CN104829566A - 一种l-抗坏血酸辛酸酯及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种L-抗坏血酸辛酸酯及制备方法。L-抗坏血酸辛酸酯微溶于水，具有良好的油溶性、抗氧化性、乳化性及抑菌活性。其制备方法是以正辛酸和L-抗坏血酸为原料，在有机相体系中利用固定化脂肪酶催化酯化反应合成L-抗坏血酸辛酸酯，反应完成后将反应液经过滤、萃取、结晶或硅胶柱层析、真空干燥等工艺步骤得到L-抗坏血酸辛酸酯。本发明的制备方法以中链脂肪酸正辛酸为酰基供体，能在较短的反应时间内获得80~90%的转化率，分离纯化相对简单，产物纯度为95~98%、回收率为75~85%，均较高，且脂肪酶重复利用次数较多，在使用50~80次后酶活仍能保持原来的60~75%，从而降低了生产成本，有利于工业化生产。

Description

一种L-抗坏血酸辛酸酯及制备方法
技术领域
本发明属于多功能天然抗氧化剂的生物催化、分离纯化技术领域，具体涉及一种L-抗坏血酸辛酸酯及制备方法。
背景技术
随着食品工业的高速发展，人民生活水平的不断提高，食品和食品添加剂的安全性越来越受到重视。油脂是人类七大营养素之一，是人体重要的热能来源，为人体提供必需脂肪酸及脂溶性成分，具有重要的生理功能，还可改善食品口感、提供食品风味及制作功能。油脂作为食品工业的重要原料之一，其品质直接影响到食品质量的好坏。然而油脂中的不饱和脂肪酸在加工、运输、贮藏过程中极易受到空气、光照、水分等因素的影响而酸败劣变。油脂酸败产生的醛、酮、酸等小分子物质有强烈的刺激气味，影响食用油脂的风味及色泽，其二级氧化产物和聚合物在人体及动物体内很难被吸收、代谢，积累于体内对肝脏造成损伤。同时，油脂酸败产物还会破坏膜、酶、蛋白质等，导致人体衰老、心血管疾病等的发生，甚至可能致癌，严重危及人体健康。因此，研究和开发延缓油脂氧化酸败的方法显得十分重要。目前，添加抗氧化剂是一种延缓油脂及含油食品酸败劣变的行之有效的方法，而且抗氧化剂对油脂中的氨基酸、维生素等比较容易氧化的营养成分具有保护作用。然而，用以延缓油脂及含油食品酸败劣变的化学合成类抗氧化剂，如没食子酸丙酯(PG)、丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)及叔丁基对苯二酚(TBHQ)等因可能具有毒性、致癌性而受到人们的质疑，越来越多的国家、组织开始严格限制甚至暂停使用化学合成类抗氧化剂。
由于合成抗氧化剂的安全性受到质疑，高效、低毒的天然抗氧化剂受到越来越多的关注。L-抗坏血酸是一种便宜易得的天然抗氧化剂，应用非常广泛，然而由于其极强的亲水性，极大地限制了它在油脂等疏水体系中的应用。当L-抗坏血酸的第六位羟基上植入脂肪酸基团后，其脂溶性增加，成为一种兼具表面活性和抗氧化活性的具有较高油溶性的多功能天然抗氧化剂。其中，L-抗坏血酸棕榈酸酯（L-AP）已得到世界卫生组织等机构的认可，并被多国药典收载，作为食品添加剂广泛应用于食用油、含油食品及肉制品中。目前市售的L-抗坏血酸硬脂酸酯和棕榈酸酯产品通常是采用化学法合成的，由于化学法存在反应条件剧烈、副反应多、环境污染严重等缺陷，生物酶催化合成法作为一种选择性高、反应条件温和、产品下游操作简单的新型合成方法越来越受到人们的关注。
关于酶法合成L-抗坏血酸脂肪酸酯的研究报道已有一些，但主要以长链脂肪酸尤其是棕榈酸和硬脂酸为酰基供体，而对L-抗坏血酸中链脂肪酸酯的研究鲜有报道。L-抗坏血酸长链脂肪酸酯较高的熔点使得其在油脂及脂溶性产品中的溶解度并不理想，温度较低时容易结晶析出，从而影响其抗氧化活性。
