CN104825454B - 一种尿素通道蛋白抑制剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种尿素通道蛋白抑制剂优必的应用。其结构式如所示。本发明应用红细胞模型筛选得到抑制尿素通道蛋白的化合物，实验结果表明，该类化合物（如优必）可抑制尿素通道蛋白UT‑B介导的红细胞膜对尿素的通透，且其作用呈剂量依赖关系；在有效剂量范围内优必对MDCK细胞无细胞毒性作用，说明优必抑制细胞通透尿素的作用与其细胞毒性无关；优必对尿素通道蛋白UT‑B的抑制作用逐渐增强；优必对UT‑B的抑制作用是可逆的；体内试验结果表明，优必可显著增多大鼠排尿量；降低大鼠尿中尿素的浓度；并降低其渗透压，表明优必在体内产生了尿素选择性利尿作用。

Description

一种尿素通道蛋白抑制剂的应用

技术领域

本发明涉及一种尿素通道蛋白抑制剂优必的应用。

背景技术

1.利尿剂目前应用和研发热点

利尿药作用于肾脏，可增加水的排出。临床上主要用于治疗各种原因引的水肿，也可用于治疗一些非水肿性疾病，如作为一线药可单独使用或与其他药物配伍使用治疗高血压，降低心脑血管疾病的发生率和病死率。目前常用的利尿药主要分为三类：高效能利尿药、中效能利尿药、低效能利尿药。高效能利尿药和中效能利尿药主要分别通过特异性的抑制髓袢升支Na⁺/K⁺/2Cl^-共同转运子和远曲小管Na⁺/Cl^-共同转运子，抑制NaCl的重吸收，降低肾的尿浓缩功能，排出大量接近于等渗的尿液。但长期使用这些利尿药可造成电解质紊乱，如低血钾，低血钠、低血镁等。临床应用的低效能利尿药主要是一些保钾利尿药，通过在集合管和远曲小管拮抗醛固酮，表现出排钠保钾的作用，长期使用可引起高血钾等不良反应[Mann SJ.The silent epidemic of thiazide-induced hyponatremia,JClinHypertens,2008,10:477-84]。因此，寻找和开发不引起电解质紊乱的新型利尿药是利尿药物开发研究的热点。尿素通道蛋白(UT)在尿浓缩机制中起非常重要作用，选择性敲除尿素通道可阻断肾内尿素循环通路，降低尿浓缩能力，在不影响Na⁺、K⁺、Cl^-排泄的情况下，产生尿素选择性利尿作用。尿素通道蛋白抑制剂可作为利尿药，在不明显影响机体电解质平衡的情况下，减低肾内尿素循环建立的肾内渗透压差，从而产生利尿作用，适合高血压等慢性病病人长期使用。因此，以尿素通道蛋白作为药物靶点研发新型利尿药将会给高血压及伴发心脑血管疾病的患者带来福音。

2.尿浓缩机制和肾内尿素循环过程

正常人每天形成的原尿约有180升，而实际每天排出的终尿量只有1.5升左右。尿素是尿液中含量最丰富的溶质，占尿中溶质总量的40～50％，尿中尿素浓度可高达血浆尿素浓度的100倍以上[Yang B and Bankir L.Renal handling of urea in transgenicmice lacking the urea transporter UT-B,Am J Physiol Renal Physiol,2005,288:F881-F896]。尿素是参与尿浓缩机制的主要溶质，其以肾内尿素循环机制，通过逆流倍增和逆流交换过程，浓度由外髓向内髓组织逐渐增加，和氯化钠一起形成肾皮质至肾髓质的渗透压梯度，从而使肾脏能够有效地浓缩尿液使水和某些溶质有效地被回吸收。肾脏内尿素循环机制具体包括：(1)集合管在加压素调控下对水的重吸收和对尿素的不通透，导致尿素在集合管内高度浓缩；(2)内髓集合管末端对尿素渗透性的增 加，使高浓度的尿素渗透到内髓的间质组织；（3）髓质尿素通过内髓的直小血管升支不断的被血液带向肾脏皮质，又通过直小血管降支和髓袢降支细段特定区段对尿素的通透被重新带回髓质，从而维持从肾皮质至肾髓质的尿素梯度和渗透压梯度（见图2），此过程在尿浓缩机制中具有非常重要的作用[Sands JM.Renal urea transporters,CurrOpinNephrolHypertens,2004,13:525–532]，除内髓的直小血管升支内皮细胞以微孔方式通透尿素外，上述各部分对尿素的通透性均由尿素通道（urea transporter，UT）介导[Smith CP and Rousselet G.FacilitativeUrea transporters,J MembrancBiol,2001,183:1-14]。

