JP2015525228A - 酸化ストレスの処置のためのナノセリア - Google Patents
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Abstract
Description
本特許出願は、2012年6月13日に出願された仮特許出願第61/689,806号(多発性硬化症の処置のためのナノセリア)、2012年6月18日に出願された仮特許出願第61/690,100号(多発性硬化症の予防及び処置のためのナノセリア)、2012年10月12日に出願された仮特許出願第61/795,241号(多発性硬化症のモデルにおけるナノセリアの生物学的効果)、及び2012年11月16日に出願された仮特許出願第61/796,639号(酸化ストレスの低下のためのナノセリア)に対する優先権を主張するものであり、これらの開示は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
ナノ粒子の光散乱及びサイズ評価
ニートの溶媒の試料からの散乱の量と比べた、赤のレーザーペンライトで照射したときに分散体によって示されるチンダル(Tyndell)散乱の程度を評価することによって、粒子分散体の簡単な定性的特徴付けを行った。石英キュベットを備えたBrookhaven 90Plus Particle Size Analyzer(Brookhaven Instruments Corp.,Holtzville,New York,U.S.A.)を用いた動的光散乱(DLS)によって、ナノ粒子分散体の粒子サイズの定量的評価を行った。報告されるDLSサイズは、対数正規数加重パラメータである。
Malvern Instruments製のZetasizer Nano ZSを用いてゼータ電位を測定することによって、ナノ粒子電荷の定量的評価を行った。
磁気撹拌棒を含む800mlのガラスビーカーに、500mlの高純度(HP)水を入れた。その後、水を約70℃に加熱し、そこに、2.41gmのクエン酸(CA)及び4.27gmのエチレンジアミン四酢酸、二ナトリウム塩(EDTA)を溶解させた。水酸化アンモニウム(28〜30%)を添加して、溶液のpHを約8.5に調整した。反応容器の温度を約80℃に上昇させ、磁気撹拌棒を、5000rpmで操作されるSilverson(登録商標)L4RT高剪断ミキサーに取り替えた。10.0gmの分量のCe(NO3)3・6(H2O)を30mlのHP水に溶解させ、この溶液を撹拌反応混合物に数分間かけてゆっくりと添加した。少量の濃NH4OH溶液の添加によって、反応pHを約8.5に維持した。その後、4.8mlの50%H2O2(3.0のモル比のH2O2対セリウム)を含む50mlの溶液を、3価セリウムイオン、クエン酸、EDTA反応混合物に、数分間かけてゆっくりと添加した。反応生成物に蓋をし、その後、さらに1時間加熱すると、透明な黄色/オレンジ色の懸濁液が生じた。撹拌しながら冷却した後、直接形成されたナノ粒子分散体を透析濾過によって約10mS/cm未満のイオン伝導度(ion conductive)にまで洗浄して、余分な塩を除去した。生成物分散体のpHは、約7.2であった。
虚血性脳卒中
虚血性脳卒中のマウス海馬脳スライスモデル
酸化ストレスを低下させるナノセリアの能力を、Estevez,AY;ら、虚血のマウス海馬脳スライスモデルにおける酸化セリウムナノ粒子の神経保護メカニズム(Neuroprotective mechanisms of cerium oxide nanoparticle in a mouse hippocampal brain slice model of ischemia)、Free Radic.Biol.Med.(2011)51(6):1155−63(doi:10.1016/j.radbiomed.2011.06.006)によって記載された虚血のインビトロマウス海馬脳スライスモデルの改良法で評価した。
[CAの比]*[CAの温存%]+[EDTAの比]*[EDTAの温存%]
(式中、所与の安定剤の比は、存在する全安定剤のモル比である)によって与えられる。表1に示す結果について、CAの温存%は15.5%であり、EDTAの温存%は1.8%である。この式の値(予測温存パーセント)は、上の表1で、温存結果及び予測(%)という見出しの付いた欄に一覧化されている。
多発性硬化症(MS)は、全世界で200万人を超える人々に影響を及ぼす中枢神経系(CNS)の疾患である。MSは、一部は、神経細胞を取り囲むミエリン鞘の変性、及び最後には、酸化ストレスによるニューロン細胞死に至る免疫媒介性炎症性疾患と長い間考えられている。再発/寛解と呼ばれる、最も一般的な疾患経過は、神経及び運動機能悪化の明確に定義された発作と、それに続く、疾患活動性の新たな兆候のない相対的静穏(寛解)の期間を特徴とする。あまり一般的でない疾患経過は、慢性進行性MSと呼ばれ、最初のMS症状の後、寛解することなく、臨床的な神経損傷が着実に進行することを特徴とする。患者の約20%しか最初に慢性進行性MSと診断されないが、再発/寛解MSと最初に診断されたものの約半数は、10年経過する毎に、慢性進行性形態へと進行する。
MSのマウスEAEモデル
MSの開始の病理学的特徴の多くは、マウス実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルによってモデル化されており、このモデルにおいて、炎症性障害は、ミエリン抗原による免疫によって誘導される。EAEモデルは、血液脳関門(BBB)崩壊、免疫細胞の血管周囲性浸潤、ミクログリア活性化、及び脱髄を特徴とする。EAEモデルは、MSの処置で使用される現在の療法の開発において極めて重要である。
EAEマウスにおける多発性硬化症様症状の疾患進行を、下の表3に示すような、Selvarajら(2008)から改変した臨床基準を用いて、毎日スコア化した。
ハンギングワイヤー試験
