CN103394100B - 一种构建金龙胶囊药理机制的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药学和系统生物学领域，具体涉及一种利用生物及基因工程手段构建金龙胶囊作用药理机制的方法。本发明所述的方法利用组学和系统生物学手段，通过基因芯片的杂交、检测与分析，并利用汤森路透Genego数据库对处理后的基因芯片结果进行系统生物学的分析，并构建金龙胶囊的药理机制。本发明还公开了金龙胶囊在作为抗脑肿瘤药物和在化疗耐药活性逆转方面的用途，并通过上述方法构建了金龙胶囊在作为抗脑肿瘤药物和在化疗耐药活性逆转方面的药理机制。

Description

一种构建金龙胶囊药理机制的方法

技术领域

本发明属于中药学和系统生物学领域，具体涉及一种利用生物及基因工程手段构建金龙胶囊作用药理机制的方法。

背景技术

中药即中医用药，为中国传统中医特有药物，有着悠久的历史，在数千年的临床使用中疗效显著。鲜药是中药的重要组成部分，由于其含有丰富的天然活性成分，在防治某些疾病尤其是危急重症中疗效独到而倍受推崇。传统鲜药常现采现用，由于受环境和地域因素的影响而限制了其临床使用。随着“低温冷冻现代生化分离提取技术”的研发成功，具有现代剂型特点的“现代鲜药”应运而生，使鲜药的发展迈入了新的时代。作为首例抗癌现代鲜药，金龙胶囊是以鲜守宫、鲜金钱白花蛇和鲜蕲蛇三味鲜动物药为原料，采用“低温冷冻现代生化分离提取技术”精制而成的复方中药制剂，主要用于肝癌的治疗。在十多年的临床使用中，金龙胶囊疗效确切，可抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡、诱导细胞分化、抑制新生血管生成、降低血液粘稠度，其单独使用可提高患者生活质量、缓解临床症状、延长生存期；配合放化疗使用，可以起到增效减毒的作用；手术前后配合使用，能够有效抑制术后复发、转移。

然而，尽管以金龙胶囊为代表的中药的临床使用方面已经积累了丰富的经验，但是对于其有效成分和作用机制却未能做出非常全面而合理的阐释。而且采用何种方式来解释中药的疗效，也成为了一直是困扰研究人员的难题，也是制约中药走出国门，提高竞争力的瓶颈所在。

目前中药机制常用的研究手段，主要集中在对某一蛋白或基因表达水平的研究，通过Westernblot和PCR的方法检测动物组织中，或细胞样品中蛋白或基因的表达量，评价药物对该种蛋白或基因的作用，推测该物质是否为药物的作用靶点和环节。

这种研究方法借鉴了西方化学药物的研究方法，追求对药物单一靶点和作用环节的寻找。虽然初步阐释了中药可能的作用环节，但是中药有其自身特点，尤其对于复方中药来说，其成分多样，作用环节复杂，仅仅针对某一基因或蛋白的研究，已远远不能反映中药的作用特点。

早期，有关中药作用机制和有效成分的分析，受西方医学思想理念和化学药物研究体系的影响，而追求对药物单一靶点和某一有效成分的寻找。虽然初步阐释了中药可能的作用环节和有效成分，但是随着研究的深入和与临床用药的反馈验证，越来越多的医学工作者开始意识到，这种过于单一的研究模式并不完全适用于成分多样、机制复杂的中药，制约了对中药多维度、多层面的全面解析。因此，如何立足于中药自身的特点，并结合不断发展的新技术新方法，探索出一条真正适合于中药的研究模式，成为摆在所有科研工作者面前的课题。

再者，肿瘤尤其是恶性肿瘤是一种复杂性疾病，从细胞的癌变到肿瘤快速生长、侵袭和转移是一个多因素作用、多基因参与，并经过多阶段变化累积起来的极其复杂的病变过程。肿瘤中的突变基因不仅数目繁多而且功能复杂，任何一个基因都不是独立执行功能，它们必须与其他基因相互协调，作为分子网络中的一环协同完成一定的生物学过程，参与决定细胞的行为和表型。从这个意义上讲，恶性肿瘤实际上是一种分子网络病。

面对这样一种复杂性疾病，药物治疗的目标也不可能只关注对某个单靶点的作用。因此，无论是对现代中药的研究还是对复杂疾病治疗的需求，都迫切需要开发出一种系统的对复方中药的药理研究机制。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于现有技术中对中药尤其是复方中药的药理药效研究手段过于单一的问题，进而提供一种利用组学及系统生物学手段构建金龙胶囊药理机制的方法。

