KR101990070B1 - 산화 스트레스 치료용 나노세리아 - Google Patents

산화 스트레스 치료용 나노세리아 Download PDF

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Abstract

생체적합성 물질의 나노입자를 제조하는 방법이 기술되어 있으며, 여기에서 제1세륨 이온, 소정 비율의 시트르산 및 에틸렌디아민테트라아세트산, 산화제 및 물을 포함하는 수성 반응 혼합물이 분리 없이 안정한 세륨 옥사이드 나노입자의 안정한 분산액을 직접적으로 형성시키는 온도 조건과 함께 제공된다. 이러한 생체적합한 세륨 옥사이드 나노입자는 발작, 재발/완화형 다발성 경화증, 만성-진행형 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증 또는 허혈성 재관류 손상과 같은 산화 스트레스 관련 질환의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.

Description

산화 스트레스 치료용 나노세리아 {NANOCERIA FOR THE TREATMENT OF OXIDATIVE STRESS}
관련 출원에 대한 교차-참조
본 특허 출원은 2012년 6월 13일 출원된 가출원 일련 번호 61/689,806 (NANOCERIA FOR THE TREATMENT OF MULTIPLE SCLEROSIS), 2012년 6월 18일 출원된 가출원 일련 번호 61/690,100 (NANOCERIA FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF MULTIPLE SCLEROSIS), 2012년 10월 12일 출원된 가출원 일련 번호 61/795,241 (BIOLOGICAL EFFECTS OF NANOCERIA IN A MODEL OF MULTIPLE SCLEROSIS), 및 2012년 11월 16일 출원된 가출원 일련 번호 61/796,639 (NANOCERIA FOR THE REDUCTION OF OXIDATIVE STRESS)에 대한 우선권을 주장하며, 이의 기재내용은 그 전체가 본원에 참조로서 통합된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 나노의약 분야에서의 개선에 관한 것이다. 특히,본 발명은 생체적합성 물질로 제조된 세륨-함유 나노입자, 이러한 나노입자의 제조 방법, 및 염증 및 산화 스트레스 관련 사건 및 질환을 예방 및 치료하는데 있어서 이러한 나노입자의 용도에 관한 것이다.
자유 라디칼 산화 스트레스는 많은 인간 질환의 발병기전 및 특히, 신경퇴행성 질환에서 주요 역할을 수행한다. 따라서, 특정 자유 라디칼 종을 감소시킬 수 있는 항산화제로의 치료는 조직 손상을 이론적으로 예방할 수 있으며, 생존 및 신경학적 예후 둘 모두를 향상시킬 수 있다. 생리학적 환경에서 자유 라디칼은 종종 반응성 산소 종 (ROS) 또는 반응성 질소 종 (RNS)으로서 분류될 수 있다. 자유 라디칼은 고도로 반응성인 화학 종이며, 준세포 수준에서 단백질, 지질 및 핵산과 용이하게 반응하여 다양한 질환의 진행에 기여한다.
나노의약에서 나노세리아 사용 기원은 베일리 (Bailey) 및 르지갈린스키 (Rzigalinski)의 중요 작업까지 거슬러 올라갈 수 있으며, 여기에서 배양물중 뇌 세포로의 초미세 세륨 옥사이드 입자의 적용은 르지갈린스키에 의해 문헌 [Nanoparticles and Cell Longevity, Technology in Cancer Research & Treatment 4(6), 651-659 (2005)]에 기술된 바와 같이 세포 생존성을 크게 향상시키는 것으로 관찰되었다. 더욱 특히, 시험관내에서 래트 (rat) 뇌 세포 배양물은 르지갈린스키 등의 2003년 9월 4일 출원된 미국 특히 7,534,453에 보고된 바와 같이, 역 미셀 마이크로 에멀젼 기법에 의해 합성된 2-10 나노미터 (nm) 크기의 세륨 옥사이드 나노입자로 처리되는 경우 약 3-4배 더 길게 생존하는 것으로 관찰되었다. 과산화수소 또는 자외선 노출에 의해 생성된 치사량의 자유 라디칼에 노출된, 배양된 뇌 세포는 세륨 옥사이드 나노입자에 의해 상당한 보호가 제공되었다. 또한, 세륨 옥사이드 나노입자는 쥣과 동물 몸체에서 비교적 불활성으로서 저독성인 것으로 보고되었다 (예를 들어, 꼬리 정맥 주입은 독성 효과를 유도하지 않음). 생체내에서 의학적 이점이 보고되지 않았으나, 이러한 세리아 나노입자로의 처리는 상처, 이식, 관절염, 관절 질환, 혈관 질환, 조직 노화, 발작 및 외상 뇌 상해와 관련하여 감소된 염증을 포함하는 이점을 가질 것으로 가정되었다.
그러나, 이러한 특정 나노세리아 입자를 갖는 숙주의 문제점이 후에 WO 2007/002662에서 르지갈린스키 등에 의해 보고되었다. 이러한 역 미셀 마이크로 에멀젼 기법에 의해 생성된 나노세리아는 하기의 여러 문제점을 갖고 있다: (1) 입자 크기는 보고된 2-10 나노미터 (nm) 범위내로 잘 제어되지 않았으며, 이로 인해 배치간의 가변성이 높음; (2) 최종 산물로의 공정에 사용된 도쿠세이트 소듐 또는 (AOT)로서 또한 공지된 소듐 비스(에틸헥실)설포석시네이트와 같은 계면활성제의 테일링 (캐리오버 오염 (carryover contamination))이 독성 반응을 초래함; (3) 이러한 나노입자가 생물학적 매질중에 위치할 경우 계면활성제 테일링 양의 제어 불능은 응집 관련 문제점을 제기하였으며, 이는 감소된 효능 및 전달가능성을 초래함; 및 (4) 시간 경과에 따른 세륨의 원자가 상태 (+3/+4)의 불안정성. 이와 같이, 역 미셀 마이크로 에멀젼 기법에 의해 생성된 세륨 옥사이드 나노입자는 배치 대 배치로 매우 가변성이었으며, 포유동물 세포에 대해 바라던 독성보다 더 높은 독성을 나타내었다.
대안적으로, WO 2007/002662에서 르지갈린스키 등은 적어도 3개의 시중 공급원으로부터 획득한 고온 기법에 의해 합성된 나노세리아의 생물학적 효능을 보고하였다. 이러한 세륨 옥사이드 나노입자의 새로운 공급원은 배치 대 배치의 활성의 탁월한 재현성을 제공하는 것으로 보고되었다. 공급원에 상관없이, 작은 입자, 좁은 크기 분포 및 낮은 응집률을 갖는 세륨 옥사이드 입자가 가장 유리한 것으로 추가로 보고되었다. 크기에 있어서, 이러한 기재내용은 특히 입자가 세포 내부로 취해지는 구체예에서, 세포 내로 취해지는 바람직한 입자 크기 범위는 약 11 nm 내지 약 50 nm, 예컨대, 약 20 nm임을 특별히 주장하였다. 입자가 세포 외부로부터 세포에 대해 이들의 영향을 발휘하는 구체예에서, 이러한 세포외 입자의 바람직한 크기 범위는 약 11 nm 내지 약 500 nm이다.
르지갈린스키 등은 또한, 전달에 있어서, 비응집된 형태의 나노입자가 유리한 것으로 보고하였다. 이를 달성하기 위해, 이들은 약 10 중량%의 스톡액이 초-고순도 물 또는 초고순도 물로 제조된 보통 염수중에서 음파처리될 수 있음을 보고하였다. 그러나, 다른 사람들이 주지한 바와 같이, 고온 기법에 의해 합성된 (예를 들어, 시중 공급원으로부터 획득한) 나노세리아의 음파 처리된 수성 분산액은 고도로 불안정하며, 신속하게 (즉, 수분 내에) 침전되어 이들 공급원으로부터 유래된 나노세리아의 수성 분삭액의 투여에서 상당한 가변성을 초래한다.
르지갈린스키 등은 시험관내 세포 배양물 즉, 경구 섭식한 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) 초파리 및 명백히 치료 용량 미만 (300 나노몰 또는 약 0.2 mg/kg)으로 꼬리 정맥 주입된 마우스를 포함하는 비교적 단순 모델 시스템에서 생물학적 효능을 보고하였다.
요켈 (Yokel) 등은 문헌 [Nanotoxicology, 2009, 3(3): 234-248]에서 시중의 세리아 나노물질의 생물학적분배 및 산화 스트레스 효과에 대한 광대한 연구를 기술한다. 특히, 알드리치 (#639648)로부터 수득된 5% 나노세리아 분산액을 3분 동안 음파처리하고, 50, 250 및 750 mg/kg 나노세리아 용량으로 래트에 주입하였다. 이러한 물질에 대한 임의의 나노입자 표면 안정화제(들)의 특성은 알려지지 않았다. 나노세리아 입자의 크기는 다양한 기법에 의해 특성 결정되며, 동적 광 산란에 의해 평균 31 +/- 4 nm인 것으로 보고되었다. 투과전자현미경 (TEM)은 입자 대부분이 8 nm 및 24 nm에서 피크를 갖는 이봉 크기 분포를 갖는 판형이며, 일부 입자는 ~ 100 nm임을 나타냈다. 이러한 형태의 나노세리아와 1시간 동안 인큐베이션한 혈액은 ~200 nm 내지 1 마이크론 초과 범위의 응집물을 가지며, 래트에 주입한 경우, 혈액으로부터 신속하게 없어짐이 관찰되었다 (7.5분의 반감기). 대부분의 나노세리아는 간 및 비장에서 축적되는 것으로 관찰되었으나, 임의의 상당량이 혈액 뇌 장벽을 침투하여 뇌조직 세포로 유입되었는지는 확실하지 않았다.
그 후, 요켈 등은 생체적합성 안정화제로서 소듐 시트레이트를 포함한, 문헌 [Masui et al., J. Mater. Sci. Lett. 21, 489-491 (2002)]의 직접 2-단계 열수 제법에 의해 제조된 안정한 나노세리아 수성 분산액 및 나노세리아 표면 코팅 (안정화제)에 대한 정밀한 제어를 추구하였다. 고해상도 TEM은 이러한 형태의 나노세리아가 뾰족한 가장자리를 갖는 결정질 다면체 입자 형태 및 4-6 nm의 좁은 크기 분포를 가짐을 나타내었다. 이러한 5 nm 평균 크기의 세리아 나노입자의 시트레이트 안정화된 분산액은 7.35의 생리학적 pH 및 -53 mV의 제타 포텐셜에서 2 개월 넘도록 안정적인 것으로 보고되었다. 투여전 음파처리는 요구되지 않았다.
이러한 형태의 시트레이트 안정화된 나노세리아의 광대한 생물학적 분배 및 독성 연구의 결과는 문헌 [Hardas et al., Toxicological Sciences 116(2), 562-576 (2010)]에 보고되었다. 놀랍게도, 이들은 종래 연구된 ~30 nm 나노세리아 (상기 기술된 알드리치 (#639648))와 비교한 경우, 이러한 더 작은 나노세리아는 더욱 독성이며, 뇌에서 관찰되지 않았으며, 해마 및 소뇌에서 산화 스트레스에 대한 작은 효과를 유도하였음을 보고하였다. 이러한 결과는 더 작게 조작된 나노물질이 혈액 뇌 장벽을 용이하게 침투할 것이라는 가설과 반대되었다.
나노입자를 함유하는 세륨 옥사이드는 본 기술분야에 공지된 다양한 기법에 의해 제조될 수 있으나, 입자에는 전형적으로 바람직하지 않은 응집을 방지하기 위해 안정화제가 요구된다. 종래 사용된 생체적합성 나노세리아 안정화제에 있어서, 문헌 [Masui et al., J. Mater. Sci. Lett. 21, 489-491 (2002)]에는 안정화제로서 시트레이트 완충제를 사용하는 세리아 나노입자의 안정한 수성 분산액을 직접 생성하는 2-단계 열수 공정이 기술되어 있다. 그러나, 이러한 공정은 시간 소모적이며 또한 실비 집약적으로서, 밀폐된 중-반응기 (heavy closed-reactor)에서 2번의 별도의 24시간 반응 단계가 요구된다.
샌드포드 (Sandford) 등의 WO 2008/002323 A2는 침전 또는 분리 단계 없이 및 후속의 하소 없이 세륨 디옥사이드의 나노입자 분산액을 직접적으로 생성하는 생체적합성 안정화제 (아세트산)를 사용하는 수성 제조 기법을 보고한다. 아세트산이 안정화제로서 사용되는 경우, 제1세륨 이온은 니트레이트 이온에 의해 세륨으로 서서히 산화되며, 11 nm 결정질 크기 (및 대략적으로 동일한 그레인 크기)의 안정한 비응집된 졸이 수득된다.
디프란세스코 (DiFrancesco) 등은 2007년 9월 4일 출원된 PCT/US2007/077545 (METHOD OF PREPARING CERIUM DIOXIDE NANOPARTICLES)에서 생체적합성 안정화제 예컨대, 시트르산, 락트산, 타르타르산, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 및 이들의 조합물의 존재하에 낮은 pH (< 4.5)에서 과산화수소에 의해 제1세륨 이온의 산화를 기술하고 있다. 특히, 안정화제 락트산 및 락트산과 EDTA의 조합물은 중간체 입자 분리 단계 없이 나노세리아 (3-8 nm 범위의 평균 입자 크기)의 안정한 분산액을 직접 생성하는 것으로 나타났다.
카라코티 (Karakoti) 등은 문헌 [J. Phys. Chem. C 111, 17232-17240 (2007)]에서 산성 조건 (과산화수소에 의해) 및 염기성 조건 (수산화암모늄에 의해) 둘 모두에서 제1세륨 이온의 산화에 의한 모노/폴리사카라이드에서 나노세리아의 직접 합성에 대해 보고하였다. 기술된 구체적인 생체적합성 안정화제는 글루코스 및 덱스트란을 포함한다. 3-5 nm 만큼 작은 개별 입자 크기가 기재되어 있으나, 10-30 nm의 약한 응집물도 생성된다. 콜로이드 불안정성의 근원은 기술되어 있지 않으나, 이들 입자들의 제타 포텐셜의 규모가 충분히 크지 않을 수 있는 것으로 여겨진다.
