CN104830725A - 可降解氯代烯烃的贪铜菌及其应用 - Google Patents

可降解氯代烯烃的贪铜菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种可降解氯代烯烃的贪铜菌及其应用，该菌株的保藏号为CCTCC NO：M 2015045，该菌能够利用三氯乙烯、二氯乙烯、氯乙烯等难降解毒性有机物为唯一碳源和能源生长，克服了共代谢降解工艺的不足，能够在贫养环境中保持较高的活性，适用于废水、饮用水和土壤修复等领域应用，有望在氯代烃生物降解的工程应用领域取得新的突破。

Description

可降解氯代烯烃的贪铜菌及其应用
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一种可降解氯代烯烃的贪铜菌及其应用。
背景技术
氯代烃作为重要的有机溶剂和产品中间体，广泛应用在化工、医药、农药等领域。由于使用和存储不当，氯代烃通过挥发、泄漏、废水排放等方式排入到自然环境中。近年来的大量研究表明，三氯乙烯等氯代烃污染物具有潜在的“三致”(致癌、致畸、致突变)效应和遗传毒性效应，如微量三氯乙烯暴露接触可导致肝、肾及中枢神经系统损伤，引起一系列机体功能紊乱症状，严重危及人类健康。随着国际、国内在可持续发展中对生态环境提出越来越高的要求，如何有效的消除氯代烃污染已成为环境保护领域的重要研究内容。
从解决大面积污染的角度考虑，生物降解因其具有高效性及低成本性，被认为是消除氯代烯烃污染物最有效的途径。生物降解包括了厌氧和好氧生物降解两种方式。厌氧降解常用Hyphomicrobium、Dehalococcoides等脱氯菌，使高氯代有机物还原脱氯。脱氯菌常与产乙酸菌(homoacgtogens)和产甲烷菌(methanogens)形成聚生体，在碳源和外源电子供体存在的条件下，氯代烃作为电子受体为厌氧微生物提供能源并同时被降解。但厌氧降解存在降解不彻底的缺陷，脱氯后的产物往往具有更大的生物毒性和致癌性。而好氧降解途径可通过羟基化作用或环氧化作用使得氯代烃完全降解，相对于降解不彻底的厌氧生物降解，好氧生物降解具有显著优势。
甲烷氧化菌(Methanotrophs)降解氯代烃属于该领域的研究热点。甲烷氧化菌中含有的甲烷单加氧酶可以通过环氧化的途径降解氯代烃，但由于甲烷氧化菌必须通过添加碳源的共代谢的形式实现氯代烃的降解，这在一定程度上限 制了氯代烃好氧氧化在工程上的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种可降解氯代烯烃的贪铜菌，该菌能够降解氯代烯烃，可应用于废水、饮用水和土壤修复等领域，特别适用于废水中氯代烯烃污染物降解和土壤生物修改，具有广泛推广的意义。
本发明的技术方案是：
可降解氯代烯烃的贪铜菌，其保藏号为CCTCC NO:M 2015045(已于2015年1月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)，分类命名为：Cupriavidus sp.SWA1，其16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明所述的可降解氯代烯烃的贪铜菌，属于贪铜菌属。菌落直径1mm左右，半透明，突起，边缘整齐，表面有光泽，颜色呈白色透明；革兰氏染色阴性。最佳生长温度为25～40℃，pH为6.5～7.5。
本发明所述的可降解氯代烯烃的贪铜菌能够降解氯代烯烃，其中氯代烯烃选自三氯乙烯、二氯乙烯、氯乙烯中的至少一种。
本发明所述的可降解氯代烯烃的贪铜菌可应用于废水、饮用水和土壤修复等领域，可用于生物催化剂。
本发明所述的可降解氯代烯烃的贪铜菌，本申请中命名为贪铜菌Cupriavidus sp.SWA1，是从生活垃圾填埋场覆盖层中分离得到的，菌株DNA的测序委托大连宝生物公司完成，碱基测定的长度为1497bp(SEQ ID NO:1)，碱基序列在GenBank核酸序列数据库进行比较发现与贪铜菌属Cupriavidus sp.的菌株Cupriavidus metallidurans strain CH34同源性为98％。通过对该菌株进行的一系列生理生化以及工艺优化试验表明，本发明提供的贪铜菌Cupriavidus sp.SWA1，可高效降解氯代烯烃，主要优点如下：