进一步的，提供一种构建金龙胶囊在抑制脑肿瘤以及化疗耐药逆转活性方面药理作用机制的方法。

为解决上述技术问题，本发明所述的一种构建金龙胶囊药理机制的方法，包括如下步骤：

（1）构建具有特定病症的原位模型；

（2）以金龙胶囊持续给药，并记录病症的发展情况；

（3）提取金龙胶囊干预后的病症组织的总RNA模板，使用PT-PCR方法反转录合成cDNA，体外转录合成生物素标记的cRNA，并进行cRNA纯化，将纯化后的cRNA进行片段化处理后，与HumanGenomeU133Plus2.0基因芯片杂交；所述个步骤均可采用现有技术中的试剂盒完成；

（4）将杂交后的芯片进行清洗和染色，并扫描杂交信号，获取基因表达的荧光信号强度，并采用AffymetrixGenChipCommandConsoleSoftware软件进行数字化处理和分析；

（5）利用汤森路透Genego数据库对处理后的基因芯片结果进行系统生物学的分析，并构建金龙胶囊的药理机制。

本发明进一步公开了金龙胶囊在作为抗脑肿瘤药物中的用途。

本发明还进一步公开了一种构建金龙胶囊在作为抗脑肿瘤药物的作用机制的方法，包括如下步骤：

（1）构建人类脑肿瘤小鼠原位模型；

（2）以金龙胶囊对所述小鼠原位模型持续给药；

（3）提取金龙胶囊干预后的脑肿瘤组织的总RNA模板，以其反转录合成cDNA，并体外转录合成生物素标记的cRNA，并进行cRNA纯化，片段化处理后，与基因芯片杂交；

（4）将杂交后的芯片进行清洗和染色，并扫描杂交信号，获取基因表达的荧光信号强度，并采用AffymetrixGenChipCommandConsoleSoftware软件进行数字化处理和分析；

（5）利用汤森路透Genego数据库对处理后的基因芯片结果进行系统生物学的分析，并构建金龙胶囊的药理机制。

所述步骤（3）中，所述基因芯片为Affymetrix公司的HumanGenomeU133Plus2.0。

所述步骤（1）中，所述小鼠原位模型为红色荧光蛋白标记的人类脑肿瘤U87-RFP小鼠原位模型。

所述步骤（2）中，所述金龙胶囊的给药量为0.75g/kg。

本发明还进一步公开了一种金龙胶囊在作为化疗耐药逆转活性药物中的用途。

进一步公开了一种构建金龙胶囊化疗耐药逆转活性作用机制的方法，包括如下步骤：

（1）培养耐药及亲本细胞；

（2）向培养的所述耐药及亲本细胞中加入金龙胶囊培养，得到金龙胶囊干预后的耐药细胞；

（3）提取所述金龙胶囊干预后的耐药细胞的总RNA模板，以其反转录合成cDNA，并体外转录合成生物素标记的cRNA，并进行cRNA纯化，片段化处理后，与基因芯片杂交；

（4）将杂交后的芯片进行清洗和染色，并扫描杂交信号，获取基因表达的荧光信号强度，并采用AffymetrixGenChipCommandConsoleSoftware软件进行数字化处理和分析；

（5）利用汤森路透Genego数据库对处理后的基因芯片结果进行系统生物学的分析，并构建金龙胶囊的药理机制。

所述步骤（3）中，所述基因芯片为Affymetrix公司的HumanGenomeU133Plus2.0。

所述步骤（1）中，所述耐药及亲本细胞分别为人肺腺癌耐紫杉醇耐药细胞A549/Paclitaxel及其亲本细胞A549。

脑胶质瘤恶性度高，不易手术切除和放化疗治疗，患者多采用姑息治疗方式。目前已有的治疗药物中，除替莫唑胺胶囊等西药和鸦胆子油中药外，尚无明确的治疗脑胶质瘤的中成药，导致临床用药价格昂贵。另外，脑胶质瘤的动物模型不多，大多采用移植瘤的方法在小鼠腋下或皮下种植脑肿瘤细胞，观察药物对移植瘤的抑制作用。这种方法的缺点是无法观察药物透过血脑屏障的作用，导致很多对移植瘤有效的药物，由于无法透过血脑屏障而无效。目前，有很多方法可以追踪某一成分透过血脑屏障的效果。但是，鉴于中成药具有成分多样复杂的特点，发挥作用的成分复杂多样，故无法通过追踪特定成分观察透过血脑屏障的作用。因此，我们采用建立原位脑肿瘤动物模型，观察药物对原位脑肿瘤的抑制作用，间接反映药物透过血脑屏障的效果。但是，由于颅内肿瘤被头骨覆盖，无法直接观察到肿瘤的大小。本发明通过构建红色荧光蛋白标记的质粒转染U87细胞，再将U87细胞注入颅内建立原位脑肿瘤模型，再利用活体成像技术便可实时观察到红色荧光标记的肿瘤大小。通过该方法，我们观察到不同剂量的金龙胶囊均可有效抑制原位脑肿瘤的生长。我们推测，可能是由于金龙胶囊中低分子量的抗肿瘤多肽易透过血脑屏障而发挥了作用。在发挥疗效的同时，金龙胶囊还有效避免了替莫唑胺胶囊降低小鼠体重的毒副作用，这也在一定程度上与临床上金龙胶囊对脑胶质瘤患者的治疗作用相吻合。