尿素通道是特异性通透尿素的膜通道蛋白。目前已经克隆了7个成员，分别属于UT-A和UT-B两个亚家族，UT-A亚家族包括6个成员（UT-A1至UT-A6）由同一基因（Slc14a2）经不同启动子调控和转录后剪切所产生[Bagnasco SM.Gene structure of ureatransporters,Am J Physiol,2003,284:F3–F10;Shayakul C and Hediger MA.TheSLC14gene family of urea transporters,Pfluegers Arch,2004447:603–609]，UT-B亚家族只有一个成员UT-B。有5个尿素通道蛋白在肾脏不同部位的表达，UT-A1、UT-A3和UT-A4（UT-A4仅在大鼠表达）在肾脏集合管上皮细胞表达，UT-A2在肾脏髓袢降支细段表达，UT-A5、UT-A6分别在睾丸、结肠中表达。UT-B由另一基因（Slc14a1）表达，定位于肾脏直小血管降支内皮细胞、红细胞和多个组织器官。UT-A1、UT-A2、UT-A3、UT-A4和UT-B介导肾内尿素循环相应部位的尿素通透性，在肾内尿素循环过程中起重要作用，参与尿浓缩机制。

3.尿素通道功能性敲除可产生尿素选择性利尿和降低血压

利用尿素通道基因敲除小鼠模型[Yang B,Bankir L,Gillepsie A.Urea-selective concentrating defect in transgenic mice lacking urea transporterUT-B,J BiolChem,2002,277:10633-10637]进行的肾脏生理学研究结果表明，缺失UT-B的小鼠未表现出生长发育异常。UT-B敲除不影响肾小球滤过率、肾脏重量以及尿中尿素以外其他主要溶质（Na⁺、K⁺、Cl^-）的清除率。但其尿浓缩能力发生了明显改变：尿量增加、尿渗透压降低、尿尿素和血尿素浓度比值仅为野生型小鼠的50%。实验结果表明，UT-B在肾脏直小血管介导的尿素转运占肾脏总尿浓缩能力的三分之一[Bankir L,Chen K and YangB.Renal handling of urea in transgenic mice lacking the urea transporter UT-B,Am J Physiol,2004,286:F144-F151]。UT-Al／UT-A3基因缺失小鼠在基础条件下，尿浓缩能力下降到野生型小鼠尿浓缩能力的35％，其尿量比野生型小鼠高3倍。而且在严格控制摄入液体5天后，它们的尿渗透压并没有提高。UT-A1／UT-A3基因敲除小鼠尿素在肾脏内髓的积聚也显著减少(为正常水平的1／3)[Fenton RA,Chou CL,Stewart GS.Urinaryconcentrating defect in mice with selective deletion of phloretin-sensitiveurea transporters in the renal collecting duct,ProcNatlAcadSci,2004,101:7469-7474;Fenton,R.A.,Flynn A,Shodeinde A.Renal phenotype of UT-A ureatransporterknockout mice,J Am SocNephrol.2005,16:1583–1592]。因此，选择性敲除UT-B或UT-A1/UT-A3可阻断肾内尿素循环通路，降低尿浓缩能力，在不影响Na⁺、K⁺、Cl^-的情况下，产生尿素选择性利尿作用。我们近期研究结果表明，在正常生理状态下用小鼠尾动脉无创血压检测法测量小鼠血压，UT-B敲除小鼠的收缩压（systolic）、舒张压(diastolic)和平均血压(mean)均明显低于野生型小鼠。根据以上研究结果，我们提出尿素通道蛋白抑制剂可研发成为利尿药的科学假说。尿素通道蛋白抑制剂作为利尿药的优点是不影响体液电解质平衡，适合高血压等慢性病患者长期使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种尿素通道蛋白抑制剂优必的应用