카라코티 등은 JOM (Journal of the Minerals, Metals & Materials Society) 60(3), 33-37 (2008))에서 자유 라디칼 (반응성 산소 종 (ROS) 및 반응성 질소 종)의 제거를 가능하게 하는 나노세리아의 환원/산화 (레독스) 능력을 간섭하지 않도록 콜로이드 화학 (제타 포텐셜, 입자 크기, 분산제, 용액의 pH 등)의 이해가 요구되는 바와 같이, 유기체 생리와 양립가능하도록 생물학적 관련 매질에서 나노세리아의 안정한 분산액을 합성하는 도전에 대해 언급하였다. 카라코티 등은 임의의 안정화제의 부재하에 및 덱스트란, 에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 안정화제의 존재하에 낮은 pH (< 3.5)에서 과산화수소에 의해 세륨 니트레이트의 산화를 구체적으로 기술한다. 10-20 nm로의 입자 응집이 또한 보고되었으나, 3-5 nm의 입자 크기가 보고되었다.
킴 (Kim) 등은 문헌 [Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 1-6]에서 역 미셀 방법에 의해 합성되고 인지질-폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로 캡슐화된 3 nm 나노세리아가 뇌경색 부피를 감소시키고 ROS를 제거함으로써 래트에서 허혈성 발작에 대해 보호할 수 있음을 보고하였다. 그러나, 더 많은 용량은 보호성이지 않으며, 이는 역 미셀 합성법에 피해를 주는 상기 언급된 바와 같이 계면활성제 테일링 문제와 관련될 수 있는 것으로 여겨진다.
자유 라디칼 산화 스트레스로부터의 손상을 조정하고 완화시키기 위한 유효하고 효과적인 방법 및 제제가 여전히 요구된다. 또한, 크기가 충분히 작으며, 건강하거나 건강하지 않은 혈액 뇌 장벽을 침투할 수 있으며, 크기 빈도 분포가 더욱 균일하고, 광범위한 생물학적 매질에서 안정하고 비독성이며, 생체내에서 증가된 세포 흡수 및 혈관 순환 시간을 갖는 세륨-함유 나노입자의 생체적합성 분산액을 예를 들어, 고수율로 더 짧은 기간에서 더 높은 현탁 밀도로 직접 제조 (즉, 입자 분리 단계 없이)하는 방법에 있어서 추가의 개선이 여전히 요구된다. 또한, 이는 포유동물 및 특히 인간에서 염증 및 산화 스트레스 관련 사건 예컨대, 허혈성 발작 및 재관류 손상 및 산화 스트레스 관련 사건 특히, 중추신경계 질환 예컨대, 다발성 경화증 및 근위축성 측삭 경화증의 예방 및/또는 치료를 위한 의약을 생산하는데 매우 유용할 것이다.
발명의 요약
본 발명의 일 양태에 따르면, 제1세륨 이온, 약 3.0 내지 약 0.1 (즉, 약 3:1 내지 약 1:9) 범위의 몰비 (CA/EDTA)의 시트르산 (CA)과 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 산화제, 및 물을 포함하는 반응 혼합물을 형성시키고; 반응 혼합물을 선택적으로 가열 또는 냉각시키고 세륨-함유 나노입자의 분산액을 분리 없이 직접 형성시키는 것을 포함하는 나노입자 분산액 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 2 양태에서, 산화 스트레스 관련 질환의 발병 전에 약 3.0 내지 약 0.1 범위의 몰비의 시트르산과 에틸렌디아민테트라아세트산의 혼합물의 존재하에 제조된 유효량의 세륨-함유 나노입자를 투여하는 것을 포함하여 산화 스트레스 관련 질환 및 특히, 중추 신경계 질환 예컨대, 다발성 경화증 또는 근위축성 측삭 경화증을 예방 (즉, 예방학적 치료)하는 방법이 제공된다.
본 발명의 제 3 양태에서, 약 3.0 내지 약 0.1 범위의 몰비의 시트르산과 에틸렌디아민테트라아세트산의 혼합물의 존재하에 제조된 유효량의 세륨-함유 나노입자를 질환 또는 사건 발생 후에 투여하는 것을 포함하여 산화 스트레스 관련 사건 또는 질환 및 특히, 중추 신경계 질환 예컨대, 다발성 경화증 또는 근위축성 측삭 경화증을 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 제 4 양태에서, 세륨 옥사이드, 시트르산 및 에틸렌디아민테트라아세트산을 포함하는 나노입자가 제공되며, 여기에서 제조 동안 첨가된 시트르산과 에틸렌디아민테트라아세트산의 몰비는 약 3.0 내지 약 0.1의 범위이다.
본 발명의 제 5 양태에서, 세륨 옥사이드, 시트르산 및 에틸렌디아민테트라아세트산을 포함하는 나노입자가 제공되며, 여기서 시트르산과 에틸렌디아민테트라아세트산의 몰비는 약 3.0 내지 약 0.1의 범위이다.
본 발명의 제 6 양태에서, 제조 동안 첨가되는 시트르산과 에틸렌디아민테트라아세트산의 몰비가 약 3.0 내지 약 0.1의 범위인 세륨 옥사이드 나노입자를 포함하는, 산화 스트레스 관련 사건 또는 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약제 조성물이 제공된다.
본 발명의 제 7 양태에서, 포유동물 혈액 뇌 장벽을 침투할 수 있는 세륨 옥사이드 나노입자를 포함하는, 산화 스트레스 관련 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약제 조성물이 제공된다.
도 1은 CeO2 (Cerianite)의 선 스펙트럼과 함께 CA/EDTA 세리아 나노입자의 분말 X-선 회절 (XRD) 스펙트럼을 함유한다.
도 2는 건조된 CA/EDTA 세리아 나노입자의 TEM 현미경 사진이다.
도 3은 건조된 CA/EDTA 세리아 나노입자의 고해상도 TEM 현미경 사진이다.
도 4는 CA/EDTA 세리아 나노입자의 크기 등급 분포 차트이다.
도 5는 예방 및 치료 처치 요법으로 투여된 CeNP 및 비히클 대조군에 있어서 만성-진행형 MS 모델에 대한 시간에 따른 평균 임상 스코어 (Mean Clinical Score)의 플롯이다. 약물 (CeNP) 처리 투여량은 10 mg/kg이었다.
도 6은 예방 및 치료 처치 요법에서 비히클 대조군에 대한 만성-진행형 MS 모델에서 시간에 따른 평균 임상 스코어의 플롯이다. 약물 (CeNP) 처리 투여량은 20 mg/kg이었다.
도 7은 예방 (prev) 및 치료 (ther) 처치 요법에 의해 투여된 CeNP 및 비히클 대조군 (cont)에 있어서 만성-진행형 MS 모델에 대한 질환 경과에 따른 임상 스코어 (AUC) 차트이다. 약물 (CeNP) 처리 투여량은 20 mg/kg이었다.
도 8은 예방 처치 요법에 있어서 CeNP 용량에 따른 만성-진행형 MS 모델의 임상 중증도 (AUC)의 차트이다.
도 9는 치료 (3일 지연) 처치 요법에 있어서 CeNP 용량에 따른 만성-진행형 MS 모델의 임상 중증도 (AUC)의 차트이다.
도 10은 만성-진행형 MS 모델로 주입된 전체 세리아 (CeNP)에 따른 질환 중증도의 감소 플롯이다.
도 11은 만성-진행형 MS 모델로 주입된 전체 세리아 (CeNP)에 따른 뇌 세륨 함량의 플롯이다.
도 12는 예방 및 치료 처치 요법으로 투여된 대조군 및 CeNP에 있어서, 및 매일 핑골리모드 처리에 있어서, 만성-진행형 MS 모델에 대한 시간에 따른 평균 임상 스코어의 플롯이다. 약물 (CeNP) 처리 투여량은 30 mg/kg이었다.
도 13은 예방 및 치료 (7일 지연) 처치 요법으로 투여된 대조군, 핑골리모드 및 CeNP에 있어서 만성-진행형 MS 모델의 급성기 (0-30 일)동안 질환 중증도 감소 차트이다.
도 14는 예방 및 치료 (7일 지연) 처치 요법으로 투여된 대조군, 핑골리모드 및 CeNP에 있어서 만성-진행형 MS 모델의 만성기 (31-35 일)동안 질환 중증도 감소 차트이다.
도 15는 예방 (prev) 및 치료 (7일 지연) (ther) 요법에 의해 투여된 대조군 및 CeNP에 있어서, 및 핑골리모드 (fing) 매일 처치 요법에 있어서, 만성-진행형 MS 모델에 대한 전체 질환 경과를 통한 질환 중증도 (AUC) 평가 차트이다.
도 16은 예방 및 치료 처치 요법에 의해 투여된 대조군 및 CeNP에 있어서 만성-진행형 MS 모델에 대한 시간에 따른 로타로드 검사 (Rotarod Test) 수행의 플롯이다. 약물 (CeNP) 처리 투여량은 20 mg/kg이었다.
도 17은 예방 처치 요법에 의해 투여된 CeNP 용량에 따른 만성-진행형 MS 모델에 대한 로타로드 검사 수행의 차트이다.
도 18은 치료 (3일 지연) 처치 요법에 의해 투여된 CeNP 용량에 따른 만성-진행형 MS 모델에 대한 로타로드 검사 수행의 차트이다.
도 19는 예방 및 치료 처치 요법에 의해 투여된 대조군 및 CeNP에 있어서 만성-진행형 MS 모델에 대한 시간에 따른 행잉 와이어 검사 (Hanging Wire Test) 수행의 플롯이다. 약물 (CeNP) 처리 투여량은 20 mg/kg이었다.
도 20은 예방 및 치료 (지연) 처치 요법에 의해 투여된 CeNP 용량에 따른 만성-진행형 MS 모델의 행잉 와이어 수행의 차트이다.
도 21은 예방 및 치료 처치 요법에 의해 투여된 대조군 및 CeNP에 있어서 만성-진행형 MS 모델에 대한 시간에 따른 평균대 검사 (Balance Beam Test) 수행의 플롯이다. 약물 (CeNP) 처리 투여량은 20 mg/kg이었다.
도 22는 예방 및 치료 (지연) 처치 요법에 의해 투여된 CeNP 용량에 따른 만성-진행형 MS 모델에 대한 평균대 검사 수행의 차트이다.
도 23은 만성-진행형 MS 유도되고 예방 (prev) 및 치료 (ther) 처치 요법으로 비히클 대조군 (cont) 또는 20 mg/kg CeNP 투여된 C57BL/6 마우스로부터 취해진 뇌 및 척수 (sc) 및 분리된 소뇌 조직에서 축적된 전체 세리아의 차트이다.
도 24는 만성-진행형 MS 유도되고, 예방 및 치료 처치 요법으로 20 mg/kg CeNP 투여되고, 질환 유도 후 42일째에 희생된 C57BL/6 마우스로부터 취해진 다양한 조직에서 세리아 축적에 대한 ICP-MS 결과 차트이다.
도 25는 예방 (30 mg/kg 용량) 처치 요법에 의해 투여된 비히클 대조군, 핑골리모드 및 세리아 (CeNP)로 처리된 C57BL/6 마우스에 있어서 만성-진행형 MS의 만성기 (42 일) 동안 뇌 (소뇌 절편)에서 반응성 산소 종 수준 (빛 세기)의 차트이다.
도 26은 예방 (30 mg/kg 용량) 처치 요법에 의해 투여된 핑골리모드 및 CeNP에 대한 대조군의 백분율로서 표현한 만성-진행형 MS 모델의 만성기 (42 일) 동안의 뇌 (소뇌 절편)에서 반응성 산소 종 수준 (빛 세기)의 차트이다.
도 27은 세리아 (CeNP) 처리된 (예방 처치 요법) 및 비처리된 대조군 마우스로부터 42일에 취해진, 자유 라디칼 표시제 염료 CM-DCFDA로 처리된 소뇌 절편의 형광 현미경 이미지(슈도-칼라 이미지로서, 더 높은 형광 세기는 더 따뜻한 (예를 들어, 적색/주황색, 더 밝은 영역) 색으로서 나타나며, 더 낮은 세기는 더 차가운 (예를 들어, 청색/보라색, 더 어두운 영역) 색으로서 나타냄)를 함유한다.
도 28은 면역조직화학 염색으로 처리된 마우스 소뇌 절편의 현미경 이미지를 함유한다.
도 29는 예방 및 치료 처치 요법으로 투여된 비히클 대조군 및 CeNP에 있어서 재발/완화형 MS 모델에서 시간에 따른 평균 임상 스코어의 플롯이다.
도 30은 예방 및 치료 처치 요법에 의해 투여된 대조군 및 CeNP에 있어서 재발/완화형 MS 모델에서 시간에 따른 평균대 검사 수행의 플롯이다.
도 31은 예방 및 치료 처치 요법에 의해 투여된 대조군 및 CeNP에 있어서 재발/완화형 MS 모델에서 시간에 따른 행잉 와이어 검사 수행의 플롯이다.
도 32는 예방 및 치료 처치 요법에 의해 투여된 대조군 및 CeNP에 있어서 재발/완화형 MS 모델에서 시간에 따른 로타로드 검사 수행의 플롯이다.
도 33은 치료 처치 요법에 의해 투여된 대조군, 시그마-알드리치, 알파 에이사 (Alfa Aesar) (1:14 및 1:9 희석) 및 CA/EDTA 세리아 나노입자 (CNRx 87)에 있어서 재발/완화형 MS 모델에서 질환 경과에 따른 임상 스코어 (AUC)의 차트이다.
도 34는 치료 처치 요법에 의해 투여된 대조군, 시그마-알드리치, 알파 에이사 (1:14 및 1:9 희석) 및 CA/EDTA 세리아 나노입자 (CNRx 87)에 있어서 재발/완화형 MS 모델에서 질환 경과에 따른 평균 평균대 스코어의 차트이다.
