CN104812375B - 用于治疗氧化应激的纳米二氧化铈 - Google Patents

用于治疗氧化应激的纳米二氧化铈 Download PDF

Info

Publication number
CN104812375B
CN104812375B CN201380030839.3A CN201380030839A CN104812375B CN 104812375 B CN104812375 B CN 104812375B CN 201380030839 A CN201380030839 A CN 201380030839A CN 104812375 B CN104812375 B CN 104812375B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nano particle
cerium
edta
disease
nano
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201380030839.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104812375A (zh
Inventor
肯尼斯·约瑟夫·里德
文迪·安·科斯坦佐
约瑟夫·塞缪尔·埃利克曼
埃里克·莱斯利·贝尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sirain Inc
Original Assignee
Sirain Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sirain Inc filed Critical Sirain Inc
Publication of CN104812375A publication Critical patent/CN104812375A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104812375B publication Critical patent/CN104812375B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/244—Lanthanides; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1682—Processes
    • A61K9/1694—Processes resulting in granules or microspheres of the matrix type containing more than 5% of excipient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/14—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L31/16—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01P—INDEXING SCHEME RELATING TO STRUCTURAL AND PHYSICAL ASPECTS OF SOLID INORGANIC COMPOUNDS
    • C01P2004/00—Particle morphology
    • C01P2004/60—Particles characterised by their size
    • C01P2004/64—Nanometer sized, i.e. from 1-100 nanometer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)

Abstract

本文描述了用于制备生物相容材料的纳米颗粒的方法，其中提供了包含三价铈离子、预定比率的柠檬酸和乙二胺四乙酸、氧化剂和水的水性反应混合物，以及直接形成铈氧化物纳米颗粒的稳定分散体而不进行分离的温度条件。这些生物相容的铈氧化物纳米颗粒可用于预防和/或治疗氧化应激相关疾病，例如中风、复发/弛张型多发性硬化、慢性进行性多发性硬化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症和缺血再灌注损伤。