本发明提供了一种式I所示化合物的新应用，也即以式I所示化合物或其药学上可接受的盐或可溶性化合物为活性成分的下述任意一种产品：

1）尿素通道蛋白抑制剂；

2）利尿的药物；

3）用于研究尿素通道蛋白的工具药；

所述式I中，R₁、R₂、R₃和R₄相同或不同，均选自如下基团中的任意一种：

氢、苄基、C1-C6的烷基、环丙基、氨基、酰基、卤素、 吗啉基、哌啶基、含有取代基的C1-C6的烷基、含有取代基的环戊基、含有取代基的苯基、含有取代基的哌啶基、含有取代基的苄基、含有取代基的噻吩基、含有取代基的吡啶基、含有取代基的呋喃基和含有取代基的吗啉基；

所述含有取代基的C1-C6的烷基、含有取代基的环戊基、含有取代基的苯基、含有取代基的哌啶基、含有取代基的苄基、含有取代基的噻吩基、含有取代基的吡啶基、 含有取代基的呋喃基和含有取代基的吗啉基中，取代基选自苯基、氨基、C1-C6的酰胺基、甲酰胺基、乙酰胺基、丙酰胺基、甲基亚硝基、卤素、C1-C6的烷基、苯乙酰基、卤素取代的苯基和甲氧基中的至少一种。

具体的，所述C1-C6的烷基具体可为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或正戊基；

所述酰基为3，4，5-三甲氧基苯甲酰基或苯乙酰基。

此外，以上述式I所示化合物或其药学上可接受的盐或可溶性化合物在制备下述任意一种产品中的应用，也属于本发明的保护范围：

1）尿素通道蛋白抑制剂；

2）利尿的药物；

3）用于研究尿素通道蛋白的工具药。

具体的，所述式I中，R₁选自下述基团的至少一种：

2-呋喃甲酰胺基、2-噻吩甲酰胺基、环戊基甲酰胺基、对甲氧基苯甲酰胺基、正丁酰胺基、2-氯苯甲酰胺基、苯甲酰胺基、3-氯苯甲酰胺基、2-氟苯甲酰胺基、乙酰胺基、苯丙酰胺基、N-（3-丙酸乙酯）脲基、噻吩甲基亚硝基、3，4，5-三甲氧基苯甲酰基、苯乙酰基和N-甲基异烟酰胺基；

R₂选自下述基团的任意一种：

对氯苄基、（邻甲苯基）乙酰胺基、N-（邻甲氧基苯基）乙酰胺基、4-（对氯苯基）苄基、4-（间氯苯基）苄基、4-（邻氯苯基）苄基、4-苯基苄基、邻氯苄基、间氯苄基、苄基和对甲氧基苄基；