도 35는 치료 처치 요법에 의해 투여된 대조군, 시그마-알드리치, 알파 에이사 (1:14 및 1:9 희석) 및 CA/EDTA 세리아 나노입자 (CNRx 87)에 있어서 재발/완화형 MS 모델에서 질환 경과에 따른 평균 행잉 와이어 검사 수행의 차트이다.
도 36은 치료 처치 요법에 의해 투여된 대조군, 시그마-알드리치, 알파 에이사 (1:14 및 1:9 희석) 및 CA/EDTA 세리아 나노입자 (CNRx 87)에 있어서 재발/완화형 MS 모델에서 질환 경과에 따른 평균 로타로드 검사 수행의 차트이다.
도 37은 다양한 시중에서 입수가능한 나노세리아 대비 CA/EDTA 세리아 나노입자 (CNRx로 표시)로 치료 처치 요법에 의해 투여된 재발/완화형 MS 모델에 대한 뇌 침착 결과의 차트이다 (24 mg/kg 전체 용량).
도 38은 재발/완화형 MS 모델에서 CA/EDTA 세리아 나노입자의 최종 주입 후 시간에 따른 뇌 세리아 함량의 차트이다 (24 mg/kg 전체 용량).
도 39는 CeNP의 래트로의 10 mg/kg 정맥내 (IV) 주입 및 50 mg/kg 피하 주입에 있어서 24 시간의 기간에 걸쳐 혈장내 세리아 농도 플롯이다.
도 40은 비히클 대조군 및 CeNP (CNRx 87)로 처리된 G93A 모델 ALS 마우스에 있어서 생존 간격 (일)의 차트이다.
도 41은 -4, -2 및 0일째에 20 mg/kg 투여된 CeNP (CNRx 87) 및 비히클 대조군으로 처리된 마우스에 있어서 랑겐도르프 행잉 하트 (Langendorff hanging heart) 절차를 통한 심근 허혈/재관류 후 LDH 축적의 차트이다.
구체적으로 명시되거나 기술되지 않은 요소는 당업자에게 널리 공지된 다양한 형태를 취할 수 있음이 이해되어야 한다. 본 발명은 청구범위에 의해 규정된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 나노입자는 100 nm 미만의 평균 직경을 갖는 입자를 포함한다. 본 기재 내용의 목적에 있어서, 다르게 언급되지 않는 한, 나노입자의 직경은 이의 유체역학적 직경을 지칭하며, 이는 동적 광 산란 기법에 의해 측정된 직경이며, 분자 흡착물 및 수반되는 입자의 용매화 껍질을 포함한다. 대안적으로, 기하학적 입자 직경은 투과성 전자 현미경 사진 (TEM)의 분석에 의해 추정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 다양한 세륨-함유 물질은 "세리아", "세륨 옥사이드" 또는 "세륨 디옥사이드"로서 상호교환적으로 기술되어 있다. 이러한 물질중에 존재하는 실제 옥사이드 음이온이 옥사이드 음이온 또는 하이드록시드 음이온 또는 이들의 혼합물 예컨대, 수화된 옥사이드 상 (예를 들어, 옥시하이드록시드)을 포함할 수 있음이 화학 분야의 당업자에게 이해될 것이다. 또한, 물질의 조성물은 다가 양이온의 고형 용액으로 구성될 수 있으며, 비-화학량론적 고형물로 불림이 공지되어 있다. 따라서, 다중 산화 상태의 금속 양이온으로 구성된 옥사이드 상에 있어서, 옥사이드 음이온의 전체 양은 전하적 중심이 유지되도록 존재하는 다양한 산화 상태의 금속 양이온 (예를 들어, Ce3 + 및 Ce4 +)의 특정 양에 의해 결정될 것임이 이해된다. 명목상 금속 디옥사이드로서 기술된 비-화학량론적 상에 있어서, 이는 화학식 MO2 -δ로 구체화되며, 여기서 δ (델타)의 값은 변화될 수 있다. 세륨 옥사이드 CeO2 -δ에 있어서, δ (델타)의 값은 전형적으로 약 0.0 내지 약 0.5의 범위이며, 전자는 세륨 (IV) 옥사이드 CeO2를 의미하며, 후자는 세륨 (III) 옥사이드 CeO1 .5 (대안적으로, Ce2O3을 의미함)를 의미한다. 대안적으로, δ (델타)의 값은 세륨 (IV) 옥사이드 (CeO2)와 관련하여 존재하는 산소 결원 (vacancy)의 양을 의미한다. 존재하는 각 산소 이-음이온 결원에 있어서, 2개의 일차세륨 이온 (Ce3 +)이 존재하여 전하적 중성을 보존한다.
본 발명의 일 구체예에서, 일차세륨 이온, 시트르산, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 산화제 및 물을 포함하는 반응 혼합물을 형성시키고; 반응 혼합물을 선택적으로 가열하거나 냉각시키고; 분리 없이 나노입자의 안정한 분산액을 직접 형성시키는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
다양한 구체예에서, 반응 혼합물중 시트르산 대 EDTA의 몰 비는 약 3:1 내지 약 1:9; 약 3:1 내지 약 2:1; 및 약 1.2:1.0 내지 약 1:9의 범위이다.
다양한 구체예에서, 산화제는 분자 산소 또는 공기, 또는 분자 산소 (또는 공기의 주위 대기)보다 더욱 산화시키는 화합물를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 산화제는 표준 수소 전극에 대비 -0.13 볼트 더 큰 수성 단극 환원전위를 갖는다. 특정 구체예에서, 산화제는 알칼리 금속 또는 암모늄 퍼클로레이트, 클로레이트, 하이포클로라이트 또는 퍼설페이트; 오존, 퍼옥사이드 또는 이들의 조합물이다. 특정 구체예에서, 2-전자 산화제 예컨대, 과산화수소가 사용된다. 특정 구체예에서, 과산화수소는 제1세륨 이온의 몰량의 1/2보다 많은 양으로 존재한다. 추가의 다른 구체예에서, 존재하는 산화제의 양은 존재하는 세륨 이온 또는 그 밖의 금속 이온의 양과 관련하여 다양하게 변화된다.
특정 구체예에서, 분자 산소는 반응 혼합물을 통하여 통과한다.
특정 구체예에서, 반응 혼합물의 온도는 주위 온도보다 높거나 낮다. 특정 구체예에서, 반응 혼합물은 주위 온도보다 높거나 낮은 온도로 가열되거나 냉각된다. 다양한 구체예에서, 반응 혼합물은 약 30 ℃ 초과, 약 40 ℃ 초과, 약 50 ℃ 초과, 약 60 ℃ 초과, 약 70 ℃ 초과, 약 80 ℃ 초과 또는 약 90 ℃ 초과의 온도로 가열되거나 냉각된다. 특정 구체예에서, 반응 혼합물은 물의 비등온도 미만의 온도로 가열되거나 냉각된다.
다양한 구체예에서, 형성된 나노입자는 무정형, 반-결정질 또는 실질적으로 결정질, 또는 결정질이다. 특정 구체예에서, 형성된 나노입자는 입방 형석 결정 구조를 특징으로 한다. 특정 구체예에서, 형성된 나노입자는 세륨 옥사이드 결정 구조를 특징으로 한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 반-결정질 및 실질적으로 결정질은 적어도 일부 결정질 구조를 갖는 나노입자를 지칭한다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 입자의 정확한 특성 결정은 입자 크기가 더 작아짐에 따라 더 어려워 지는데, 왜냐하면 더 작은 입자는 덜 검출되는 장거리 질서를 갖기 때문이다. 적어도 일 구체예에서, 나노입자는 결정질이며, 단결정질 또는 다결정질일 수 있다.
특정 구체예에서, 형성된 나노입자의 결정성은 반응 혼합물을 가열함으로써 향상된다.
특정 구체예에서, 형성된 나노입자는 반응 혼합물을 가열함으로써 탈수되거나 탈수산화된다.
다양한 구체예에서, 형성된 나노입자는 100 nm 미만, 80 nm 미만, 60 nm 미만, 40 nm 미만, 20 nm 미만, 10 nm 미만, 5.0 nm 미만, 약 3 nm 미만 또는 약 2.0 nm 미만의 유체역학적 직경을 갖는다.
특정 구체예에서, 형성된 나노입자는 유체역학적 직경 미만의 기하학적 직경을 갖는다.
다양한 구체예에서, 형성된 나노입자는 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 또는 약 3% 미만의 평균 입자 크기로 나눈 입자 크기의 표준 편차로서 정의된 입자 크기의 분산 계수 (COV)를 갖는다.
특정 구체예에서, 세륨을 포함하는 나노입자가 제공된다. 또 다른 구체예에서, 세륨 옥사이드, 세륨 하이드록시드 또는 세륨 옥시하이드록시드를 포함하는 나노입자가 제공된다.
특정 구체예에서, 시트르산, 에틸렌디아민테트라아세트산 및 세륨 옥사이드, 세륨 하이드록시드 또는 세륨 옥시하이드록시드를 포함하는 나노입자가 제공된다.
또 다른 구체예에서, 0 또는 그 미만의 제타 포텐셜을 갖는 나노입자가 제공된다. 특정 구체예에서, 세륨 옥사이드, 시트르산, 에틸렌디아민테트라아세트산을 포함하며, 0 또는 그 미만의 제타 포텐셜을 갖는 나노입자가 제공된다. 특정 구체예에서, 세륨 옥사이드, 시트르산, 에틸렌디아민테트라아세트산을 포함하며, -10 mV 미만, -20 mV 미만, -30 mV 미만, -40 mV 미만 또는 약 -50 mV 미만의 제타 포텐셜을 갖는 나노입자가 제공된다. 특정 구체예에서, 세륨 옥사이드, 시트르산, 에틸렌디아민테트라아세트산을 포함하며, -15 mV 내지 -30mV 범위의 제타 포텐셜을 갖는 나노입자가 제공된다.
특정 구체예에서, 0 초과의 제타 포텐셜을 갖는 나노입자가 제공된다. 특정 구체예에서, 세륨, 시트르산, 에틸렌디아민테트라아세트산을 포함하며, 0 초과, 10 mV 초과, 20 mV 초과, 30 mV 초과, 40 mV 초과 또는 50 mV 초과의 제타 포텐셜을 갖는 나노입자가 제공된다.
다양한 구체예에서, 나노입자의 제타 포텐셜은 나노입자 분산액의 pH, 시트르산 및/또는 에틸렌디아민테트라아세트산 함량 또는 이들의 조합을 조절함으로써 조정된다.
특정 구체예에서, 나노입자의 제타 포텐셜은 포화 범위 미만으로 나노입자 분산액중의 시트르산 및 에틸렌디아민테트라아세트산 함량을 조절함으로써 조정된다.
또 다른 구체예에서, 나노입자의 제타 포텐셜은 나노입자 분산액의 pH와 시트르산 및 에틸렌디아민테트라아세트산 함량 둘 모두를 포화 범위 미만으로의 조절함으로써 변경된다.
다양한 구체예에서, 세륨-함유 나노입자의 분산액은 실질적으로 비-응집된 나노입자, 90% 초과의 비-응집된 나노입자, 95% 초과의 비-응집된 나노입자, 98% 초과의 비-응집된 나노입자 및 전체적으로 비-응집된 나노입자를 함유한다.
특정 구체예에서, 비-응집된 나노입자는 결정질이며, 대안적으로 단일 입자 결정자 또는 개별 결정자로서 칭해진다.
특정 구체예에서, 형성된 나노입자 분산액은 세척되어 과량의 이온 또는 부산물 염이 제거된다. 다양한 구체예에서, 나노입자 분산액은 이온 전도성이 센티미터당 약 15 밀리지멘스 (mS/cm) 미만, 약 10 mS/cm 미만, 약 5 mS/cm 미만 또는 약 3 mS/cm 미만으로 감소 되도록 세척된다. 특정 구체예에서, 형성된 나노입자 분산액은 투석, 여과 또는 원심분리에 의해 세척된다.
특정 구체예에서, 형성된 나노입자 분산액은 농축되어 과량의 용매 또는 과량의 물이 제거된다. 특정 구체예에서, 나노입자 분산액은 투석, 투석여과 또는 원심분리에 의해 농축된다.
다양한 구체예에서, 분산액중 나노입자의 농도는 약 0.05 몰랄 초과, 약 0.5 몰랄 초과 또는 약 2.0 몰랄 초과 (해당 분산액중 약 35% 고형물)이다.
특정 구체예에서, 나노입자의 크기 분포는 실질적으로 단봉이다. 또 다른 구체예에서, 나노입자 크기는 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만 또는 약 5% 미만의 분산 계수 (COV)를 가지며, 여기에서 COV는 평균으로 나눈 표준 편차로서 정의된다.
특정 구체예에서, 당해분야에 공지된 다양한 혼합 기기가 반응 혼합물의 내용물을 교반, 혼합, 전단 또는 진탕시키는데 사용된다. 다양한 구체예에서, 교반 막대, 마린 블레이드 프로펠러 (marine blade propeller), 피치 블레이드 터빈 (pitch blade turbine) 또는 플랫 블레이드 터빈 (flat blade turbine)을 포함하는 혼합기가 사용된다. 특정 구체예에서, 밀리미터 내지 수 밀리미터의 분획 크기 범위의 홀을 포함하는 스크린을 통해 반응 혼합물을 통과시키는 고 전단 혼합기가 사용된다. 특정 구체예에서, 콜로이드 밀 또는 Silverson® High Shear Mixer가 사용된다. 특정 구체예에서, 반응물중 하나 이상은 수성 반응 혼합물의 표면 아래로 유입된다. 특정 구체예에서, 반응물은 혼합 기기에 매우 근접하게 수성 반응 혼합물의 표면 아래로 유입된다.