组学（Omics）是近年来出现的一种新的研究方法，包括基因组学、蛋白质组学、代谢组学等。作为一种高通量的分子生物学技术，组学技术可同时对大量样品进行平行检测和分析，具有整体性和系统性的特点。随着组学技术的发展，系统生物学和网络药理学也应运而生。系统生物学是研究一个生物系统中所有组成成分的构成，以及在特定条件下这些组分间的相互关系，并通过计算生物学建立数学模型来定量描述和预测生物功能、表型和行为的学科，可对组学研究结果进行综合及预测性分析。

基因芯片技术是近几年迅速发展起来的一种组学技术，可以同时高效的观察大量基因的变化情况。由于金龙胶囊成分复杂，其通过多靶点、多环节发挥抗肿瘤作用，如抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡、诱导细胞分化、抑制新生血管生成、降低血液粘稠度等。因此，本发明通过将药物干预后的脑肿瘤组织进行基因芯片检测，使用Affymetrix公司的HumanGenomeU133Plus2.0基因芯片，检测人物种的基因表达谱。实验结果显示，低剂量金龙胶囊可有效上调48个基因，下调48个基因。这些基因很多都与肿瘤细胞的生长、侵袭、粘附，以及抗血管生成相关。所涉及的通路包括：VEGF信号通路、PPAR信号通路、Wnt信号通路、Jak-STAT信号通路、T细胞受体信号通路等。

另外，由于基因芯片检测结果涉及大量基因，无法通过人工手段对其之间的内在关联进行挖掘，本发明利用系统生物学手段恰恰解决了这一难题。利用最具代表性的是汤森路透的GeneGo数据库，将大量组学结果进行系统分析，从而按照指定参数给出各基因之间的可能关联。通过与GeneGo采纳的各种实验数据进行比对，将变化的96个基因进行了分类，并通过网络关联图的形式形象的展现出来。利用该方法，也轻易的找到了VNN1基因下游的核转录因子，这也为后续的实验验证提供了思路。

另外，本发明将金龙胶囊中的守宫、金钱白花蛇和蕲蛇已有的基础研究结果进行了汇总，并采用网络图的方式形象的展示出来。同时，将该网络图与开放的KEGG和HRP网络进行整合，找到金龙胶囊已研究过的基因节点和其相互关联基因36个。将该36个基因与脑肿瘤基因芯片结果进行对比，发现其中有4个基因在金龙胶囊干预后变化倍数超过2倍，另有17个基因也出现在了基因芯片检测结果中。由于金龙已有研究结果中尚未有针对脑肿瘤的实验研究，且分子生物学研究相对较少，造成已有研究网络过小，与组学检测结果重合度不高。本发明所述的方法及研究结果对发现更多金龙胶囊抗肿瘤的作用靶点和环节，能够更加准确解释金龙胶囊抗肿瘤的作用机制奠定坚实的基础。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1为实施例2中BALB/C裸鼠原位脑肿瘤红色荧光图像；

图2为实施例2中不同的药物干预后裸鼠颅内肿瘤重量；

图3为实施例5中GeneGo数据库的分析结果；

图4为实施例5中构建的胶囊抗肿瘤的机制网络图；

图5-A为实施例5中金龙胶囊已有基础研究中守宫构建的网络图；

图5-B为实施例5中金龙胶囊已有基础研究中金钱白花蛇构建的网络图；

图5-C为实施例5中金龙胶囊已有基础研究中蕲蛇构建的网络图。

具体实施方式

一、金龙胶囊在作为脑肿瘤药物应用的药效机制

本发明中涉及的药品市售即可，下述各实施例中具体选用：BALB/c裸鼠(北京华阜康生物技术股份有限公司，实验动物质量合格证编号为SCXK京2009-0004，中国)；U87-RFP(安泰康生物技术有限公司，中国)；金龙胶囊(北京建生药业有限公司)；替莫唑胺胶囊（天士力制药有限公司）；FluorVivo型号-100（INDECBioSystems公司，加利福尼亚，美国）；人类基因组U133plus2.0（Affymetrix公司）；RNA提取试剂盒（Invitrogen公司，美国）。

实施例1

取5-6周龄的雌性裸鼠55只，应用外科原位移植方法，将取自同系小鼠皮下的U87-RFP肿瘤组织切成1mm³大小的组织块，运用外科原位接种技术，将肿瘤块种植到裸鼠颅内，通过构建红色荧光蛋白标记的质粒转染U87细胞，再将U87细胞注入颅内建立原位脑肿瘤模型，建立表达红色荧光蛋白标记的人类脑肿瘤（U87-RFP）小鼠原位模型。

