CN112494513A - 一种二氧化铈纳米粒及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种二氧化铈纳米粒及其制备方法与应用，属于医药技术领域。所述二氧化铈纳米粒包括二氧化铈纳米颗粒，在二氧化铈纳米颗粒表面还修饰有聚合物，所述聚合物选自透明质酸、聚天冬氨酸、葡聚糖或聚谷氨酸。本发明的二氧化铈纳米粒不仅具有良好的的稳定性和优异的生物安全性，还具有抗氧化类酶模拟活性和载药的功能，能够可逆高效消耗体内的各种活性氧（ROS），可单独或负载药物协同治疗动脉粥样硬化（AS），实现药物有效靶向至AS斑块。

Description

一种二氧化铈纳米粒及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种功能性聚合物修饰的二氧化铈纳米粒及其制备方法与应用。
背景技术
目前，心血管疾病已成为重大的公共卫生问题，而动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是当前引起心血管疾病的主要因素之一。AS是指在动脉及其分支的动脉壁内膜下有脂质沉着，同时伴有内膜增厚，形成黄色或灰黄色状如粥样物质的斑块。目前临床上用于治疗 AS 的药物主要分为以下几大类：调节血脂类药物、抗炎类药物、抗氧化类药物、抗血小板和抗凝类药物。其中，他汀类药物由于其较好的降血脂效果在临床上的应用最为广泛。但是，针对 AS 的治疗策略主要是基于全身水平的降脂作用，并无直接作用病灶部位即 AS 斑块内部的治疗策略，如何将药物有效靶向至斑块是 AS 治疗的关键问题。
AS部位具有血管内皮细胞通透性增大的病理特征，因此低密度脂蛋白、免疫细胞很容易进入AS部位。由于AS部位处于持续的慢性炎症和高活性氧（reactive oxygenspecies, ROS）环境，低密度脂蛋白会变成氧化型低密度脂蛋白，氧化型低密度脂蛋白很容易被巨噬细胞和血管平滑肌细胞吞噬，变成泡沫细胞，泡沫细胞很容易凋亡裂解成细胞碎片，从而加剧炎症和氧化应激状态，不断的恶性循环。其次，细胞碎片堆积在纤维帽部位，不加以控制，纤维帽会越变越大，造成组织器官缺血，甚至脱落堵塞血管，形成血栓，引发卒中等更严重的后果。另外，高ROS本身可导致细胞凋亡、对蛋白质和其他生物分子造成氧化损伤危害。目前，AS的氧化学说已得到了广泛流行病学数据的支持，基于此，降低AS部位的ROS、减缓AS部位氧化应激状态可能能够治疗AS。
目前，抗氧化疗法用于治疗AS已有上市药品，如普罗布考片，普罗布考结构式中有两个酚羟基，有很强的抗氧化作用，能够抑制泡沫细胞的形成、斑块的形成，消退已形成的斑块。但是，其也有不足的地方：如降低了高密度脂蛋白的浓度（HDL)、不易进入细胞内发挥抗氧化作用、持续抗氧化能力差、没有相对特异性的作用病灶部位等。基于AS 斑块部位与正常血管在生理病理上存在的显著差异，纳米药物递送系统在 AS 的诊断、治疗方面具有显著优势。
发明内容
本发明的目的是提供一种功能性聚合物修饰的二氧化铈纳米粒及其制备方法与应用，通过采用多羧基或者多羟基聚合物对二氧化铈纳米颗粒进行修饰，使得二氧化铈纳米粒能够靶向动脉粥样硬化的斑块部位，甚至是斑块部位细胞胞内，实现药物有效靶向至AS斑块。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种二氧化铈纳米粒，包括二氧化铈纳米颗粒，在二氧化铈纳米颗粒表面修饰有聚合物；
所述聚合物选自透明质酸、聚天冬氨酸、葡聚糖或聚谷氨酸；
所述二氧化铈纳米颗粒的粒径为1～50 nm；所述二氧化铈纳米粒的水合粒径为8～100 nm。