Description

用于治疗氧化应激的纳米二氧化铈
相关申请的交叉引用
本专利申请要求于2012年6月13日提交的临时申请序列号61/689,806(NANOCERIAFOR THE TREATMENT OF MULTIPLE SCLEROSIS)，2012年6月18日提交的临时申请序列号61/690,100(NANOCERIA FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF MULTIPLE SCLEROSIS)，2012年10月12日提交的临时申请序列号61/795,241(BIOLOGICAL EFFECTS OF NANOCERIAIN A MODEL OF MULTIPLE SCLEROSIS)以及2012年11月16日提交的临时申请序列号61/796,639(NANOCERIA FOR THE REDUCTION OF OXIDATIVE STRESS)的优先权，其全部公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明一般性地涉及纳米医学领域的改进。特别地，本发明涉及用生物相容材料制备的含铈纳米颗粒，制备所述纳米颗粒的方法，以及所述纳米颗粒预防和治疗炎症及氧化应激相关事件和疾病的用途。
背景技术
自由基氧化应激在许多人类疾病尤其是神经退行性疾病的发病机理中起着主要作用。因此，使用可降低特定自由基物类的抗氧化剂进行治疗在理论上可防止组织损伤并改善存活和神经结果两者。生理环境中的自由基通常可分为活性氧类(reactive oxygenspecies，ROS)或活性氮类(reactive nitrogen species，RNS)。自由基是具有高度活性的化学物类并且易于在亚细胞水平上与蛋白质、脂类和核酸反应，从而导致各种疾病的发展。
在纳米医学中使用纳米二氧化铈的起源可追溯到Bailey和Rzigalinski的开创性工作，其中观察到将超细铈氧化物颗粒施用于培养的脑细胞中大大增强了细胞存活能力，如Rzigalinski在Nanoparticles and Cell Longevity，Technology in CancerResearch&Treatment 4(6)，651-659(2005)中所描述的。更特别地，当使用由反胶束微乳化技术合成的2至10纳米(nm)大小的铈氧化物纳米颗粒处理体外大鼠脑细胞培养物时，其表现出长约3至4倍的存活时间，如Rzigalinski等于2003年9月4日提交的美国专利7,534,453中所报道的。铈氧化物纳米颗粒为暴露于由过氧化氢或紫外线暴露所产生的致死剂量自由基的经培养脑细胞提供了相当大的保护。此外，据报道，铈氧化物纳米颗粒在鼠体内是相对惰性的，具有较低毒性(例如，尾部静脉注射不产生毒性作用)。虽然没有报道体内的医学益处，但是假设了用这些二氧化铈纳米颗粒进行治疗的益处，包括减少与创伤、移植、关节炎、关节病、血管病、组织衰老、中风和创伤性脑损伤相关的炎症。
然而，Rzigalinski等随后在WO 2007/002662中报道了这些特定纳米二氧化铈颗粒的许多问题。通过这种反胶束微乳化技术制备的纳米二氧化铈有几个问题：(1)粒径不能较好地控制在所报道的2至10纳米(nm)范围内，使得批次之间的可变性较高；(2)用于最终产物加工的表面活性剂尾料(携带污染物)如双(乙基己基)磺基琥珀酸钠(也称为多库酯钠或(AOT))导致了毒性反应；(3)当将这些纳米颗粒放置在生物介质中时，表面活性剂尾料量的无法控制产生了聚集的问题，导致功效和可递送性降低；以及(4)铈(+3/+4)的价态随时间的不稳定性。因此，通过反胶束微乳化技术制备的铈氧化物纳米颗粒在批次之间是高度可变的，并且对于哺乳动物细胞显示出比期望毒性更高的毒性。
作为替代方案，Rzigalinski等在WO 2007/002662中报道了通过高温技术合成的纳米二氧化铈的生物功效，其由至少三种商业来源获得。据报道，铈氧化物纳米颗粒的这些新来源提供了批次之间活性的优异可再现性。还报道了在不考虑来源的情况下，具有小尺寸、窄尺寸分布和低聚集速率的铈氧化物颗粒是最有利的。就尺寸而言，该公开内容具体地断定，在颗粒进入细胞内部的实施方案中，进入细胞的颗粒的优选尺寸范围为约11nm至约50nm，例如约20nm。在颗粒从细胞外侧对细胞发挥其作用的实施方案中，这些胞外颗粒的优选尺寸范围为约11nm至约500nm。
Rzigalinski等还报道对于递送，纳米颗粒的非聚集形式是有利的。为了实现该目标，他们报道可在超高纯水中或在用超高纯水所制备的生理盐水中对按重量计约10％的原液进行超声处理。然而，如其他人注意到的，通过高温技术合成的纳米二氧化铈(例如获得自商业来源)的超声处理水性分散体是高度不稳定的并且快速沉降(即，在几分钟内)，造成施用来源于这些来源之纳米二氧化铈的水性分散体时具有很大的可变性。
Rzigalinski等报道了在相对简单的模型系统中的生物功效，包括体外细胞培养物、经口喂养的黑腹果蝇，以及以明显小于治疗剂量(300纳摩尔或约0.2mg/kg)尾静脉注射的小鼠。
Yokel等在Nanotoxicology，2009，3(3)：234-248中描述了对商业二氧化铈纳米材料的生物分布和氧化应激作用进行的深入研究。特别地，将得自于Aldrich的5％纳米二氧化铈分散体(#639648)超声处理3分钟并以50mg/kg、250mg/kg和750mg/kg的纳米二氧化铈剂量输注到大鼠中。对该材料而言，任何纳米颗粒表面稳定剂的性质都是未知的。纳米二氧化铈颗粒的尺寸通过各种技术进行表征并且通过动态光散射报道为平均31+/-4nm。透射电子显微镜法(transmission electron microscopy，TEM)表明大部分颗粒为具有双峰粒度分布(峰在8nm和24nm处)的片状物，并且一些颗粒为～100nm。观察到使血液与该形式纳米二氧化铈一起孵育1小时具有范围为～200nm至大于1微米的聚集物，并且当输注到大鼠中时，其从血液中被快速清除(半衰期为7.5分钟)。虽然观察到大部分纳米二氧化铈聚集在肝和脾中，但是尚不清楚任何显著量穿过血脑屏障并进入脑组织细胞。
然后，Yokel等试图对纳米二氧化铈表面涂层(稳定剂)进行精确控制并通过Masui等，J.Mater.Sci.Lett.21，489-491(2002)的直接两步水热制备法(其包括柠檬酸钠作为生物相容稳定剂)制备了纳米二氧化铈的稳定水性分散体。高分辨率TEM表明，该形式的纳米二氧化铈具有边缘尖锐的结晶多面体颗粒形态以及4nm至6nm的窄粒度分布。据报道，在7.35的生理pH和-53mV的ζ电势下，这些平均尺寸为5nm的二氧化铈纳米颗粒的柠檬酸盐稳定化分散体在大于2个月中是稳定的。因此在施用前不需要进行超声处理。
Hardas等，Toxicological Sciences 116(2)，562-576(2010)报道了该形式的柠檬酸盐稳定化纳米二氧化铈的广泛生物分布和毒理学研究的结果。出乎意料地，他们报道与先前研究的～30nm纳米二氧化铈(Aldrich(#639648)，以上所述)相比，这种更小的纳米二氧化铈毒性更大，在脑中未观察到，并且对海马和小脑中的氧化应激产生很小的影响。这些结果与“设计得更小的纳米材料将易于穿过血脑屏障的假设”相违背。
虽然包含铈氧化物的纳米颗粒可通过本领域已知的各种技术来制备，但是所述颗粒通常需要稳定剂以防止不期望的聚集。关于先前所用的生物相容纳米二氧化铈稳定剂，Masui等，J.Mater.Sci.Lett.21，489-491(2002)描述了直接产生二氧化铈纳米颗粒的稳定水性分散体的两步水热方法，其使用柠檬酸盐缓冲剂作为稳定剂。然而，该方法既耗时又设备密集，其需要在大的密封反应器中进行两个单独的24小时反应步骤。
Sandford等，WO 2008/002323 A2报道了使用生物相容稳定剂(乙酸)的水性制备技术，其直接产生二氧化铈的纳米颗粒分散体而无需进行沉淀或分离步骤，并且不需要后续的煅烧。三价铈离子被硝酸根离子缓慢氧化为四价铈离子，并且在将乙酸用作稳定剂时获得了11nm微晶尺寸(约等于晶粒尺寸)的稳定的非聚集溶胶。
DiFrancesco等在于2007年9月4日提交的PCT/US2007/077545，METHOD OFPREPARING CERIUM DIOXIDE NANOPARTICLES中描述了，在生物相容稳定剂(例如柠檬酸、乳酸、酒石酸、乙二胺四乙酸(EDTA)及其组合)的存在下，在低pH(＜4.5)下三价铈离子被过氧化氢氧化。具体地，稳定剂乳酸和乳酸与EDTA的组合均示出直接产生了纳米二氧化铈的稳定分散体(平均粒径为3nm至8nm)而无需进行中间颗粒分离步骤。
Karakoti等在J.Phys.Chem.C 111，17232-17240(2007)中报道了通过在酸性条件(过氧化氢)和碱性条件(氢氧化铵)两者中氧化三价铈离子在单糖/多糖中直接合成了纳米二氧化铈。所公开的具体生物相容稳定剂包括葡萄糖和葡聚糖。虽然公开了小至3nm至5nm的单一粒径，但是产生了10nm至30nm的弱聚集体。虽然没有描述胶体不稳定性的起因，但是认为这些颗粒的ζ电势大小可能不够大。
Karakoti等在JOM(Journal of the Minerals，Metals&Materials Society)60(3)，33-37(2008)中评论了在生物相关介质(使得与生物体生理相容)中合成纳米二氧化铈的稳定分散体的挑战，诸如需要理解胶体化学(ζ电位、粒径、分散剂、溶液pH等)使得不干扰能够清除自由基(活性氧类(ROS)和活性氮类)的纳米二氧化铈的还原/氧化(redox)能力。Karakoti等具体描述了在不存在任意稳定剂时以及在存在葡聚糖、乙二醇和聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)稳定剂时，在低pH(＜3.5)下硝酸铈被过氧化氢氧化。虽然报道了粒径为3nm至5nm，但是还报道了颗粒聚集至10nm至20nm。
Kim等在Angew.Chem.Int.Ed.2012，51，1-6中报道了通过反胶束方法合成并用磷脂-聚乙二醇(PEG)包封的3nm纳米二氧化铈可通过减小脑梗死体积并通过清除ROS来预防大鼠的缺血性中风。然而，更高剂量不能预防，并且认为这可能与如上所述的表面活性剂尾料问题有关，这困扰着反胶束合成方法。
仍然需要高效且有效的方法和药剂来调解和减缓来自自由基氧化应激的损害。此外，仍需要对用于直接制备(即，无需颗粒分离步骤)含铈纳米颗粒的生物相容分散体的方法进行进一步改进，例如，收率更高、时间更短以及悬液密度更高，所述含铈纳米颗粒尺寸足够小，能够穿过健康或不健康的血脑屏障，尺寸频率分布更均匀，在宽范围的生物介质中稳定且无毒，体内的细胞吸收和血液循环时间增大。此外，其在生产用于预防和/或治疗哺乳动物尤其是人的炎症和氧化应激相关事件(例如缺血性中风和再灌注损伤)以及氧化应激相关疾病(特别是中枢神经系统疾病，例如多发性硬化和肌萎缩性脊髓侧索硬化症)的药剂中是很有用的。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了制备纳米颗粒的分散体的方法，其包括：形成包含三价铈离子、摩尔比(CA/EDTA)为约3.0至约0.1(即约3∶1至约1∶9)的柠檬酸(CA)和乙二胺四乙酸(EDTA)、氧化剂和水的反应混合物；任选地，加热或冷却反应混合物并且直接形成含铈纳米颗粒的分散体而不进行分离。
在本发明的第二方面中，提供了预防(即，预防性治疗)氧化应激相关疾病特别是中枢神经系统疾病(例如多发性硬化或肌萎缩性脊髓侧索硬化症)的方法，其包括在氧化应激相关疾病发生前施用有效量的含铈纳米颗粒，所述含铈纳米颗粒在摩尔比为约3.0至约0.1的柠檬酸与乙二胺四乙酸之混合物的存在下制备。
在本发明的第三方面中，提供了治疗氧化应激相关事件或疾病特别是中枢神经系统疾病(例如多发性硬化或肌萎缩性脊髓侧索硬化症)的方法，其包括在疾病或事件发生后施用有效量的含铈纳米颗粒，所述含铈纳米颗粒在摩尔比为约3.0至约0.1的柠檬酸与乙二胺四乙酸之混合物的存在下制备。
在本发明的第四方面中，提供了包含铈氧化物、柠檬酸和乙二胺四乙酸的纳米颗粒，其中在制备期间添加的柠檬酸与乙二胺四乙酸的摩尔比为约3.0至约0.1。
在本发明的第五方面中，提供了包含铈氧化物、柠檬酸和乙二胺四乙酸的纳米颗粒，其中柠檬酸与乙二胺四乙酸的摩尔比为约3.0至约0.1。
在本发明的第六方面中，提供了用于预防和/或治疗氧化应激相关事件或疾病的药物组合物，其包含铈氧化物纳米颗粒，其中在制备期间添加的柠檬酸与乙二胺四乙酸的摩尔比为约3.0至约0.1。
在本发明的第七方面中，提供了用于预防和/或治疗氧化应激相关疾病的药物组合物，其包含能够穿过哺乳动物血脑屏障的铈氧化物纳米颗粒。
附图说明
图1包括CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒的粉末X射线衍射(X-ray diffraction，XRD)图谱以及CeO2(方铈矿)的线状谱。
图2是经干燥的CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒的TEM显微照片。
图3是经干燥的CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒的高分辨率TEM显微照片。
图4是CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒的尺寸等级分布图。
图5是对于MS慢性进行性模型，对于载剂对照以及在预防性和治疗性治疗方案中施用的CeNP而言，平均临床评分随时间变化的图。药物(CeNP)治疗剂量为10mg/kg。
图6是对于载剂对照、预防性和治疗性治疗方案，MS慢性进行性模型中的平均临床评分随时间变化的图。药物(CeNP)治疗剂量为20mg/kg。
图7是对于MS慢性进行性模型，载剂对照(cont)以及通过预防性(prev)和治疗性(ther)治疗方案施用的CeNP在疾病进程中的临床分数(AUC)的图表。药物(CeNP)治疗剂量为20mg/kg。
图8是MS慢性进行性模型的临床严重程度(AUC)随用于预防性治疗方案的CeNP剂量变化的图表。
图9是MS慢性进行性模型的临床严重程度(AUC)随用于治疗性(延迟3天)治疗方案的CeNP剂量变化的图表。