发明内容
本发明针对L-抗坏血酸长链脂肪酸酯油溶性较低、低温时容易结晶析出的问题，旨在提供一种L-抗坏血酸辛酸酯及其制备方法。
本发明所述L-抗坏血酸辛酸酯的结构如下式所示：
；
L-抗坏血酸辛酸酯微溶于水，可溶于乙醇、乙酸乙酯，在植物油中的溶解度900~2000mg/kg；熔融温度62℃，结晶温度22℃；清除自由基的EC50值＜0.62mg/mL；HLB值11.5，临界胶束浓度1×10-4 mol/L；对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度≤1.4g/L；添加量为0.02%时，食用油脂在40℃下的氧化诱导期延长至16~36d。
制备L-抗坏血酸辛酸酯的具体操作步骤如下：
（1）酶法合成L-抗坏血酸辛酸酯
取L-抗坏血酸、正辛酸和Novozym 435固定化脂肪酶加入到反应介质中，L-抗坏血酸的初始浓度为0.1~0.25 mol/L，正辛酸与L-抗坏血酸的摩尔比为4:1~8:1，Novozym 435固定化脂肪酶用量为L-抗坏血酸质量的15~20%；然后加入4?分子筛，4?分子筛的加入量为50~100mg/mL，密封体系，在55~60℃、振荡摇床转速100~150r/min条件下，反应8~12h，得到含L-抗坏血酸辛酸酯的反应液；
（2）反应液中L-抗坏血酸辛酸酯的分离纯化
将所述反应液抽滤除去分子筛、脂肪酶和未反应的L-抗坏血酸，所得的滤液经真空旋转蒸发除去溶剂，加入乙酸乙酯溶解，乙酸乙酯的加入量为2~6mL/g，用2~4倍乙酸乙酯体积的水洗涤，充分混匀，静置分层，取有机层真空旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到含L-抗坏血酸辛酸酯的反应混合物；
将所述反应混合物采用有机溶剂结晶法或硅胶柱层析法处理，得到L-抗坏血酸辛酸酯，所述L-抗坏血酸辛酸酯的纯度大于95.0%。
步骤（1）所述反应介质为叔丁醇或叔戊醇或丙酮。
步骤（2）所述有机溶剂结晶法的具体操作如下：将含L-抗坏血酸辛酸酯的反应混合物边搅拌边加入5~15℃的烷烃类有机溶剂，烷烃类有机溶剂的加入量为6~8mL/g，搅拌时间5~10min，结晶析出，抽滤得粗产物；加入有机溶剂，在35~50℃下搅拌溶解，有机溶剂的加入量为5~15mL/g，然后在5~25℃下边冷却边搅拌至结晶析出，抽滤，真空干燥即得L-抗坏血酸辛酸酯；
所述烷烃类有机溶剂为正己烷或正庚烷或异辛烷或环己烷。所述有机溶剂为体积比1:2~1:4的二氯甲烷:正己烷的混合溶剂或体积比1:30~1:40的正丁醇:正己烷的混合溶剂或体积比1:3~1:4的氯仿:正己烷的混合溶剂。
步骤（2）所述硅胶柱层析法的具体操作如下：将200~300目的20~30g硅胶浸泡于洗脱剂中，硅胶溶胀30min，湿法装柱（16×500mm），用洗脱剂平衡30min后上样，上样量2~4g，上样浓度0.4~0.6g/mL，吸附平衡，洗脱剂洗脱，流速为0.5~1.5mL/min，大约1个柱体积后开始收集，2~3个柱体积后停止收集，将收集液真空旋转蒸发，得到L-抗坏血酸辛酸酯；
所述洗脱剂为体积比1:1的乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂。