所述聚合物通过氢键和/或络合作用修饰在二氧化铈纳米颗粒表面。本发明的二氧化铈纳米粒具有超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶模拟活性，能够可逆消耗H2O2、O2 .-、•OH等ROS。
上述二氧化铈纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将三价铈盐和聚合物分别溶于水中，然后将聚合物溶液和三价铈盐溶液混合均匀，得到混合溶液；
步骤2，将混合溶液滴加至剧烈搅拌状态下的碱溶液中，反应混合液在10～95 ℃条件下剧烈搅拌反应1～48 h，得到反应液；
步骤3，将所述反应液离心去除大颗粒，透析纯化去除未反应原料，得到纳米粒。
进一步地，步骤1中，所述三价铈盐为硝酸铈或醋酸铈，混合溶液中铈离子与聚合物的质量比为1：2～1：20。
进一步地，所述混合溶液中，Ce3+的浓度为10～30 mg/mL。
进一步地，步骤2中剧烈搅拌的搅拌速度为1000～1500 r/min。
进一步地，步骤2中，反应混合液中碱的质量浓度为5%～15%、Ce3+的浓度为5-20mg/mL；所述碱为NH4OH、KOH或NaOH。
上述二氧化铈纳米粒在制备动脉粥样硬化治疗药物中的应用。
一种动脉粥样硬化的治疗药物，由上述二氧化铈纳米粒负载抗动脉粥样硬化药物制成，所述抗动脉粥样硬化药物选自阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、匹伐他汀、非诺贝特、普罗布考、考来烯胺或氯贝丁酯。所述抗动脉粥样硬化药物可通过酰胺键或酯键与聚合物连接或者吸附分散在聚合物分子层中。
本发明提供的二氧化铈纳米粒粒径小，具有模拟过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶的活性，能够以超强活性可逆清除过氧化氢、过氧化物、超氧化物、羟基自由基等活性氧；其稳定性良好、生物安全性好；其表面修饰的聚合物具有多种活性基团能够修饰各种药物，也可以将药物依附分散在聚合物分子层中；有望应用于各种氧化应激疾病，或者载药实现药物和抗氧化协同治疗各种氧化应激疾病。
本发明提供了用于治疗动脉粥样硬化的功能性多羧基或者多羟基聚合物修饰的二氧化铈纳米粒，目前研究认为动脉粥样硬化进程与其高活性氧环境密切相关，功能性多羧基或者多羟基聚合物修饰的二氧化铈纳米粒具有优异的清除活性氧能力，而且是可逆的持续清除活性氧，并且能够靶向动脉粥样硬化部位，靶向胞内，清除细胞内部的ROS，一定程度的治疗动脉粥样硬化，还可以载药协同治疗动脉粥样硬化。
附图说明
图1为二氧化铈纳米粒的粒径分布图；其中图1a为HA-CeO2 NP的粒径分布图，图1b为Dex-CeO2 NP的粒径分布图，图1c为PASP-CeO2 NP的粒径分布图。
图2为二氧化铈纳米粒的透射电镜图；其中图2a为HA-CeO2 NP的透射电镜图，图2b为Dex-CeO2 NP的透射电镜图，图2c为PASP-CeO2 NP的透射电镜图。
图3为二氧化铈纳米粒的粉末X射线衍射图谱。
图4为二氧化铈纳米粒的超氧化物歧化酶模拟结果图。
图5为添加二氧化铈纳米粒前后溶液中的羟基自由基的ESR光谱图。
图6为二氧化铈纳米粒的血清稳定性结果。
图7为二氧化铈纳米粒的溶血实验结果。
图8为二氧化铈纳米粒的细胞毒性结果。
图9为RAW264.7细胞对二氧化铈纳米粒的细胞摄取结果。
图10为二氧化铈纳米粒对RAW264.7细胞内部ROS消耗的流式细胞仪定量结果。
图11为二氧化铈纳米粒对apoE−/−AS模型鼠动脉斑块位置靶向性荧光定量结果图。
图12为二氧化铈纳米粒对AS的治疗后斑块面积定量图。
具体实施方式
