CN110627809B - 多取代噻吩并[2,3-b]吡啶衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents

多取代噻吩并[2,3-b]吡啶衍生物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了多取代噻吩并[2,3‑b]吡啶衍生物及其制备方法与应用。结构式如I所示。本发明应用红细胞模型筛选得到抑制尿素通道蛋白的化合物，实验结果表明，该类化合物(如式I‑1所示化合物)可抑制尿素通道蛋白UT‑B介导的红细胞膜对尿素的通透，且其作用呈剂量依赖关系；在有效剂量范围内式I‑1所示化合物对MDCK细胞无细胞毒性作用，说明式I‑1所示化合物抑制细胞通透尿素的作用与其细胞毒性无关；式I‑1所示化合物对尿素通道蛋白UT‑B的抑制作用逐渐增强；式I‑1所示化合物对UT‑B的抑制作用是可逆的；体内试验结果表明，式I‑1所示化合物可显著增多大鼠排尿量；降低大鼠尿中尿素的浓度；并降低其渗透压，表明式I‑1所示化合物在体内产生了尿素选择性利尿作用。

Description

多取代噻吩并[2,3-b]吡啶衍生物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及利尿和降压药物领域，具体涉及多取代噻吩并[2,3-b]吡啶衍生物及其制备方法与应用。
背景技术
1.利尿药目前应用和研发热点
利尿药作用于肾脏，可增加水的排出。临床上主要用于治疗各种原因引起的水肿，也可用于治疗一些非水肿性疾病，如作为一线药可单独使用或与其他药物配伍使用治疗高血压，降低心脑血管疾病的发生率和病死率。目前常用的利尿药主要分为三类：高效能利尿药、中效能利尿药、低效能利尿药。高效能利尿药和中效能利尿药主要分别通过特异性的抑制髓袢升支Na+/K+/2Cl-共同转运子和远曲小管Na+/Cl-共同转运子，抑制NaCl的重吸收，降低肾的尿浓缩功能，排出大量接近于等渗的尿液。但长期使用这些利尿药可造成电解质紊乱，如低血钾，低血钠、低血镁等。临床应用的低效能利尿药主要是一些保钾利尿药，通过在集合管和远曲小管拮抗醛固酮，表现出排钠保钾的作用，长期使用可引起高血钾等不良反应[Mann SJ.The silent epidemic of thiazide-induced hyponatremia,JClinHypertens,2008,10:477-84]。因此，寻找和开发不引起电解质紊乱的新型利尿药是利尿药物开发研究的热点。
尿素通道蛋白(UT)在尿浓缩机制中起非常重要作用，选择性敲除尿素通道可阻断肾内尿素循环通路，降低尿浓缩能力，在不影响Na+、K+、Cl-排泄的情况下，产生尿素选择性利尿作用。尿素通道蛋白抑制剂可作为利尿药，在不明显影响机体电解质平衡的情况下，减低肾内尿素循环建立的肾内渗透压差，从而产生利尿作用，适合高血压等慢性病病人长期使用。因此，以尿素通道蛋白作为药物靶点研发新型利尿药将会给高血压及伴发心脑血管疾病的患者带来福音。
2.尿浓缩机制和肾内尿素循环过程
正常人每天形成的原尿约有180升，而实际每天排出的终尿量只有1.5升左右。尿素是尿液中含量最丰富的溶质，占尿中溶质总量的40～50％，尿中尿素浓度可高达血浆尿素浓度的100倍以上[Yang B and Bankir L.Renal handling of urea in transgenicmice lacking the urea transporter UT-B,Am J Physiol Renal Physiol,2005,288:F881-F896]。尿素是参与尿浓缩机制的主要溶质，其以肾内尿素循环机制，通过逆流倍增和逆流交换过程，浓度由外髓向内髓组织逐渐增加，和氯化钠一起形成肾皮质至肾髓质的渗透压梯度，从而使肾脏能够有效地浓缩尿液使水和某些溶质有效地被回吸收。肾脏内尿素循环机制具体包括：(1)集合管在加压素调控下对水的重吸收和对尿素的不通透，导致尿素在集合管内高度浓缩；(2)内髓集合管末端对尿素渗透性的增加，使高浓度的尿素渗透到内髓的间质组织；(3)髓质尿素通过内髓的直小血管升支不断的被血液带向肾脏皮质，又通过直小血管降支和髓袢降支细段特定区段对尿素的通透被重新带回髓质，从而维持从肾皮质至肾髓质的尿素梯度和渗透压梯度，此过程在尿浓缩机制中具有非常重要的作用[SandsJM.Renal urea transporters,Curr Opin Nephrol Hypertens,2004,13:525–532]，除内髓的直小血管升支内皮细胞以微孔方式通透尿素外，上述各部分对尿素的通透性均由尿素通道(urea transporter，UT)介导[Smith CP and Rousselet G.Facilitative Ureatransporters,J MembrancBiol,2001,183:1-14]。