图10是疾病严重程度的降低随注入MS慢性进行性模型中的总二氧化铈(CeNP)变化的图。
图11是脑部铈含量随注入MS慢性进行性模型中的总二氧化铈(CeNP)变化的图。
图12是对于MS慢性进行性模型，对于对照，在预防性和治疗性治疗方案中施用的CeNP以及每日芬戈莫德(fingolimod)治疗的平均临床分数随时间变化的图。药物(CeNP)治疗剂量为30mg/kg。
图13是对于芬戈莫德以及通过预防性和治疗性(延迟7天)治疗方案施用的CeNP，在MS慢性进行性模型的急性期(0至30天)期间相对于对照的疾病严重程度降低的图表。
图14是对于芬戈莫德以及通过预防性和治疗性(延迟7天)治疗方案施用的CeNP，在MS慢性进行性模型的慢性期(31至35天)期间相对于对照的疾病严重程度降低的图表。
图15是对于MS慢性进行性模型，对于对照、通过预防性(prev)和治疗性(延迟7天)(ther)方案施用的CeNP以及芬戈莫德(fing)日治疗方案，在整个疾病进程中评价疾病严重程度(AUC)的图表。
图16是对于MS慢性进行性模型，对于对照以及通过预防性和治疗性治疗方案施用的CeNP，转棒测试(Rotarod Test)表现随时间变化的图。药物(CeNP)治疗剂量为20mg/kg。
图17是对于MS慢性进行性模型，转棒测试表现随通过预防性治疗方案施用的CeNP剂量变化的图表。
图18是对于MS慢性进行性模型，转棒测试表现随通过治疗性(延迟3天)治疗方案施用的CeNP剂量变化的图表。
图19是对于MS慢性进行性模型，对于对照以及通过预防性和治疗性治疗方案施用的CeNP，悬线测试(Hanging Wire Test)表现随时间变化的图。药物(CeNP)治疗剂量为20mg/kg。
图20是对于MS慢性进行性模型，悬线测试表现随通过预防性和治疗性(延迟)治疗方案施用的CeNP剂量变化的图表。
图21是对于MS慢性进行性模型，对于对照以及通过预防性和治疗性治疗方案施用的CeNP，平衡木测试表现随时间变化的图。药物(CeNP)治疗剂量为20mg/kg。
图22是MS慢性进行性模型的平衡木测试表现随通过预防性和治疗性(延迟)治疗方案施用之CeNP剂量变化的图表。
图23是取自C57BL/6小鼠的脑和脊髓(sc)中以及分离的小脑组织中聚集的总二氧化铈的图表，所述C57BL/6小鼠经慢性进行性MS来诱发并且施用载剂对照(cont)或者在预防性(prev)和治疗性(ther)治疗方案中施用20mg/kg CeNP。
图24是取自C57BL/6小鼠的各种组织中二氧化铈聚集的ICP-MS结果的图表，所述C57BL/6小鼠经慢性进行性MS诱发并且在预防性和治疗性治疗方案中施用20mg/kg CeNP，并在疾病诱发后第42天处死。
图25是C57BL/6小鼠的慢性进行性MS的慢性期(42天)期间脑(小脑部分)中活性氧类水平(光强度)的图表，所述C57BL/6小鼠经载剂对照、芬戈莫德以及通过预防性(30mg/kg剂量)治疗方案施用的二氧化铈(CeNP)治疗。
图26是在MS慢性进行性模型的慢性期(第42天)期间脑(小脑部分)中活性氧类水平(光强度)的图表，其表示为芬戈莫德以及通过预防性(30mg/kg剂量)治疗方案施用的二氧化铈(CeNP)与对照的百分比。
图27包括在第42天取自经二氧化铈(CeNP)治疗(预防性治疗方案)的小鼠和未治疗的对照小鼠的经自由基指示剂染料CM-DCFDA处理的小脑切片的荧光显微镜照片(伪彩色图片使得较高荧光强度显示为较暖(例如，红/橙，较亮区域)的颜色并且较低强度显示为较冷(例如，蓝/紫，较暗区域)的颜色)。
图28包括经免疫组织化学染色处理的小鼠小脑切片的显微镜图像。
图29是对于MS的复发/弛张模型而言，对于载剂对照以及在预防性和治疗性治疗方案中施用的CeNP，平均临床评分随时间变化的图。
图30是对于MS的复发/弛张模型而言，对于对照以及通过预防性和治疗性治疗方案施用的CeNP，平衡木测试表现随时间变化的图。
图31是对于MS的复发/弛张模型而言，对于对照以及通过预防性和治疗性治疗方案施用的CeNP，悬线测试表现随时间变化的图。
图32是对于MS的复发/弛张模型而言，对于对照以及通过预防性和治疗性治疗方案施用的CeNP，转棒测试表现随时间变化的图。
图33是对于MS的复发/弛张模型而言，对于对照、Sigma-Aldrich、Alfa Aesar(1∶14和1∶9稀释度)以及通过治疗性治疗方案施用的CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒(CNRx 87)，疾病进程中临床评分(AUC)的图表。
图34是对于MS的复发/弛张模型而言，对于对照、Sigma-Aldrich、Alfa Aesar(1∶14和1∶9稀释度)以及通过治疗性治疗方案施用的CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒(CNRx 87)，疾病进程中平均平衡木评分(AUC)的图表。
图35是对于MS的复发/弛张模型而言，对于对照、Sigma-Aldrich、Alfa Aesar(1∶14和1∶9稀释度)以及通过治疗性治疗方法施用的CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒(CNRx 87)，疾病进程中平均悬线测试表现的图表。
图36是对于MS的复发/弛张模型而言，对于对照、Sigma-Aldrich、Alfa Aesar(1∶14和1∶9稀释度)以及通过治疗性治疗方案施用的CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒(CNRx 87)，疾病进程中平均转棒测试表现的图表。
图37是与各种市售的纳米二氧化铈(24mg/kg的总剂量)相比，采用CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒(标记为CNRx)以治疗性治疗方案给药的MS的复发/弛张模型的脑部沉积结果的图表。
图38是在MS的复发/弛张模型中，在最终注射CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒(24mg/kg的总剂量)后脑部二氧化铈含量随时间变化的图表。
图39是对于10mg/kg静脉(IV)注射以及50mg/kg皮下注射CeNP到大鼠中，血浆中二氧化铈浓度在24小时时间中的图。
图40是经载剂对照和CeNP(CNRx 87)处理的G93A模型ALS小鼠的存活期(天数)的图表。
图41是对于采用载剂对照以及采用在第-4、-2和0天以20mg/kg给药的CeNP(CNRx87)处理的小鼠，在经由离体心脏灌注下垂心手术(Langendorff hanging heartprocedure)进行心肌缺血/再灌注之后LDH聚集的图表。
发明详述
应理解，没有具体示出或描述的元件可采用本领域技术人员公知的各种形式。本发明受权利要求限定。
本文使用的术语纳米颗粒包括平均直径小于100nm的颗粒。出于本公开内容的目的，除非另外说明，否则纳米颗粒的直径是指其流体动力学直径，其是通过动态光散射技术测定的直径并且包括分子吸附物和颗粒附随的溶剂化壳。或者，可通过电子透射显微照片(TEM)分析来估计几何粒径。
本文使用的各种含铈材料可交换地描述为“二氧化铈”、“铈氧化物”或“铈二氧化物”。化学领域的技术人员应理解，这些材料中存在的实际氧化阴离子可包括氧化物阴离子或氢氧根阴离子或其混合物，例如水合氧化物相(例如羟基氧化物)。此外，已知物质的组合物可由多价阳离子的固溶体构成，并且被称为非化学计量固体。因此，对于由多种氧化态的金属阳离子构成的氧化物相，应理解存在的氧化物阴离子总量将通过存在的金属阳离子多种氧化态(例如，Ce3+和Ce4+)的具体量来确定，使得能够维持电荷中性。对于名义上描述为金属二氧化物的非化学计量相，其具体为化学式MO2-δ，其中δ(delta)的值可变化。对于铈氧化物CeO2-δ，δ(delta)的值通常为约0.0至约0.5，前者表示铈(IV)氧化物CeO2，后者表示铈(III)氧化物CeO1.5(或者表示为Ce2O3)。或者，δ(delta)的值表示相对于铈(IV)氧化物(CeO2)存在的氧空位的量。对于存在的每个氧二价阴离子空位，存在两个三价铈离子(Ce3 +)，以保持电荷中性。
在本发明的一个实施方案中，提供了这样的方法，其包括：形成包含三价铈离子、柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、氧化剂和水的反应混合物；任选地加热或冷却反应混合物；以及直接形成纳米颗粒的稳定分散体而不进行分离。
在多个实施方案中，反应混合物中的柠檬酸与EDTA的摩尔比为约3∶1至约1∶9、约3∶1至约2∶1和约1.2∶1.0至约1∶9。
在多个实施方案中，氧化剂包含分子氧或空气或者比分子氧更具氧化性的化合物(或空气的环境气氛)。在另一些实施方案中，氧化剂的水性半电池还原电位比标准氢电极大-0.13伏。在一些具体的实施方案中，氧化剂是碱金属或铵的高氯酸盐、氯酸盐、次氯酸盐或过硫酸盐，臭氧、过氧化物或其组合。在一个具体的实施方案中，使用双电子氧化剂，例如过氧化氢。在一些具体的实施方案中，过氧化氢以比三价铈离子摩尔量大二分之一的量存在。在又一些实施方案中，存在的氧化剂的量相对于存在的铈离子或其他金属离子的量变化很大。
在一个具体的实施方案中，使分子氧穿过反应混合物。
在一些具体的实施方案中，反应混合物的温度大于或小于环境温度。在一些具体的实施方案中，将反应混合物加热或冷却至大于或小于环境温度的温度。在多个实施方案中，将反应混合物加热或冷却至大于约30℃、大于约40℃、大于约50℃、大于约60℃、大于约70℃、大于约80℃或大于约90℃的温度。在一个具体的实施方案中，将反应混合物加热或冷却至小于水沸点温度的温度。
在多个实施方案中，所形成的纳米颗粒是无定形的、半结晶的或基本结晶的或结晶的。在一个具体的实施方案中，所形成的纳米颗粒的特征在于立方萤石晶体结构。在一个具体的实施方案中，所形成的纳米颗粒的特征在于铈氧化物晶体结构。
本文使用的术语半结晶和基本结晶是指具有至少一些晶体结构的纳米颗粒。如本领域普通技术人员所认识的，颗粒的精确表征随着粒度变小而变得越来越困难，因为较小颗粒之长程序(long-range order)的可检测性较差。
在至少一个实施方案中，纳米颗粒是结晶的并且可以是单结晶或多结晶的。
在一些具体的实施方案中，通过加热反应混合物使所形成的纳米颗粒的结晶度增强。
在一些具体的实施方案中，通过加热反应混合物对所形成的纳米颗粒进行脱水或脱羟基。
在多个实施方案中，所形成的纳米颗粒的流体动力学直径小于100nm、小于80nm、小于60nm、小于40nm、小于20nm、小于10nm、小于5.0nm、小于约3nm或小于约2.0nm。
在一个具体的实施方案中，所形成的纳米颗粒的几何直径小于流体动力学直径。
在多个实施方案中，所形成的纳米颗粒的粒径变异系数(COV)(定义为粒径的标准偏差除以平均粒径)小于约15％、小于约10％、小于约5％或小于约3％。
在一个具体的实施方案中，提供了含铈纳米颗粒。在另一些实施方案中，提供了包含铈氧化物、氢氧化铈或羟基氧化铈的纳米颗粒。
在一个具体的实施方案中，提供了包含柠檬酸、乙二胺四乙酸和铈氧化物、氢氧化铈或羟基氧化铈的纳米颗粒。
在另一些实施方案中，提供了ζ电势小于或等于零的纳米颗粒。在一些具体的实施方案中，提供了包含铈氧化物、柠檬酸、乙二胺四乙酸并且ζ电势小于或等于零的纳米颗粒。在一些具体的实施方案中，提供了包含铈氧化物、柠檬酸、乙二胺四乙酸并且ζ电势小于-10mV、小于-20mV、小于-30mV、小于-40mV或小于约-50mV的纳米颗粒。在一些具体的实施方案中，提供了包含铈氧化物、柠檬酸、乙二胺四乙酸并且ζ电势为-15mV至-30mV的纳米颗粒。
在一些具体的实施方案中，提供了ζ电势大于零的纳米颗粒。在一些具体的实施方案中，提供了包含铈、柠檬酸、乙二胺四乙酸并且ζ电势大于零、大于10mV、大于20mV、大于30mV、大于40mV或大于50mV的纳米颗粒。
在多个实施方案中，纳米颗粒的ζ电势通过调节纳米颗粒分散体的pH、柠檬酸和/或乙二胺四乙酸含量或其组合来改变。
在一个具体的实施方案中，纳米颗粒的ζ电势通过将纳米颗粒分散体的柠檬酸和乙二胺四乙酸含量调节至小于饱和范围来改变。
在另一个实施方案中，纳米颗粒的ζ电势通过调节纳米颗粒分散体的pH以及将柠檬酸和乙二胺四乙酸含量调节至小于饱和范围两者来改变。
在多个实施方案中，含铈纳米颗粒的分散体包含基本上非聚集的纳米颗粒、大于90百分比的非聚集纳米颗粒、大于95百分比的非聚集纳米颗粒、大于98百分比的非聚集纳米颗粒和完全非聚集的纳米颗粒。
在一个具体的实施方案中，非聚集纳米颗粒是结晶的，或者被称为单颗粒微晶或单个微晶。
在一个具体的实施方案中，洗涤所形成的纳米颗粒分散体以移除过量离子或副产物盐。在多个实施方案中，洗涤纳米颗粒分散体使得离子电导率减小至小于约15毫西门子/厘米(mS/cm)、小于约10mS/cm、小于约5mS/cm或小于约3mS/cm。在一些具体的实施方案中，通过渗析、渗滤或离心洗涤所形成的纳米颗粒分散体。
在一些具体的实施方案中，浓缩所形成的纳米颗粒分散体以移除过量溶剂或过量水。在一些具体的实施方案中，通过渗析、渗滤或离心来浓缩纳米颗粒分散体。
在多个实施方案中，分散体中纳米颗粒的浓度大于约0.05重量摩尔、大于约0.5重量摩尔或大于约2.0重量摩尔(在给定分散体中约35％的固体)。
在一些具体的实施方案中，纳米颗粒的尺寸分布基本上为单峰的。在另一些实施方案中，纳米颗粒尺寸的变异系数(coefficient of variation，COV)小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％或小于约5％，其中COV定义为标准偏差除以平均值。
在一些具体的实施方案中，采用本领域已知的各种混合装置来搅拌、混合、剪切或搅动反应混合物的内容物。在多个实施方案中，使用包括搅拌棒、船用叶片螺旋桨、倾斜叶片涡轮或平叶片涡轮的混合器。在一个具体的实施方案中，使用迫使反应混合物穿过筛网的高剪切混合器，所述筛网包含尺寸为几分之一毫米至数毫米的孔。在一些具体的实施方案中，使用胶体磨或高剪切混合器。在一些具体的实施方案中，将一种或更多种反应物引入水性反应混合物的液面之下。在一个具体的实施方案中，将反应物引入极为接近混合装置的水性反应混合物的液面之下。