(1)贪铜菌Cupriavidus sp.SWA1可以氯代烯烃为碳源和能源生长，克服了甲烷氧化菌必须要依靠外加碳源的共代谢途径才能实现氯代烃降解的局限 性。
(2)用贪铜菌Cupriavidus sp.SWA1的完整细胞作为生物催化剂，液体培养菌体密度(600nm下菌液吸光度)可达到0.83，脱离环境体系后仍可维持较高活性。
(3)该菌对氯仿具有高耐受性，可高效降解三氯乙烯、二氯乙烯、氯乙烯等氯代烯烃。
(4)贪铜菌Cupriavidus sp.SWA1扩大培养所需的培养基成分简单，成本低。特别适用于废水中氯代烯烃污染物降解和土壤生物修改，可以广泛推广。
本发明解决了现有技术中好氧生物降解氯代烃污染物无法工程化的问题。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
附图说明
图1为贪铜菌Cupriavidus sp.SWA1的系统发育树；
图2为贪铜菌Cupriavidus sp.SWA1对不同浓度三氯乙烯的降解效果曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。
1、实验材料 
贪铜菌无机盐培养基的组成如下(g/g)：KH2PO4，0.1％；Na2SO4，0.02％；NaCl，0.02％；NH4Cl，0.1％；CuSO4标准液0.1～0.2g/L。
其余试剂为市售分析纯产品。
垃圾颗粒选自生活垃圾填埋场覆盖层，本实施例选取重庆长生桥垃圾填埋场(重庆市南岸区025乡道)，取4mm筛下和2mm筛上垃圾颗粒，添加一定量的氯仿并调节pH至适合贪铜菌生长，在甲烷和空气混合气中密闭驯化2周以实现菌株的复壮。
2.菌种富集与优化实验
1)富集培养：称取覆盖土1g放入100ml无机盐培养基中，置于27℃、160转/min摇床振荡2h。取菌悬液2ml作为种子接入分装了20ml无机盐培养基的100ml血清瓶中，加盖橡胶塞密封；用20ml甲烷气置换瓶内20ml空气，然后在30℃、160转/min条件下振荡培养一周。
2)纯菌分离：用已冷却的无菌蒸馏水对菌液进行10倍系列稀释，制成稀释度为10-1、10-2的稀释液。采用倾注法进行无机盐培养基培养。将平板倒置于真空干燥器中，并向干燥器中通入一定量的三氯乙烯，然后用保鲜膜封口。将干燥器置于生化培养箱中，27℃培养4～5d。将长势好的菌种进行多次传代，纯化。
3)优化实验：利用纯菌株制备一定浓度的菌悬液，加入到装有一定量无机盐培养基的血清瓶中；添加2-10mg/L的三氯乙烯后具塞密封。在27℃、160转/min条件下振荡培养。间隔一段时间检测菌液浓度以及三氯乙烯浓度。
3.菌种鉴定实验 
使用QIAquick Genomic DNA Buffer Set进行PCR扩增目的片段。取5μl进行3％琼脂糖凝胶电泳，使用切胶回收目的片段进行DNA测序。DNA的测序委托大连宝生物公司完成。以Seq Forward、Seq Reverse、Seq Internal为引物进行DNA测序。16S rRNA扩增采用广谱引物F27(SEQ ID NO:2-AGAGTTTGATCATGGCTCAG)和R1492(SEQ ID NO:3-TACGGTTACCTTGTTACGACTT)。
4.检测方法
菌液的OD值采用UV2000分光光度计检测，波长为600nm。活细胞浓度采用平板菌落计数法确定。菌体干重通过10ml菌液在80℃下烘干至恒重，用精密电子天平称量。每个实验最少做2组平行试验，确保RSD小于5％。
氯代烯烃的检测采用气相色谱(安捷伦6890N)。色谱条件：GDX不锈钢柱(10m×2mm)，进样口温度、柱温以及检测器(ECD)温度分别为80、50、120 ℃，氢气为载气，流速为25ml/min，进样量为0.2ml。