尿素通道是特异性通透尿素的膜通道蛋白。目前已经克隆了7个成员，分别属于UT-A和UT-B两个亚家族，UT-A亚家族包括6个成员(UT-A1至UT-A6)由同一基因(Slc14a2)经不同启动子调控和转录后剪切所产生[Bagnasco SM.Gene structure of ureatransporters,Am J Physiol,2003,284:F3–F10；Shayakul C and Hediger MA.The SLC14gene family of urea transporters,Pfluegers Arch,2004 447:603–609]，UT-B亚家族只有一个成员UT-B。有5个尿素通道蛋白在肾脏不同部位的表达，UT-A1、UT-A3和UT-A4(UT-A4仅在大鼠表达)在肾脏集合管上皮细胞表达，UT-A2在肾脏髓袢降支细段表达，UT-A5、UT-A6分别在睾丸、结肠中表达。UT-B由另一基因(Slc14a1)表达，定位于肾脏直小血管降支内皮细胞、红细胞和多个组织器官。UT-A1、UT-A2、UT-A3、UT-A4和UT-B介导肾内尿素循环相应部位的尿素通透性，在肾内尿素循环过程中起重要作用，参与尿浓缩机制。
3.尿素通道功能性敲除可产生尿素选择性利尿和降低血压
利用尿素通道基因敲除小鼠模型[Yang B,Bankir L,Gillepsie A.Urea-selective concentrating defect in transgenic mice lacking urea transporterUT-B,J Biol Chem,2002,277:10633-10637]进行的肾脏生理学研究结果表明，缺失UT-B的小鼠未表现出生长发育异常。UT-B敲除不影响肾小球滤过率、肾脏重量以及尿中尿素以外其他主要溶质(Na+、K+、Cl-)的清除率。但其尿浓缩能力发生了明显改变：尿量增加、尿渗透压降低、尿尿素和血尿素浓度比值仅为野生型小鼠的50％。实验结果表明，UT-B在肾脏直小血管介导的尿素转运占肾脏总尿浓缩能力的三分之一[Bankir L,Chen K and YangB.Renal handling of urea in transgenic mice lacking the urea transporter UT-B,Am J Physiol,2004,286:F144-F151]。UT-Al/UT-A3基因缺失小鼠在基础条件下，尿浓缩能力下降到野生型小鼠尿浓缩能力的35％，其尿量比野生型小鼠高3倍。而且在严格控制摄入液体5天后，它们的尿渗透压并没有提高。UT-A1/UT-A3基因敲除小鼠尿素在肾脏内髓的积聚也显著减少(为正常水平的1/3)[Fenton RA,Chou CL,Stewart GS.Urinaryconcentrating defect in mice with selective deletion of phloretin-sensitiveurea transporters in the renal collecting duct,Proc Natl Acad Sci,2004,101:7469-7474；Fenton,R.A.,Flynn A,Shodeinde A.Renal phenotype of UT-A ureatransporter knockout mice,J Am Soc Nephrol.2005,16:1583–1592]。全部UT敲除小鼠表现出显著性的多尿，日均尿量大约为野生型小鼠的3倍；禁水后，野生型小鼠的尿渗透压升高明显，而全部UT敲除小鼠的尿渗透压升高较平缓。因此，HE染色切片显示，野生型小鼠和全部UT敲除小鼠的肾脏皮质和外髓没有任何组织学异常，在全部UT敲除小鼠的肾脏内髓可以观察到集合管扩张，而野生型小鼠则没有这种现象[Jiang,T.,Li,Y.,Layton,A.T.,Wang,W.,Sun,Y.,Li,M.,Zhou,H.,and Yang,B.(2017).Generation and phenotypicanalysis of mice lacking all urea transporters.Kidney Int 91,338-351]。因此，选择性敲除UT-B或UT-A1/UT-A3可阻断肾内尿素循环通路，降低尿浓缩能力，在不影响Na+、K+、Cl-的情况下，产生尿素选择性利尿作用。
发明内容
本发明的目的是提供一类多取代噻吩并[2,3-b]吡啶衍生物及其制备方法与应用。
本发明所提供的多取代噻吩并[2,3-b]吡啶衍生物，其结构式如式I所示：
Figure GDA0002566626530000031
所述式I中，R1、R2和R3相同或不同，独立地选自下述基团中的任意一种：C1-C6烷基、苯基、卤素、C1-C6烷氧基、羟基、氰基、乙酰基、乙酰氧基、环烷基、N-甲基哌嗪-亚甲基-、三氟甲基、取代或未取代的氨基、取代或未取代的甲酰基；
或，R2和R3连成环，其环选自下属任意一种：
Figure GDA0002566626530000032
哌啶
Figure GDA0002566626530000033
哌嗪
Figure GDA0002566626530000034
嘧啶
Figure GDA0002566626530000041
吗啉
Figure GDA0002566626530000042
硫代吗啉
Figure GDA0002566626530000043
噁嗪烷
Figure GDA0002566626530000044
1，3-硫代吗啉
Figure GDA0002566626530000045
1，3-噁嗪
Figure GDA0002566626530000046
二恶烷
Figure GDA0002566626530000047
四氢吡咯
Figure GDA0002566626530000048
四氢噻吩