纳米尺寸的二氧化铈纳米颗粒表面会有氧空位的形成，这导致Ce3+和Ce4+在晶格上共存。Ce4+负责消除超氧阴离子（O2 .-）和羟基自由基（•OH），Ce3+可消除过氧化氢（H2O2），由于晶格结构的记忆功能，二氧化铈纳米粒很容易与其他离子进行电子交换，恢复其氧化还原活性。所以二氧化铈纳米粒也被叫做二氧化铈纳米酶，特别是尺寸小于5nm的二氧化铈纳米颗粒，具有超强的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性。近几年有大量文章报道其对帕金森、缺血性脑卒中、脑内出血、神经保护、阿尔茨海默氏病、肝脏缺血再灌注、风湿性关节炎、抗菌、自身免疫性退行性疾病有治疗效果。在2017和2019年，欧洲航天局还分别在细胞水平上证实了二氧化铈纳米粒在太空中能够保护细胞，延缓衰老、削弱微重力引起的氧化应激的不利影响。但是，在AS治疗领域却鲜有报道。
基于二氧化铈纳米酶能够持续可逆高效的消耗ROS的特性以及AS的病理特征，本发明设计并合成特异性的有机材料修饰的二氧化铈纳米粒，如透明质酸、葡聚糖、聚天冬氨酸修饰的二氧化铈纳米粒，其中透明质酸、葡聚糖有靶向AS部位的功能，能够将二氧化铈纳米酶特异性的递送至AS部位以及AS部位细胞的胞内，为治疗AS提供一种新策略。
本发明一方面提供了一种功能性多羧基或者多羟基聚合物修饰的二氧化铈纳米粒，所述功能性多羧基或者多羟基聚合物包括但不限于透明质酸（HA）、聚天冬氨酸（PASP）、聚谷氨酸（PGA）和葡聚糖（Dex）。在本发明的实施例中，以透明质酸（HA）、聚天冬氨酸（PASP）、葡聚糖（Dex）修饰的二氧化铈纳米粒为例来说明二氧化铈纳米粒的制备方法、性能和对动脉粥样硬化的治疗效果，但不能理解为对本发明技术方案的限制。
本发明另一方面提供了功能性多羧基或者多羟基聚合物修饰的二氧化铈纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将三价铈盐和聚合物分别溶于水中，然后将聚合物溶液和三价铈盐溶液混合均匀，得到混合溶液；
步骤2，将混合溶液滴加至剧烈搅拌状态下的碱溶液中，10～95 ℃条件下剧烈搅拌反应1～48 h，得到反应液；
步骤3，将所述反应液离心去除大颗粒，透析纯化去除未反应原料，得到纳米粒。
在本发明中，反应温度优选为25~85 ℃，反应时间优选为2-24 h，所述反应过程中，功能性多羧基或者多羟基聚合物与铈离子通过氢键和络合作用形成前驱复合物，在碱性条件下发生水解反应生成Ce(OH)n(n<4)，然后在水热条件下分解原位形成功能性多羧基或者多羟基聚合物修饰的二氧化铈纳米粒。
在本发明中，所述三价铈盐优选硝酸铈、醋酸铈等。铈离子质量与聚合物的质量比优选为1：4～1：10。所述混合溶液中，Ce3+的浓度优选为15～25 mg/mL。最终的反应混合溶液中碱的最终质量浓度优选为8%～12%、Ce3+的浓度优选为8-15 mg/mL。所述碱包括强碱，所述强碱包括NH4OH和/或KOH和/或NaOH。本发明对所述三价铈盐、功能性多羧基或者多羟基聚合物、碱的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的药品来源即可。
在本发明中，采用马尔文激光粒度分析仪测定所述二氧化铈纳米粒的水合粒径，通过高分辨率透射电子显微镜测定所述二氧化铈纳米粒的形貌特征，测得水合粒径为5～200 nm，多分散性指数(PDI)小于0.2，分布较为均匀（图1）。电镜下看到的纳米粒子核心粒径为1～100 nm（图2）。
在本发明中，通过X射线粉末衍射证明了所述二氧化铈纳米粒具有二氧化铈典型的晶体形态（图3）。
在本发明中，测定了所述二氧化铈纳米粒的超氧化物歧化酶（SOD）模拟活性，表明其具有良好的SOD活性（图4）。