实施例2

分别给予96mg/kg替莫唑胺、0.75g/kg金龙胶囊和1.5g/kg金龙胶囊及空白组，连续给药28天。利用FluorVivoModel-100荧光成像仪进行非侵袭性的实时成像观察，记录肿瘤体积和重量。

给予96mg/kg替莫唑胺、0.75g/kg金龙胶囊和1.5g/kg金龙胶囊第15天时，进行荧光活体成像，观察裸鼠颅内肿瘤大小。如图1所示，96mg/kg替莫唑胺、0.75g/kg金龙胶囊和1.5g/kg金龙胶囊与模型组相比，具有不同程度的抑制作用。

连续给予96mg/kg替莫唑胺、0.75g/kg金龙胶囊和1.5g/kg金龙胶囊28天，于第28天时取裸鼠颅内肿瘤组织进行称量。如图2所示，与模型组相比，96mg/kg替莫唑胺、0.75g/kg金龙胶囊和1.5g/kg金龙胶囊均可降低肿瘤组织重量，且具有统计学意义（P<0.05）。

实施例3

取3例空白对照组脑肿瘤组织和3例0.75g/kg金龙胶囊组脑肿瘤组织，提取样本总RNA，使用RT-PCR方法反转录合成cDNA（采用RT-PCR试剂盒，Invitrogen公司），体外转录合成生物素标记的cRNA，并进行cRNA的纯化。cRNA经片段化处理后，与Affymetrix公司的HumanGenomeU133Plus2.0基因芯片进行杂交。

实施例4

杂交16h后取出所述基因芯片，对38500个肿瘤相关基因进行检测。将所述芯片在Affymetrix公司的专用设备AffymetrixFluididsStation450中完成清洗和染色。使用Affymetrix公司的GeneChipScanner3000扫描仪对杂交信号进行扫描，获取基因表达的荧光信号强度。扫描图像采用AffymetrixGenChipCommandConsoleSoftware（AGCC）软件进行数字化处理和分析。

结果显示，0.75g/kg金龙胶囊组与模型组相比，上调2倍以上的差异表达基因48个（详见表1），其中上调3倍以上的基因有6个，占总数的12.50%，上调最为显著的基因为VNN1，上调比率为9.4595。金龙胶囊治疗组与空白对照组相比，下调2倍以上的差异表达基因48个（详见表2），其中下调3倍以上的基因有9个，占总数的18.75%，下调最为显著的基因为TRBC1/TRBC2，下调比率为0.1038。

表1上调差异2倍以上基因

表2下调差异2倍以上基因

将上述98个差异基因在MAS系统中进行pathway和GeneOntology的统计分析，按照其所涉及的信号通路和生物学过程进行分类，并对其p-value和q-value进行了计算。其中，p-value的计算是根据超几何分布的概率公式来进行，q-value则是对每一个p-value阈值进行筛选后得到的显著性信号通路和生物学过程的假阳性率，其计算方法采用bootstrap方法，p-value和q-value的大小与此信号通路或生物学过程在实验结果中的重要性呈负相关。分析结果显示，上述98个差异基因参与的生物学过程被分为217类，其中与肿瘤发生发展关系密切的约有60类，占总数的27.65%，它们涉及细胞的增殖、凋亡、有丝分裂、分化、运动、粘附、侵袭，以及血管生成、信号转导、免疫调节等生物过程。表3列出了差异基因所涉及的p-value值最小的（最可能相关）11个生物学过程，结果显示，大部分都与肿瘤的发生发展关系密切。表4中列出了差异基因所涉及的p-value值最小的（最可能相关）33条信号通路。

表3差异基因最可能相关的生物学过程分类

表4差异基因最可能相关的信号通路分类

从表中我们可以看出，金龙胶囊作用靶点多样，并且不同靶点之间相互作用，形成了一个复杂的调控网络。可以认为，金龙胶囊正是通过对这些特异基因组合的调节，而最终发挥促进肿瘤细胞凋亡、阻滞肿瘤细胞周期、诱导肿瘤细胞分化，抑制肿瘤新生血管形成，调节机体免疫力等作用。这种“组合药靶”的发现为系统评价金龙胶囊复杂的药理机制提供了重要依据。

在以上的分析中，分别采用RMA方法（RobustMulti-affayAverage）对以上五个样品芯片检测后的原始数据进行前处理，探针注释系统采用了最新版本，经前处理后的数据采用LimmapachageofR-Bioconductor方法来计算差异基因的统计学意义。

实施例5

利用汤森路透公司的GeneGo数据库对基因芯片结果进行系统生物学的分析，发现了一些基因之间的内在联系（如图3所示），并利用计算机技术对金龙胶囊已有的基础研究结果进行网络构建，并将上述两种结果进行比对。