R₃选自甲基、丙基、苄基和环丙基中的任意一种；

R₄选自氢、吗啉基和哌啶基中的任意一种。

所述式I所示化合物具体为式I-1所示化合物，也即“优必”：

所述尿素通道蛋白抑制剂中，尿素通道蛋白为UT-B和/或UT-A；

所述UT-A具体为UT-A1。

上述式Ⅰ所示化合物的制备方法如图2所示。

由于UT-B的蛋白质结构已经被阐明[Levin EJ,Cao Y and ZhouM.Structureandpermeationmechanismof a mammalian urea transporter.ProcNatlAcadSci,2012,109:11194-9.Levin EJ,Quick M,and Zhou M.Crystal structure of abacterial homologue of the kidney urea transporter.Nature,2009,462,757-761],为筛选尿素通道抑制剂和研究其抑制作用机制奠定了理论基础。发明人的前期研究结果表明，UT-B介导的红细胞膜尿素通透性是脂质双层膜尿素通透性的50倍[Yang B,andVerkman AS.Analysis of double knockout mice lacking aquaporin-1and ureatransporter UT-B.Evidence for UT-B-facilitated water transport inerythrocytes,J BiolChem,2002,277:36782-36786]，UT-B除通透尿素还通透水和尿素类似物乙酰胺[Zhao D,Sonawane ND,Levin MH,and Yang B.Comparative transportefficiencies of urea analogues through urea transporter UT-B,BiochimBiophysActa,2007,1768:1815-1821]。根据红细胞膜高水平表达水通道蛋白AQP1（特异性通透水的膜蛋白）和尿素通道蛋白UT-B的特性，发明人所在的研究组建立了尿素通道抑制剂的高通量筛选模型[Marc H.Levin,Ricardo de la Fuente,and A.S.Verkman.Urearetics:asmall molecule screen yields nanomolar potency inhibitors of urea transporterUT-B,The FASEB J,2007,21:551-563]，将红细胞放在1.25M乙酰胺(UT-B通透乙酰胺的速度慢于通透尿素，适于测量通透性抑制作用)生理盐水溶液中，使红细胞内含有高浓度的乙酰胺，再将红细胞快速放到等渗生理盐水中。细胞内高浓度乙酰胺产生的高渗透压将水通过AQP1快速转运至细胞内，乙酰胺在细胞内外浓度差的作用下通过UT-B快速转运出细胞，使红细胞内外渗透压迅速到达平衡，细胞体积变化不明显。如果尿素通道被阻断，细胞内乙酰胺不能快速转运出细胞，所致的细胞内外渗透压差将水通过AQP1快速转运进入细胞，从而引起红细胞体积迅速增大以致破裂。红细胞破裂释放血红蛋白的量，可作为化合物对尿素通道蛋白UT-B抑制活性的评价指标。酶标仪测710nm吸光度值，可计算红细胞溶解率。

本发明利用尿素通道抑制剂筛选模型通过高通量筛选系统从合成的小分子化合物库中筛选到具有尿素通道UT-B抑制活性的线索化合物。从线索化合物650个衍生物（化学结构见表1）中筛出量效关系最好的候选化合物“优必”，其结构见式Ⅰ-1。优必和其部分衍生物具有较强的抑制UT-B及UT-A通透尿素的活性，其在体外对尿素通道UT-B抑制的半数有效剂量在微摩尔水平以下，且没有明显细胞毒性。体内实验发现：体内给予优必可显著增加大鼠尿量，降低尿尿素水平，同时降低尿渗透压，表明具有很好的尿素选择性利尿作用。

附图说明

图1为红细胞尿素通道抑制剂筛选模型。

图2为优必对红细胞的裂解率。

图3为红细胞高通量筛选模型筛选条件优化图。

图4为优必的细胞毒作用。

图5为优必对MDCK细胞UT-A通透尿素的抑制作用。

图6为大鼠皮下注射优必利尿作用的时效曲线。

图7为优必对各种参数的影响图（平均值+标准差，n=6）。

图8为优必和氢氯噻嗪对肾脏内髓组织的影响图（平均值+标准差，n=6）。

图9为优必对各种参数的影响图（平均值+标准差，n=6）。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、UT-B抑制剂的筛选和药效学评价

1、筛选试验方法

1）取血，置于15ml刻度离心管（悬于含有肝素钠的PBS）中，离心，3000r/min，10min，弃上清；

2）加入与血等量的PBS，离心，3000r/min，10min，弃上清；

3）用含1.25M乙酰胺的高渗PBS稀释红细胞至比容为2%的细胞悬液；

4）红细胞悬液置于室温孵育2h使细胞内外乙酰胺浓度平衡，定时用移液器进行混合；

5）取99μl上述红细胞悬液置于96孔圆底微孔板各孔中，然后加入1μl待测化合物（如优必），混匀，室温孵育6min（待测化合物终浓度为20μM，DMSO终浓度为1%）；

6）另取96孔平底黑壁微孔板，每孔加入180μl等渗PBS(含1%DMSO)；

7）取上述步骤5）红细胞悬液20μl，迅速加入96孔板中，快速混匀；

8）5min内用酶标仪测吸光度值，波长710nm；

9）每块微孔板均设阳性对照孔（非特异性UT-B抑制剂phloretin）、阴性对照孔（PBS）。

计算红细胞溶解率：

红细胞的溶解率百分比计算公式，其中A_test是测试孔的吸光度值，A_neg是阴性对照孔的吸光度值，A_pos是阳性对照孔的吸光度值。通过测吸收波长710计算红细胞裂解率，吸光度值稳定，至少一小时吸光度值无变化，结果见图2。