本发明制备得到的L-抗坏血酸辛酸酯为白色晶体，对其进行红外光谱、质谱、核磁共振测定得到谱图。由红外光谱图（图1）可以看出，产物分别在1733 cm-1、1659 cm-1处出现L-抗坏血酸的特征基团C=O、C=C的伸缩振动吸收峰；在2929 cm-1处出现CH3的C-H伸缩振动吸收峰，在2854cm-1处出现CH2的C-H伸缩振动吸收峰，在1695 cm-1处出现链上酯羰基C=O的伸缩振动吸收峰，在724 cm-1处出现 (CH2)n (n≥4)的吸收峰，而这四处振动在L-抗坏血酸的红外图谱上并未发现，说明产物中存在链状酯键和4个碳以上的烷基，因此可证明正辛酸和L-抗坏血酸发生了酯化反应。由质谱图（图2）可以看出，分子离子峰301.5为(M-1)峰，347.6为加甲酸峰(M-H+HCOOH)，625.8为二聚体加钠峰(2M-H+Na)，可知产物的分子量约为302，与 L-抗坏血酸辛酸酯一致。由核磁共振图（图3~4）可知，13C(CD3OD)：δ(ppm)=175.824(C-1’=O)，173.412(C-1=O)，155.259(C-2’)，121.286(C-3’)，78.104(C-4’)，68.606(C-5’)，67.549(C-6’)，36.487(C-2)，34.198(C-6)，31.497、31.438 (C-4~C-5)，27.478(C-3)，25.117(C-7)，17.014(C-8)；1H(600MHz，CD3OD)：δ(ppm)= 11.058(s，1H， OH-2’)，8.348(s，1H， OH-3’)，5.266(s，1H， OH-5’)，4.640(d，J=2.4Hz，1H，H-4’)，4.032~3.287(m，3H，H-5’和H-6’)，2.472~ 2.288(t，J=7.8 Hz，2H，H-2)，1.501(m，2H，H-3)，1.231(m，8H，H-4~H-7)，0.827(t，J=6.6 Hz，3H，H-8)。每个峰均能找到合理的归属，且氢和碳的个数与目标化合物基本一致。氢谱数据显示产物2’、3’、5’位碳上有羟基，6’位碳上无羟基，说明酯化反应可能发生在6’羟基上。综合上述结果可以判定，本实验中合成的产物为L-抗坏血酸辛酸酯，且酯化反应发生在L-抗坏血酸的第六位羟基上。
本发明的有益效果体现在以下方面：
1. 本发明将中链脂肪酸正辛酸引入到L-抗坏血酸中，使其具有了较低的熔融温度、熔融焓、结晶温度和较高的结晶焓，大大增加了其油溶性和减少低温时的结晶析出，稳定性也有所提高。L-抗坏血酸辛酸酯对自由基的清除能力和对油脂的抗氧化能力普遍优于传统L-抗坏血酸长链脂肪酸酯，还具有较强的乳化性能和起泡性能，可以媲美甚至优于常用乳化剂。同时中链脂肪酸正辛酸还赋予L-抗坏血酸辛酸酯一定的抑菌活性。所以，L-抗坏血酸辛酸酯是一种很有发展潜力的多功能天然抗氧化剂。
2. 本发明首次提供了一种L-抗坏血酸辛酸酯的制备方法，探索了以中链脂肪酸正辛酸和L-抗坏血酸为原料，在有机相体系中利用固定化脂肪酶催化酯化反应合成、采用有机溶剂萃取结晶法或硅胶柱层析法分离纯化得到L-抗坏血酸辛酸酯产品的新途径。
3. 本发明反应条件温和、副反应少、工艺简单、产物易分离、产品品质高。与传统酰基供体为长链脂肪酸相比，以中链脂肪酸为酰基供体，能在较短的时间内达到较高的底物酯化转化率，可达90%，分离纯化也相对简单，产物纯度及回收率均较高，回收率可达85%，产物纯度可达98%，且脂肪酶有很好的重复利用效果，在使用50~80次后酶活仍能保持原来的60~75%，这些特点均有利于降低生产成本，在工业化生产中具有一定的优势。
