用MTT法分别测定正常组、损伤组以及不同浓度预处理的人参稀有皂苷C-K组神经元活细胞数量。结果显示，氧糖剥夺/复氧糖损伤后神经元活性显著下降，提示N存活率下降；人参稀有皂苷C-K预处理后，神经元细胞活性有所增加，并且有剂量依赖性趋势(见图8)。

4.神经元LDH漏出率测定

氧糖剥夺/复氧糖处理后，分别比较正常组、损伤组以及不同浓度预处理的人参稀有皂苷C-K组插件外腔神经元细胞培养上清LDH漏出率，以判断细胞的损伤程度。实验结果显示：糖氧剥夺2h，复氧糖3h后插件外腔神经元细胞上清LDH释放量均显著增加，提示细胞严重受损；不同浓度人参稀有皂苷C-K预处理可以明显减少神经元损伤程度，并且呈现剂量依赖性(见图9)。

8.神经元凋亡率检测

氧糖剥夺/复氧糖处理后，利用TUNEL法检测各组细胞凋亡情况，并且计算细胞凋亡率。实验结果显示：糖氧剥夺2h，复氧糖3h后，神经元凋亡率明显增高，不同浓度人参稀有皂苷C-K预处理可以明显降低神经元凋亡率，并且呈现剂量依赖性(见图10)。

二、人参稀有皂苷C-K抗急性缺血性脑卒中的神经保护和损伤修复效应的体内研究：

(一)实验方法

1.MCAO(大脑中动脉阻断)模型构建

本发明选取体重200-250g雄性SD大鼠用于构建MCAO(大脑中动脉阻断)模型的。所有动物术前空腹至少8小时，40只SD大鼠被随机分为5组：分为假手术组、模型组、人参稀有皂苷C-K(3mg/kg)组、人参稀有皂苷C-K(6mg/kg)组、人参稀有皂苷C-K(12mg/kg)组。大脑中动脉阻断术前30分钟对大鼠进行通过人参稀有皂苷C-K或者等体积DMSO腹腔注射。30分钟后，10％水合氯醛(35mg/kg)腹腔注射麻醉、固定。颈部正中切口，分离右侧颈总动脉、劲外动脉和颈内动脉。在颈总动脉远心端、近心端及劲外动脉处穿线备用，关闭颈内动脉近心端及劲外动脉处结扎，然后在距劲总分叉部4mm处剪一小口，将拴线插入到颈内动脉，这时用绕在劲总远心端的细线轻轻系牢拴线。轻推拴线，当插入深度在18mm时，紧紧系牢颈总动脉远心端，大脑中动脉阻断2小时以后，取出线栓。假手术组大鼠除插入线栓意外，同时实施其他手术操作。

2.人参稀有皂苷C-K对MCAO再灌注大鼠脑梗死面积影响

MCAO再灌注24小时以后，断头取脑，将脑置于冰生理盐水中，除去小脑、嗅球和低位脑干，-20℃冷冻10分钟，将脑组织切成5片。然后将脑片放人含有2％的TTC的磷酸缓冲溶液中，37℃避光15分钟。经过染色，正常区域脑组织显暗红色，梗死区未被染色，利用Image-Pro Plus软件测量组织面积，大鼠MCAO再灌注脑梗死百分比＝梗死区面积/脑切片面积×100％。

3.人参稀有皂苷C-K对MCAO再灌注大鼠脑含水量和脑指数的影响

MCAO再灌注24小时以后，断头取脑，大鼠断头后快速取脑，用电子天平称取脑组织标本湿重。将脑组织放入恒温干燥箱110℃干烤24小时，称取脑组织干重，脑含水量(％)＝(湿重-干重)/湿重×100％。

(二)实验结果

1.大鼠脑梗死面积百分比测量

MCAO再灌注24小时以后，检测大鼠脑梗死面积百分比。结果显示：与模型组相比，不同浓度人参稀有皂苷C-K预给药可以减少脑梗死面积百分比，并且呈现剂量依赖性(见图11)。

2.大鼠脑含水量测量

MCAO再灌注24小时以后，检测大鼠脑含水量。结果显示：MCAO再灌注损伤后，大鼠脑含水量增加，不同浓度人参稀有皂苷C-K预给药可以减少脑含水量，并且呈现剂量依赖性(见图12)。

Claims (1)

1.人参稀有皂苷C-K在制备抗急性缺血性脑卒中的神经保护和损伤修复的药物中的应用。