본 발명의 일 구체예에서, 공동 양도된 미국 특허 출원 공개 2010/0152077에 기재된 방법에 의해 덜 극성인 용매 조성물로 나노입자 수성 분산액을 용매 이동하는 방법이 이용된다. 특정 구체예에서, 나노입자 분산액은 예를 들어, 알콜 또는 글리콜 에테르를 포함하는 유기 희석물을 지닌 투석여과 칼럼을 통해 통과된다.
적어도 일 구체예에서, 세륨-함유 나노입자의 분산액은 예를 들어, 적어도 12 개월과 같이 적어도 2 개월 동안 안정적이다.
임의의 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니나, 염증 및 산화 스트레스 관련 질환 (예를 들어, ROS 매개된 질환)의 치료를 위한 세륨 옥사이드의 제안된 용도는 세륨 옥사이드가 자유 라디칼의 촉매적 제거제로서 작용할 수 있다는 확신에 부분적으로 기반을 둔다. Ce3 + 및 Ce4 + 원자가 상태의 혼합물중 세륨의 존재 및 용이한 상호전환으로 인해 세륨 옥사이드는 촉매적 또는 자가-재생 방식으로 자유 라디칼을 덜 해로운 종으로 환원 및/또는 산화시킬 수 있다. 레독스 반응은 조직-손상 자유 라디칼을 중성화시키는 세륨 옥사이드 나노입자 (CeNP)의 표면상에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 수퍼옥사이드 음이온 (O2 -)을 분자 산소로 산화시키고, 퍼옥시니트라이트 음이온 (ONOO-)을 생리학적으로 유순한 종으로 산화시키고, 하이드록실 라디칼 (ㆍOH)을 하이드록시드 음이온을 환원시키는 것이 바람직한 것으로 여겨진다. 이어서, 이는 예를 들어, 산화 스트레스 관련 질환 및 사건을 치료하는데 현재 이용가능한 희생적 항산화제와 비교하여 매우 감소된 투약 요법을 가능하게 할 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 투여된 나노세리아 입자는 세포 막을 통해 세포 내로 들어가서 세포 세포질 또는 다양한 세포 소기관 예컨대, 세포핵 및 미토콘드리아에서 위치한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 나노세리아 입자는 혈관내 또는 간질 공간내에 위치하며, 여기서 이들은 자가면역 반응을 감소시키거나 자유 라디칼을 제거함으로써 산화 스트레스 및 염증을 감소시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 혈액-뇌 장벽 (BBB) 또는 혈액-뇌척수액 장벽 (BCFB) 또는 혈액-안구 장벽 (BOB)의 파괴로부터 초래된 중추 신경계의 면역계 침습은 본 발명의 나노세리아 입자에 의해 조절된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 나노세리아 입자는 포유동물 혈액 뇌 장벽을 통과할 수 있는 입자이다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 나노세리아 입자는 포유동물 혈액 뇌 장벽을 통과하여 약 100 nm 미만, 약 50 nm 미만, 약 20 nm 미만, 약 10 nm 미만, 약 5 nm 미만 크기의 응집체 또는 응집물로서 뇌 실질 조직에 위치한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 나노세리아 입자는 포유동물 혈액 뇌 장벽을 통과하여 약 3.5 nm 미만의 크기의 독립적인 비-응집된 나노입자로서 뇌 실질 조직에 위치한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 나노세리아 입자를 포함하는 약제 조성물은 산화 스트레스 관련 질환 및 사건 예컨대, 비제한적으로, 특히 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴 병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 운동실조 (ataxia), 프리이드라이히 운동실조 (Friedreich's ataxia), 자폐 (autism), 강박반응성 장애 (obsessive-compulsive disorder), 주의력 결핍 과다 활동 장애 (attention deficit hyperactivity disorder), 편두통 (migraine), 발작 (stroke), 외상성 뇌손상 (traumatic brain injury), 암, 염증, 자가면역 질환, 루푸스 (lupus), MS, 염증성 장 질환 (inflammatory bowel disease), 크론병 (Crohn's Disease), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis), 협착증 (stenosis), 재협착증 (restenosis), 죽상동맥경화증 (atherosclerosis), 대사 증후군 (metabolic syndrome), 내피세포 기능장애 (endothelial dysfunction), 혈관경련수축 (vasospasms), 당뇨, 노화, 만성 피로 (chronic fatigue), 관동맥심질환 (coronary heart disease), 심장 섬유증 (cardiac fibrosis), 심근경색증 (myocardial infarction), 고혈압 (hypertension), 프리즈메탈 협심증 (Prizmetal's angina), 허혈 (ischemia), 혈관성형 (angioplasty), 저산소증 (hypoxia), 케산병 (Keshan disease), 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나아제 결핍 (glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency), 잠두중독증 (favism), 허혈성 재관류 손상 (ischemic reperfusion injury), 류마티스 및 골-관절염 (rheumatoid and osteo-arthritis), 천식 (asthma), 만성 폐쇄성 폐병 (chronic obstructive pulmonary disease) (예를 들어, 폐기종 및 기관지염), 알레르기, 급성 호흡 곤란 증후군 (acute respiratory distress syndrome), 만성 신장 질환 (chronic kidney disease), 신장 이식 (renal graft), 신장염, 전리 방사선 손상 (ionizing radiation damage), 일광화상 (sunburn), 피부염 (dermatitis), 흑색종 (melanoma), 건선 (psoriasis), 황반변성 (macular degeneration), 망막 변성 (retinal degeneration), 백내장발생증 (cataractogenesis)의 예방 및/또는 치료를 위해 특히 고려된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 나노세리아 입자를 포함하는 약제 조성물은 산화 스트레스 관련 세포 병태 예컨대, 비제한적으로, 미토콘드리아 기능이상, 라이소좀 및 프로테아좀 기능이상, 핵산 (예를 들어, RNA 및 DNA)의 산화, 티로신 질화, 포리포릴화 매개된 시그널링 연쇄반응의 손실, 아폽토시스의 개시, 지질 퍼옥사이드화 및 막 지질 환경의 파괴의 예방 및/또는 치료를 위해 특히 고려된다.
적어도 일 구체예에서, 본 발명에 따라 제조된 세륨-함유 나노입자를 포함하는 약제 조성물은 산화 스트레스 관련 질환을 예방적으로 치료하기 위해 유효량으로 투여된다. 본원에 사용된 바와 같이, 문구 "유효량"은 요망되는 효과를 유도하기에 충분한 활성 원소 (principle) (예를 들어, 세륨-함유 나노입자)를 포함하는 약제 조성물의 양을 의미한다. 본 기술분야에 인지되는 바와 같이 약제학적 유효량은 정례적 실험을 통해 결정될 수 있다.
적어도 일 구체예에서, 본 발명에 따라 제조된 세륨-함유 나노입자를 포함하는 약제 조성물은 산화 스트레스 관련 질환의 증상을 치료하기 위해 유효량으로 투여된다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 나노세리아 입자를 포함하는 약제 조성물은 인간 또는 인간외 대상체 예컨대, 비제한적으로 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지 또는 설치류를 포함하는 또 다른 포유동물에 투여된다. 대안적으로, 투여 대상체는 동물 예컨대, 조류, 곤충, 파충류, 양서류 또는 임의의 반려동물 또는 농장 동물일 수 있다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 나노세리아 입자는 주사, 주입 또는 이식을 포함하는 국소적, 장관 또는 비경구적 방법에 의해 대상체로 생체내 투여된다. 더욱 특히, 본 발명의 나노세리아 입자를 하기 임의의 경로에 의해 투여하는 것이 고려된다: 심이 (auricular) (귀), 구강 (buccal), 결막 (conjunctival), 피부 (cutaneous), 치아 (dental), 전기삼투 (electro-osmosis), 자궁내경관 (endocervical), 부비강내 (endosinusial), 기관내 (endotracheal), 장관 (enteral), 경막외 (epidural), 양수외 (extra-amniotic), 체외 (extracorporeal), 혈액 투석 (hemodialysis), 침윤 (infiltration), 간질 (interstitial), 복강내 (intra-abdominal), 양수내 (intra-amniotic), 동맥내 (intra-arterial), 쓸개내 (intrabiliary), 기관지내 (intrabronchial), 낭내 (intrabursal), 심장내 (intracardiac), 연골내 (intracartilaginous), 미추내 (intracaudal), 해면내 (intracavernous), 강내 (intracavitary), 뇌내 (intracerebral), 수조내 (intracisternal), 각막내 (intracorneal), 코르날-치아내 (intracornal-dental), 광동맥내 (intracoronary), 해면체내 (intracorporus cavernosum), 피내 (intradermal), 추간판내 (intradiscal), 관내 (intraductal), 십이지장내 (intraduodenal), 경막내 (intradural), 상피내 (intraepidermal), 식도내 (intraesophageal), 위내 (intragastric), 잇몸내 (intragingival), 회장내 (intraileal), 병변내 (intralesional), 루미날내 (intraluminal), 림프내 (intralymphatic), 수질내 (intramedullary), 뇌막내 (intrameningeal), 근내 (intramuscular), 안구내 (intraocular), 난소내 (intraovarian), 심막내 (intrapericardial), 복강내 (intraperitoneal), 흉강내 (intrapleural), 전립선내 (intraprostatic), 폐내 (intrapulmonary), 부비강내 (intrasinal), 척수내 (intraspinal), 활액낭내 (intrasynovial), 힘줄내 (intratendinous), 고환내 (intratesticular), 막내 (intrathecal), 흉부내 (intrathoracic), 관내 (intratubular), 종양내 (intratumor), 고막내 (intratympanic), 자궁내 (intrauterine), 혈관내 (intravascular), 정맥내 (intravenous), 정맥내 대량 주입 (intravenous bolus), 정맥내 점적 주입 (intravenous drip), 심실내 (intraventricular), 방광내 (intravesical), 유리체내 (intravitreal), 이온삼투요법 (iontophoresis), 관류 (irrigation), 후두 (laryngeal), 비 (nasal), 비위관 (nasogastric), 밀봉 붕대법 (occlusive dressing technique), 눈 (ophthalmic), 구강 (oral), 구강인두 (oropharyngeal), 비경구 (parenteral), 경피 (percutaneous), 관절주위 (periarticular), 경막외 (peridural), 신경주위 (perineural), 치주 (periodontal), 직장 (rectal), 호흡기 (respiratory) (흡입 (inhalation)), 안구후 (retrobulbar), 연조직 (soft tissue), 거미막밑 (subarachnoid), 결막밑 (subconjunctival), 피하 (subcutaneous), 설하 (sublingual), 점막밑 (submucosal), 구소 (topical), 경피 (transdermal), 유선경유 (transmammary), 점막경유 (transmucosal), 태반경유 (transplacenta), 기관경유 (transtracheal), 고실경유 (transtympanic), 요관 (ureteral), 요도 (urethral), 질 (vaginal), 및 임의의 그 밖의 또는 지정되지 않은 경로.
기타 구체예에서, 본 발명의 나노세리아 입자는 의료 장치 또는 보철물 예컨대, 캐뉼라, 카테터 또는 스텐트내에 또는 이의 표면상에 유지되어, 단기간 또는 장기간에 걸쳐 국소적으로 또는 전신적으로 염증을 감소시킨다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 나노세리아 입자는 비제한적으로, 현탁액, 겔, 정제, 장용정, 내장 리포좀 (loaded liposome), 분말, 좌약, 불용해물, 로젠지, 크림, 로션, 고약 또는 흡입제를 포함하는 본 기술분야에 공지된 임의의 적합한 형태로 전달된다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 나노세리아 입자는 그 밖의 약제학적으로 허용되는 물질 예컨대, 비제한적으로, 물, 염, 완충제, 인산염 완충된 염수 (PBS), 당, 인간 또는 소 혈청 알부민, 지질, 약물, 착색제, 향미제, 결합제, 검, 계면활성제, 충전제 또는 본 기술분야에 공지된 임의의 부형제와 조합된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 나노세리아 입자를 포함하는 비히클은 투여전에 멸균된다.
그 밖의 구체예에서, 세포 또는 세포 배양물은 본 발명의 나노세리아 입자 또는 입자들과 접촉된다. 접촉은 시험관내 또는 생체외 방법에 의해 세포 또는 세포 배양물을 노출시킴으로써 실시될 수 있으며, 여기에서 후자의 방법은 처리된 세포 또는 세포들을 대상체 예컨대, 세포 또는 세포들이 원래 수득되었던 대상체로 재유입시키는 것을 포함한다. 다양한 구체예에서, 세포는 천연의 원핵세포 또는 진핵세포이다. 특정 구체예에서, 처리된 세포는 예컨대, 비제한적으로, 항원, 항체 및 백신을 포함하는 생물제제로서 일반적으로 공지된 약제 산업에 사용되는 단백질의 생성에 사용된다. 또 다른 구체예에서, 처리된 세포는 발효 공정에 사용된다.
본 발명은 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하는 것이 아닌 하기 실시예에 의해 추가로 설명된다.
실험 부문
나노입자 광 산란 및 크기 평가
입자 분산액의 단순 정성적 특성 결정은 순수 용매의 샘플로부터 산란되는 양과 비교하여, 레드 레이저 펜 광 (red laser pen light)으로 조사하는 경우 분산액이 나타내는 Tyndell 산란 정도를 평가함으로써 수행되었다. 나노입자 분산액의 입자 크기의 정량적 측정은 석영 큐벳이 장착된 Brookhaven 90Plus Particle Size Analyzer (Brookhaven Instruments Corp., Holtzville, New York, U.S.A.)을 사용하여 동적 광 산란 (DLS)에 의해 수행하였다. 보고된 DLS 크기는 로그정규 수 가중 변수 (lognormal number weighted parameter)이다.
나노입자 전하 평가
나노입자 전하의 정량적 평가는 Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments)를 사용하여 제타 포텐셜을 측정함으로써 수행하였다.