ハンギングワイヤー課題を用いて、握力を評価した。この課題のために、鋼線グリッド床を備えた無蓋のプレキシガラス製の箱の中に、マウスを入れた。この箱をテーブルトップから60cmの高さの所でひっくり返し、落下するまでの潜伏時間を測定した。
ロータロッド装置(Med Associates,St.Albans,VT)を用いて、主に後肢運動協調性及び持続時間を評価した。マウスを28rpmで回転するドラムの上に置き、ドラムから落下するまでの潜伏時間(300秒、最大)を測定した。
この課題のために、マウスを高架木製ビームの照明末端に置き、目標の箱に到達するまで最大60秒与えた。5段階評価(5=正常な足取り〜0=すぐにビームから落ちる)を用いて、バランス及び足取りの質をスコア化した。足取りの質を下記の基準に従って更に格付けした。
多発性硬化症のマウスEAEモデル
MSの開始の病理学的特徴の多くは、マウス実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルによってモデル化されており、このモデルにおいて、炎症性障害は、ミエリン抗原による免疫によって誘導される。EAEモデルは、血液脳関門(BBB)崩壊、免疫細胞の血管周囲性浸潤、ミクログリア活性化、及び脱髄を特徴とする。EAEモデルは、MSの処置で使用される現在の療法の開発において極めて重要である。
治療的投与設計を用いて、EAE誘導マウス(n=12)に、CA/EDTAセリアナノ粒子又は市販のナノセリア(すなわち、Sigma−Aldrich及びAlfa Aesarから入手されたもの)を含むセリア分散体(24mg/kg全投与量)の尾静脈注射を投与した。最後の注射から24時間後、脳及び他の器官を回収し、誘導結合プラズマ質量分析(ICP−MS)を用いて、これらの器官におけるセリアの濃度を決定した。
最後のCA/EDTAセリアナノ粒子注射(24mg/kg全投与量)からの様々な時点(1〜21日)で、再発/寛解型のEAEを誘導したマウスの脳(n=22)を回収し、ICP−MSを用いて、セリウムの濃度を決定した。相当なレベルのセリアが、最後の注射の少なくとも3週間後まで検出可能であった(図38)。
Gentronix Ltd.(UK)のGreenScreenアッセイで評価したとき、CA/EDATセリアナノ粒子実施形態について、遺伝毒性は認められなかった。
筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、脊髄前角に位置する上位及び下位ニューロン並びにそれらの遠心性入力をもたらす皮質ニューロンの変性によって引き起こされる進行性、致死性の運動ニューロン疾患である。この疾病は、1939年にこの疾患と診断された野球選手に因んで、ルーゲーリック病と呼ばれることが多い。
再灌流傷害とは、虚血期間の後、血液供給が組織に戻るときに起こる組織損傷を指す。虚血期間中の血液からの酸素及び栄養素の欠如は、循環の回復によって、正常な代謝機能の回復ではなく、酸化ストレスの誘導による炎症及び酸化的損傷がもたらされる状態を生じさせる。
Claims (15)
- ナノ粒子の分散体を作製する方法であって、
3価セリウムイオン、約3.0〜約0.1の範囲のモル比のクエン酸及びエチレンジアミン四酢酸、酸化剤、並びに水を含む反応混合物を形成させる工程、及び
単離することなく、セリウム含有ナノ粒子の分散体を直接形成させる工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記セリウム含有ナノ粒子が、実質的に結晶性である、請求項1に記載の方法。
- 前記ナノ粒子が、立方蛍石結晶構造を特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 前記反応混合物を加熱又は冷却して、反応温度を水の沸点未満に維持する工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記酸化剤が、大気、分子酸素、又は過酸化水素を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記セリウム含有ナノ粒子が、実質的に非凝集性である、請求項1に記載の方法。
- 前記セリウム含有ナノ粒子の約95%超が、非凝集性である、請求項6に記載の方法。
- 前記セリウム含有ナノ粒子の分散体が、約−15mV〜約−30mVの範囲のゼータ電位を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記分散体が、少なくとも2カ月間安定である、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法によって調製されたセリウム含有ナノ粒子を含むことを特徴とする医薬組成物。
- 酸化ストレス関連疾患又は酸化ストレス関連事象を予防するために患者を予防的に処置する方法であって、
請求項1に記載の方法によって作製されるセリウム含有ナノ粒子の分散体の有効量を含む医薬組成物を投与することを特徴とする方法。 - 前記酸化ストレス関連疾患又は事象が、虚血性脳卒中、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、又は虚血再灌流傷害である、請求項11に記載の方法。
- 患者における酸化ストレス関連疾患又は酸化ストレス関連事象の症状を処置する方法であって、
請求項1に記載の方法によって作製されたセリウム含有ナノ粒子の分散体の有効量を含む医薬組成物を投与することを特徴とする方法。 - 前記酸化ストレス関連疾患又は事象が、虚血性脳卒中、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、又は虚血再灌流傷害である、請求項13に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法によって作製されたことを特徴とするナノ粒子。
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