附图说明
图1 为制得的L-抗坏血酸辛酸酯的红外光谱图。
图2 为制得的L-抗坏血酸辛酸酯的质谱图。
图3 为制得的L-抗坏血酸辛酸酯的核磁共振碳谱图。
图4 为制得的L-抗坏血酸辛酸酯的核磁共振氢谱图。
具体实施方式
下面通过实施例，对本发明作进一步详细说明。
实施例1
制备L-抗坏血酸辛酸酯的具体操作步骤如下：
（1）酶法合成L-抗坏血酸辛酸酯
取干净的150mL具塞锥形瓶，在瓶中放入0.704g L-抗坏血酸、3.456g正辛酸和0.141g诺维信公司的Novozym 435固定化脂肪酶，加入20mL叔丁醇和1.2g 4?分子筛，塞紧塞子，用保鲜膜将瓶口包实，辅以橡皮筋，确保体系密封。将锥形瓶置于55℃、150r/min的恒温水浴振荡摇床中反应10h，得到含L-抗坏血酸辛酸酯的反应液，L-抗坏血酸酯化转化率达87.5%。
（2）反应液中L-抗坏血酸辛酸酯的分离纯化
反应完成后，反应液经抽滤除去4?分子筛、脂肪酶和未反应的L-抗坏血酸，所得滤液经真空旋转蒸发除去溶剂，用20mL乙酸乙酯溶解，再加入60mL水洗涤，充分混匀，置于分液漏斗中静置分层，取有机层真空旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到粘稠液体状的含L-抗坏血酸辛酸酯的反应混合物；
采用有机溶剂结晶法，将反应混合物边搅拌边加入温度15℃的正己烷25mL，搅拌5min，结晶析出，抽滤得粗产物，加入10mL体积比1:3的二氯甲烷:正己烷的混合溶剂，35℃水浴加热搅拌溶解，然后在室温（25℃）下边冷却边搅拌至结晶析出，抽滤，真空干燥，得到0.915g纯度为95.5%的L-抗坏血酸辛酸酯，产品回收率为82.7%。
表1  纯度为95.5%的L-抗坏血酸辛酸酯的结构、性质检测结果
对纯度为95.5%的L-抗坏血酸辛酸酯进行结构鉴定、性质研究，具体检测结果见上表1。
实施例2
操作步骤同实施例1，不同之处在于：反应混合物水洗后经过硅胶柱层析法分离。将24g规格200~300目的硅胶浸泡于洗脱剂中，洗脱剂为体积比1:1的乙酸乙酯:石油醚的混合溶剂，溶胀30min，湿法装柱（16×500mm），用洗脱剂平衡30min后上样，所上样为含L-抗坏血酸辛酸酯的反应混合物，上样量2.1g，上样浓度0.5g/mL（用洗脱剂稀释），吸附平衡，洗脱剂洗脱，流速为1mL/min，大约1个柱体积后开始收集，2个柱体积后停止收集，将收集液真空旋转蒸发得到L-抗坏血酸辛酸酯，重复两次。得到0.827g纯度为97.5%的L-抗坏血酸辛酸酯，产品回收率为76.3%。
表2  纯度为97.5%的L-抗坏血酸辛酸酯的结构、性质检测结果
对纯度为97.5%的L-抗坏血酸辛酸酯进行结构鉴定、性质研究，具体检测结果见上表2。
实施例3
制备L-抗坏血酸辛酸酯的具体操作步骤如下：
（1）酶法合成L-抗坏血酸辛酸酯
取干净的250mL圆底烧瓶，在瓶中加入4.225g L-抗坏血酸、20.735g正辛酸和0.81g诺维信公司的Novozym 435固定化脂肪酶，加入100mL叔戊醇和6g 4?分子筛，用保鲜膜将瓶口密封。将圆底烧瓶置于55.3℃、150r/min的恒温水浴蒸发器上反应11.5h，得到含L-抗坏血酸辛酸酯的反应液，L-抗坏血酸酯化转化率达90.3%。
（2）反应液中L-抗坏血酸辛酸酯的分离纯化