시트르산 및 EDTA를 갖는 세리아 나노입자의 제조
자석 교반 막대를 지닌 800ml 유리 비이커에 500 ml의 고순도 (HP) 물을 첨가하였다. 이어서, 물을 약 70 ℃로 가열시키고, 여기에 2.41 gm의 시트르산 (CA) 및 4.27 gm의 에틸렌디아민테트라아세트산, 디소듐 염 (EDTA)을 용해시켰다. 암모늄 하이드록시드 (28-30 %)를 첨가하여 용액의 pH를 약 8.5로 조절하였다. 반응 용기의 온도를 약 80 ℃로 증가시키고, 자석 교반 막대를 5000 rpm으로 작동시킨 Silverson® L4RT 고전단 혼합기에 넣었다. 10.0 gm 양의 Ce(NO3)3ㆍ6(H2O)을 30 ml의 HP 물에 용해시키고, 이러한 용액을 수분에 걸쳐 교반된 반응 혼합물에 서서히 첨가하였다. 반응 pH를 소량의 진한 NH4OH 용액을 첨가하여 약 8.5로 유지하였다. 이어서, 4.8 ml의 50% H2O2 (세륨에 대한 H2O2 3.0 몰비)를 함유하는 50 ml 용액을 서서히 수 분에 걸쳐 제1세륨 이온, 시트르산, EDTA 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 생성물을 덮고, 추가의 시간 동안 가열하여 투명한 황색/주황색 현탁액을 생성시켰다. 교반하면서 냉각시킨 후, 직접적으로 형성된 나노입자 분산액을 약 10 mS/cm 미만의 이온 전도성으로 투석여과에 의해 세척하여 과량의 염을 제거하였다. 생성물 분산액의 pH는 약 7.2이었다.
최종 생성물 분산액은 투명한 황색/주황색 액체였으며, 이는 저강도 레이저 빔으로 조사하는 경우 높은 수준의 Tyndall 산란을 나타냈으며, 이는 잘 분산된 콜로이드 입자를 함유함을 나타낸다. 최종 생성물 분산액은 입자 응집 또는 침전을 나타내지 않으면서 적어도 12 개월 동안 안정한 것으로 관찰되었다. 7회 반복된 제조물에 대한 동적 광 산란에 의한 입자 크기 분석 결과는 3.1 nm의 평균 유체역학적 직경 및 0.30 nm의 표준 편차 (10%의 COV)이다.
동몰량 (50/50)의 시트르산과 EDTA가 첨가되는 이러한 방법에 의해 제조된 세리아 나노입자는 CA/EDTA 세리아 나노입자, CA/EDTA 나노세리아, CeNP, CNRx, 또는 CNRx 87로서 본원에서 다양하게 지칭된다.
CA/EDTA 세리아 나노입자의 반복 제조물을 분말 X-선 회절 (XRD)에 의한 상 식별 및 결정질 크기 분석을 위해 제공하였다. 샘플 일부를 Teflon 보트에 넣고, 4시간 동안 가열 램프하에 건조시키고, 이어서 80 ℃에서 4 시간 동안 오븐에서 진공하에 건조시켰다. 생성된 고형물을 약하게 분쇄하여 분말을 형성시켰다. 이어서, 이러한 분말을 글래스 홀더에 프론트-패킹시키고, N2 건조 셀 부착에서 XRD에 의해 분석하였다.
도 1에 도시된 CA/EDTA 세리아 나노입자의 3개의 특정 반복 제조물의 XRD 스펙트럼의 분석은 각 샘플이 CeO2 (PDF # 34-394, 세리아나이트)을 지닌 주요 결정질 상 이소-구조물을 함유하였음을 나타냈다. Scherrer 기법을 이용한 7회 반복 샘플에 있어서 CeO2 (220) 방향에서 2.4 nm의 평균 결정자 크기 및 0.06 nm의 표준 편차 (2.5%의 COV)가 측정되었다.
건조된 CA/EDTA 세리아 나노입자의 적당한 고해상된 TEM 현미경사진 (도 2)은 2-3 nm 등급의 직경을 갖는 개별 (비-응집된) 입자의 앙상블을 나타냈다. 건조된 CA/EDTA 세리아 나노입자의 더 높은 해상도 TEM 현미경 사진 (도 3)은 선택된 나노입자에서 원자의 개별적 배열을 나타냈다. 크기 등급 분포는 도 4에 도시된 바와 같이 TEM 현미경 사진으로부터 결정하였다.
제타 포텐셜 측정은 CA/EDTA 세리아 나노입자의 반복 제조물의 이러한 수성 분산액에 있어서 -23 mV의 평균 전하를 나타냈다.
안정화제의 전체 몰 양을 일정하게 유지하면서 시트르산 및 EDTA 안정화제의 몰비를 100/0, 80/20, 70/30, 60/40, 40/60, 30/70, 20/80 및 0/100로 조절한 것을 제외하고는 상기 기술된 CA/EDTA 세리아 나노입자의 제조를 반복하였다. 실질적으로 유사한 물리적 특징 (입자 크기 및 제타 포텐셜)을 갖는 세륨 옥사이드 나노입자의 안정한 분산액이 하기 표 1에 기재된 바와 같이 생성되었다.
다양한 산화 스트레스 관련 질환에서 세륨 옥사이드 나노입자의 평가
허혈성 발작
허혈성 발작의 마우스 해마 뇌 절편 모델
산화 스트레스를 감소시키는 나노세리아의 능력을 문헌 [Estevez, AY; et al., Neuroprotective mechanisms of cerium oxide nanoparticles in a mouse hippocampal brain slice model of ischemia, Free Radic. Biol. Med. (2011)51(6):1155-63 (doi:10.1016/j.radbiomed.2011.06.006)]에 기술된 허혈의 시험관내 마우스 해마 뇌 절편 모델의 변형된 모델에서 평가하였다.
성체 (2-5월령) CD1 마우스를 신속한 단두에 의해 희생시키고, 이들의 뇌를 재빨리 제거하고 24 mM 콜린 비카보네이트, 135 mM 콜린 클로라이드, 1 mM 키누렌산, 0.5 mM CaCl2, 1.4 mM Na2PO4, 10 mM 글루코스, 1 mM KCl, 및 20 mM MgCl2 (315 mOsm)을 함유하는 냉각된 콜린-기재 슬라이싱 용액에 넣었다. 횡단 해마 절편 400 ㎛ 두께를 Leica VT1200 Vibratome (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)를 사용하여 입쪽-대-꼬리쪽 축을 따라 잘라내고 (-1.2 내지 -2.8 mm Bregma), 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 2.4 mM CaCl2, 1.3 mM MgSO4, 1.24 mM K3PO4, 26 mM NaHCO3, 10 mM 글루코스를 함유하는 대조군 인공 뇌척수액 (aCSF)에서 1시간 동안 회수되게 하고 5% CO2, 95% O2 기체 (pH 7.4, 300 mOsm)로 버블링시켰다. 해마 절편을 배양 접시에 넣고, NuAire 가습 인큐베이터 (NuAire, Plymouth, MN, USA)에서 37 ℃에서 5% CO2 하에 48 hr 이하 동안 저장하였다.
뇌 절편을 37 ℃에서 30 min 동안 저혈당의 산성 및 혈중산소 감소 aCSF (글루코스 및 pH를 각각 2 mM 및 6.8로 저하시키고, 용액을 84% N2, 15% CO2, 및 1% O2로 버블링시킴)에 넣어 허혈로 인한 산화 스트레스를 유도하였다. 용액의 오스몰농도를 약 295 mOsm로 유지시키기 위해 수크로스를 첨가하였다.
상기 기술된 바와 같이 제조된 세륨 옥사이드 나노입자의 수성 분산액을 허혈 사건 발병시 1 ml aCSF 또는 매질 (당량 내지 5.8μM) 당 1 ㎍의 전달 용적에 매칭되는 용량으로 투여하고, 나머지 실험에 걸쳐 매질 중에 유지시켰다. 대조군 절편은 동일한 용적의 비히클 대조군을 수령하였다. 정류수 단독, 염수액, Na-시트레이트 용액, PBS 및 이의 조합물을 포함하는, 본원에 기술된 바와 같이 제조된 세륨 옥사이드 나노입자에 대한 유사한 성공률을 갖는 다양한 전달 비히클을 사용하였다.
산화 스트레스 (허혈 상태)에 30분 노출시킨 후, 살아있는 뇌 절편 (시험 및 대조군)을 배양 배지 및 Millipore 삽입물 (Millipore, Billerica, MA, USA)을 함유하는 35 mm 배양 접시에 넣고 기관형 배양으로 24 hr 동안 인큐베이션하였다. 배양 배지는 50% 최소 필수 배지 (Hyclone Scientific, Logan UT, USA), 25% 말 혈청, 25% 행크의 균형 염 용액 (28 mM 글루코스, 20 mM HEPES 및 4 mM NaHCO3이 보충됨), 50 U/ml 페니실린, 및 50 ㎕/ml 스트렙토마이신을 함유하였다 (pH 7.2).
세포 치사 정도는 형광 이미징 기법을 이용하여 산화 손상 후 24시간에 측정하였다. 시험 조건 (즉, 세륨 옥사이드 나노입자 투여)에서 연구된 각 세트의 뇌 절편을 비히클 단독의 투여를 제외하고는 모든 방식에서 동일하게 처리된 유사한 세트의 대조군 뇌 절편에 매칭시켰다. 따라서, 각 연구 일에, 연령-매칭되고 성별-매칭되어 취해진 자동 매칭된 뇌 절편 두 세트를 시험 조건 (세륨 옥사이드 나노입자 투여) 또는 대조군 (비히클 단독)으로 처리하였다. 형광 이미징 측정 동안, 광 세기, 이미지 포획 기간 및 이미지 수집 시점은 시험 조건 및 비히클 대조군 뇌 절편에 있어서 동일하였다. 결과는 실험 순서의 동일한 시점에서 이미지화된 매칭된 대조군 절편에서의 형광에 대한 시험 조건에서의 형광의 비로서 표현하였다.
산화 손상 후 24시간째에, 한 쌍 (대조군 및 시험)의 뇌 절편을 0.81 μM 바이탈 배제 염료 SYTOX® Green (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 함유하는 배양 배지에서 20 min 동안 인큐베이션시키고, 후속하여 배양 배지에서 15-20 min 동안 세척하여 비혼입된 염료를 제거하였다. SYTOX® Green은 DNA 및 RNA에 결합하는 형광 염료이다. 그러나, 이는 온전한 생 세포에서는 세포 막에 의해 세포 핵으로부터 차단된다. 따라서, 이는 바이탈 염료로서 작용하며, 세포 막이 투과가능하게 되어 염료가 세포 내부에 접근할 수 있는 죽은 세포 및 죽어가는 세포만 염색한다. 염색 및 세척 후, 뇌 절편을 형광 부착기 (epifluorescence attachment) 및 150-W 제논 광 소스 (Optiquip, Highland Mills, NY, USA)가 장착된 Nikon TE 2000-U (Nikon Instruments, Melville, NY, USA) 현미경의 스테이지로 옮겼다. 대조군 aCSF 용액을 60-ml 주사기 내로 로딩시키고, 95% O2/5% CO2로 평형화시키고, 서보-제어된 주사기 히터 블록, 스테이지 히터 및 인-라인 관류 히터 (Warner Instruments, Hamden, CT, USA)를 사용하여 37 ℃로 가열하였다. 뇌 섹션을 분당 1 ml의 속도로 가온의 95% O2/5% CO2 평형화된 aCSF로 연속하여 관류시켰다. 5 min 후, 각 대조군 및 시험 뇌 절편의 해마 형성의 이미지를 동일한 조건 (즉, 광 세기, 노출 시간, 카메라 획득 변수)하에 4x Plan Flour 대물렌즈 (Nikon Instruments)를 사용하여 수집하였다. SYTOX® Green 형광을 480±40 nm에서 조직을 간단하게 (620 ms) 여기시키고, 505 nm, 롱-패스, 색선별 거울 (Chroma technology, Bennington, VT, USA)을 사용하여 프로브로부터 방사된 형광 (535 ±50 nm)을 여과하고, 강화시키고 냉각된 CCD 획득 EM 카메라 (Hamamatsu CCD EM C9100; Bridgewater, NJ, USA)로 측정함으로써 측정하였다. 디지털 이미지를 획득하고, Compix SimplePCI 6.5 소프트웨어 (C Imaging Systems, Cranberry Township, PA, USA)로 처리하였다.
SYTOX® Green 로딩으로부터 유도된 광 세기는 계산된 영역 내의 죽거나 죽고있는 세포의 수를 반영하였다. 광-세기 측정은 Compix SimplePCI 6.5 소프트웨어를 사용하여 자동으로 수행하여, 관심 영역 선택에서 실험자 편향을 제거하였다.
세포 치사의 감소는, 슬라이싱되고 동일한 날에 허혈성 산화 스트레스에 노출된 연령-매칭되고 성별-매칭된 한배 새끼 뇌로부터 취해진, 해부학적으로 매칭된 해마 섹션에 있어서, 코르누 암모니 필드 (지향층, 방사층 및 소강 분자)로부터의 SYTOX® Green 형광의 광 세기의 대조군 (비처리됨)에 대한 시험 조건 (즉, 나노세리아 처리됨)의 비로서 기록하고, 허혈 손상 후 24 hr째에 형광 이미지화시켰다.
시트르산, EDTA 및 이들의 조합물을 포함하는 생체적합성 안정화제로 제조된 세륨 옥사이드 나노입자를 5.8 μM의 처리 농도를 이용하여 허혈성 발작의 마우스 해마 뇌 절편 모델에서 평가하였다. 시트르산 대 EDTA 몰비에 따른, 보통 스패어링 (sparing)으로서 지칭되는 세포 치사 감소 결과 (대조군 대비 감소 백분율)은 하기 표 1에 제공하였다.