在本发明中，通过电子自旋共振光谱(ESR)表明所述二氧化铈纳米粒具有优异的消耗羟基自由基（•OH）的能力（图5）。
在本发明中，通过血清稳定性实验、溶血实验、MTT实验表明所述二氧化铈纳米粒稳定性良好、安全无毒（图6、7、8）。
在本发明中，通过细胞摄取实验证明了透明质酸修饰的二氧化铈纳米粒更容易被RAW264.7细胞摄取、葡聚糖修饰的二氧化铈纳米粒其次、聚天冬氨酸修饰的二氧化铈纳米粒最不容易被摄取，容易被摄取为清除胞内ROS的基础，可能能够更好的治疗AS（图9）。
在本发明中，通过对RAW264.7细胞内部ROS的量定量分析表明，所述二氧化铈纳米粒能够不同程度降低细胞内的ROS（图10）。
在本发明中，对所述二氧化铈纳米粒进行荧光标记，对造好动脉粥样硬化模型的ApoE-/-小鼠静脉注射荧光标记的二氧化铈纳米粒，通过对主动脉活体成像和荧光定量分析表明所述二氧化铈纳米粒能够不同程度的靶向于动脉粥样硬化斑块部位（图11）。
在本发明中，对造好动脉粥样硬化模型的ApoE-/-小鼠尾静脉注射所述二氧化铈纳米粒，治疗2个月、一周给药两次，通过对主动脉斑块进行油红O染色、Image Pro Plus 6.0软件对斑块面积定量分析，表明所述二氧化铈纳米粒相比生理盐水组能够不同程度的减少斑块面积，其对AS有一个治疗效果（图12）。
实施例1
制备透明质酸修饰的二氧化铈纳米粒（HA-CeO2NP）
称取六水合硝酸铈（III）0.545 g溶在3 mL水中、称取透明质酸钠(HA，MW=8000）3g溶于7mL 超纯水中，将HA溶液逐滴加入硝酸铈溶液中，1000 r/min搅拌5 min，得到混合溶液，将混合溶液逐滴加入1500 r/min搅拌状态下的8.0 mL氢氧化铵溶液中（30%），并在40℃油浴条件下搅拌24 h，24 h过后，溶液已变为澄清的深棕色，表明形成了稳定的HA包覆的纳米粒，将溶液以6000 rpm的速度离心2个30 min的循环，以沉降所有大团聚物。最后，通过使用截留分子量为5万的耐碱透析袋在超纯水中透析72 h，每隔12 h换一次透析液，冻干，得到透明质酸修饰的二氧化铈纳米粒。
实施例2
制备葡聚糖修饰的二氧化铈纳米粒（Dex-CeO2NP）
称取六水合硝酸铈（III）0.545 g溶在3 mL水中、称取葡聚糖(Dex，MW=10000）3 g溶于7 mL 超纯水中，将Dex溶液逐滴加入硝酸铈溶液中，1000 r/min搅拌5 min，得到混合溶液，将混合溶液逐滴加入1500 r/min搅拌状态下的8.0 mL氢氧化铵溶液中（30%），并在25℃油浴条件下搅拌24 h，24 h过后，此时溶液已变为澄清的深棕色，表明形成了稳定的Dex包覆的纳米粒，将溶液以6000 rpm的速度离心2个30 min的循环，以沉降所有大团聚物。最后，通过使用截留分子量为5万的耐碱透析袋在超纯水中透析72 h，每隔12 h换一次透析液，冻干，得到葡聚糖修饰的二氧化铈纳米递送系统。
实施例3
制备聚天冬氨酸修饰的二氧化铈纳米粒（PASP-CeO2NP）
称取六水合硝酸铈（III）0.545 g溶在3 mL水中、称取聚天冬氨酸(PASP，MW=10000）3 g溶于7 mL 超纯水中，将PASP溶液逐滴加入硝酸铈溶液中，1000 r/min搅拌5min，得到混合溶液，将混合溶液逐滴加入1500 r/min搅拌状态下的8.0 mL氢氧化铵溶液中（30%），并在40 ℃油浴条件下搅拌24 h，3 h过后，此时溶液已变为澄清的深棕色，表明形成了稳定的PASP包覆的纳米粒，将溶液以6000 rpm的速度离心2个30 min的循环，以沉降所有大团聚物。最后，通过使用截留分子量为5万的耐碱透析袋在超纯水中透析72 h，每隔12 h换一次透析液，冻干，得到聚天冬氨酸修饰的二氧化铈纳米递送系统。