1、隐藏节点（hiddennodes）的分析

通过前述步骤的分析，得到了金龙胶囊组vs.空白组的差异基因表达谱，都是芯片检测中可以检测到的差异表达的基因。同时，我们认为，与这些差异基因相关的上游调控因子也是十分重要的，这些调控因子既包括通过一步也包括通过多步与差异基因连通的隐藏基因（我们统称为拓扑学重要基因topologicallysignificantgenes）。因此，我们分别通过one-step“overconnectivity”test和multi-step“hiddennodes”algorithm两种方法，得到了差异基因表达谱相对应的拓扑学重要基因（topologicallysignificantgenes）列表，详见表5。具体来说，针对金龙胶囊组vs.空白组差异基因，共发现106个拓扑学重要基因。

表5拓扑学重要基因列表（hiddennodes）

2、聚类分析（enrichmentsignificance）

针对以上分析得到的差异基因表达谱和拓扑学重要基因，对差异基因和拓扑学重要基因所涉及的以下几个项目进行聚类分析，并计算其重要性（P-value的计算采用hypergeometrictest方法）。①范式通路（CanonicalPathway）；②生物学过程网络（ProcessNetworks）；③疾病的生物标记物（DiseaseBiomarkers）；④毒理学网络（ToxicityNetworks）；⑤生物学过程（GeneOntologyprocesses）；⑥分子功能（GeneOntologymolecularfunctions）；⑦细胞组件（GeneOntologylocalizations）。其中，前4个项目的数据库为汤森·路透科技集团所有，不是公共数据库；后三个项目的数据库为公共数据库。表6列出了金龙胶囊组vs.空白组的差异基因和拓扑学重要基因在①范式通路（CanonicalPathway）②生物学过程网络（ProcessNetworks）两个项目上的聚类分析结果。

表6范式通路和生物学过程网络的聚类分析

3、机制网络图的构建（Causalnetworks）

通过以上的分析，我们对差异基因和拓扑学重要基因所参与的生物学过程、分子功能、基因之间的相互作用、与疾病的关系等有了一定的了解。接下来的分析，是以上面所做的分析工作为基础，来构建这些基因所参与的发挥药效作用的机制网络图（使用了汤森·路透科技集团MetaCoreplatform平台的算法和工具）。这个机制网络图包含了上游的触发因子、激酶、信号转导过程中的级联反应、转录因子、效应基因以及最终实现的生理功能。与所述的比较相对应，分析结果得到了1个机制网络图即胶囊抗脑肿瘤的机制网络图（详见图4），它解释了药物比较重要的作用靶点、通路以及这些靶点通路之间的协同关系，通过网络图的方式来展现，更加清楚明了。

4、重要生物标记物（functionalbiomarkers）和靶点（drugtargets）的筛选

根据以上对基因的分析，我们设定7个评分标准来对该组差异基因一一打分，根据得分高低来筛选出重要的生物标记物，从而得到可以用来评判金龙胶囊药效作用的生物标记物（详见表7）。

同样基于以上的分析，我们设定8个评分标准来对该组差异基因和拓扑学重要基因一一打分，根据分数高低来筛选出重要靶点，从而得到金龙胶囊作用后的主要靶点基因（详见表7）。

表7排序前10位的重要生物标记物结果列表——金龙胶囊组vs.空白组

表8排序前10位的重要靶点结果列表——金龙胶囊组vs.空白组

5、金龙胶囊的临床适应症预测

以下对于金龙胶囊适应症的分析是基于这样两组差异基因表达谱数据来进行：即金龙胶囊组vs.空白组。通过以下的分析，来综合评价金龙胶囊可能的临床适应症。

6、差异基因表达谱与疾病基因谱进行反向比较

汤森·路透科技集团拥有多种疾病发生后的基因表达谱数据库，将金龙胶囊组vs.空白组的差异基因表达谱与此数据库中各种疾病的基因表达谱进行比对，如果差异性越大，则说明金龙胶囊可能对此疾病具有治疗作用（详见表9）。

表9差异基因表达谱与疾病基因谱反向比较结果列表——金龙胶囊组vs.空白组

7、差异基因表达谱与已知药物的基因表达谱进行相似性比较

美国FDA有已知药物发挥各适应症作用的基因表达谱数据库，将金龙胶囊组vs.空白组的差异基因表达谱与此数据库中已知药物的基因表达谱进行相似性比对，如果相似性越高，则说明金龙胶囊可能也具有与此已知药物相似的适应症（见表10）。