在本发明的一个实施方案中，采用了通过共同转让的美国专利申请公开2010/0152077中公开的方法将水性纳米颗粒分散体转换为较小极性的溶剂组合物的溶剂方法。在一个具体的实施方案中，纳米颗粒分散体穿过具有包含例如醇或甘醇醚的有机稀释剂的渗滤柱。
在至少一个实施方案中，含铈纳米颗粒的分散体在至少2个月(例如，至少12个月)中是稳定的。
不受任何理论的限制，提出的使用铈氧化物来治疗炎症和氧化应激相关疾病(例如，ROS介导的疾病)部分基于铈氧化物可起自由基的催化性清除剂的作用的认知。Ce3+和Ce4+价态的混合物中铈的存在和易于相互转换可使得铈氧化物能够将自由基还原和/或以催化或自动再生方式氧化为危害较小的物质。氧化还原反应可发生在中和损害组织之自由基的铈氧化物纳米颗粒(CeNP)的表面。例如，人们认为期望使过氧化物阴离子(O2-)氧化为分子氧，以将过氧亚硝基阴离子(ONOO-)氧化为生理学无害物质，并将羟基自由基(·OH)还原为氢氧根阴离子。与例如目前可用于治疗氧化应激相关疾病和事件的牺牲抗氧化剂相比，这可能转而能够较大程度地降低给药方案。
在一些具体的实施方案中，施用的本发明纳米二氧化铈颗粒穿过细胞膜进入细胞中并存在于细胞质中或各种细胞器(例如细胞核和线粒体)中。在另一些实施方案中，本发明的纳米二氧化铈颗粒存在于血管内空间或间质空间中，其中其可通过除去自由基或降低自身免疫应答降低氧化应激和炎症。在一个具体的实施方案中，由血脑屏障(blood-brainbarrier，BBB)或血-脑脊液屏障(blood-cerebrospinal fluid barrier，BCFB)或血眼屏障(blood-ocular barrier，BOB)故障造成的中枢神经系统的免疫系统入侵通过本发明的纳米二氧化铈颗粒来调节。
在另一个实施方案中，本发明的纳米二氧化铈颗粒是能够跨越哺乳动物血脑屏障的颗粒。在多个实施方案中，本发明的纳米二氧化铈颗粒跨越哺乳动物血脑屏障并作为尺寸小于约100nm、小于约50nm、小于约20nm、小于约10nm、小于约5nm的聚集体或附聚物存在于脑实质组织中。在一个具体实施方案中，本发明的纳米二氧化铈颗粒跨越哺乳动物血脑屏障并作为尺寸小于约3.5nm的独立的非聚集纳米颗粒存在于脑实质组织中。
在一些具体的实施方案中，特别地，预期包含本发明纳米二氧化铈颗粒的药物组合物用于预防和/或治疗氧化应激相关疾病和事件，例如但不限于阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、共济失调、弗里德赖希共济失调(Friedreich’s ataxia)、孤独症、强迫性精神障碍、注意力缺陷多动障碍(attentiondeficit hyperactivity disorder)、偏头痛、中风、创伤性脑损伤、癌症、炎症、自身免疫疾病、狼疮、MS、炎性肠病、克罗恩病(Crohn’s Disease)、溃疡性结肠炎、狭窄、再狭窄、动脉粥样硬化、代谢综合症、内皮功能障碍、血管痉挛、糖尿病、衰老、慢性疲劳、冠心病、心脏纤维化、心肌梗塞、高血压、心绞痛、变异型心绞痛(Prizmetal’s angina)、局部缺血、血管成形术、缺氧症、克山病(Keshan disease)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency)、蚕豆病、缺血再灌注损伤、类风湿性关节炎和骨关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(例如，肺气肿和支气管炎)、过敏症、急性呼吸窘迫综合征、慢性肾病、肾移植、肾炎、电离辐射损伤、晒伤、皮炎、黑素瘤、银屑癣、黄斑变性、视网膜变性、白内障形成(cataractogenesis)等。
在一些具体的实施方案中，特别地，预期包含本发明纳米二氧化铈颗粒的药物组合物用于预防和/或治疗氧化应激相关细胞病变，例如但不限于线粒体功能障碍、溶酶体和蛋白酶体功能障碍、核酸氧化(例如，RNA 和DNA)、酪氨酸硝化(tyrosine nitration)、磷酸化介导的信号级联的损失、细胞凋亡的启动、脂质过氧化和膜脂环境的破坏。
在至少一个实施方案中，以有效量施用根据本发明制备的包含含铈纳米颗粒的药物组合物以预防性治疗氧化应激相关疾病。本文使用的短语“有效量”意指包含足够有效成分(例如，含铈纳米颗粒)以带来期望效果的药物组合物的量。如本领域所认识的，药物有效量可通过常规实验来确定。
在至少一个实施方案中，以有效量施用根据本发明制备的包含含铈纳米颗粒的药物组合物以治疗氧化应激相关疾病的症状。
在多个实施方案中，将包含本发明纳米二氧化铈颗粒的药物组合物施用于人或非人对象，例如另一种哺乳动物，包括但不限于犬、猫、牛、马、绵羊、猪或啮齿动物。或者，施用对象可以是动物，例如鸟、昆虫、爬行动物、两栖动物或者任意的宠物(companion)或农用动物。
在多个实施方案中，本发明的纳米二氧化铈颗粒通过局部、肠内或肠胃外方法体内施用至对象，包括注射、输注或移植。更具体地，特别预期的是，通过任意以下途径施用本发明的纳米二氧化铈颗粒：耳(耳部)、口腔、结膜、皮肤、牙齿、电渗、宫颈内、窦内(endosinusial)、气管内、肠内、硬膜外、羊膜腔外(extra-amniotic)、体外(extracorporeal)、血液透析、渗透、间质(interstitial)、腹内、羊膜内、动脉内、胆内、支气管内、囊内、心脏内、软骨内、脊尾内(intracaudal)、海绵窦内、腔内、大脑内、脑池内、角膜内、冠状牙齿(intracornal-dental)、冠状动脉内、冠状海绵体内(intracorporuscavernosum)、皮内、椎间盘内、管内、十二指肠内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、牙龈内、回肠内(intraileal)、病灶内、管腔内、淋巴管内、髓内、脑膜内、肌肉内、眼内、卵巢内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、窦内(intrasinal)、脊柱内、滑膜内、腱内(intratendinous)、睾丸内、鞘内、胸内、小管内、肿瘤内、鼓室内、子宫内、血管内、静脉内、静脉内推注、静脉内滴注、心室内、膀胱内、玻璃体内、离子电渗、冲洗、喉、鼻、鼻饲、封闭给药法(occlusive dressing technique)、眼用、口服、口咽、肠胃外、经皮、关节周围、硬膜外、神经周、牙周、直肠、呼吸道(吸入)、眼球后、软组织、蛛网膜下、结膜下、皮下、舌下、粘膜下、局部、经皮、经乳腺、经粘膜、经胎盘(transplacenta)、经气管、经鼓膜、输尿管、尿道、阴道、以及任意其他或未指定的途径。
在另一些实施方案中，使本发明的纳米二氧化铈颗粒保留在医疗装置或假体(例如套管、导管或支架)中或其表面上，从而在短时间或长时间内局部或全身地减轻炎症。
在多个实施方案中，本发明的纳米二氧化铈颗粒以本领域已知的任何合适形式递送，所述形式包括但不限于：悬液、凝胶、片剂、肠衣片剂、负载脂质体、散剂、栓剂、难熔剂(infusible)、锭剂、霜剂、洗剂、药膏或吸入剂。
在多个实施方案中，本发明的纳米二氧化铈颗粒与其他可药用物质组合，所述物质例如但不限于：水、盐、缓冲剂、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、糖、人或牛血清白蛋白、脂质、药物、着色剂、调味剂、粘合剂、胶、表面活性剂、填料或本领域已知的任何赋形剂。
在一个具体的实施方案中，包含本发明纳米二氧化铈颗粒的载剂在施用之前进行灭菌。
在另一些实施方案中，使细胞或细胞培养物与本发明纳米二氧化铈颗粒接触。接触可通过体内或体外方法通过暴露细胞或细胞培养来实践，其中后一种方法包括将经处理的细胞重新引入对象中，例如最初从其获得所述细胞的对象。在多个实施方案中，所述细胞本质上是原核细胞或真核细胞。在一些具体的实施方案中，将经处理细胞用于生产医药工业中所使用的蛋白质(一般称为生物制剂)，例如但不限于抗原、抗体和疫苗。在另一个实施方案中，将经处理细胞用于发酵方法。
本发明通过以下实施例进行进一步说明，这些实施例不旨在以任何方式限制本发明。
实验部分
纳米颗粒光散射和尺寸评估
通过评估当红激光笔灯照射时相对于来自纯溶剂样品的散射量分散体表现出的Tyndell散射度进行了颗粒分散体的简单定性表征。使用配备有石英杯(quartz cuvette)的Brookhaven 90Plus粒度分析仪(Brookhaven Instruments Corp.，Holtzville，NewYork，U.S.A.)通过动态光散射(dynamic light scattering，DLS)进行了纳米颗粒分散体粒度的定量评估。所报道的DLS尺寸是对数加权参数。
纳米颗粒电荷评估
通过使用来自Malvern Instruments的Zetasizer Nano ZS测量ζ电势进行了纳米颗粒电荷的定量评估。
制备具有柠檬酸和EDTA的二氧化铈纳米颗粒
向含有磁力搅拌棒的800ml玻璃烧杯中引入500ml的高纯(HP)水。然后，将水加热至约70℃，并在其中溶解2.41克柠檬酸(CA)和4.27克乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)。添加氢氧化铵(28％至30％)以将溶液的pH调节至约8.5。将反应容器的温度升高至约80℃，并用在5000rpm下运行的L4RT高剪切混合器代替磁力搅拌棒。将10.0克量的Ce(NO3)3·6(H2O)溶解在30ml HP水中，并将该溶液于数分钟内缓慢添加至搅拌的反应混合物中。通过添加少量的浓NH4OH溶液将反应pH维持在约8.5。然后在数分钟内将包含4.8ml50％H2O2(H2O2与铈的摩尔比为3.0)的50ml溶液缓慢添加到三价铈离子、柠檬酸、EDTA反应混合物中。覆盖反应产物，然后再加热1小时，得到透明的黄色/橙色悬液。在搅拌下冷却后，将直接形成的纳米分散体通过渗滤洗涤至离子电导率小于约10mS/cm，从而除去过量的盐。产物分散体的pH为约7.2。
最终产物分散体是透明的黄色/橙色液体，当用低强度激光束照射时其显示出高Tyndall散射度，表明其包含良好分散的胶体颗粒。观察到最终产物分散体在至少12个月内是稳定的，并且没有颗粒聚集或沉淀的迹象。通过对七个重复制备物进行的动态光散射的粒度分析得出，平均流体动力学直径为3.1nm且标准偏差为0.30nm(COV为10％)。
通过其中添加等摩尔量(50/50)柠檬酸和EDTA的这种方法制备的二氧化铈纳米颗粒在本文中不同地称为CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒、CA/EDTA纳米二氧化铈、CeNP、CNRx或CNRx 87。
使CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒的重复制备物通过粉末X射线衍射(XRD)进行相识别和微晶尺寸分析。将样品部分放置在聚四氟乙烯舟皿中，在加热灯下干燥4小时，然后在真空下于80℃在烤箱中干燥4小时。轻轻研磨所得固体以形成粉末。然后将这些粉末从前面填充至玻璃保持器上并通过XRD在N2干电池附件中进行分析。
图1中示出了CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒的三个特别重复制备物的XRD光谱的分析，表明每个样品都包含与CeO2(PDF#34-394，方铈矿)结构相同的主晶相。使用Scherrer技术测定七个重复样品在CeO2(220) 方向上的平均微晶尺寸为2.4nm且标准偏差为0.06nm(COV为2.5％)。
经干燥的CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒的中等高分辨率TEM显微图(图2)显示出各个(非聚集)颗粒全体的直径为约2nm至3nm。经干燥的CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒的更高分辨率TEM显微图(图3)表明了所选纳米颗粒中原子的各个排列。如图4所示，由TEM显微图确定了尺寸等级分布。
ζ电势测量显示出，对于这些CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒的重复制备物的水性分散体，平均电荷为-23mV。
除了将柠檬酸与EDTA稳定剂的摩尔比调节至100/0、80/20、70/30、60/40、40/60、30/70、20/80和0/100之外，同时维持恒定总摩尔量的稳定剂，重复上述CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒的制备。如下表1所示，得到了具有大体相似的物理特征(粒径和ζ电势)的铈氧化物纳米颗粒的稳定分散体。
在多种氧化应激相关疾病中评估铈氧化物纳米颗粒
缺血性中风
缺血性中风的小鼠海马脑部切片模型
对由Estevez，AY等，Neuroprotective mechanisms of cerium oxidenanoparticles in a mouse hippocampal brain slice model of ischemia，FreeRadic.Biol.Med.(2011)51(6)：1155-63(doi：10.1016/j.radbiomed.2011.06.006)所述的局部缺血体外小鼠海马脑部切片模型进行修改，评估了对纳米二氧化铈减少氧化应激的能力。
通过快速断头处死成年(年龄为2至5个月)CD1小鼠并快速摘除其脑并放置在经冷冻的胆碱基切片溶液(315mOsm)中，所述溶液包含24mM胆碱碳酸氢盐、135mM氯化胆碱、1mM犬尿喹啉酸、0.5mM CaCl2、1.4mM Na2PO4、10mM葡萄糖、1mM KCl和20mM MgCl2。使用LeicaVT1200振动切片机(Leica Microsystems，Wetzlar，德国)将横向海马切片(400μm厚)沿从喙-尾(rostral-to-caudal)轴(-1.2mm至-2.8mm前囱)切割，并使其在对照的人工脑脊髓液(artificial cerebral spinal fluid，aCSF)(pH 7.4，300mOsm)中恢复1小时，所述人工脑脊髓液包含1.24mM NaCl、3mM KCl、2.4mM CaCl2、1.3mM MgSO4、124mM K3PO4、26mM NaHCO3、10mM葡萄糖并用5％CO2、95％O2气体进行鼓泡。将海马切片放置在培养皿中并在37℃下在具有5％CO2的NuAire湿润孵育箱(NuAire，Plymouth，MN，USA)中储存48小时。