下面对实施例1-3制得的二氧化铈纳米粒进行理化表征测试及活性测试。
1、纳米粒的水合粒径以及形貌表征
将制备得到的二氧化铈纳米粒溶液约2 mL加入比色皿，放入样品池中，使用激光粒度分析仪测定样品的粒径分布。
将制备得到的二氧化铈纳米粒溶液适量滴于附有碳膜的铜网上，静置3分钟，用滤纸吸去多余液体，重复上述操作三次，置于红外灯下干燥，使用高分辨透射电子显微镜观察二氧化铈纳米粒形态。
如图1、图2所示，所合成的透明质酸、葡聚糖、聚天冬氨酸修饰的二氧化铈纳米粒粒径大小分别为24.5 nm、20.5 nm、19 nm，透射电镜下纳米粒核心均小于5 nm，保证了其高模拟酶活性。
2、纳米粒的X射线粉末衍射表征
将制备得到的二氧化铈纳米粒溶液冻干后，用玛瑙研钵研成细粉，采用X射线衍射仪在10到80度下扫描分析晶型，结果如图3所示。
3、纳米粒的超氧化物歧化酶（SOD）模拟酶活性测定
用SOD分析试剂盒测定，在2-(4-碘代苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二硫代苯基)-2H-四唑鎓单钠盐（WST-1）溶液（600 uL）中，将功能性多羧基或者多羟基聚合物修饰的二氧化铈纳米粒稀释至不同浓度（0、0.05、0.1、0.2、0.4和0.8 mM [Ce] ）。将稀释好的纳米粒溶液转移200 ul到96孔板孔中，每个浓度平行三份，向每个孔中加入黄嘌呤氧化酶（20uL）后，将96孔板在37℃孵育20分钟。测量每个孔在450 nm处的吸光度，以评估超氧化物歧化酶模拟活性。50U/mL的超氧化物歧化酶被定义为将WST-1的还原反应抑制50%的超氧化物歧化酶的量，结果如图4所示。
4、纳米粒添加前后溶液中的羟基自由基的ESR光谱图测定
电子自旋共振（ESR）检测：Fenton反应（70 μL 0.735 mM FeSO4和25 μL 0.315 mMH2O2）产生羟基自由基。选择DMPO作为ESR谱仪中的自旋捕捉剂（5μL，98%），研究二氧化铈纳米粒（100μL，200ppm）对羟基自由基的清除作用。DMPO-•OH加合物的ESR谱相对峰值强度的变化表明二氧化铈纳米粒的清除羟基自由基的能力大小，峰的强度减少的越大表明清除羟基自由基的能力越强，结果如图5所示。
5、纳米粒血清稳定性、溶血率测定、细胞毒性实验
将二氧化铈纳米粒溶于含10%血清的PBS溶液中孵育不同时间用激光粒度仪去测纳米粒子的水合粒径。将不同浓度的二氧化铈纳米粒与2%的血细胞孵育3 h，溶液以1500rpm 离心15 mins，取上清液使用紫外分光光度计于570 nm 处检测吸光度值，计算溶血率。将不同浓度的功能性多羧基或者多羟基聚合物修饰的二氧化铈纳米粒与L02细胞孵育48h，用MTT法测定细胞活力，验证功能性多羧基或者多羟基聚合物修饰的二氧化铈纳米粒的安全性，结果如图6、图7、图8所示。
6、巨噬细胞对二氧化铈纳米粒的摄取性能考察
用60 ppm的功能性多羧基或者多羟基聚合物修饰的二氧化铈纳米粒与用细胞因子极化的巨噬细胞分别孵育1 h、12 h、24 h，每组平行三份，孵育设定时间后，弃去上层液体，用PBS清洗三遍，用王水把细胞消解下来，用微波消解仪消解细胞溶液，用ICP-MS定量测定每个孔中Ce的含量，结果如图9所示。
7、二氧化铈纳米粒对RAW264.7细胞内部ROS消耗能力实验