Figure GDA0002566626530000049
四氢呋喃
Figure GDA00025666265300000410
二氢噻吩
Figure GDA00025666265300000411
5-甲基-2，3-二氢噻吩
Figure GDA00025666265300000412
4-氯-2,3-噻吩
Figure GDA00025666265300000413
5-氯-2，3-噻吩
Figure GDA00025666265300000414
2,3-二氢呋喃
Figure GDA0002566626530000051
4-甲基-2，3-呋喃
Figure GDA0002566626530000052
5-甲基-2，3-呋喃
Figure GDA0002566626530000053
4-氯-2，3-呋喃
Figure GDA0002566626530000054
5-2,3-呋喃
Figure GDA0002566626530000055
2，3-二氢-1H-吡咯
Figure GDA0002566626530000056
4-甲基-2，3-二氢-1H-吡咯
Figure GDA0002566626530000057
5-甲基-2，3-二氢-1H-吡咯
Figure GDA0002566626530000058
4-氯-2，3-二氢-1H-吡咯
Figure GDA0002566626530000059
5-氯-2，3-二氢-1H-吡咯
Figure GDA00025666265300000510
4，5-二氢-1H-咪唑
Figure GDA00025666265300000511
2-氯-4,5-二氢-1H-咪唑
Figure GDA00025666265300000512
2-甲基-4,5-二氢-1H-咪唑
Figure GDA00025666265300000513
1-甲基-4,5-二氢-1H-咪唑
Figure GDA00025666265300000514
4，5-二氢-噁唑
Figure GDA0002566626530000061
2-氯-4,5-二氢噁唑
Figure GDA0002566626530000062
2-甲基-4,5-二氢噁唑
Figure GDA0002566626530000063
4，5-二氢噻唑
Figure GDA0002566626530000064
2-甲基-4，5-二氢噻唑
Figure GDA0002566626530000065
2-氯-4，5-二氢噻唑
Figure GDA0002566626530000066
4，5-二氢-1H-吡唑
Figure GDA0002566626530000067
3-甲基-4，5-二氢-1H-吡唑
Figure GDA0002566626530000068
3-氯-4，5-二氢-1H-吡唑
Figure GDA0002566626530000069
4，5-二氢-1H-1，2，3-三唑
Figure GDA00025666265300000610
1-甲基-4，5-二氢-1H-1,2,3-三唑
Figure GDA00025666265300000611
1-(4，5-二氢-1H-1,2,3-三唑-1-yl)乙酮
Figure GDA00025666265300000612
环己烷
Figure GDA00025666265300000613
哌啶，
所述取代的甲酰基中，取代基可选自：乙氧基、甲氧基、N-甲基氨基、二甲氨基、哌啶基、环己基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、N-甲基哌嗪基、Boc-哌嗪基。
所述取代的氨基中，取代基可选自：单取代的甲基，双取代的甲基、单取代的乙酰基。
所述式I中，R1选自下述基团的任意一种：
-CH3甲基
Figure GDA0002566626530000071
甲氧基
Figure GDA0002566626530000072
氯 OH-羟基 CN氰基 NH2-氨基
Figure GDA0002566626530000073
甲氨基
Figure GDA0002566626530000074
二甲胺基
Figure GDA0002566626530000075
乙酰基
Figure GDA0002566626530000076
甲氧甲酰基
Figure GDA0002566626530000077
乙酰氧基
Figure GDA0002566626530000078
氨甲酰基
Figure GDA0002566626530000079
乙酰氨基
Figure GDA00025666265300000710
N-甲基氨基甲酰基
R2选自下述基团的任意一种：
-CH3甲基
Figure GDA00025666265300000711
甲氧基
Figure GDA00025666265300000712
氯
Figure GDA00025666265300000713
氟
Figure GDA00025666265300000714
溴
Figure GDA00025666265300000715
氰基 NH2-氨基
Figure GDA00025666265300000716
乙酰基
Figure GDA00025666265300000717
甲氧甲酰基
Figure GDA00025666265300000718