표 1
Figure 112015003002072-pct00001
안정화제로서 시트르산 단독 (100/0)으로 제조된 세륨 옥사이드 나노입자로의 처리는 세포 치사 (스패어링)를 약 16% 만큼 감소시킨 반면, 안정화제로서 EDTA 단독 (0/100)으로 제조된 세륨 옥사이드 나노입자로의 처리는 세포 치사에 대해 약간의 영향만 끼쳤다 (1.8% 감소). 세포 치사에서의 추가 감소 (스패어링 증가로 대안적으로 칭해짐)는 약제 조성물 또는 의약의 바람직한 특징이다. 70/30 내지 20/80 범위의 몰비의 시트르산 및 EDTA의 조합물로 제조된 세륨 옥사이드 나노입자로의 처리는 스패어링의 놀랄만한 증가를 유도하였으며, 이는 실질적으로 각 안정화제를 단독으로 사용한 경우의 효과를 기초로 했을 경우 단순한 선형의 예상되는 부가적 합계를 초과하였다. 예를 들어, 가장 높은 스패어링 (약 30%)은 시트르산 대 EDTA의 동몰 (50/50)에서 관찰된 반면, 안정화제의 이러한 조합물로 제조된 나노입자에 대한 단순 선형 예상치는 시트르산 단독에 있어서는 평균 15.5% 스패어링 및 EDTA 단독에 있어서는 1.8% 스패어링이며, 이는 단지 8.65% 스패어링이다. 이와 같이, 시트르산 및 EDTA 안정화제의 조합물 사이의 놀랍고 예상치못한 상승효과가 발견되었으며, 여기에서 동몰 (50/50) 시트르산 및 EDTA에 대한 실제 스패어링은 단순 선형 예상치 보다 약 3.5배 높았다.
일반적으로, 시트르산 대 EDTA의 해당 비에 있어서 예측 스패어링 백분율에 대한 단순 선형 (부가) 모델은 하기 표현으로 제시된다:
[CA의 분획]*[CA의 스패어링 %] + [EDTA의 분획]*[EDTA의 스패어링 %]
상기 식에서, 해당 안정화제의 분획은 존재하는 전체 안정화제의 몰 분획이다. 표 1에 기재된 결과에 있어서, CA의 스패어링 %은 15.5%이며, EDTA의 스패어링 %는 1.8%이다. 이러한 표현의 값 (예측 스패어링 백분율)은 표 1의 스패어링 결과 및 예측 (%)이라는 제목의 열에 기록하였다.
일반적으로, 스패어링에서 상승효과적 증가는 2개의 별개의 변수로 구체화될 수 있다. 실제 및 예측 스패어링 양 간의 차이 (실제 - 예상)는 절대적 기저에 대한 상승효과를 상징하며, 여기서 파지티브 값은 예상치못한 부가적인 스패어링을 나타내며 (발명의 결과), 네거티브 값은 예측된 스패어링 양 미만을 나타낸다 (즉, 안정화제 간의 네거티브 상호작용 또는 간섭). 대안적으로, 실제 대 예측치 비 (실제/예측)는 상대적 기저에 대한 상승효과를 상징하며, 여기서 1보다 높은 값은 부가적인 예상치못한 스패어링의 상대적 양을 나타내며 (발명의 결과), 1보다 낮은 값은 안정화제 간의 네거티브 상호작용 또는 간섭으로 인해 예상되는 예측량보다 낮은 스패어링의 상대적 양을 나타낸다 (비교 결과).
표 1의 스패어링 상승효과 열에서 이러한 변수의 시험은 70/30 내지 20/80 범위의 몰 비의 시트르산 및 EDTA의 조합물로 제조된 세륨 옥사이드 나노입자로의 처리가 상대적 스패어링에 있어서의 상승효과적 증가 ((실제/예측)의 값이 1보다 높음)와 함께 절대적 스패어링에서의 상승효과적 증가 ((실제-예측)의 값이 파지티브임)를 유도하였음을 다시 한번 나타내었다. 절대적 상승효과적 스패어링 증가의 가장 많은 양은 50/50의 시트르산 대 EDTA의 처리 비에서 발생하였으며, 추가적인 21.65%의 스패어링이 예상치 못하게 관찰되었다. 상대적 상스효과적 스패어링 증가의 가장 많은 양은 30/70의 시트르산 대 EDTA의 처리 비에서 발생하였으며, 실제 스패어링은 예측보다 3.9배 더 높았다.
그에 반해서, 네거티브 상호작용 또는 갑섭이 80/20 몰비의 시트르산 및 EDTA의 조합물로 제조된 세륨 옥사이드 나노입자로의 처리에 있어서 관찰되었으며, 여기서 절대적 실제 스패어링은 예측보다 6.8% 낮거나, 대안적으로, 상대적 실제 스패어링은 예측치의 단지 1/2 (0.5 배)이었다.
이와 같이, 요약하자면, 약 3.0 내지 약 0.1 범위의 EDTA에 대한 시트르산의 몰비로 제조된 세륨 옥사이드 나노입자로의 처리가 스패어링에서 상승효과적 증가를 유도하는 반면, 4.0의 EDTA에 대한 시트르산의 몰비로 제조된 세륨 옥사이드 나노입자로의 처리는 간섭을 초래하여 예측 스패어링보다 낮게 유도함이 발견되었다.
다발성 경화증
다발성 경화증 (MS)은 전세계 이백만명이 넘는 인간들이 앓고 있는 중추신경계 (CNS)의 질환이다. MS는 부분적으로 신경 세포를 둘러싸는 수초의 변성을 유도하고 궁극적으로는 산화 스트레스로 인한 뉴런 세포 치사를 초래하는 면역 매개된 염증 질환으로서 오랫동안 간주되었다. 재발/완화형으로 불리는 질환의 가장 일반적인 과정은 신경학적 및 운동 기능 악화의 명백하게 규정된 공격 이어서 질환 활성의 새로인 사인 없이 상대적으로 조용한 기간 (차도)을 특징으로 한다. 질환의 덜 일반적인 과정은 만성-진행형 MS로 불리며, 이는 초기 MS 증상 후 차도 없이 임상적 신경학적 손상의 꾸준한 진행을 특징으로 한다. 단지 약 20%의 환자만이 만성-진행형 MS로 초기에 진단받는 반면, 재발/완화형 MS로 초기에 진단된 환자 중 약 반은 십년마다 만성-진행형 형태로 진행될 것이다.
만성-진행형 다발성 경화증
MS의 쥣과 EAE 모델
MS 발병의 많은 병리학적 특징은 쥣과의 실험적 자가면역 뇌수막염 (EAE) 모델에 의해 모델링되며, 여기에서 염증 장애는 미엘린 항원으로의 면역화에 의해 유도된다. EAE 모델은 혈액-뇌-장벽 (BBB) 파괴, 면역 세포의 혈관 주위 침투, 미세아교세포 활성화 및 탈수초를 특징으로 한다. EAE 모델은 MS의 치료에 사용되는 현재 치료법의 개발에 있어서 중요하였다.
SJL-EAE 마우스는 Jackson Laboratories로부터 구입하였으며 (C57BL/6), 비히클 또는 비히클과 CA/EDTA 세리아 나노입자로 처리하였다. PBS/50 mM 소듐 시트레이트 염수중에 혼합된 CA/EDTA 세리아 나노입자를 질환 유도 전 (예방적 모델) 또는 후 (치료적 모델)에 IV 꼬리 정맥 주입에 의해 실험 동물에 투여하고, 이어서 다양한 농도의 유지량을 제공하였다. 한 실험에서는, 마우스 하위군을 음료수중 2 ㎍/L의 면역조절 약물 핑골리모드 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)로 매일 처리하였다. 다양한 처리 요법 (투약 요법)은 하기 표 4에 상세히 기술되어 있다.
표 4
Figure 112015003002072-pct00002
실험적 자가면역 뇌수막염 (EAE) 즉, 만성-진행형 다발성 경화증-유사 증상을 갖는 마우스를 다음과 같이 유도하였다: 인산염 완충된 염수 (PBS) 중에 용해된 200 ㎍ 미엘린 올리고덴드로사이트 (MOG35 -55) 단백질 펩티드 (Genscript)와 혼합된 동일 용적의 완전 프로인트 보조제의 0.1 ml를 정맥내 (IV) 꼬리 주입 후 PBS중 200 ng 백일해 독소의 0.1 ml를 복강내 주입으로 0일 및 2일에 전달하였다.
질환 진행을 소뇌 기능 (평균대), 앞다리 강도 (행잉 와이어), 및 뒷다리 강도 (로타로드)를 평가하기 위해 설계된 3가지 운동 성향 검사와 함께 하기 기술된 임상 스코어링 검사를 이용하여 매일 스코어 작성하였다.
임상 스코어링 검사
EAE 마우스에서 다발성 경화증 유형 증상의 질환 진행을 하기 표 2에 도시된 바와 같이 셀바라즈 (Selvaraj) 등 (2008)으로부터 변형된 임상 등급을 이용하여 매일 스코어 작성하였다.
표 2
Figure 112015003002072-pct00003
운동 성향 검사
행잉 와이어 검사
행잉 와이어 과제를 이용하여 악력을 평가하였다. 이러한 과제를 위해, 마우스를 철선 격자 바닥을 갖춘 오픈-탑 Plexiglas 박스에 넣었다. 박스를 카운터 탑 위 60 cm에서 뒤집고, 떨어질 때까지의 시간 (latency to fall)을 측정하였다.
로타로드 검사
로타로드 장치 (Med Associates, St. Albans, VT)를 사용하여 주로 뒷 다리 운동 조정력 및 지구성을 평가하였다. 마우스를 28 rpm으로 회전하는 드럼에 넣고 드럼으로부터 떨어지는 시간 (300 초, 최대)을 측정하였다.
평균대 검사
이러한 과제를 위해, 마우스를 상승된 나무 평균대 (wooden beam)의 조명이 있는 말단에 위치시키고 60 s 이하까지의 시간을 부여하여 골 박스에 도달하게 하였다. 균형 및 걸음걸이를 5점 등급을 이용하여 스코어를 매겼다 (5 = 정상적인 걸음걸이 내지 0 = 빔에서 즉시 떨어짐). 걸이걸이 질은 하기 기술된 등급에 따라 추가로 등급을 매겼다.
표 3
Figure 112015003002072-pct00004
도 5에서는 10 mg/kg 투여량으로 및 도 6에서는 20 mg/kg 투여량으로 CA/EDTA 세리아 나노입자가 예방적 및 치료적 투약 설계 둘 모두에 대한 임상 스코어링을 감소 (개선)시켰음이 도시되어 있다. 누적 질환 중증도의 평가로서, 평균 임상 스코어 대 유도 후 일의 곡선하 영역 (AUC)을 20 mg/kg 수준으로 투여된 각 동물에 있어서 계산하였다 (도 7 참조). CA/EDTA 세리아 나노입자는 예방적 처치 요법 (도 8) 및 치료적 3일 지연 처치 요법 (도 9)에 있어서 용량-의존적 방식으로 임상 중증도를 감소 (개선)시켰다. 주입된 전체 세리아에 따른 질환 중증도 감소의 전반적인 개요는 도 10에 도시되어 있다.
세리아의 조직 축적: 마우스 하위군을 이소플루란 과다복용으로 안락사시키고, 경심관류로 PBS를 관류시켰다. 수집된 조직을 냉동시키고 유도 결합 플라즈마 질량 분석법 (ICP-MS)에 의해 세륨에 대해서 분석하였다. 주입된 전체 세리아에 따른 뇌 세륨 함량은 도 11에 도시되어 있다.
도 10-11의 결과는 CNS로의 입자 침투가 전달된 용량과 매우 연관성이 있으며, 시험된 용량 범위에서는 포화되지 않음을 시사한다.
면역조절 약물 핑골리모드에 대비 30 mg/kg 수준으로 투여된 CA/EDTA 나노입자의 비교는 도 12-15의 결과에 나타내었다. 모든 처리군은 질환의 A) 급성기 (도 13) 및 B) 만성기 (31-35 일) (p<0.05) (도 14) 둘 모두 동안 대조군 대비 질환 중증도를 현저하게 감소시켰다. 핑골리모드 및 예방적 처치는 급성기 동안 치료적 (7일 지연) 처치보다 현저하게 더욱 효과적이었다. 모든 군은 질환의 만성기 (31-35 일) 동안 동일하게 효과적이었다.
또한, CA/EDTA 세리아 나노입자로의 처리는 마우스의 운동 성향 수행을 향상시켰다. 20 mg/kg 투여량의 CA/EDTA 세리아 나노입자가 투여된 마우스에 대한 매일 군의 평균 운동 성향 수행을 로타로드 검사 (도 16) 및 행잉 와이어 검사 (도 19)로 나타냈으며, 여기서 대조군 대비 떨어지기까지의 더 긴 시간은 개선된 운동 수행을 나타낸다. 20 mg/kg 투여량의 매일 군의 평균 평균대 수행을 도 21에 나타냈으며, 여기서 대조군 대비 더 높은 스코어는 개선된 운동 수행을 나타낸다. 예방적 (도 17) 및 치료적 3일 지연 (도 18) 처치 요법 둘 모두에 대한 로타로드 검사에 있어서, 및 모든 용량 및 처치 요법에 대한 행잉 와이어 검사 (도 20) 및 평균대 검사 (도 22)에 있어서 도시된 바와 같이, 운동 성향 수행은 연구된 범위에 걸쳐 투여량이 증가함에 따라 계속해서 향상되었다.
CA/EDTA 나노세리아로 처리된 마우스로부터 분리된 기관 및 뇌 섹션의 유도 결합 플라즈마 질량 분석법 (ICP-MS)에 의한 세륨 함량 분석 결과는 도 23-24에 도시되어 있으며, 이는 세륨이 예방적 및 치료적 처치 요법 둘 모두에 있어서 소뇌에서 가장 높게 축적되었음을 나타낸다.