通过在37℃下将脑切片在低血糖、酸性和缺氧的aCSF(葡萄糖和pH分别降至2mM和6.8，并且溶液用84％N2、15％CO2和1％O2进行鼓泡)中放置30分钟诱导了局部缺血的氧化应激。添加蔗糖以将溶液的摩尔渗透压浓度维持在约295mOsm。
在缺血事件发生时，在1μg/1ml aCSF或培养基的递送体积(相当于5.8μM)中以匹配剂量施用如上所述制备的铈氧化物纳米颗粒的水性分散体，并在整个实验的剩余时间中保留在培养基中。对照切片接受相等体积的载剂对照。对于如本文所述制备的铈氧化物纳米颗粒，使用多种递送载剂都取得了相似的成功，所述载剂包括单独的蒸馏水、盐溶液、柠檬酸钠溶液、PBS及其组合。
在暴露于氧化应激(缺血情况)30分钟之后，活的脑切片(测试和对照)通过将其放置在包含培养基和Millipore插入物(Millipore，Billerica，MA，USA)的35mm培养皿中而在器官型培养物中孵育24小时。培养基包含50％极限必需培养基(Hyclone Scientific，Logan UT，USA)、25％马血清、25％Hank平衡盐溶液(补充有28mM葡萄糖、20mM HEPES和4mMNaHCO3)、50U/ml青霉素和50μl/ml链霉素，pH 7.2。
在氧化损伤24小时后使用荧光成像技术测定了细胞死亡的程度。除了单独施用载剂之外，测试条件(即，施用铈氧化物纳米颗粒)下所研究的每组脑切片与在各方面都进行相同处理的相似组对照脑切片相匹配。因此，在每个研究日，使取自年龄匹配且性别匹配之同窝仔畜的解剖学上匹配的两组脑切片经受测试条件(施用铈氧化物纳米颗粒)或对照(单独施用载剂)。在荧光成像测量期间，光强度、图像捕捉持续时间和图像收集的时机对于测试条件和载剂对照脑切片是相同的。结果表示为实验程序中同一时间点时成像的测试条件中荧光与匹配对照切片中荧光的比率。
氧化损伤24小时后，将成对的(对照和测试)脑切片在包含0.81μM活体排泄染料Green(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的培养基中孵育20分钟，并且随后在培养基中洗涤15至20分钟以除去未并入的染料。Green是结合DNA和RNA的荧光染料。然而，其在完整的活细胞中通过细胞膜从细胞核中被排除。因此，其充当活体染料并只对那些死亡细胞和垂死细胞(其中细胞膜变得可渗透使得染料得以进入细胞内部)染色。在染色和洗涤之后，将脑切片转移至配备有荧光显微镜附件和150-W氙光源(Optiquip，Highland Mills，NY，USA)的Nikon TE 2000-U(Nikon Instruments，Melville，NY，USA)显微镜的台上。将对照aCSF溶液负载到60ml注射器中，用95％O2/5％CO2平衡并使用伺服控制的注射加热部件、回热加热器和同轴灌注加热器(Warner Instruments，Hamden，CT，USA)加热至37℃。以1ml/分钟的速率向脑部分连续地灌注经加热的经95％O2/5％CO2平衡的aCSF。5分钟后，使用4×Plan Flour物镜(Nikon Instruments)在相同条件下(即，光强度、曝光时间、照相机采集参数)收集每个对照和测试脑切片的海马形成图像。通过在480±40nm下短暂地(620ms)激发组织，使用505nm的长通二色镜(Chroma technology，Bennington，VT，USA)过滤来自探针的发射荧光(535±50nm)，强化并用冷却CCD增益EM照相机(HamamatsuCCD EM C9100；Bridgewater，NJ，USA)测量对Green荧光进行了测量。获得了数字图像并用Compix SimplePCI 6.5软件(C成像系统，Cranberry Township，PA，USA)进行了处理。
由Green装载得到的光强度反映出所计算面积内死亡或垂死细胞的数目。光强度测量使用Compix SimplePCI 6.5软件自动进行，从而消除了选择目标区域时的实验者偏差。
细胞死亡的减少报道为：对于取自年龄匹配且性别匹配的同窝仔畜脑并且在同一天切片并暴露于缺血性氧化应激的解剖学上匹配的海马部分，以及在损伤型缺血24小时后成像的荧光，测试条件(即经纳米二氧化铈处理)与对照(未处理)的海马区域(起始层、放射层和腔隙分子层)的Green荧光的光强度比。
使用5.8μM的处理浓度在缺血性中风的小鼠海马脑切片模型中评估了铈氧化物纳米颗粒，所述纳米颗粒用包含柠檬酸、EDTA及其组合的生物相容稳定剂来制备。下表1中给出了作为柠檬酸与EDTA摩尔比之函数的细胞死亡的减少(相对于对照的减少百分比)(通常称作节制(sparing))的结果。
表1
用单独柠檬酸作为稳定剂制备的铈氧化物纳米颗粒(100/0)进行处理使细胞死亡减少(节制)了约16％，然而用单独EDTA作为稳定剂制备的铈氧化物纳米颗粒(0/100)进行处理对细胞死亡的影响很小(1.8％降低)。细胞死亡的进一步减少(或者称为节制增加)是药物组合物或药剂的期望特征。用摩尔比为70/30至20/80的柠檬酸与EDTA的组合制备的铈氧化物纳米颗粒进行处理导致了节制出乎意料的增加，其大大超过了基于单独使用每种稳定剂的效果的简单线性预测总和。例如，对于柠檬酸与EDTA的等摩尔(50/50)比，看到了最大的节制(约30％)，而对于用这种稳定剂组合制备的纳米颗粒的简单线性预测为单独柠檬酸的15.5％节制和单独EDTA的1.8％节制的平均值，其仅为8.65％节制。因此，发现了柠檬酸与EDTA稳定剂组合之间出乎意料且预料不到的协同作用，其中等摩尔(50/50)柠檬酸与EDTA的实际节制比简单线性预测高约3.5倍。
一般地，对于柠檬酸与EDTA的给定比，用于预测节制百分比的简单线性(加和)模型有以下表达式给出：
[CA的分数]＊[CA的节制％]+[EDTA的分数]＊[EDTA的节制％]
其中给定稳定剂的分数是存在的所有稳定剂的摩尔分数。对于表1 所示的结果，CA的节制％是15.5％并且EDTA的节制％是1.8％。该表达的值(预测性节制百分比)列于上表1以节制结果和预测(％)为标题的栏中。
一般地，节制的协同增加可体现为两个不同的参数。实际和预测节制量(实际-预测)之间的差异体现了绝对基础上的协同作用，因此正值代表出乎意料的额外节制(发明结果)，并且负值代表低于预期节制量(即，稳定剂之间的负相互作用或干扰)。或者，实际与预测之比(实际/预期)体现了相对基础上的协同作用，因此值大于1代表出乎意料的额外节制的相对量(发明结果)，并且值小于1代表由于稳定剂之间的负相互作用或干扰而小于预测期望量的节制的相对量(比较结果)。
表1中节制协同栏中这些参数的测试再一次表明，用摩尔比为70/30至20/80的柠檬酸与EDTA的组合制备的铈氧化物纳米颗粒进行处理，导致了绝对节制的协同增加((实际/预期)的值为正)，以及相对节制的协同增加((实际/预期)的值大于1)。绝对协同节制的最大量的增加在柠檬酸与EDTA的处理比率为50/50时发生，因此出乎意料地观察到额外的21.65％节制。相对协同节制增加的最大量在柠檬酸与EDTA的处理比率为30/70时发生，因此实际节制比预测大3.9倍。
相比之下，用由摩尔比为80/20的柠檬酸与EDTA的组合制备的铈氧化物纳米颗粒进行处理，观察到负相互作用或干扰，因此绝对实际节制比预测节制小6.8％，或者可替代地，相对实际节制仅是预测节制的一半(0.5倍)。
因此，总之，已发现用摩尔比为约3.0至约0.1的柠檬酸和EDTA制备的铈氧化物纳米颗粒进行处理导致了节制的协同增加，而用摩尔比为4.0的柠檬酸和EDTA制备的铈氧化物纳米颗粒进行处理导致了干扰，使得节制小于预期。
多发性硬化
多发性硬化(MS)是中枢神经系统(CNS)的疾病，其在全世界范围内影响超过2百万人。MS长期以来被认为是免疫介导的炎症疾病，其部分地引起神经细胞周围髓鞘的变性并最终因氧化应激导致神经元细胞死亡。最常见病程(称作复发/弛张)的特征在于明确的恶化神经功能和运动功能的攻击，然后是没有疾病活动的新信号的相对安静(弛张)时期。较不常见的病程被称为慢性进行性MS，并且特征在于临床神经损伤的稳态进行，其在最初MS症状之后没有弛张。虽然最初只有约20％的患者被诊断为慢性进行性MS，但是约一半最初诊断为复发/弛张MS的那些将在每十年发展成慢性进行形式。
慢性进行性多发性硬化
MS的小鼠EAE模型
通过鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)模型模拟了MS发生的多个病理特征，其中炎性疾病通过用髓磷脂抗原免疫进行诱导。EAE模型的特征在于血脑屏障(BBB)破坏、免疫细胞的血管周围浸润、小胶质细胞活化和脱髓鞘。EAE模型在开发用于MS治疗的目前疗法中至关重要。
SJL-EAE小鼠购自Jackson Laboratories(C57BL/6)并用载剂或载剂+CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒进行了处理。在疾病诱导之前(预防性模型)或之后(治疗性模型)通过IV尾静脉注射向实验动物施用在PBS/50mM柠檬酸钠盐中混合的CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒，然后给予不同浓度的维持剂量。在一个实验中，一个子集的小鼠每日用饮用水中2μg/L的免疫调节药物芬戈莫德(Cayman Chemical，Ann Arbor，MI，USA)进行了处理。下表4中详细描述了各种处理方案(给药方案)。
表4
如下诱导小鼠患上实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)(即，慢性进行性多发性硬化样症状)：0.1ml静脉内(IV)尾注射200μg溶解在与等体积的完全弗氏佐剂(Freund’sadjuvant)混合的磷酸盐缓冲盐(phosphate buffered saline，PBS)中的髓磷脂少突胶质细胞(MOG35-55)蛋白肽(Genscript)，然后在第0天和第2天递送0.1ml腹膜内注射PBS中的200ng百日咳毒素。
使用下述的临床评分测试，连同设计为评估小脑功能(平衡木)、前肢力量(悬线)和后肢力量(转棒)的三种运动行为测试，每天对疾病进展进行评分。
临床评分测试
每天使用改编自Selvaraj等(2008)的临床规模对EAE小鼠中多发性硬化型症状的疾病进展进行评分，如下表2所示。
表2
运动行为测试
悬线测试
使用悬线任务评估了握力。对于该任务，将小鼠放置在具有钢线栅板的开口Plexiglas盒中。将盒在高于台面60cm处向下翻转，并测试掉落的时延。
转棒测试
使用转棒设备(Med Associates，St.Albans，VT)主要评估了后肢运动协调性和耐力。将小鼠放置在以28rpm旋转的滚筒上并测定了从滚筒上掉落的时延(300秒，最大值)。
平衡木测试
对于该任务，将小鼠放置在升高木梁的照射终端，并给予长达60s以到达目标盒。使用5等级尺度(5＝等于正常步态至0＝立即从平衡木上掉落)对平横和步态质量进行了评分。根据下述尺度对步态质量进行了进一步评定。
表3
图5中对于10mg/kg剂量并且图6中对于20mg/kg剂量示出了预防性和治疗性给药设计二者的CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒减少的(改善的)临床评分结果。作为积累的疾病严重程度的度量，对于以20mg/kg水平给药的每只动物，计算了平均临床评分与诱导后天数的曲线下面积(area under the curve，AUC)(参见图7)。对于预防性处理方案(图8)和治疗性3天延迟处理方案(图9)，CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒使临床严重程度以剂量依赖性方式降低(改善)。图10示出了疾病严重程度随注射的总二氧化铈而降低的整体图。
二氧化铈的组织积累：通过过剂量异氟烷使一个子集的小鼠安乐死，并用PBS进行穿心灌注。将收集的组织冷冻并通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对铈进行分析。图11示出了作为所注射的总二氧化铈之函数的脑铈含量。
图10至11的结果表明，颗粒穿透到CNS中与递送剂量密切相关并在所测试剂量的范围下没有饱和。
图12至图15的结果示出了以30mg/kg水平给药的CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒与免疫调节药物芬戈莫德的比较。相对于对照，所有的处理组在疾病的A)急性期(图13)和B)慢性期(第31至35天)期间均使疾病严重程度显著降低(p＜0.05)(图14)。在急性期期间，芬戈莫德和预防性处理显著地比治疗性(延迟7天)处理更有效。在疾病的慢性期(第31天至第35天)期间，所有组都同样有效。
此外，用CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒进行处理改善了小鼠的运动行为表现。转棒测试(图16)和悬线测试(图19)示出了接受20mg/kg剂量CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒的小鼠每日的组平均运动行为表现，其中相对于对照较长的掉落时延表明了改善的运动表现。图21示出了对于20mg/kg剂量的每日组平均平衡木表现，其中相对于对照的较高评分表明了改善的运动表现。如用于预防性(图17)与治疗性延迟3天(图18)两种处理方案的转棒测试以及用于所有剂量和处理方案的悬线测试(图20)和平衡木测试(图22)所示，运动行为表现在所研究范围中随剂量增加而持续改善。
图23至24中示出了分离自经CA/EDTA纳米二氧化铈处理之小鼠的器官和脑切片的电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)的铈含量分析的结果，表明对于预防性和治疗性两种处理方案，小脑中积累的铈最高。