N-甲基氨基甲酰基
Figure GDA00025666265300000719
二甲氨基甲酰基 OH-羟基
Figure GDA00025666265300000720
环丙基
Figure GDA00025666265300000721
哌啶-1-甲酰基
Figure GDA00025666265300000722
环己甲酰基
Figure GDA00025666265300000723
哌嗪-1-甲酰基
Figure GDA00025666265300000724
吗啉-4-甲酰基
Figure GDA00025666265300000725
硫代吗啉-4-甲酰基
Figure GDA00025666265300000726
乙氧甲酰基
Figure GDA00025666265300000727
4-甲基哌嗪-1-甲酰基
R3选自下述基团的任意一种：
-CH3甲基
Figure GDA00025666265300000728
甲氧基
Figure GDA00025666265300000729
氯 NH2-氨基 CN氰基 OH羟基
Figure GDA0002566626530000081
二甲胺基
Figure GDA0002566626530000082
甲氨基
Figure GDA0002566626530000083
乙酰氨基
Figure GDA0002566626530000084
乙酰基
Figure GDA0002566626530000085
甲氧甲酰基
Figure GDA0002566626530000086
二甲氨基甲酰基
Figure GDA0002566626530000087
哌啶-1-甲酰基
Figure GDA0002566626530000088
哌嗪-1-甲酰基
Figure GDA0002566626530000089
N-甲基哌嗪-1-甲酰基盐酸盐
Figure GDA00025666265300000810
吗啉-4-甲酰基
Figure GDA00025666265300000811
硫代吗啉-4-甲酰基
Figure GDA00025666265300000812
苯基
Figure GDA00025666265300000813
哌嗪-1-甲酰基盐酸盐
Figure GDA00025666265300000814
Boc-哌嗪-1甲酰基。
具体的，所述式I所示化合物为式I-1所示化合物：
Figure GDA00025666265300000815
上述式I所示化合物按照附图12所示的反应流程图通过包括下述步骤的方法制备得到：
1)使得式1所示化合物与2-氰基硫代乙酰胺反应，得到式2所示化合物；
Figure GDA0002566626530000091
上述式1和式2中，R1、R2和R3的定义同式I中R1、R2和R3的定义；
2)使得式2所示化合物与氯乙酸甲酯发生关环反应，得到式I所示化合物。
上述方法步骤1)中，所述反应在DABCO存在下进行，所述反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂具体可为乙醇。
所述反应在回流条件下进行。
式1所示化合物与2-氰基硫代乙酰胺的摩尔比可为1:1-4。
上述方法步骤2)中，所述关环反应在无机碱存在下进行，所述无机碱具体可为氢氧化钾。
式2所示化合物与氯乙酸甲酯的摩尔比可为1:1-4。
所述关环反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂具体可为DMF。
上述式I所示化合物的溶剂合物、水合物或盐也属于本发明的保护范围。
本发明还提供上述式I所示化合物或其溶剂合物、水合物或盐在制备下述任意一种产品中的应用：
1)尿素通道蛋白抑制剂；
2)利尿的药物；
3)用于研究尿素通道蛋白的工具药。
所述尿素通道蛋白抑制剂中，尿素通道蛋白为UT-B和/或UT-A。
由于UT-B的蛋白质结构已经被阐明[Levin EJ,Cao Y and Zhou M.Structureandpermeationmechanismof a mammalian urea transporter.Proc Natl Acad Sci,2012,109:11194-9.Levin EJ,Quick M,and Zhou M.Crystal structure of a bacterialhomologue of the kidney urea transporter.Nature,2009,462,757-761],为筛选尿素通道抑制剂和研究其抑制作用机制奠定了理论基础。发明人的前期研究结果表明，UT-B介导的红细胞膜尿素通透性是脂质双层膜尿素通透性的50倍[Yang B,and VerkmanAS.Analysis of double knockout mice lacking aquaporin-1and urea transporterUT-B.Evidence for UT-B-facilitated water transport in erythrocytes,J BiolChem,2002,277:36782-36786]，UT-B除通透尿素还通透水和尿素类似物乙酰胺[Zhao D,Sonawane ND,Levin MH,and Yang B.Comparative transport efficiencies of ureaanalogues through urea transporter UT-B,Biochim Biophys Acta,2007,1768:1815-1821]。