实施例1贪铜菌Cupriavidus sp.SWA1的纯化与鉴定
该菌属革兰氏阴性菌，菌落直径约1mm，颜色呈白色半透明，突起，边缘整齐，表面有光泽；革兰氏染色阴性。贪铜菌Cupriavidus sp.SWA1的16S rDNA的测序委托大连宝生物公司完成，碱基测定的长度为1497bp(SEQ ID NO:1)，碱基序列在GenBank核酸序列数据库进行比较发现与贪铜菌属Cupriavidus sp.的菌株Cupriavidus metallidurans strain CH34同源性为98％。由贪铜菌Cupriavidus sp.SWA1系统发育树(见图1)可知，Cupriavidus sp.与Ralstonia sp.亲缘关系较近，而先前的研究是将二者归为一类的，后期因为Ralstonia sp.新功能的出现分类水平发生了变化，将其从Cupriavidus sp.中分离出来成为一类新科的新属，而Cupriavidus sp.与Burkholderia sp.虽然在分类手册上归属于同一科的不同属，在进化过程中却发生了较大的变化，二者之间的亲缘关系较远。
实施例2贪铜菌Cupriavidus sp.SWA1对不同氯代烃降解效果实验
分别配置浓度为2g/L的三氯乙烯、二氯乙烯、氯乙烯溶液，并各取100μl分别添加到含有20ml NMS培养基的100ml血清瓶中，将上述NMS培养基在121℃条件下高温蒸汽灭菌，待冷却后用微量移液器向瓶中加入1ml贪铜菌菌液(OD600nm为0.7)，盖好胶塞摇匀，放入摇床设定在30℃、160转/min条件下培养40h，然后测定用气相色谱顶空测定氯代烯烃的含量确定氯代烯烃的降解效果，测定菌液的OD600nm值确定菌体生长情况。由表1可知，贪铜菌Cupriavidus sp.SWA1可以很好地降解氯代烯烃，其中三氯乙烯的降解效果最好，达到了73.2％。
表1Cupriavidus sp.SWA1对氯代烃的降解效果
实施例3贪铜菌Cupriavidus sp.SWA1对不同浓度三氯乙烯的降解效果实验
配置浓度为2g/L的三氯乙烯溶液，添加到含有20ml NMS培养基的100ml血清瓶中，三氯乙烯浓度分别为1.65mg/L、2.73mg/L、5.40mg/L、7.99mg/L和10.1mg/L。加入1ml贪铜菌菌液(OD600nm为0.7)，盖好胶塞摇匀，放入摇床设定在30℃、160转/min条件下培养80h，然后用气相色谱测定氯代烯烃的含量，并确定氯代烯烃的降解效果。不同浓度三氯乙烯的降解效果见图2。当三氯乙烯的浓度小于5.40mg/L时，降解效果良好，三氯乙烯的降解率达到了95％以上。当三氯乙烯的浓度高于5.40mg/L时，由于毒性的作用抑制了菌体的活性，当三氯乙烯的浓度为10.1mg/L时，降解率为21％。
本发明从生活垃圾覆盖层筛选得到的贪铜菌不仅对铜离子、氯代烯烃具有高耐受性，而且还可以氯代烃为唯一碳源和能源生长，从而克服了共代谢降解工艺的不足。贪铜菌对重金属和有机物的高耐受性及其独特的降解特性，有望在氯代烃生物降解的工程应用领域取得新的突破。
以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种可降解氯代烯烃的贪铜菌，其特征在于，其保藏号为CCTCC NO:M 2015045，所述贪铜菌属于贪铜菌属。
2.根据权利要求1所述的可降解氯代烯烃的贪铜菌，其特征在于，所述贪铜菌的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
3.权利要求1所述的可降解氯代烯烃的贪铜菌在降解氯代烯烃中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述氯代烯烃选自三氯乙烯、二氯乙烯、氯乙烯中的至少一种。
5.权利要求1所述的可降解氯代烯烃的贪铜菌在制备生物催化剂中的应用。
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