EAE (만성-진행형 증상의 MS)를 발생하도록 유도된 마우스의 소뇌로부터 제조된 뇌 절편에서 반응성 산소 종 (ROS) 수준을 연구하였으며, 상기 절편은 최종 CA/EDTA 나노세리아 주입 (n = 12마리 마우스) 후 1주에 제조하였다. ROS 수준은 문헌 [Estevez, AY; et al., Neuroprotective mechanisms of cerium oxide nanoparticles in a mouse hippocampal brain slice model of ischemia, Free Radic. Biol. Med. (2011)51(6):1155-63 (doi:10.1016/j.radbiomed.2011.06.006)]에 기술된 방법을 이용하여 형광 프로브 CM-DFCDA (Invitrogen)을 사용하여 측정하였다.
마지막 약물 처리 후 7일째에 검사한 경우 대조군 및 핑골리모드 처리된 동물 대비 CA/EDTA 나노세리아 처리된 마우스로부터의 뇌 절편에서 세포내 ROS 수준이 현저하게 감소되었다 (도 25-26).
마이크론 또는 서브마이크론 해상도로 이미지화하는 경우, 살아있는 포유동물의 뇌 유조직으로의 나노세리아의 광범위하고 균일한 분포는 종래에는 보고되지 않았다. 이를 위해, CA/EDTA 나노세리아 처리된 및 비처리된 쌍의 대조군으로부터 취해진 소뇌 절편에서 감소된 ROS 형광 (CM-DFCDA) 수준의 분산되고 균일한 특성 증거는 마우스 뇌 조직 전반에 걸쳐 CA/EDTA 나노세리아 입자의 광범위한 분포를 나타낸다 (도 27). 특히, 나노세리아 처리된 절편에서의 형광 분포 (도 27)는 도 28에서 유사한 배율 등급에서 묘사된 소뇌 미소혈관계의 분포에 상응하지 않으며, 이는 CA/EDTA 나노세리아 입자가 미소혈관에 제한되지 않거나 혈액 뇌 장벽 세포에 포획되지 않으며, 소뇌 조직 전반에 걸쳐 광범위에 분포됨을 나타냄이 주지되었다. 이러한 관찰은, CA/EDTA 나노세리아 입자가 만성-진행형 다발성 경화증 유도된 EAE 마우스의 절충된 혈액 뇌 장벽을 통해 관통하고, 입자가 뇌 조직에 광범위하게 분산되었다는 것과 일관된다.
재발/완화형 다발성 경화증
다발성 경화증의 쥣과 EAE 모델
MS 발병의 많은 병리학적 특징은 쥣과의 실험적 자가면역 뇌수막염 (EAE) 모델에 의해 모델링되며, 여기에서 염증 장애는 미엘린 항원으로의 면역화에 의해 유도된다. EAE 모델은 혈액-뇌-장벽 (BBB) 파괴, 면역 세포의 혈관 주위 침투, 미세아교세포 활성화 및 탈수초를 특징으로 한다. EAE 모델은 MS의 치료에 사용되는 현재 치료법의 개발에 있어서 중요하였다.
암컷 SJL-EAE 마우스를 비히클, 비히클과 CA/EDTA 세리아 나노입자 또는 비히클과 시그마-알드리치 또는 알파 에이사로부터 수득된 시중의 나노세리아로 처리하였다. 시중에서 입수된 나노세리아를 사용 직전 비히클에 분산시키면서 음파처리하였다. 예방적 투약 설계에서, 마우스에 질환 유도 전일 및 질환 유도 당일에 10 mg/kg의 CA/EDTA 세리아 나노입자를 IV 꼬리 정맥에 주입하고, 이어서 질환 유도 후 3, 7, 14 및 21일에 6 mg/kg의 CA/EDTA 세리아 나노입자를 주입하였다. 치료적 투약 설계는 첫 번째 2회의 주입 (질환 유도 전일 및 당일)이 생략되었다는 점을 제외하고는 유사하였다. CA/EDTA 세리아 나노입자를 투여 전 PBS/50 mM 소듐 시트레이트 염수 비히클에서 혼합하였다.
실험적 자가면역 뇌수막염 (EAE) 즉, 재발/완화형 다발성 경화증-유사 증상을 갖는 마우스를 다음과 같이 유도하였다: 인산염 완충된 염수 (PBS) 중에 용해된 200 ㎍ 미엘린 염기성 단백질 펩티드 (PLP139-151)와 혼합된 동일 용적의 완전 프로인트 보조제의 0.1 ml를 정맥내 (IV) 꼬리 주입 후 PBS중 200 ng 백일해 독소의 0.1 ml를 복강내 주입으로 0일 및 2일에 전달하였다.
질환 유도 후, 마우스는 면역화 후 11-14일 (14일에 피크임)에 백일해의 제 1 에피소드를 발생시켰으며, 대부분의 인간 MS 환자와 유사하게, 이들은 약 20일 까지 백일해의 이러한 첫 번째 웨이브로부터 완전히 또는 거의 완전히 회복되었다.
검사는 상기 기술된 바와 같이 소뇌 기능 (평균대), 앞 다리 강도 (행잉 와이어) 및 뒷다리 강도 (로타로드)를 평가하도록 설계된 3가지 운동 성향 검사와 함께 매일의 임상 스코어링 작성을 포함하였다.
질환의 발병과 관련하여, 실질적인 지연 (개선)은 하기 검사에서 관찰되었다: 예방적 및 치료적 투약 설계 둘 모두에 대한 임상 스코어링 결과 (도 29), 예방적 투약 설계에 대한 평균대 결과 (도 30), 및 예방적 및 치료적 투약 설계 둘 모두에 대한 행잉 와이어 결과 (도 31).
비히클 대조군 대비 예방적 및 치료적 투약 설계에 의해 투여된 CA/EDTA 세리아 나노입자의 정량적 (평균) 효과의 통계적 요약은 표 6에 기재되어 있다. 로타로드 검사에 대한 예방적 투약 설계의 경우를 제외하고, 예방적 및 치료적 투약 설계 둘 모두에 대한 임상 스코어링 및 각각의 운동 성향 검사에 있어서 통계적으로 유의한 개선이 관찰되었다.
표 6
Figure 112015003002072-pct00005
재발/완화형 MS 모델에 대한 질환 과정에 걸친 평균 임상 스코어 (AUC)의 비교는 대조군 대비, 단지 CA/EDTA 세리아 나노입자 (CNRx 87)가 질환을 개선시킴을 나타내었다 (도 33). 시그마-알드리치 및 알파 에이사 (1:14 및 1:9 희석) 비교에 대한 결과는 대조군 보다 악화되었거나 차이가 없었다.
재발/완화형 MS 모델에 대한 질환 과정에 걸친 평균 평균대 스코어의 비교는 CA/EDTA 세리아 나노입자 (CNRx 87)가 가장 잘 수행된 반면, 알파 에이사 1:9 희석물을 제외하고는, 대조군 대비 더욱 악화되거나 차이가 없었다 (도 34).
재발/완화형 MS 모델에 대한 질환 과정에 걸친 평균 행잉 와이어 검사 결과의 비교는, 대조군 대비, 단지 CA/EDTA 세리아 나노입자 (CNRx 87)만이 떨어지기 까지의 평균 기간을 증가시킴으로써 질환을 완화시킴을 나타내었다 (도 35). 시그마-알드리치 및 알파 에이사 (1:14 및 1:9 희석) 비교에 대한 결과는 대조군 대비 더욱 악화되었거나 차이가 없었다.
재발/완화형 MS 모델에 대한 질환 과정에 걸친 평균 로타로드 검사 결과의 비교는, 대조군 대비 단지 CA/EDTA 세리아 나노입자(CNRx 87)만이 떨어지기 까지의 평균 시간을 증가시킴으로써 질환을 완화시켰음을 나타내었다 (도 36). 시그마-알드리치 및 알파 에이사 (1:14 및 1:9 희석물) 비교 결과는 대조군 보다 악화되었다.
세륨 뇌 수준 비교
치료적 투약 설계를 이용하여, EAE-유도된 마우스 (n=12)에 CA/EDTA 세리아 나노입자 또는 시중에서 입수가능한 나노세리아 (즉, 시그마-알드리치 및 알파 에이사로부터 획득)를 포함하는 세리아 분산액 (24 mg/kg 전체 투여량)을 꼬리 정맥 주입으로 투여하였다. 마지막 주입 후 24시간째에, 뇌 및 기타 기관을 수집하고, 이러한 기관내의 세리아 농도를 유도 결합 플라즈마 질량 분석법 (ICP-MS)를 이용하여 측정하였다.
도 37에 도시된 뇌 침착 결과는 세륨이 시그마-알드리치 나노세리아에 대한 검출 한계치 미만인 반면, 본 발명의 CNRx 나노세리아 구체예의 뇌에서의 침착은 알파 에이사 물질에 대한 것보다 약 4배 높았음을 나타내었다.
별도의 생물학적 분배 연구에서, 실험적 자가면역 뇌수막염 (EAE) 특징을 갖는 1-3 월령의 4마리의 성체 SJL 마우스에 염수중의 마우스 몸체 질량 kg 당 52 mg의 CA/EDTA 나노세리아 (52mg/kg 용량)를 꼬리 정맥으로 하기 세 시점에서 주입하였다: 0일, 3일 및 7일. 또한, 이러한 마우스중 2 마리에 프로테오지질 단백질 (PLP)를 0일에 주입하여 다발성 경화증 (MS) 유사 증상 (실험적 자가면역 뇌수막염) 발생을 유도하였으며, 7일에 MS-유사 증상이 피크가 됨을 확인하였다. 다른 두 마리 마우스에는 MS-유사 증상이 발생하도록 유도하지 않았으나, 단순히 비히클 대조군으로서 염수를 주입하였다. 8일에 (나노세리아의 마지막 주입 후 24시간), 4마리 마우스 각각을 희생시켰다: 그리고, 이들의 심장, 신장, 간, 폐, 비장, 뇌 및 척수 기관을 제거하고, 냉동시키고 세륨 함량 분석을 위해 제공하였다.
하기 절차에 의해 유도 결합 플라즈마 질량 분광법 (ICP-MS)를 사용하여 대량 세륨 함량에 대해 기관을 분석하였다. 각 기관의 0.1-0.5 g 조직 샘플을 15 ml 폴리프로필렌 튜브에서 1 ml의 최적 HNO3로 분해하고, 마이크로웨이브 분해 오븐에서 30분 동안 105 ℃로 가열하였다. 샘플을 냉각되게 하고, 100 ㎕의 H2O2를 첨가하고, 샘플을 탈이온수로 10 ml 최종 용적으로 희석하였다. 이러한 분해된 샘플을 정상 모드에서 작동한 ICP-MS (7500cx, Agilent, Santa Clara, CA)에 의해 대량 세륨 함량에 대해 분석하였다. 본 장치를 NIST-추적가능한 일차 기준으로 교정하고, 2차 소스 기준을 교정 점검으로서 이용하였다.
하기 표 5는 본 발명의 구체예로서 본원에 기술된 생물학적 분배 연구로 구성된 4마리 마우스 (마우스 1-4로 라벨링됨)에 대한 대량 세륨 함량 결과를 갖는다. 또한, 요켈 (Yokel) 등의 문헌 [Nanotoxicology 3(3), 234-248 (2009)] (여기의 표 I로부터 취해진 데이타) 및 하다스 (Hardas) 등의 문헌 [Toxicological Sciences 116(2), 562-576 (2010)] (여기의 표 2로부터 20-h 종료화에 대해 취해진 데이타)에 보고된 정맥내 투여된 나노세리아의 앞선 전체 동물 (설치류)의 생물학적 분배 연구의 결과를 비교를 위해 포함시켰다.
표 5
Figure 112015003002072-pct00006
본원에 기술된 연구 (마우스 1-4) 및 비교용 또는 더 높은 용량에서 수행한 앞선 연구 (Yokel et al. and Hardas et al.) 간의 대량 세륨 함량의 비교는, 본 발명의 구체예로서 본원에 기술된 2.5 nm 직경 CA/EDTA 세리아 나노입자의 수성 분산액의 주입 결과, 약 30-100배 더 많은 세륨이 뇌와 관련되어 있으며, 약 25-50배 더 많은 세륨이 간과 관련되어 있으며, 약 7배 더 많은 세륨이 비장과 관련되어 있음을 나타내었다. 또한, 다양한 기관과 관련된 세륨의 양에 있어서 놀랄만한 큰 증가가 완전히 온전한 BBB를 지닌 건강한 마우스 (마우스 3-4)뿐만 아니라 실질적으로 절충된 BBB를 갖는 것으로 예상되는 유도된 MS-유사 증상을 갖는 마우스 (마우스 1-2) 둘 모두에서 관찰되었음이 주지된다.
본원에 기술된 연구 (마우스 1-4) 및 비교용 또는 더 많은 용량으로 수행된 앞선 연구 (Yokel et al. and Hardas et al.)에 사용된 생물학적 분배 프로토콜간의 차이는, 본 발명의 본 구체예의 결과로서 다양한 표적 기관과 관련된 세륨의 큰 증가와 비교해 볼 때 일반적으로 매우 적었음이 주지된다. 특히, 요켈 등은 50 mg/kg 용량을 사용하였으며, 최종 주입 후 20시간째에 동물을 종료화시켰다. 하다스 등은 100 mg/kg 용량을 사용하였으며, 또한, 최종 주입 후 20시간째에 동물을 종료화시켰으며, 본원에서 본 발명자들은 52 mg/kg 용량을 사용하였으며, 최종 주입 후 24시간째에 동물을 종료화시켰다.
생물학적-지속성 연구
마지막 CA/EDTA 세리아 나노입자 주입 (24 mg/kg 전체 용량)으로부터 다양한 시점 (1-21일)에서, 재발/완화형 EAE이 유도된 마우스 (n=22)의 뇌를 수집하고, 세륨의 농도를 CPI-MS를 이용하여 측정하였다. 현저한 수준의 세리아는 마지막 주입 후 적어도 3주까지 검출가능하였다 (도 38).
래트에서 수행된 연구로부터, 단일 10 mg/kg 정맥내 주입 또는 단일 50 mg/kg 피하 주입 후, 래트의 혈중 세륨 함량 측정은 CA/EDTA 세리아 나노입자가 혈액 혈장으로부터 신속하게 제거됨을 나타내었다 (도 39).