根据红细胞膜高水平表达水通道蛋白AQP1(特异性通透水的膜蛋白)和尿素通道蛋白UT-B的特性，发明人所在的研究组建立了尿素通道抑制剂的高通量筛选模型[MarcH.Levin,Ricardo de la Fuente,and A.S.Verkman.Urearetics:a small moleculescreen yields nanomolar potency inhibitors of urea transporter UT-B,The FASEBJ,2007,21:551-563]，见图1。将红细胞放在1.25M乙酰胺(UT-B通透乙酰胺的速度慢于通透尿素，适于测量通透性抑制作用)生理盐水溶液中，使红细胞内含有高浓度的乙酰胺，再将红细胞快速放到等渗生理盐水中。细胞内高浓度乙酰胺产生的高渗透压将水通过AQP1快速转运至细胞内，乙酰胺在细胞内外浓度差的作用下通过UT-B快速转运出细胞，使红细胞内外渗透压迅速到达平衡，细胞体积变化不明显。如果尿素通道被阻断，细胞内乙酰胺不能快速转运出细胞，所致的细胞内外渗透压差将水通过AQP1快速转运进入细胞，从而引起红细胞体积迅速增大以致破裂。红细胞破裂释放血红蛋白的量，可作为化合物对尿素通道蛋白UT-B抑制活性的评价指标。酶标仪测710nm吸光度值，可计算红细胞溶解率。
本发明利用尿素通道抑制剂筛选模型通过高通量筛选系统从合成的小分子化合物库中筛选到具有尿素通道UT-B抑制活性的线索化合物。从线索化合物127个衍生物(化学结构见表1)中筛出量效关系最好的候选化合物，其结构见式I-1。式I-1所示化合物和其部分衍生物具有较强的抑制UT-B及UT-A通透尿素的活性，其在体外对尿素通道UT-B抑制的半数有效剂量在微摩尔水平以下，且没有明显细胞毒性。体内实验发现：体内给予式I-1所示化合物可显著增加大鼠尿量，降低尿尿素水平，同时降低尿渗透压，表明具有很好的尿素选择性利尿作用，且该化合物不影响体液电解质平衡，适合高血压等慢性病患者长期使用。
附图说明
图1为红细胞尿素通道抑制剂筛选模型。
图2为式I-1所示化合物对红细胞的裂解率。
图3为红细胞高通量筛选模型筛选条件优化图。
图4为式I-1所示化合物的细胞毒作用。
图5为式I-1所示化合物对MDCK细胞UT-A通透尿素的抑制作用。
图6为大鼠单次皮下注射式I-1所示化合物利尿作用对各种参数的影响图(平均值+标准差，n＝6)。
图7为大鼠单次皮下注射式I-1所示化合物尿尿素和非尿素排泄量(平均值+标准差，n＝6)。
图8为式I-1所示化合物长期大鼠给药利尿作用对各种参数的影响图(平均值+标准差，n＝6)。
图9为式I-1所示化合物长期大鼠给药对血清和尿液中电解质的影响(平均值+标准差，n＝6)。
图10为式I-1所示化合物长期大鼠给药对肾功能的影响(平均值+标准差，n＝6)。
图11为式I-1所示化合物长期大鼠给药对大鼠脂代谢和血糖代谢的影响(平均值+标准差，n＝6)。
图12为式1所示化合物的制备流程图。
图13为实施例1中制备式I-1所示化合物的流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1、式I-1所示化合物的制备
参照图13所示流程图制备式I-1所示化合物，具体操作步骤如下：
称取乙酰乙酸乙酯(1.302g,10mmol)，加入DMF-DMA(1.430g，12mmol)及5mL二氯甲烷，40℃回流搅拌反应。反应8h后，TLC检测反应结束。冷却至室温，旋蒸除去溶剂及挥发性溶质，再加入甲苯10mL×3，分三次旋蒸除去挥发性溶质，得到瑰红色油状液体。
称取乙醇钠(0.34g，5mmol)溶于15mL乙醇中，冰浴下缓慢加入2-氰基硫代乙酰胺(0.463g，5.5mmol)，搅拌10分钟后，滴加上述中间体的乙醇溶液，升至室温反应过夜，溶液由澄清逐渐浑浊。TLC检测反应结束后终止反应，旋蒸除去溶剂，向蒸干剩余物中加入1N盐酸溶液至PH＝4，充分搅拌2h。抽滤后，得到黄色中间体934mg，收率43％。
称取0.111g溶于l0 mL DMF中。向溶液中加入氯乙酸甲酯(0.065g，0.6mmol)、1.8NKOH水溶液(0.33mL)，室温下搅拌反应3h后，TLC检测反应结束。向反应体系中加入100mL蒸馏水，充分搅拌有大量黄色固体析出。将所得固体抽滤并反复水洗，以石油醚-乙酸乙酯体系重结晶，得到白色固体0.107g，收率73％，mp：193-194℃。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.51(S,1H),6.05(S,2H),4.43(q,J＝7.1Hz,2H)3.91(S,3H),2.95(S,3H),1.44(t,J＝7.1Hz,3H).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ166.18,165.60,162.93,160.95,146.42,132.11,123.11,121.45,98.17,61.56,51.75,25.63,14.33.HRMS(ESH+):m/z calcd forC13H1SN2O,S[M+H]+:295.07470.