取对数生长期的RAW264.7细胞以5×105个/孔细胞接种于6孔培养板中，每孔加样2 mL，37℃、5% CO2培养至细胞贴壁后，弃去培养基，加入含LPS、TFN-γ的培养基极化细胞12 h，之后用含或不含不同浓度二氧化铈纳米粒培养基孵育细胞12 h，弃去培养基后加入10 μM的DCFH-DA溶液1 mL，37℃避光孵育20 min，收集细胞，用PBS清洗3次，采用流式细胞仪检测各组荧光强度（激发波长488 nm，发射波长525 nm），荧光强度越强表明细胞内部ROS越多，结果如图10所示。
8、动物实验
动脉粥样硬化造模采用载脂蛋白E基因缺陷小鼠（ApoE-/-）喂食高脂饲料三个月的方法，三个月后解剖鼠，取主动脉油红O染色拍照，并用Image Pro Plus 6.0对斑块面积进行定量，表明AS的造模成功。用模型鼠研究了DiR负载的二氧化铈纳米粒在模型鼠斑块部位的积累量，通过活体成像仪拍照成像，Living Image对斑块部位的荧光强度定量，验证二氧化铈纳米粒对AS部位的靶向性。另外，用二氧化铈纳米粒治疗模型鼠2个月，每周给药两次，给药剂量为1 mg/kg，治疗结束后，眼眶取血处死，解剖获得整体主动脉，清除血管外面的多余脂肪和结缔组织，用PBS清洗干净，于4%多聚甲醛中固定12 h以后，再纵向剖开，主动脉经70%乙醇中侵泡2 min后进行油红O染色30 min，70%乙醇漂洗至组织发白，经蒸馏水清洗数次后拍照，并用Image Pro Plus 6.0软件对斑块面积定量分析，验证二氧化铈纳米粒对AS的治疗效果，结果如图11、图12所示。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种二氧化铈纳米粒，其特征在于：包括二氧化铈纳米颗粒，在二氧化铈纳米颗粒表面修饰有聚合物；
所述聚合物选自透明质酸、聚天冬氨酸、葡聚糖或聚谷氨酸；
所述二氧化铈纳米颗粒的粒径为1～50 nm；所述二氧化铈纳米粒的水合粒径为8～100nm。
2.权利要求1所述的二氧化铈纳米粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，将三价铈盐和聚合物分别溶于水中，然后将聚合物溶液和三价铈盐溶液混合均匀，得到混合溶液；
步骤2，将混合溶液滴加至剧烈搅拌状态下的碱溶液中，反应混合液在10～95 ℃条件下剧烈搅拌反应1～48 h，得到反应液；
步骤3，将所述反应液离心去除大颗粒，透析纯化去除未反应原料，得到纳米粒。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1中，所述三价铈盐为硝酸铈或醋酸铈，混合溶液中铈离子与聚合物的质量比为1：2～1：20。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤1中，所述混合溶液中Ce3+的浓度为10～30 mg/mL。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤2中剧烈搅拌的搅拌速度为1000～1500 r/min。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤2中，反应混合液中碱的质量浓度为5%～15%、Ce3+的浓度为5-20 mg/mL；所述碱为NH4OH、KOH或NaOH。
7.权利要求1所述的二氧化铈纳米粒在制备动脉粥样硬化治疗药物中的应用。
8.一种动脉粥样硬化的治疗药物，由权利要求1所述的二氧化铈纳米粒负载抗动脉粥样硬化药物制成；
所述抗动脉粥样硬化药物选自阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、匹伐他汀、非诺贝特、普罗布考、考来烯胺或氯贝丁酯。
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