在由诱导以患有EAE(MS的慢性进行性症状)的小鼠之小脑制备的脑切片中研究了活性氧类(ROS)水平，所述切片在最终CA/EDTA纳米二氧化铈注射之后一周制备(n＝12只小鼠)。使用Estevez，AY等，Neuroprotective mechanisms of cerium oxide nanoparticlesin a mouse hippocampal brain slice model of ischemia，Free Radic.Biol.Med.(2011)51(6)：1155-63(doi：10.1016/j.radbiomed.2011.06.006)所述方法，利用荧光探针CM-DFCDA(Invitrogen)测量了ROS水平。
在最后药物处理之后7天进行测试时，与对照和经芬戈莫德处理之动物相比，来自经CA/EDTA纳米二氧化铈处理之小鼠的脑切片中的细胞内ROS水平显著降低(图25至26)。
以前没有报道过当在微米或亚微米分辨率下成像时纳米二氧化铈进入活哺乳动物脑实质组织中宽且均匀的分布。为此，通过取自经CA/EDTA纳米二氧化铈处理和未处理的成对对照的小脑切片中明显降低的ROS荧光(CM-DFCDA)水平的分散和均匀性质，表明了整个小鼠脑组织中CA/EDTA纳米二氧化铈颗粒的宽分布(图27)。尤其是，注意到，经纳米二氧化铈处理切片中的荧光分布(图27)与图28中以相似放大比描绘的小脑微脉管系统分布不对应，表明CA/EDTA纳米二氧化铈颗粒不限于微脉管或局限于血脑屏障细胞中，而是广泛地分布在整个小脑组织中。这些观察结果与CA/EDTA纳米二氧化铈颗粒通过用慢性进行性多发性硬化诱导之EAE小鼠的受损血脑屏障的渗透相一致，并且颗粒广泛分散在脑组织中。
复发/弛张型多发性硬化
多发性硬化的鼠EAE模型
通过鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型模拟了MS发生的多个病理特征，其中炎性疾病通过用髓磷脂抗原免疫进行诱导。EAE模型的特征在于血脑屏障(BBB)破坏、免疫细胞的血管周围浸润、小胶质细胞活化和脱髓鞘。EAE模型在开发用于MS治疗的目前疗法中至关重要。
用载剂、载剂+CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒或者载剂+得自于Sigma-Aldrich或AlfaAesar的商用纳米二氧化铈处理了雌性SJL-EAE小鼠。在临使用之前，将市售纳米二氧化铈分散在载剂中并进行超声处理。在预防性给药设计中，在疾病诱导前一天和疾病诱导当天用10mg/kg的CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒对小鼠进行IV尾静脉注射，然后在疾病诱导之后第3天、第7天、第14天和第21天注射6mg/kg CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒。除了消除前两次注射(在疾病诱导之前和疾病诱导当天)之外，治疗性给药设计是相似的。在施用之前，将CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒混合在PBS/50mM柠檬酸钠盐水载剂中。
如下诱导小鼠患上实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)(即，复发/弛张型多发性硬化样症状)：0.1ml静脉尾注射200μg溶解在与等体积的完全弗氏佐剂混合的磷酸盐缓冲盐(PBS)中的髓磷脂碱性蛋白肽(PLP139-151)，然后在第0天和第2天0.1ml腹膜内注射200ngPBS 中的百日咳毒素。
在疾病诱导之后，小鼠在免疫之后11至14天产生麻痹的首次发病(第14天达到高峰)，并且与大多数人MS患者相似，其在约第20天从麻痹的第一次波动中完全或几乎完全恢复。
如先前所述，测试包括每日临床评分连同设计成评估小脑功能(平衡木)、前肢力量(悬线)和后肢力量(转棒)的三种运动行为测试。
关于疾病的发生，在以下测试看到了大大延迟(改善)：预防性和治疗性给药设计二者的临床评分结果(图29)、预防性给药设计的平衡木结果(图30)以及预防性和治疗性给药设计二者的悬线结果(图31)。
表6中列出了与载剂对照组相比，通过预防性和治疗性给药设计施用的CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒的定量(平均)效果的统计概要。除了用于转棒测试的预防性给药设计的情况之外，预防性和治疗性给药设计二者的临床评分以及各种运动行为测试显示出统计学显著的改善。
表6
对于MS的复发/弛张模型，病程的平均临床评分(AUC)比较表明，相对于对照，仅CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒(CNRx 87)减缓了疾病(图33)。Sigma-Aldrich和Alfa Aesar(1∶14和1∶9稀释)比较的结果比对照更差或与对照没有不同。
对于MS的复发/弛张模型，病程的平均平衡木评分比较表明，CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒(CNRx 87)完成得最好，而除Alfa Aesar 1∶9稀释之外，比较比对照差或与对照没有不同(图34)。
对于MS的复发/弛张模型，病程的平均悬线测试结果比较表明，相对于对照，仅CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒(CNRx 87)通过增加掉落的平均时延而减缓了疾病(图35)。Sigma-Aldrich和Alfa Aesar(1∶14和1∶9稀释)比较的结果比对照差或与对照没有不同。
对于MS的复发/弛张模型，病程的平均转棒测试结果比较表明，相对于对照，仅CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒(CNRx 87)通过增加掉落的平均时延而减缓了疾病(图36)。Sigma-Aldrich和Alfa Aesar(1∶14和1∶9稀释)比较的结果比对照差。
铈脑水平的比较
使用治疗性给药设计，EAE-诱导小鼠(n＝12)接受了包含CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒或市售纳米二氧化铈(即，得自Sigma-Aldrich和Alfa Aesar)的二氧化铈分散体(24mg/kg全部剂量)的尾静脉注射。在最终注射后24小时，收集脑和其他器官并使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定了这些器官中二氧化铈的浓度。
图37中示出的脑沉积结果表明铈低于Sigma-Aldrich纳米二氧化铈的检测限，而本发明CNRx纳米二氧化铈实施方案的脑中沉积比Alfa Aesar材料的脑中沉积高约4倍。
在单独的生物分布研究中，在三个时间点上向四只年龄为1至3个月的具有实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)特征的成年SJL小鼠经尾静脉注射盐水中中的52mg CA/EDTA纳米二氧化铈/kg小鼠体重(52mg/kg剂量)：第0天、第3天和第7天。此外，通过注射蛋白脂质蛋白(proteolipid protein)诱导了这些小鼠中的两只产生多发性硬化(MS)样症状(实验性自身免疫性脑脊髓炎)，并在第7天显示出峰值MS样症状。另外两只小鼠没有诱导产生MS样症状，而是简单地注射盐水作为载剂对照。在第8天(在最后注射纳米二氧化铈之后24小时)将四只动物各自处死；并摘除其心脏、肾、肝脏、肺、脾、脑和脊髓器官，冷冻并进行铈含量分析。
使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)通过以下步骤对器官的体积铈含量进行了分析。在15ml聚丙烯管中用1ml最适HNO3消化每个器官的0.1g至0.5g组织样品并在微波消化炉中加热至105℃保持30分钟。使样品冷却，添加100μl H2O2并用去离子水将样品稀释至10ml最终体积。通过以正常模式运行的ICP-MS(7500cx，Agilent，Santa Clara，CA)分析这些经消化样品的体积铈含量。仪器用NIST可跟踪初始标准校准，并且使用第二源标准作为校准检查。
以下所示的表5包括四只小鼠(标记为小鼠1至4)的体积铈含量结果，其构成如本文中本发明实施方案所述的生物分布研究。此外，Yokel等Nanotoxicology 3(3)，234-248(2009)(数据取自其中的表I)与Hardas 等Toxicological Sciences 116(2)，562-576(2010)(数据取自其中表2的20小时结束)所报道的静脉内施用纳米二氧化铈的早期全动物(啮齿动物)生物分布研究的结果包括在内以进行比较。
表5
本文所述研究(小鼠1至4)与在相当或较高剂量下进行的早期研究(Yokel等和Hardas等)之间的体积铈含量比较表明，作为注射了本文中作为本发明一个实施方案所述的2.5nm直径的CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒的水性分散体的结果，多约30至100倍的铈与脑相关，多约25至50倍的铈与肝脏相关，并且多约7倍的铈与脾相关。此外，注意到，在具有完全完整BBB的健康小鼠(小鼠3至4)中以及在期望具有大大受损BBB的具有诱导的MS样症状的小鼠(小鼠1至2)中，均观察到与各个器官相关的铈量的增加出乎意料地大。
注意到，与作为本发明该实施方案结果的与各个靶器官相关的铈大量增加相比，本文所述研究(小鼠1至4)与在相当或较高剂量下进行的早期研究(Yokel等和Hardas等)的生物分布方案之间的差异一般来说是相当小的。具体地，Yokel等使用了50mg/kg剂量并在最终注射之后20小时使动物终止。Hardas等使用了100mg/kg剂量并也在最终注射之后20小时使动物终止，而在本文中本发明人使用了52mg/kg剂量并在最终注射之后24小时使动物终止。
生物持久性研究
在从最终CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒注射(24mg/kg总剂量)开始的不同时间点(1至21天)，收集了经诱导患有EAE复发/弛张形式的小鼠脑部(n＝22)并使用ICP-MS测定了铈的浓度。在最终注射之后至少到3周可检测到显著水平的二氧化铈(图38)。
通过对大鼠进行的研究，在单次10mg/kg静脉注射或单次50mg/kg皮下注射之后，大鼠血液中铈含量的测量表明CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒被快速地从血浆中清除(图39)。
毒性研究
当通过Gentronix Ltd.(UK)的GreenScreen测定进行评价时，观察到CA/EDAT二氧化铈纳米颗粒实施方案无基因毒性。
当通过Gentronix Ltd.(UK)的磷脂沉积(Phospholipidosis，PLD)测定进行评价时，观察到CA/EDAT二氧化铈纳米颗粒实施方案无磷脂沉积毒性。
当通过Gentronix Ltd.(UK)的hERG-450测定进行评价时，观察到CA/EDAT二氧化铈纳米颗粒实施方案无钾通道干扰。
肌萎缩性脊髓侧索硬化症
肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)是由位于脊髓腹角中的上和下神经元以及提供其传出输入的皮层神经元的退化引起的进行性的，致命的运动神经元疾病。在1939年诊断出患此疾病的棒球运动员之后，该病症通常被称为卢格里克氏病(Lou Gehrig’s disease)。
虽然不知道ALS的原因，但是发现了家族ALS与产生Cu/Zn超氧化物歧化酶(superoxide dismutase enzyme，SOD1，强有力的抗氧化剂)的基因中的突变有关，表明其可能涉及自由基的积累。然而，缺乏SOD1基因的小鼠通常没有患家族ALS，但是其表现出年龄相关肌肉萎缩(肌肉减少症)增加。
使得自于Jackson实验室的SOD1G93A小鼠(Bar Harbor，ME，USA；品系B6SJL-TgSOD1G93A)每周经历临床和运动行为测试(上述)并在疾病发生时随机分成几个处理组。一组小鼠接受单独的盐载剂对照注射，而向纳米二氧化铈处理动物进行16mg/kg CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒的尾静脉注射，每周一次或两次。
接受纳米二氧化铈处理的雄性G93A小鼠在所有运动技能测试(悬线、平衡木和转棒)中都表现出非常大的改善。如图40所示，接受CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒处理的雄性G93A小鼠也表现出相对于对照的寿命延长。
缺血再灌注损伤
再灌注损伤是指在局部缺血一段时间之后血液供应返回至组织时发生的组织损伤。在缺血期间血液中氧和营养物的缺乏产生了这样的情况，其中循环恢复通过诱导氧化应激而不是恢复正常代谢功能导致了炎症和氧化损伤。
认为炎症应答部分地介导再灌注损伤的损害。通过重新返回血液运载至区域的白血球可释放出多种炎症因子，包括白细胞介素和自由基。
在证明小鼠心脏缺血再灌注损伤时，在第-4天和第-2天通过颈静脉以20mg/kg的剂量向小鼠注射载剂或CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒。在第0天切除心脏并在Langendorff系统上进行灌注。在25分钟的总体不流动缺血和45分钟的再灌注后，通过乳酸脱氢酶(LDH)测定监测了坏死性细胞死亡。图41示出相对于载剂对照，CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒处理的LDH聚集减少形式的改善。心肌梗塞尺寸的评估也表明，20mg/kg剂量的CA/EDTA二氧化铈纳米颗粒提供了保护作用。
虽然参照多个具体实施方案对本发明进行了描述，但是应理解在所述的发明构思的精神和范围内可进行许多改变。因此，意味着本发明不限于所述的实施方案，而是具有权利要求所限定的全部范围。