其他化合物的制备参照上述式I-1所示化合物的制备。
实施例2、UT-B抑制剂的筛选和药效学评价
1、筛选试验方法
1)取血，置于15ml刻度离心管(悬于含有肝素钠的PBS)中，离心，3000r/min，10min，弃上清；
2)加入与血等量的PBS，离心，3000r/min，10min，弃上清；
3)用含1.25M乙酰胺的高渗PBS稀释红细胞至比容为2％的细胞悬液；
4)红细胞悬液置于室温孵育2h使细胞内外乙酰胺浓度平衡，定时用移液器进行混合；
5)取99μl上述红细胞悬液置于96孔圆底微孔板各孔中，然后加入1μl待测化合物(如式I-1所示化合物)，混匀，室温孵育6min(待测化合物终浓度为20μM，DMSO终浓度为1％)；
6)另取96孔平底黑壁微孔板，每孔加入180μl等渗PBS(含1％DMSO)；
7)取上述步骤5)红细胞悬液20μl，迅速加入96孔板中，快速混匀；
8)5min内用酶标仪测吸光度值，波长710nm；
9)每块微孔板均设阳性对照孔(非特异性UT-B抑制剂phloretin)、阴性对照孔(PBS)。
计算红细胞溶解率：
Figure GDA0002566626530000121
红细胞的溶解率百分比计算公式，其中Atest是测试孔的吸光度值，Aneg是阴性对照孔的吸光度值，Apos是阳性对照孔的吸光度值。通过测吸收波长710计算红细胞裂解率，吸光度值稳定，至少一小时吸光度值无变化，结果见图2。
2、红细胞高通量筛选模型筛选条件优化
用不同浓度的乙酰胺(0-3.0M)孵育红细胞，测710nm的吸光度值，绘制量效曲线，乙酰胺浓度为1.1-1.25M时，阳性对照组(phloretin)与溶剂对照组的吸光度值差值最大，因此选择1.1-1.25M的乙酰胺进行后续实验，结果见图3。
3、发现尿素通道抑制剂线索化合物
为增加发现尿素通道线索化合物的机会，本项目组首先根据UT-B蛋白分子结构，以计算机化学模拟方法对具有式I母环结构的化合物进行计算机模拟筛选，选出2319个化合物，将上述化合物溶于DMSO，在96孔微孔板中稀释成1mM浓度应用液作为筛选化合物库。
取人、兔(日本大耳白家兔)、大鼠(SD大鼠)、小鼠(C57小鼠)四个种属的红细胞，以红细胞尿素通道抑制剂筛选模型，对上述筛选化合物库进行尿素通道抑制剂的初步筛选，筛选化合物浓度为10M，重复筛选一次，确定线索化合物。
4、线索化合物特异性抑制尿素通道
为了确定线索化合物作用特异性，分别用等渗PBS或1.25M乙酰胺PBS平衡红细胞，线索化合物(10μM)孵育后，快速转移至等渗PBS中，检测红细胞裂解率。结果为：用等渗PBS孵育的红细胞，未见红细胞明显裂解，而用1.25M乙酰胺PBS孵育的红细胞，红细胞裂解。表明红细胞的破裂是线索化合物特异性抑制尿素通道蛋白的尿素通透性所致。
5.确定最佳线索化合物
以所获得的线索化合物结构的母核为基础，进行取代基的替换化学结构类似物，建立二次筛选小分子库，应用上述模型和方法筛选和确定活性，获得剂量效应实验结果(表1)(注：表1中的IC50是人红细胞溶解率为50％时的浓度)。
经分析比较，选择对四个种属均有较好抑制作用的化合物作为优选化合物(见表1)。
6.式I-1所示化合物无明显细胞毒性
为了研究上述化合物的细胞毒性，利用CCK-8试剂盒(同仁化学研究所)，完成了MDCK细胞毒性试验，结果见图4，表明式I-1所示化合物无显著细胞毒作用。
本研究用CCK-8试剂盒检测化合物细胞毒性：将对数生长期的MDCK细胞悬液接种于96孔培养板(1×104个细胞/孔/100μl)，每孔给予100μl含有10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养液，置37℃、5％CO2培养箱中培养。当细胞70％-80％融合时，血清饥饿12h进行同步化。然后每孔给予100μl含有不同浓度(0.128,0.64,3.2,16和80μM)化合物的DMEM培养液，培养12h。每孔给予10μl CCK-8检测液，37℃避光孵育1h，检测470nm OD值。同时设置空白孔(培养基、CCK-8)，对照孔(细胞、相同浓度化合物的溶解介质、培养基、CCK-8)，每组设3复孔。计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝[(OD实验孔－OD空白孔)/(OD对照孔－OD空白孔)]×100％
其中，OD是指各孔的吸光度值。
7.式I-1所示化合物特异性抑制尿素通道UT-A
为确定式I-1所示化合物对UT-A的抑制作用，将稳定表达UT-A1的MDCK细胞在Transwell中培养成紧密的单细胞层，用forskolin刺激UT-A蛋白转移至细胞质膜，用式I-1所示化合物孵育15min，将Transwell下面的培养液换成含有15mM尿素的培养液，在特定时间检测Transwell上面培养液中的尿素浓度，评价式I-1所示化合物对UT-A尿素通透性的抑制作用。