反应完成后，反应液经抽滤除去4?分子筛、脂肪酶和未反应的L-抗坏血酸，所得滤液经真空旋转蒸发除去溶剂，用100mL乙酸乙酯溶解，再加入300mL水洗涤，充分混匀，置于分液漏斗中静置分层，取有机层真空旋转蒸发除去乙酸乙酯。得到粘稠液体状的含L-抗坏血酸辛酸酯的反应混合物；
采用有机溶剂结晶法，将反应混合物边搅拌边加入温度15℃的正庚烷150mL，搅拌7min，结晶析出，抽滤得粗产物，加入50mL体积比1:30的正丁醇:正己烷的混合溶剂，40℃水浴加热搅拌溶解，然后在室温（25℃）下边冷却边搅拌至结晶析出，抽滤，真空干燥，得到5.885g纯度为95.0%的L-抗坏血酸辛酸酯，产品回收率为85.4%。
表3  纯度为95.0%的L-抗坏血酸辛酸酯的结构、性质检测结果
对纯度为95.0%的L-抗坏血酸辛酸酯进行结构鉴定、性质研究，具体检测结果见上表3。
实施例4
操作步骤同实施例3，不同之处在于：反应混合物水洗后经过硅胶柱层析法分离。将28g 规格200~300目的硅胶浸泡于洗脱剂中，洗脱剂为体积比1:1的乙酸乙酯:石油醚的混合溶剂，溶胀30min，湿法装柱（16×500mm），用洗脱剂平衡30min后上样，所上样为含L-抗坏血酸辛酸酯的反应混合物，上样量4g，上样浓度0.4g/mL（用洗脱剂稀释），吸附平衡，洗脱剂洗脱，流速为0.8mL/min，大约1个柱体积后开始收集，2个柱体积后停止收集，将收集液真空旋转蒸发得到L-抗坏血酸辛酸酯，重复六次。得到5.053g纯度为98.2%的L-抗坏血酸辛酸酯，产品回收率为75.8%。
表4  纯度为98.2%的L-抗坏血酸辛酸酯的结构、性质检测结果
对纯度为98.2%的L-抗坏血酸辛酸酯进行结构鉴定、性质研究，具体检测结果见上表4。
实施例5
制备L-抗坏血酸辛酸酯的具体操作步骤如下：
（1）酶法合成L-抗坏血酸辛酸酯
称取105.6g L-抗坏血酸、518.4g正辛酸和21.12g诺维信公司的Novozym 435固定化脂肪酶于5L反应釜中，加入3L丙酮和180g 4?分子筛，密封体系。在温度55℃、搅拌速度100r/min的条件下反应12h，得到含L-抗坏血酸辛酸酯的反应液，L-抗坏血酸酯化转化率达89.5%。
（2）反应液中L-抗坏血酸辛酸酯的分离纯化
反应完成后，反应液经过滤除去4?分子筛、脂肪酶和未反应的L-抗坏血酸，所得滤液经真空旋转蒸发除去溶剂，用1.5L乙酸乙酯溶解，再加入4.5L水洗涤，充分混匀，静置分层，取有机层真空旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到粘稠液体状的含L-抗坏血酸辛酸酯的反应混合物；
采用有机溶剂结晶法，将反应混合物边搅拌边加入温度15℃的环己烷3.75L，搅拌10min，结晶析出，过滤得粗产物，加入1.5L体积比1:3的二氯甲烷:正己烷的混合溶剂，35℃水浴加热搅拌溶解，然后在室温（25℃）下边冷却边搅拌至结晶析出，过滤，真空干燥，得到145.40g纯度为95.7%的L-抗坏血酸辛酸酯，产品回收率为85.8%。
表5  纯度为95.7%的L-抗坏血酸辛酸酯的结构、性质检测结果
对纯度为95.7%的L-抗坏血酸辛酸酯进行结构鉴定、性质研究，具体检测结果见上表5。

Claims (8)

1.一种L-抗坏血酸辛酸酯，其特征在于：L-抗坏血酸辛酸酯的结构如下式所示：
；