表10差异基因表达谱与已知药物基因表达谱相似性比较结果列表——金龙胶囊组vs.空白组

同时，采用计算机技术，对金龙胶囊中守宫、金钱白花蛇和蕲蛇已有的基础研究结果进行网络构建，其结果如图5-A、5-B、5-C所示。

同时，将该网络图与开放的KEGG和HRP网络进行整合，找到金龙胶囊已研究过的基因节点和其相互关联基因36个。将金龙胶囊干预后，裸鼠颅内脑肿瘤组织进行基因芯片检测的结果，与金龙胶囊各成分已有基础研究结果中的36个基因结果进行对比分析，发现两者重合基因有21个，其中有6个基因在金龙胶囊干预后变化倍数超过2倍，另有15个基因也出现在了基因芯片检测结果中，具体对比结果见表11。

表11基因对比分析结果

可见通过本发明所述的方法可有效分析并构建金龙胶囊在作为抗脑肿瘤药物用途中的药效作用机制，对阐述及研究金龙胶囊的作用机制具有积极的指导作用。

二、金龙胶囊在化疗耐药逆转活性中的作用

本发明中涉及的药品市售即可，下述各实施例中具体选用：金龙胶囊样品由北京建生药业有限公司提供，为胶囊成品，批号：120527087，配置方法参考北京建生药业有限公司提供的方法，用细胞培养基溶解，0.22μM滤膜过滤，现用现配。注射用硫酸长春新碱（VCR）为上海华联制药有限公司产品；注射用盐酸阿霉素（DOX）为深圳万乐药业有限公司产品；多西紫杉醇（Paclitaxol）为北京协和药厂（白色粉末，纯度＞99%）；5-氟尿嘧啶（5-FU）为上海旭东海普药业有限公司产品；维拉帕米（VRP）为sigma产品（白色粉末，纯度＞99%）。

实施例6

取人肺腺癌耐紫杉醇耐药细胞A549/Paclitaxel及其亲本细胞A549培养于含10%新生牛血清的DMEM培养液（含青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL）内，37℃、5%CO2湿培养箱中培养，0.25%胰酶和0.02%EDTA液消化传代。耐药株细胞A549/Paclitaxol在含20nMPaclitaxol的培养液中培养以维持其耐药性，实验进行前细胞脱药一周。

实施例7

采用MTT方法测定金龙胶囊对上述细胞的细胞毒性及其肿瘤多药耐药（MDR）逆转活性。取对数生长期的敏感及耐药株肿瘤细胞胰酶消化，接种于96孔细胞培养板中。24h后，加入不同浓度的金龙胶囊和/或抗肿瘤药物，以VRP为阳性对照药，每个浓度设3个平行孔。培养72h，弃原培养液，每孔加入0.5mg/mlMTT液100μL。继续培养4h，弃去MTT液，每孔加入DMSO150μL，混合振荡器振荡，于酶标仪570nm波长处测定吸光值。上述实验重复三次。细胞存活率（%）=100×OD给药组/OD对照组。利用GraphpadPrism6.0软件计算IC50值。逆转倍数（RF,reversalfold）=IC50（抗肿瘤药物）/IC50（抗肿瘤药物+逆转剂），实验重复3-5次。结果见表12，金龙胶囊作用72h，对所用到的四对肿瘤细胞具有弱的生长抑制作用，无明显细胞选择性，IC50值在1.5-5.2mg/mL水平。

表12金龙胶囊对A549/Paclitaxol及其亲本细胞的生长抑制作用。n=3.

金龙胶囊(JL)在100、200、400μg/mL无毒浓度对A549/Paclitaxol对paclitaxol的获得性耐药有一定的逆转活性，结果见表6、7所示。逆转倍数分别为2.25,2.99和10.64，但活性弱于阳性对照药VRP（为P-gp抑制剂）。金龙胶囊对A549/Paclitaxol对VCR的交叉耐药无明显逆转作用。金龙胶囊及VRP在所用浓度下对A549细胞无增敏作用。结果见表13、表14显示，400μg/mL浓度的金龙胶囊联合紫杉醇作用于人肺腺癌耐紫杉醇耐药细胞系A549/Paclilaxol72h，对A549/Paclilaxol对Paclilaxol的获得性耐药具有一定的逆转活性。可见，金龙胶囊对于获得化疗耐药逆转活性具有积极的效果。

表13金龙胶囊（JL）对A549/Paclitaxol细胞耐药的逆转作用，n=3

表14金龙胶囊（JL）对A549细胞的影响。n=3.