实验结果表明，式I-1所示化合物显著抑制UT-A1介导的尿素通透性(图5A)，其抑制活性与阳性对照化合物非特异性尿素通道抑制剂根皮素phloretin抑制强度相同(图5B)，提示式I-1所示化合物对UT-B和UT-A有相同的抑制活性。
8.式I-1所示化合物具有利尿作用
SD大鼠，雄性，每组6只，体重200～250克，实验前将动物放入代谢笼中适应三天，标准饮食，自由饮水。尿液收集系统提前进行硅化处理，以防尿液丢失。适应完成后，收集两小时尿液，转移至事先称量好的试管中，皮下注射25、50和100mg/kg式I-1所示化合物，每两小时收集一次尿液，共收集12小时。溶剂对照：40％2-HP-β-CD。减重法测量尿液重量，换算为体积(1g≈1ml)。以时间为横坐标，尿量作为纵坐标，绘制曲线，结果见图6A；和溶剂对照组相比，式I-1所示化合物各剂量组均表现出不同程度的利尿作用，且利尿作用和剂量呈正相关，具有量效关系。利尿作用的高峰在给药后8小时，利尿作用持续时间约8小时，并于给药后10小时恢复到给药前的水平，与溶剂对照组相比，排尿量高达给药前的2倍。结果显示means±SEM，n＝6。收集的尿液使用冰点渗透压仪测量尿液渗透压仪。以时间为横坐标，尿渗透压作为纵坐标，绘制曲线，结果见图6B；和溶剂对照组相比，式I-1所示化合物各剂量组均不同程度地降低尿渗透压，且降低渗透压的作用与剂量呈正相关，具有量效关系。作用的高峰在给药后8小时，并于给药后10小时恢复到给药前的水平,结果显示means±SEM，n＝6。所取的尿样应用尿素试剂盒检测尿中尿素的水平。以时间为横坐标，尿尿素水平作为纵坐标，绘制曲线，结果见图6C；和溶剂对照组相比，式I-1所示化合物各剂量组均不同程度地降低尿尿素水平，且降低尿尿素水平的作用与剂量呈正相关，具有量效关系。作用的高峰在给药后8小时，并于给药后10小时恢复到给药前的水平。根据之前测得的每2小时尿量，计算出每2小时的尿素排泄量。与对照组比较，各剂量组每2小时尿素排泄量无显著变化，如图7A。根据之前测得的每2小时尿量、尿渗透压和尿素排泄量，计算出每2小时尿非尿素排泄量。与对照组比较，各剂量组每2小时尿素排泄量无显著变化，如图7B。
临床上利尿药主要是与其他抗高血压药长期联合应用治疗中度及高度高血压，因此我们进一步观察UT-B抑制剂式I-1所示化合物的长期利尿作用。正常SD大鼠，8周，雄性，每组6只，实验前将动物放入代谢笼中适应三天，标准饮食，自由饮水。适应完成后，皮下注射100mg/kg式I-1所示化合物(首剂加倍)，每8小时一次，溶剂对照：40％2-HP-β-CD每24小时收集一次尿液，转移至事先称量好的试管中。共给药5天。减重法测量尿液重量，换算为体积(1g≈1ml)。以时间为横坐标，尿量作为纵坐标，绘制曲线，结果见图8A；和溶剂对照组相比，式I-1所示化合物给药第一天尿量开始增多，第二天逐渐达到稳态，一直持续到第5天，较溶剂对照组，具有明显的利尿作用，结果显示means±SEM，n＝6。使用冰点渗透压仪测量尿液渗透压。以时间为横坐标，尿渗透压作为纵坐标，绘制曲线，结果见图8B；和溶剂对照组相比，式I-1所示化合物给药组第一天尿渗透压开始下降，第3天达稳态，一直持续到第5天，说明连续给予式I-1所示化合物后，可以降低大鼠尿的渗透压，结果显示means±SEM，n＝6。以时间为横坐标，尿尿素浓度作为纵坐标，绘制曲线，结果见图8C；和溶剂对照组相比，式I-1所示化合物能够降低大鼠尿尿素水平，第一天尿尿素浓度开始降低，第二天到第五天尿素维持在一个较低的浓度，溶剂对照大鼠尿尿素浓度几无变化。结果显示means±SEM，n＝6。根据之前测得的每24小时尿量，计算出每24小时的尿素排泄量。与对照组比较，各剂量组每24小时尿素排泄量无显著变化，如图8D。结果显示means±SEM，n＝6。根据之前测得的每24小时尿量、尿渗透压和尿素排泄量，计算出每24小时尿非尿素排泄量。与对照组比较，各剂量组每24小时尿素排泄量无显著变化，如图8E。结果显示means±SEM，n＝6。正常SD大鼠，8周，雄性，每组6只，实验前将动物放入代谢笼中适应三天，标准饮食，自由饮水。适应完成后，皮下注射100mg/kg式I-1所示化合物(首剂加倍)，每8小时一次，溶剂对照：40％2-HP-β-CD，每24小时收集一次大鼠尿液，连续给药并记录5天，第六天，乌拉坦麻醉大鼠，肾动脉取血，并抗凝。检测大鼠尿液及血清中与尿浓缩相关的主要离子水平，结果见表2。与溶剂对照组比较，式I-1所示化合物给药组尿液中Na+、K+、Cl-水平均显著下降(图9A)；血清Na+、K+、Cl-水平均无显著差异(图9B)。结果显示means±SEM，n＝6。以上结果说明，式I-1所示化合物引起尿素选择性利尿且对电解质平衡无显著影响。血清中尿素和肌酐(Creatinine)的水平是反应肾功能的主要指标。结果显示(表2)，连续给予式I-1所示化合物处理后，较溶剂对照组，大鼠血清肌酐无显著变化，但血清尿素水平有所降低，具有统计学差异，如图10。血清T-CHO、TG、HDL-C、LDL-Ch和GLU是反应代谢的主要指标。与对照组比较，连续给予式I-1所示化合物处理后，大鼠血清T-CHO、TG、HDL-C、LDL-C和GLU水平无显著变化(如图11)。结果表明，连续给予式I-1所示化合物对机体脂代谢和血糖代谢无显著影响。