2、红细胞高通量筛选模型筛选条件优化

用不同浓度的乙酰胺（0-3.0M）孵育红细胞，测710nm的吸光度值，绘制量效曲线，乙酰胺浓度为1.1-1.25M时，阳性对照组（phloretin）与溶剂对照组的吸光度值差值最大，因此选择1.1-1.25M的乙酰胺进行后续实验，结果见图3。

3、发现尿素通道抑制剂线索化合物

为增加发现尿素通道线索化合物的机会，本项目组首先根据UT-B蛋白分子结构，以计算机化学模拟方法对具有式I母环结构的化合物进行计算机模拟筛选，选出2319个化合物，将上述化合物溶于DMSO，在96孔微孔板中稀释成1mM浓度应用液作为筛选化合物库。

取人、兔（日本大耳白家兔）、大鼠（SD大鼠）、小鼠（C57小鼠）四个种属的红细胞，以红细胞尿素通道抑制剂筛选模型，对上述筛选化合物库进行尿素通道抑制剂的初步筛选，筛选化合物浓度为10M，重复筛选一次，确定线索化合物。

4、线索化合物特异性抑制尿素通道

为了确定线索化合物作用特异性，分别用等渗PBS或1.25M乙酰胺PBS平衡红细胞，线索化合物（10μM）孵育后，快速转移至等渗PBS中，检测红细胞裂解率。结果为：用等渗PBS孵育的红细胞，未见红细胞明显裂解，而用1.25M乙酰胺PBS孵育的红细胞，红细胞裂解。表明红细胞的破裂是线索化合物特异性抑制尿素通道蛋白的尿素通透性所致。

5.确定最佳线索化合物

以所获得的线索化合物结构的母核为基础，进行取代基的替换化学结构类似物，建立二次筛选小分子库，应用上述模型和方法筛选和确定活性，获得剂量效应实验结果（表1）（注：表1中的IC50是人红细胞溶解率为50%时的浓度）。

经分析比较，选择对四个种属均有较好抑制作用的式I-1所示化合物作为优选化合物，命名为优必，优必和其他化合物的化学结构式见表1。

6.优必化合物无明显细胞毒性

为了研究上述化合物的细胞毒性，利用CCK-8试剂盒（同仁化学研究所），完成了MDCK细胞毒性试验，结果见图4，表明化合物优必无显著细胞毒作用。

本研究用CCK-8试剂盒检测化合物细胞毒性：将对数生长期的MDCK细胞悬液接种于96孔培养板（1×10⁴个细胞/孔/100μl），每孔给予100μl含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养液，置37℃、5%CO2培养 箱中培养。当细胞70%-80%融合时，血清饥饿12h进行同步化。然后每孔给予100μl含有不同浓度（0.128,0.64,3.2,16和80μM）化合物的DMEM培养液，培养12h。每孔给予10μl CCK-8检测液，37℃避光孵育1h，检测470nmOD值。同时设置空白孔（培养基、CCK-8），对照孔（细胞、相同浓度化合物的溶解介质、培养基、CCK-8），每组设3复孔。计算细胞存活率：

细胞存活率（%）=[（OD实验孔－OD空白孔）/（OD对照孔－OD空白孔）]×100%

其中，OD是指各孔的吸光度值。

7.优必特异性抑制尿素通道UT-A

为确定优必对UT-A的抑制作用，将稳定表达UT-A1的MDCK细胞在Transwell中培养成紧密的单细胞层，用forskolin刺激UT-A蛋白转移至细胞质膜，用优必孵育15min，将Transwell下面的培养液换成含有15mM尿素的培养液，在特定时间检测Transwell上面培养液中的尿素浓度，评价优必对UT-A尿素通透性的抑制作用。