독성 연구
그린스크린 검정 (GreenScreen assay)(Gentronix Ltd. (UK))에 의해 평가시 CA/EDTA 세리아 나노입자 구체예에 있어서 어떠한 유전독성도 관찰되지 않았다.
포스포리피도시스 (PLD:Phospholipidosis) 검정 (Gentronix Ltd. (UK))에 의해 평가하는 경우, CA/EDTA 세리아 나노입자 구체예에 있어서 어떠한 포스포리피도시스 독성도 관찰되지 않았다.
hERG-450 검정 (Gentronix Ltd. (UK))에 의해 평가하는 경우, CA/EDTA 세리아 나노입자 구체예에 있어서 어떠한 포타슘 채널 간섭도 관찰되지 않았다.
근위축성 측삭 경화증
근위축성 측삭 경화증 (ALS)는 원심성 입력을 제공하는 피질 뉴런 및 척수의 배쪽뿔에 위치한 상위 및 하위 뉴런의 변성에 의해 초래된 진행성의 치명적인 운동 뉴런 질환이다. 본 질병은 1939년 이러한 질환을 갖는 것으로 진단된 야구선수를 따라 루게릭 병으로 종종 불린다. ALS의 원인이 알려지지 않았으나, 가족성 ALS가 강력한 항산화제인 Cu/Zn 수퍼옥사이드 디스무타제 효소 (SOD1)를 생성하는 유전자에서의 변이와 관련된다는 발견은 자유 라디칼의 축적이 관련될 수 있음을 시사한다. 그러나, SOD1 유전자 결핍 마우스는 가족성 ALS를 통례적으로 발생하지 않았으며, 그보다는 이들은 연령-관련 근육 위축 (근육감소증)에서의 증가를 나타내었다.
Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA; 균주 B6SJL-TgSOD1G93A)로부터 수득한 SOD1G93A 마우스에서 매주 임상 및 운동 성향 검사 (상기 기술됨)를 수행하였으며, 질환 발병시 처리군으로 무작위 추출하였다. 한 군의 마우스는 염수 비히클 대조군만 단독 주입된 반면, 나노세리아 처리된 동물에는 주당 1회 또는 2회 16 mg/kg의 CA/EDTA 세리아 나노입자를 꼬리 정맥 주입하였다. 나노세리아 처리된 수컷 G93A 마우스는 모든 운동 기능 검사 (행잉 와이어, 평균대 및 로타로드)에서 매우 실질적인 향상을 나타냈다. 도 40에 도시된 대조군 대비 수명의 연장 또한 CA/EDTA 세리아 나노입자 처리된 수컷 G93A 마우스에서 나타났다.
허혈성 재관류 손상
재관류 손상은 허혈 기간 후 혈액이 조직으로 되돌아 갈 때 발생하는 조직 손상을 지칭한다. 허혈 기간 동안 혈액으로부터 산소 및 영양분의 부재는, 순환의 복구가 정상 대사 기능의 복구보다는 산화 스트레스 유도를 통한 염증 및 산화 손상을 초래하는 질병을 발생시킨다.
염증 반응은 재관류 손상의 상해를 부분적으로 매개하는 것으로 여겨진다. 새로 되돌아가는 혈액에 의해 영역으로 이송되는 백혈구는 인터류킨 및 자유 라디칼을 포함하는 다양한 염증 인자를 방출시킬 수 있다.
쥣과 심허혈성 재관류 손상 확인에서, 마우스에 경정맥을 통해 -4 및 -2일에 20 mg/kg 투여량의 CA/EDTA 세리아 나노입자 또는 비히클을 주입하였다. 0일째에, 심장을 절제하여, 랑겐도르프 시스템에서 관류시켰다. 25 분의 전반적인 비-흐름 허혈 및 45 분 재관류 후 락테이트 데하이드로게나아제 (LDH) 검정에 의해 괴사성 세포 치사를 모니터링하였다. 도 41은 비히클 대조군 대비 CA/EDTA 세리아 나노입자 처리에 대한 LDH 축적 감소 형태에 있어서의 개선을 나타냈다. 심근경색 크기 평가 또한, 20 mg/kg 용량의 CA/EDTA 세리아 나노입자에 의해 보호성 효과가 제공됨을 시사하였다.
본 발명이 다양한 특정 구체예를 참조로 하여 기술되었으나, 기술된 본 발명의 개념의 사상 및 범위 내에서 많은 변화가 이루어질 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 기술된 구체예로 제한하고자 하는 것은 아니나, 청구범위에 의해 규정된 전체 범위를 가질 것이다.

Claims (15)

  1. a. 제1세륨 이온, 몰 비가 3.0 내지 0.1 범위인 시트르산과 에틸렌 디아민테트라아세트산, 산화제 및 물을 포함하는 반응 혼합물을 형성시키고;
    b. 세륨-함유 나노입자 분산액을 분리 없이 직접 형성시키는 것을 포함하는, 나노입자 분산액을 제조하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 세륨-함유 나노입자가 실질적으로 결정질인 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 나노입자가 입방 형석 결정 구조를 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 반응 혼합물을 가열하거나 냉각하여 반응 온도를 물의 비등 온도보다 낮게 유지하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 산화제가 공기, 분자 산소 또는 과산화수소를 포함하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 세륨-함유 나노입자가 실질적으로 비-응집되는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 세륨-함유 나노입자의 95% 초과가 비-응집되는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 세륨-함유 나노입자 분산액의 제타-포텐셜 (zeta-potential)이 -15 mV 내지 -30 mV 범위인 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 분산액이 적어도 2개월 동안 안정한 방법.
  10. 산화 스트레스 관련 질환 또는 산화 스트레스 관련 사건을 예방 또는 치료하기 위한 약제 조성물로서, 제 1항의 방법에 따라 제조된 세륨-함유 나노입자를 포함하는 약제 조성물.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 산화 스트레스 관련 질환 또는 사건이 허혈성 발작, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증 또는 허혈성 재관류 손상인 약제 조성물.
  12. 제 1항의 방법에 따라 제조된 나노입자.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
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Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2861212T3 (en) 2012-06-13 2017-03-06 Cerion Llc Cerium oxide nanoparticles for the treatment of oxidative stress
US9446070B2 (en) * 2012-06-13 2016-09-20 Cerion, Llc Nanoceria with citric acid additive
CA2910212A1 (en) 2013-04-25 2014-10-30 Cerion Enterprises, Llc Chelated nanoceria for the treatment of oxidative stress
US10182994B2 (en) * 2014-06-10 2019-01-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Nanoparticulate complex of nicotine and cerium oxide and use thereof
RU2019133284A (ru) * 2014-07-17 2019-12-05 БайоКьюрити Фармасьютикалз Инк. Лечение рака комбинацией лучевой терапии, наночастиц оксида церия и химиотерапевтического средства
WO2016118592A1 (en) 2015-01-20 2016-07-28 Cerion, Llc Edds chelated nanoceria with catalase-like activity
KR101765557B1 (ko) 2015-02-27 2017-08-23 서울대학교산학협력단 생흡수성 전자 스텐트
US11389536B2 (en) 2015-07-17 2022-07-19 BioCurity Pharmaceuticals Inc. Treatment of cancer with a combination of radiation, cerium oxide nanoparticles, and a chemotherapeutic agent
EP3380088A4 (en) * 2015-11-25 2019-07-31 The Regents of the University of Colorado, A Body Corporate USE OF MICROARN-146A AND A CONJUGATE OF CERIUM OXIDE NANOPARTICLES TO IMPROVE HEALING AND PROMOTE TISSUE REGENERATION
KR20200110321A (ko) 2017-12-19 2020-09-23 나노비오띡스 신경 장애의 치료에서 사용하기 위한 나노입자
MX2020006361A (es) 2017-12-19 2020-08-17 Nanobiotix Nanoparticulas para su uso en la potenciacion del rendimiento cerebral o en el tratamiento del estres.
AU2019347515A1 (en) * 2018-09-28 2021-05-20 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods for preventing and treating pulmonary inflammation and fibrosis
CN111333098B (zh) * 2018-11-30 2022-04-19 中国科学院大连化学物理研究所 二氧化铈纳米立方块的制备方法
CN109806278B (zh) * 2019-02-01 2021-08-10 浙江大学 磷脂聚乙二醇修饰的超小型氧化铈纳米晶的应用
CN109939125B (zh) * 2019-04-22 2021-05-18 南昌大学第二附属医院 一种抗氧化剂及其制备方法与应用
KR102107760B1 (ko) * 2019-08-28 2020-05-07 한국콜마주식회사 피부 장벽 강화, 피부 보습 및/또는 미세 먼지 차단용 세륨옥사이드 분산액 및 이를 포함하는 화장료 조성물
JPWO2021241626A1 (ko) * 2020-05-27 2021-12-02
CN111773243B (zh) * 2020-07-17 2022-09-23 南京大学 炎症性肠病的药物及其制备方法和用途
CN112007016B (zh) * 2020-09-07 2021-07-23 南京大学 一种纳米缓释制剂及其制备方法和在制备治疗线粒体功能障碍疾病的药物中的应用
CN112494513A (zh) * 2020-12-15 2021-03-16 中国药科大学 一种二氧化铈纳米粒及其制备方法与应用
CN112516294B (zh) * 2020-12-22 2023-04-07 浙江大学 一种氧化铈纳米稳定剂在制备预防过敏性疾病药物中的应用及预防过敏性疾病的药物组合物
CN113546093A (zh) * 2021-07-20 2021-10-26 中国人民解放军陆军军医大学 氧化铈纳米颗粒在制备治疗和预防肾缺血再灌注损伤的药物中的应用
CN113842469B (zh) * 2021-08-25 2024-04-02 中国科学院过程工程研究所 一种囊泡表面原位结晶高催化活性铈纳米晶的递药系统及其制备方法和应用
CN114470326B (zh) * 2021-12-06 2022-09-13 中国人民解放军空军军医大学 一种仿生矿化胶原-糖胺聚糖材料制备方法及其应用
CN116270729A (zh) * 2022-11-09 2023-06-23 西安交通大学医学院第一附属医院 多孔纳米棒状氧化铈在制备治疗特应性皮炎的药物中的应用
CN115737678A (zh) * 2022-11-30 2023-03-07 浙江大学金华研究院 载三苯基膦修饰的氧化铈和全反式维甲酸的脂质体凝胶
CN116180065B (zh) * 2022-12-27 2024-10-08 国科大杭州高等研究院 一种表面改性的镍钛合金材料及其制备方法和应用
WO2024154276A1 (ja) * 2023-01-18 2024-07-25 株式会社applause Pharma ３価のセリウムを含むセリウム化合物を有効成分とする医薬組成物
CN116850147B (zh) * 2023-06-05 2024-05-14 中南大学 Ppc纳米颗粒、其制备方法以及在治疗心肌梗死的药物中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002201023A (ja) 2000-12-27 2002-07-16 National Institute For Materials Science ナノセリア粉末の製造方法
JP2003020224A (ja) 2001-07-09 2003-01-24 National Institute For Materials Science 個々の粒子がナノサイズに分離したセリア粉末の製造法
WO2008002323A2 (en) 2005-12-23 2008-01-03 Eastman Kodak Company Production of cerium containing metal oxide grains

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2809637B1 (fr) 2000-06-05 2003-01-24 Rhodia Terres Rares Dispersion colloidale d'un compose de cerium ou d'un compose de cerium et d'au moins un autre element choisi parmi les terres rares et des metaux de transition et comprenant un acide amine
JP3768401B2 (ja) 2000-11-24 2006-04-19 Ｎｅｃエレクトロニクス株式会社 化学的機械的研磨用スラリー
WO2003062372A2 (en) 2001-10-02 2003-07-31 The Regents Of The University Of California Nanoparticle assembled hollow spheres
US7534453B1 (en) 2002-09-05 2009-05-19 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Cerium oxide nanoparticles and use in enhancing cell survivability
KR100486959B1 (ko) * 2003-01-29 2005-05-03 한국화학연구원 나노 크기의 세리아 제조방법
WO2006004787A1 (en) 2004-06-28 2006-01-12 Procyte Corporation Methods and compositions for preventing and treating hyperpigmentation of skin
US20100166821A1 (en) * 2005-06-27 2010-07-01 Edward Via Virginia College Of Osteopathic Medicin Anti-Inflammatory, Radioprotective, and Longevity Enhancing Capabilities of Cerium Oxide Nanoparticles
JP2010502820A (ja) * 2006-09-05 2010-01-28 セリオン テクノロジー， インコーポレーテッド 二酸化セリウムナノ粒子含有燃料添加剤
WO2009012425A2 (en) 2007-07-19 2009-01-22 Logigal Therapeutics, Inc. Compositions including leukotriene antagonists and nsaids and methods of using the same
DE102007062571A1 (de) 2007-12-22 2009-06-25 Evonik Degussa Gmbh Ceroxid und Schichtsilikat enthaltende Dispersion
CN101683999A (zh) * 2008-09-26 2010-03-31 杜小青 纳米二氧化铈制备方法
US8679344B2 (en) 2008-12-17 2014-03-25 Cerion Technology, Inc. Process for solvent shifting a nanoparticle dispersion
KR101605465B1 (ko) * 2008-12-17 2016-03-22 세리온, 엘엘씨 격자 엔지니어링된 이산화세륨 나노입자를 포함하는 연료 첨가제
DK2861212T3 (en) 2012-06-13 2017-03-06 Cerion Llc Cerium oxide nanoparticles for the treatment of oxidative stress

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002201023A (ja) 2000-12-27 2002-07-16 National Institute For Materials Science ナノセリア粉末の製造方法
JP2003020224A (ja) 2001-07-09 2003-01-24 National Institute For Materials Science 個々の粒子がナノサイズに分離したセリア粉末の製造法
WO2008002323A2 (en) 2005-12-23 2008-01-03 Eastman Kodak Company Production of cerium containing metal oxide grains

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Publication number Publication date
IN2014DN10550A (ko) 2015-08-21
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