表1、筛选的化合物的结构式及IC50值
Figure GDA0002566626530000151
Figure GDA0002566626530000161
Figure GDA0002566626530000171
Figure GDA0002566626530000181
Figure GDA0002566626530000191
Figure GDA0002566626530000201
Figure GDA0002566626530000211
Figure GDA0002566626530000221
Figure GDA0002566626530000231
表2.式I-1所示化合物给药大鼠的血和尿生化指标
Figure GDA0002566626530000232
Figure GDA0002566626530000241
注：表中数据为mean±SEM(n＝6)，n是大鼠的数量；利用one-way ANOVA对比，和对照组比较，*P<0.05；**P<0.01。

Claims (3)

1.式I所示化合物在制备利尿的药物中的应用：
Figure FDA0002566626520000011
所述式I中，R1、R2和R3相同或不同，独立地选自下述基团中的任意一种：H、C1-C6烷基、苯基、卤素、C1-C6烷氧基、羟基、氰基、乙酰基、乙酰氧基、环丙基、N-甲基哌嗪-亚甲基-、三氟甲基、取代或未取代的氨基、取代或未取代的甲酰基；或，
R2和R3连成环，其环选自下述任意一种：
Figure FDA0002566626520000012
Figure FDA0002566626520000021
Figure FDA0002566626520000031
Figure FDA0002566626520000041
所述取代的甲酰基中，取代基选自：乙氧基、甲氧基、N-甲基氨基、二甲氨基、哌啶基、环己基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、N-甲基哌嗪基、Boc-哌嗪基；
所述取代的氨基中，取代基选自：甲基，乙酰基。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：式I所示化合物为式I-1所示化合物：
Figure FDA0002566626520000042
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：式I所示化合物通过如下方法制备得到：
1)使得式1所示化合物与2-氰基硫代乙酰胺反应，得到式2所示化合物；
Figure FDA0002566626520000043
Figure FDA0002566626520000051
上述式1和式2中，R1、R2和R3的定义同权利要求1中式I中R1、R2和R3的定义；
2)使得式2所示化合物与氯乙酸甲酯发生关环反应，得到式I所示化合物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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MX2007000762A (es) * 2004-07-22 2007-04-02 Ptc Therapeutics Inc Tienopiridinas para tratamientode hepatitis c.
CN102757447B (zh) * 2011-07-05 2014-12-31 北京大学 一种尿素通道蛋白抑制剂及其制备方法与应用
WO2015027204A1 (en) * 2013-08-23 2015-02-26 Vanderbilt University Substituted thieno[2,3-b]pyridine-2-carboxamide analogs as positive allosteric modulators of the muscarinic acetylcholine receptor m4
US10154992B2 (en) * 2016-07-12 2018-12-18 The Regents Of The University Of California Compounds and methods for treating HIV infection

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