实施例8

分别取人肺腺癌亲本细胞系A549（以下简称A）、人肺腺癌耐紫杉醇耐药细胞系A549/Paclilaxol（以下简称AP）、金龙胶囊作用后的人肺腺癌耐紫杉醇耐药细胞系A549/Paclilaxol（以下简称APJ），分别提取总RNA，使用RT-PCR方法反转录合成cDNA（采用RT-PCR试剂盒，Invitrogen公司），体外转录合成生物素标记的cRNA，并进行cRNA的纯化。cRNA经片段化处理后，与Affymetrix公司的HumanGenomeU133Plus2.0基因芯片进行杂交。

实施例9

杂交后取出所述基因芯片进行基因芯片检测，可分析47000个转录本或变异性基因的表达，包括38500个定性清晰的人类基因。将所述芯片在Affymetrix公司的专用设备AffymetrixFluididsStation450中完成清洗和染色。使用Affymetrix公司的GeneChipScanner3000扫描仪对杂交信号进行扫描，获取基因表达的荧光信号强度。扫描图像采用AffymetrixGenChipCommandConsoleSoftware（AGCC）软件进行数字化处理和分析，得到各组样品的基因表达谱。

将AP组基因表达谱与A组基因表达谱相比较，从而得到人肺腺癌耐紫杉醇耐药细胞系比人肺腺癌亲本细胞系的差异基因表达谱（以下简称APvs.A），并计算差异基因的差异倍数，取差异倍数≥4的基因，结果得到了421个差异基因（其中上调基因252个，下调基因169个）。

为了探究金龙胶囊对人肺腺癌耐紫杉醇耐药细胞系对紫杉醇获得性耐药的逆转机制，将APJ组基因表达谱与AP组基因表达谱相比较，从而得到金龙胶囊药物干预后人肺腺癌耐药细胞的差异基因表达谱（以下简称APJvs.AP），并计算差异基因的差异倍数，取差异倍数≥2的基因，结果得到了203个差异基因（上调基因86个，下调基因117个）。

实施例10

利用汤森路透公司的GeneGo数据库对基因芯片结果进行系统生物学的分析，发现一些基因之间的内在联系，并利用计算机技术对金龙胶囊已有的基础研究结果进行网络构建，确认金龙胶囊在化疗耐药行逆转中的作用机制。

1、隐藏节点（hiddennodes）的分析

通过前述步骤的分析，得到了APvs.A；APJvs.AP组的差异基因表达谱，都是芯片检测中可以检测到的差异表达的基因。同时，我们认为，与这些差异基因相关的上游调控因子也是十分重要的，这些调控因子既包括通过一步也包括通过多步与差异基因连通的隐藏基因（我们统称为拓扑学重要基因topologicallysignificantgenes）。因此，我们分别通过one-step“overconnectivity”test和multi-step“hiddennodes”algorithm两种方法，得到了差异基因表达谱相对应的拓扑学重要基因（topologicallysignificantgenes）列表。具体来说，针对APvs.A差异基因，共发现282个拓扑学重要基因；针对APJvs.AP差异基因，共发现416个拓扑学重要基因。

2、聚类分析（enrichmentsignificance）

针对以上分析得到的差异基因表达谱和拓扑学重要基因，对差异基因和拓扑学重要基因所涉及的以下几个项目进行聚类分析，并计算其重要性（P-value的计算采用hypergeometrictest方法）。①范式通路（CanonicalPathway）；②生物学过程网络（ProcessNetworks）；③疾病的生物标记物（DiseaseBiomarkers）；④毒理学网络（ToxicityNetworks）；⑤生物学过程（GeneOntologyprocesses）；⑥分子功能（GeneOntologymolecularfunctions）；⑦细胞组件（GeneOntologylocalizations）。其中，前4个项目的数据库为汤森·路透科技集团所有，不是公共数据库；后三个项目的数据库为公共数据库。

3、机制网络图的构建（Causalnetworks）

通过以上的分析，我们对差异基因和拓扑学重要基因所参与的生物学过程、分子功能、基因之间的相互作用、与疾病的关系等有了一定的了解。接下来的分析，是以上面所做的分析工作为基础，来构建这些基因所参与的发挥药效作用的机制网络图（使用了汤森·路透科技集团MetaCoreplatform平台的算法和工具）。这个机制网络图包含了上游的触发因子、激酶、信号转导过程中的级联反应、转录因子、效应基因以及最终实现的生理功能。与所述的比较相对应，分析结果得到了1个机制网络图即胶囊抗脑肿瘤的机制网络图，它解释了药物比较重要的作用靶点、通路以及这些靶点通路之间的协同关系，通过网络图的方式来展现，更加清楚明了。

4、重要生物标记物（functionalbiomarkers）和靶点（drugtargets）的筛选

根据以上对基因的分析，我们设定7个评分标准来对该组差异基因一一打分，根据得分高低来筛选出重要的生物标记物，从而得到可以用来评判金龙胶囊药效作用的生物标记物。

同样基于以上的分析，我们设定8个评分标准来对该组差异基因和拓扑学重要基因一一打分，根据分数高低来筛选出重要靶点，从而得到金龙胶囊作用后的主要靶点基因。

5、金龙胶囊的临床适应症预测

以下对于金龙胶囊适应症的分析是基于这样两组差异基因表达谱数据来进行：即APvs.A；APJvs.AP组。通过以下的分析，来综合评价金龙胶囊可能的临床适应症。

6、差异基因表达谱与疾病基因谱进行反向比较

汤森·路透科技集团拥有多种疾病发生后的基因表达谱数据库，将APvs.A；APJvs.AP组的差异基因表达谱与此数据库中各种疾病的基因表达谱进行比对，如果差异性越大，则说明金龙胶囊可能对此疾病具有治疗作用（详见表15）。