Claims (15)

1.一种制备纳米颗粒的分散体的方法，其包括：
a.形成包含三价铈离子、摩尔比为3.0至0.1的柠檬酸和乙二胺四乙酸、氧化剂和水的反应混合物；以及
b.直接形成含铈纳米颗粒的分散体而不进行分离，
其中所述氧化剂是分子氧，空气，碱金属或铵的高氯酸盐、氯酸盐、次氯酸盐或过硫酸盐，臭氧，过氧化物或其组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述含铈纳米颗粒是结晶的。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述纳米颗粒的特征在于立方萤石晶体结构。
4.根据权利要求1所述的方法，其还包括加热或冷却所述反应混合物以维持反应温度低于水的沸点温度。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述氧化剂包含空气、分子氧或过氧化氢。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述含铈纳米颗粒是非聚集的。
7.根据权利要求6所述的方法，其中大于95百分比的所述含铈纳米颗粒是非聚集的。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述含铈纳米颗粒的分散体的ζ电势为-15mV至-30mV。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述分散体在至少2个月中是稳定的。
10.一种药物组合物，其包含通过根据权利要求1所述的方法制备的含铈纳米颗粒。
11.通过根据权利要求1所述方法制备的含铈纳米颗粒的分散体在制备用于预防性治疗患者以预防氧化应激相关疾病或氧化应激相关事件的药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述氧化应激相关疾病或事件是缺血性中风、多发性硬化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症或缺血再灌注损伤。
13.通过根据权利要求1所述方法制备的含铈纳米颗粒的分散体在制备用于治疗患者的氧化应激相关疾病或氧化应激相关事件的症状的药物中的用途。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述氧化应激相关疾病或事件是缺血性中风、多发性硬化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症或缺血再灌注损伤。
15.一种通过根据权利要求1所述的方法制备的纳米颗粒。
CN201380030839.3A 2012-06-13 2013-03-15 用于治疗氧化应激的纳米二氧化铈 Expired - Fee Related CN104812375B (zh)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261689806P 2012-06-13 2012-06-13
US61/689,806 2012-06-13
US201261690100P 2012-06-18 2012-06-18
US61/690,100 2012-06-18
US201261795241P 2012-10-12 2012-10-12
US61/795,241 2012-10-12
US201261796639P 2012-11-16 2012-11-16
US61/796,639 2012-11-16
PCT/US2013/032318 WO2013187980A1 (en) 2012-06-13 2013-03-15 Nanoceria for the treatment of oxidative stress