实验结果表明，优必显著抑制UT-A1介导的尿素通透性（图5A），其抑制活性与阳性对照化合物非特异性尿素通道抑制剂phloretin抑制强度相同（图5B），提示优必对UT-B和UT-A有相同的抑制活性。

8.优必具有利尿作用

选用8周龄雄性SD大鼠，体重180-200g。预先置于代谢笼中2日适应环境，观察自由饮水饮食条件下尿量是否稳定。于第三日晨8-10点收集两小时尿液，然后皮下注射不同剂量优必（3.125、12.5、50、100mg/kg体重），此后收集每2小时尿液，一共收集给药后八个小时。把给药前后每2小时的尿液各自进行充分混合，测量尿量、尿渗透压值（U_osm）、尿尿素(U_urea)水平。

优必对大鼠尿量的影响见（图6A），给药后随着时间的变化，大鼠单位时间排尿量逐渐增加，给药2～4小时后，单位时间排尿量达到最高峰，平台期持续2～4小时，之后开始下降。给药后6～8小时的尿量和给药前相比仍有显著增加（P<0.05）。

优必对大鼠尿渗透压和尿尿素浓度影响的时效曲线分别如（图6B）和（图6C）所示，给药后随着时间的变化，尿渗透压和尿尿素浓度逐渐降低，在2～4小时达到谷底，然后回升，渗透压水平与尿素浓度变化一直，只是数值更大，表明尿渗透压的变化主要由尿中尿素浓度变化所引起，二者变化规律与尿量变化相反，提示尿素选择性利尿。

每6小时皮下注射50mg/kg优必一次，连续注射5次，收集24小时尿液，测量24小时尿量、尿渗透压(U_osm)、尿尿素(U_urea)、渗透溶质排泄量、尿素排泄量和非尿素溶质排泄量。

实验结果表明，50mg/kg剂量的优必明显增加尿量（图7A）、降低尿渗透压（图 7B）和尿尿素浓度（图7C），而对单位时间渗透溶质排泄量（图7D）、尿素排泄量（图7E）和非尿素溶质排泄量（图7F）没有明显影响。相比之下，阳性对照药物氢氯噻嗪（HCTZ）在利尿作用同时，明显增加渗透溶质的排泄量（图7D），而其主要是由于非尿素溶质（主要是钠、钾、氯离子）排泄量增加引起（图7F）。给药前后的尿素排泄率相似,表明优必产生的利尿作用是由优必影响肾内尿素循环所致尿浓缩能力降低所致，其不引起明显的钠、钾、氯离子丢失。

对上述实验大鼠的肾脏内髓组织的渗透压（图8A）、尿素水平（图8B）和非尿素溶质水平（图8C）进行检测可知，优必引起肾脏内随组织渗透压和尿素水平明显降低，而对内随组织的非尿素溶质没有明显影响。相比之下，氢氯噻嗪不改变肾脏内髓组织的渗透压、尿素和非尿素水平。

这些实验结果提示优必通过阻断肾内尿素循环，改变了肾内髓组织的尿素浓度，使从肾皮质至肾髓质组织的渗透压梯度降低，通过降低尿浓缩能力产生利尿作用。

给大鼠禁水18小时，然后每6小时皮下注射50mg/kg优必，在第24小时收集尿液，测尿渗透压、尿尿素和尿非尿素溶质水平，发现即使在禁水的情况下，注射优必的大鼠的尿渗透压（U_osm，图9A）、尿尿素(U_urea，图9B)水平仍然低于对照大鼠，而非尿素溶质（U_{non-urea solutes}，图9C）水平没有明显变化，证实优必在最大尿浓缩能力的情况下仍有较强的利尿作用，且优必的利尿作用不影响钠、钾、氯等非尿素溶质。血生化检测指标表明，优必作用24小时后，血Na⁺、K⁺、Cl^-、尿素、肌酐、血脂均未发生改变，相比之下，氢氯噻嗪引起血Na⁺、K⁺、Cl^-水平降低，尿素水平增高，血胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白均升高。提示优必不引起电解质丢失和代谢异常。

表1筛选的化合物的结构式及IC₅₀值

Claims (1)

1.式I-1所示化合物或其药学上可接受的盐在制备利尿的药物中的应用；