表15差异基因表达谱与疾病基因谱反向比较结果列表——APJvs.AP

7、差异基因表达谱与已知药物的基因表达谱进行相似性比较

美国FDA有已知药物发挥各适应症作用的基因表达谱数据库，将APvs.A；APJvs.AP组的差异基因表达谱与此数据库中已知药物的基因表达谱进行相似性比对，如果相似性越高，则说明金龙胶囊可能也具有与此已知药物相似的适应症（见表16）。

表16差异基因表达谱与已知药物基因表达谱相似性比较结果列表——APJvs.AP

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (3)

1.一种构建金龙胶囊在作为抗脑肿瘤药物的作用机制的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建人类脑肿瘤小鼠原位模型；

(2)以金龙胶囊按照0.75g/kg的给药量对所述小鼠原位模型持续给药；

(3)提取金龙胶囊干预后的脑肿瘤组织的总RNA模板，以其反转录合成cDNA，并体外转录合成生物素标记的cRNA，并进行cRNA纯化，片段化处理后，与Affymetrix公司的HumanGenomeU133Plus2.0基因芯片杂交；

(4)将杂交后的芯片进行清洗和染色，并扫描杂交信号，对38500个肿瘤相关基因进行检测，获取基因表达的荧光信号强度，并采用RMA方法对样品芯片检测后的原始数据进行前处理，以及利用AffymetrixGenChipCommandConsoleSoftware软件进行数字化处理和分析，获取差异基因，并将所述差异基因在MAS系统中进行pathway和GeneOntology的统计分析，按照其所涉及的信号通路和生物学过程进行分类，并对其p-value和q-value进行了计算，获取与肿瘤发生发展关系密切的类别及信号通路，观察其作用靶点以及不同靶点之间形成的调控网络；

(5)利用汤森路透Genego数据库对处理后的基因芯片结果进行系统生物学的分析，得到其差异基因表达谱,分别通过one-step”overconnectivity”test和multi-step“hiddennodes”algorithm，得到其拓扑学重要基因，并对二者所涉及的生物学信息项目进行聚类分析：①范式通路；②生物学过程网络；③疾病的生物标记物；④毒理学网络；⑤生物学过程；⑥分子功能；⑦细胞组件，并计算其重要性；同时利用计算机技术对金龙胶囊已有的基础研究结果进行网络构建，构建这些基因所参与的发挥药效作用的机制网络图以构建金龙胶囊抗脑肿瘤的机制网络图，以获取其药理机制并对金龙胶囊可能的临床适应症进行预测。

2.根据权利要求1所述的构建金龙胶囊在作为抗脑肿瘤药物的作用机制的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述小鼠原位模型为红色荧光蛋白标记的人类脑肿瘤U87-RFP小鼠原位模型。

3.一种构建金龙胶囊化疗耐药逆转活性作用机制的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)培养人肺腺癌紫杉醇耐药细胞A549/Paclitaxel及其亲本细胞A549；

(2)向培养的所述耐药及亲本细胞中加入金龙胶囊培养，得到金龙胶囊干预后的耐药细胞；

(3)提取所述金龙胶囊干预后的耐药细胞的总RNA模板，以其反转录合成cDNA，并体外转录合成生物素标记的cRNA，并进行cRNA纯化，片段化处理后，与Affymetrix公司的HumanGenomeU133Plus2.0基因芯片杂交；

(4)将杂交后的芯片进行清洗和染色，并扫描杂交信号，对47000个转录本或变异性基因进行检测，获取基因表达的荧光信号强度，并采用AffymetrixGenChipCommandConsoleSoftware软件进行数字化处理和分析；获取各样品的基因表达谱以及人肺腺癌亲本细胞系的差异基因表达谱，并计算差异基因的差异倍数，获取差异倍数≥4的基因；

(5)利用汤森路透Genego数据库对处理后的基因芯片结果进行系统生物学的分析，得到其差异基因表达谱,分别通过one-step”overconnectivity”test和multi-step“hiddennodes”algorithm，得到其差异基因表达谱以及其拓扑学重要基因，并对二者所涉及的生物学信息项目进行聚类分析：①范式通路；②生物学过程网络；③疾病的生物标记物；④毒理学网络；⑤生物学过程；⑥分子功能；⑦细胞组件，并计算其重要性；同时利用计算机技术对金龙胶囊已有的基础研究结果进行网络构建，构建这些基因所参与的发挥药效作用的机制网络图以构建金龙胶囊抗脑肿瘤的机制网络图，以获取其药理机制并对金龙胶囊可能的临床适应症进行预测。