L-抗坏血酸辛酸酯微溶于水，可溶于乙醇、乙酸乙酯，在植物油中的溶解度900~2000mg/kg；熔融温度62℃，结晶温度22℃；清除自由基的EC50值＜0.62mg/mL；HLB值11.5，临界胶束浓度1×10-4 mol/L；对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度≤1.4g/L；添加量为0.02%时，食用油脂在40℃下的氧化诱导期延长至16~36d。
2.制备权利要求1所述的L-抗坏血酸辛酸酯的方法，其特征在于具体操作步骤如下：
（1）酶法合成L-抗坏血酸辛酸酯
取L-抗坏血酸、正辛酸和Novozym 435固定化脂肪酶加入到反应介质中，L-抗坏血酸的初始浓度为0.1~0.25 mol/L，正辛酸与L-抗坏血酸的摩尔比为4:1~8:1，Novozym 435固定化脂肪酶用量为L-抗坏血酸质量的15~20%；然后加入4?分子筛，4?分子筛的加入量为50~100mg/mL，密封体系，在55~60℃、振荡摇床转速100~150r/min条件下，反应8~12h，得到含L-抗坏血酸辛酸酯的反应液；
（2）反应液中L-抗坏血酸辛酸酯的分离纯化
将所述反应液抽滤除去分子筛、脂肪酶和未反应的L-抗坏血酸，所得的滤液经真空旋转蒸发除去溶剂，加入乙酸乙酯溶解，乙酸乙酯的加入量为2~6mL/g，用2~4倍乙酸乙酯体积的水洗涤，充分混匀，静置分层，取有机层真空旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到含L-抗坏血酸辛酸酯的反应混合物；
将所述反应混合物采用有机溶剂结晶法或硅胶柱层析法处理，得到L-抗坏血酸辛酸酯，所述L-抗坏血酸辛酸酯的纯度大于95.0%。
3.根据权利要求2所述的制备L-抗坏血酸辛酸酯的方法，其特征在于：步骤（2）所述有机溶剂结晶法的具体操作如下：将含L-抗坏血酸辛酸酯的反应混合物边搅拌边加入5~15℃的烷烃类有机溶剂，烷烃类有机溶剂的加入量为6~8mL/g，搅拌时间5~10min，结晶析出，抽滤得粗产物；加入有机溶剂，在35~50℃下搅拌溶解，有机溶剂的加入量为5~15mL/g，然后在5~25℃下边冷却边搅拌至结晶析出，抽滤，真空干燥即得L-抗坏血酸辛酸酯。
4.根据权利要求2所述的制备L-抗坏血酸辛酸酯的方法，其特征在于：步骤（2）所述硅胶柱层析法的具体操作如下：将200~300目的20~30g硅胶浸泡于洗脱剂中，硅胶溶胀30min，湿法装柱（16×500mm），用洗脱剂平衡30min后上样，上样量2~4g，上样浓度0.4~0.6g/mL，吸附平衡，洗脱剂洗脱，流速为0.5~1.5mL/min，大约1个柱体积后开始收集，2~3个柱体积后停止收集，将收集液真空旋转蒸发，得到L-抗坏血酸辛酸酯。
5.根据权利要求2所述的制备L-抗坏血酸辛酸酯的方法，其特征在于，步骤（1）所述反应介质为叔丁醇或叔戊醇或丙酮。
6.根据权利要求3所述的制备L-抗坏血酸辛酸酯的方法，其特征在于，所述烷烃类有机溶剂为正己烷或正庚烷或异辛烷或环己烷。
7.根据权利要求3所述的制备L-抗坏血酸辛酸酯的方法，其特征在于，所述有机溶剂为体积比1:2~1:4的二氯甲烷:正己烷的混合溶剂或体积比1:30~1:40的正丁醇:正己烷的混合溶剂或体积比1:3~1:4的氯仿:正己烷的混合溶剂。
8.根据权利要求4所述的制备L-抗坏血酸辛酸酯的方法，其特征在于，所述洗脱剂为体积比1:1的乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂。
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