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104812375A CN104812375A (zh) 2015-07-29
CN104812375B true CN104812375B (zh) 2017-08-22

Family

ID=48048227

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380030839.3A Expired - Fee Related CN104812375B (zh) 2012-06-13 2013-03-15 用于治疗氧化应激的纳米二氧化铈

Country Status (12)

Country Link
US (4) US9034392B2 (zh)
EP (1) EP2861212B1 (zh)
JP (1) JP6174692B2 (zh)
KR (1) KR101990070B1 (zh)
CN (1) CN104812375B (zh)
AU (1) AU2013274901B2 (zh)
CA (1) CA2875206C (zh)
DK (1) DK2861212T3 (zh)
ES (1) ES2617528T3 (zh)
IN (1) IN2014DN10550A (zh)
MX (1) MX2014015251A (zh)
WO (1) WO2013187980A1 (zh)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9446070B2 (en) * 2012-06-13 2016-09-20 Cerion, Llc Nanoceria with citric acid additive
DK2861212T3 (en) 2012-06-13 2017-03-06 Cerion Llc Cerium oxide nanoparticles for the treatment of oxidative stress
AU2014256983B2 (en) 2013-04-25 2018-10-04 Cerion Enterprises, Llc Chelated nanoceria for the treatment of oxidative stress
JP6502393B2 (ja) * 2014-06-10 2019-04-17 アメリカ合衆国 ニコチンと酸化セリウムとのナノ粒子複合体及びその使用
CA2955384C (en) * 2014-07-17 2024-03-12 Biocurity Holdings, Inc. Treatment of cancer with a combination of radiation, cerium oxide nanoparticles, and a chemotherapeutic agent
JP2018508568A (ja) * 2015-01-20 2018-03-29 セリオン，リミティド ライアビリティ カンパニー カタラーゼ様活性を有するｅｄｄｓでキレート化されたナノセリア
KR101765557B1 (ko) 2015-02-27 2017-08-23 서울대학교산학협력단 생흡수성 전자 스텐트
US11389536B2 (en) 2015-07-17 2022-07-19 BioCurity Pharmaceuticals Inc. Treatment of cancer with a combination of radiation, cerium oxide nanoparticles, and a chemotherapeutic agent
WO2017091700A1 (en) * 2015-11-25 2017-06-01 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Use of microrna-146a and nanoceria conjugate to improve wound healing and promote tissue regeneration
JP2021507903A (ja) 2017-12-19 2021-02-25 ナノビオティックスＮａｎｏｂｉｏｔｉｘ 脳の能力の向上又はストレスの処置に使用するためのナノ粒子
WO2019121748A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 Nanobiotix Nanoparticles for use for treating a neuronal disorder
MX2021003710A (es) * 2018-09-28 2021-08-19 Univ Colorado Regents Metodos para prevenir y tratar inflamacion y fibrosis pulmonar.
CN111333098B (zh) * 2018-11-30 2022-04-19 中国科学院大连化学物理研究所 二氧化铈纳米立方块的制备方法
CN109806278B (zh) * 2019-02-01 2021-08-10 浙江大学 磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米晶的应用
CN109939125B (zh) * 2019-04-22 2021-05-18 南昌大学第二附属医院 一种抗氧化剂及其制备方法与应用
KR102107760B1 (ko) * 2019-08-28 2020-05-07 한국콜마주식회사 피부 장벽 강화, 피부 보습 및/또는 미세 먼지 차단용 세륨옥사이드 분산액 및 이를 포함하는 화장료 조성물
JPWO2021241626A1 (zh) * 2020-05-27 2021-12-02
CN111773243B (zh) * 2020-07-17 2022-09-23 南京大学 炎症性肠病的药物及其制备方法和用途
CN112007016B (zh) * 2020-09-07 2021-07-23 南京大学 一种纳米缓释制剂及其制备方法和在制备治疗线粒体功能障碍疾病的药物中的应用
CN112494513A (zh) * 2020-12-15 2021-03-16 中国药科大学 一种二氧化铈纳米粒及其制备方法与应用
CN112516294B (zh) * 2020-12-22 2023-04-07 浙江大学 一种氧化铈纳米稳定剂在制备预防过敏性疾病药物中的应用及预防过敏性疾病的药物组合物
CN113546093A (zh) * 2021-07-20 2021-10-26 中国人民解放军陆军军医大学 氧化铈纳米颗粒在制备治疗和预防肾缺血再灌注损伤的药物中的应用
CN113842469B (zh) * 2021-08-25 2024-04-02 中国科学院过程工程研究所 一种囊泡表面原位结晶高催化活性铈纳米晶的递药系统及其制备方法和应用
CN114470326B (zh) * 2021-12-06 2022-09-13 中国人民解放军空军军医大学 一种仿生矿化胶原-糖胺聚糖材料制备方法及其应用
CN116270729A (zh) * 2022-11-09 2023-06-23 西安交通大学医学院第一附属医院 多孔纳米棒状氧化铈在制备治疗特应性皮炎的药物中的应用
CN115737678A (zh) * 2022-11-30 2023-03-07 浙江大学金华研究院 载三苯基膦修饰的氧化铈和全反式维甲酸的脂质体凝胶
CN116180065A (zh) * 2022-12-27 2023-05-30 国科大杭州高等研究院 一种表面改性的镍钛合金材料及其制备方法和应用
CN116850147B (zh) * 2023-06-05 2024-05-14 中南大学 Ppc纳米颗粒、其制备方法以及在治疗心肌梗死的药物中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007002662A2 (en) * 2005-06-27 2007-01-04 Edward Via Virginia College Of Osteopathic Medicine Anti-inflammatory, radioprotective, and longevity enhancing capabilities of cerium oxide nanoparticles
WO2008030805A1 (en) * 2006-09-05 2008-03-13 Cerion Technology, Inc. Cerium dioxide nanoparticle-containing fuel additive
CN101683999A (zh) * 2008-09-26 2010-03-31 杜小青 纳米二氧化铈制备方法

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2809637B1 (fr) 2000-06-05 2003-01-24 Rhodia Terres Rares Dispersion colloidale d'un compose de cerium ou d'un compose de cerium et d'au moins un autre element choisi parmi les terres rares et des metaux de transition et comprenant un acide amine
JP3768401B2 (ja) 2000-11-24 2006-04-19 Ｎｅｃエレクトロニクス株式会社 化学的機械的研磨用スラリー
JP3586711B2 (ja) 2000-12-27 2004-11-10 独立行政法人物質・材料研究機構 ナノセリア粉末の製造方法
JP3793802B2 (ja) 2001-07-09 2006-07-05 独立行政法人物質・材料研究機構 個々の粒子がナノサイズに分離したセリア粉末の製造法
US7563457B2 (en) 2001-10-02 2009-07-21 The Regents Of The University Of California Nanoparticle assembled hollow spheres
US7534453B1 (en) * 2002-09-05 2009-05-19 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Cerium oxide nanoparticles and use in enhancing cell survivability
KR100486959B1 (ko) * 2003-01-29 2005-05-03 한국화학연구원 나노 크기의 세리아 제조방법
WO2006004787A1 (en) 2004-06-28 2006-01-12 Procyte Corporation Methods and compositions for preventing and treating hyperpigmentation of skin
WO2008002323A2 (en) 2005-12-23 2008-01-03 Eastman Kodak Company Production of cerium containing metal oxide grains
US20100221334A1 (en) 2007-07-19 2010-09-02 Fink Mitchell P Compositions including leukotriene antagonists and nsaids and methods of using the same
DE102007062571A1 (de) 2007-12-22 2009-06-25 Evonik Degussa Gmbh Ceroxid und Schichtsilikat enthaltende Dispersion
US8679344B2 (en) 2008-12-17 2014-03-25 Cerion Technology, Inc. Process for solvent shifting a nanoparticle dispersion
KR101605465B1 (ko) * 2008-12-17 2016-03-22 세리온, 엘엘씨 격자 엔지니어링된 이산화세륨 나노입자를 포함하는 연료 첨가제
DK2861212T3 (en) 2012-06-13 2017-03-06 Cerion Llc Cerium oxide nanoparticles for the treatment of oxidative stress

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007002662A2 (en) * 2005-06-27 2007-01-04 Edward Via Virginia College Of Osteopathic Medicine Anti-inflammatory, radioprotective, and longevity enhancing capabilities of cerium oxide nanoparticles
WO2008030805A1 (en) * 2006-09-05 2008-03-13 Cerion Technology, Inc. Cerium dioxide nanoparticle-containing fuel additive
CN101683999A (zh) * 2008-09-26 2010-03-31 杜小青 纳米二氧化铈制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
纳米二氧化铈的研究现状;王小康,等;《国外金属热处理》;20031231;第24卷(第6期);第11-12页和第29页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2875206C (en) 2020-07-14
AU2013274901B2 (en) 2017-09-14
ES2617528T3 (es) 2017-06-19
US9034392B2 (en) 2015-05-19
CA2875206A1 (en) 2013-12-19
MX2014015251A (es) 2015-04-13
US20170100430A1 (en) 2017-04-13
EP2861212B1 (en) 2016-12-07
IN2014DN10550A (zh) 2015-08-21
JP2015525228A (ja) 2015-09-03
US20180250333A1 (en) 2018-09-06
EP2861212A1 (en) 2015-04-22
DK2861212T3 (en) 2017-03-06
KR101990070B1 (ko) 2019-06-17
US20130337083A1 (en) 2013-12-19
AU2013274901A1 (en) 2014-12-18
US9962406B2 (en) 2018-05-08
US9533007B2 (en) 2017-01-03
WO2013187980A1 (en) 2013-12-19
JP6174692B2 (ja) 2017-08-02
KR20150028293A (ko) 2015-03-13
US20150231174A1 (en) 2015-08-20
US10729717B2 (en) 2020-08-04
CN104812375A (zh) 2015-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104812375B (zh) 用于治疗氧化应激的纳米二氧化铈
CN105408257B (zh) 用于治疗氧化应激的螯合纳米铈氧化物
KR102081666B1 (ko) 암 치료용 약학 조성물
CN105641696B (zh) 一种金钆复合纳米材料、制备方法及其用途
CN107427586A (zh) 具有过氧化氢酶样活性的edds螯合纳米铈氧化物
Yang et al. Hollow CeO2 with ROS-scavenging activity to alleviate colitis in mice
Shirokikh et al. Bioavailability of nanoenulsions modified with curcumin and cerium dioxide nanoparticles
US9446070B2 (en) Nanoceria with citric acid additive
CN112386708B (zh) 一种人血清白蛋白修饰四氧化三锰量子点的制备及其在治疗缺血性卒中的应用
US10143661B2 (en) Malic acid stabilized nanoceria particles
Busmann et al. Ovarian Accumulation of Nanoemulsions: Impact of Mice Age and Particle Size
CN115531344B (zh) 多功能钙锰纳米调制器通过重塑肿瘤微环境抗肿瘤及增强免疫治疗
CN115501183A (zh) 一种可供口服的紫杉醇-聚合物胶束及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20170822

Termination date: 20210315

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee