CN104800232A

CN104800232A - 促进红细胞生成的化合物和方法

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Publication number: CN104800232A
Application number: CN201510171082.0A
Authority: CN
Inventors: 吴荣灿
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2008-12-24
Filing date: 2009-12-21
Publication date: 2015-07-29
Anticipated expiration: 2029-12-21
Also published as: HK1161543A1; CN102316873B; WO2010075263A2; CA2747996A1; US20130316967A1; EP2893930A2; CA2867277C; US20100160243A1; CA2867277A1; EP3628321A1; JP5856659B2; TWI386213B; JP2015007085A; CN102316873A; US20160106769A1; TW201023861A; EP2893930B1; WO2010075263A3; EP2381948B1; EP2893930A3

Abstract

本发明涉及促进红细胞生成的化合物和方法。所述化合物包含以下显示的式(I)的化学结构，其中R是糖基。除了具有红细胞生成作用之外，式(I)的化合物在促进红细胞生成素形成、增加肾功能以及肝细胞生长因子的表达方面有效。所述方法包括对需要其的主体给予有效量的式(I)化合物，因而促进红细胞生成。

Description

促进红细胞生成的化合物和方法

本申请是申请号为200980156609.5，申请日为2009年12月21日，发明名称为“促进红细胞生成的化合物和方法”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明总体上涉及红细胞生成，并且更特别地关于促进红细胞生成。

背景技术

慢性肾病(CKD)是一个全球公共卫生问题，其会造成肾衰竭、心血管疾病以及过早死亡(Levey，2005)。具有CKD的患者处于发展为晚期肾病的高风险，并且需要洗肾或换肾以维持长期存活。贫血，CKD的早期症状，其由肾脏的体内红细胞生成素(Epo)产生不足造成(Zarzecki等人，2004)。除了CKD，贫血也与其它疾病有关，例如癌症、急性与慢性感染、自体免疫、发炎以及固态器官移植后的慢性排斥(Weiss和Goodnough，2005)。

Epo是主要在成人肾脏与胎儿肝脏生成的糖蛋白激素。Epo通过与细胞表面的红细胞生成素受体(Epo受体)结合发挥作用。当细胞感受到相对低的氧气水平时(例如低氧症)，产生并释放Epo以调节红细胞系细胞的增生、分化、成熟与存活(Moritz等人，1997和Fisher，2003)。血流中异常的Epo水平可以是骨髓与肾疾病的指标。已经在具有CKD、真性红细胞增多症和化学治疗诱发贫血的患者中看到了相对低的Epo水平。在继发性红细胞增多症与肾癌患者中已经看到相对高的Epo水平(Eckardt和Kurtz，2005以及Hodges等人，2007)。

除了在肾脏与肝脏组织生成，在非红细胞系组织与器官，包括脑、眼睛、心脏、肺、胆、胰脏、肌肉、子宫和生殖腺已经发现Epo和其受体(Eckardt和Kurtz，1992)。Epo-Epo受体信号传导有助于创伤愈合应答、血管新生和局部组织保护功能，例如神经保护、心血管保护和免受组织局部缺血与缺血/再灌注损伤的保护(Paschos等人，2008和Arcasoy，2008)。已经报道Epo通过减少肾功能障碍程度和促进顺铂诱导的急性肾衰竭的恢复具有肾脏保护作用(Sepodes等人，2006和Arcasoy，2008)。

国家肾脏基金肾病结果质量初始指南(National Kidney FoundationKidney Disease Outcomes Quality Initiative guidelines)建议用红细胞生成刺激剂(ESA)治疗具有治疗应答性贫血的患者中的CKD的贫血。重组的人类Epo(rHuEpo)已经被批准用于治疗CKD的贫血、接受化学治疗的癌症患者的贫血，以用于减少手术过程中的输血需求，以及用于治疗被人类免疫缺陷病毒感染且接受齐多夫定(zidovudine)治疗的患者中的贫血。从Epo设计的具有更长的血浆半衰期的新型红细胞生成刺激蛋白(NESP)已经被批准用于治疗慢性肾病衰竭的贫血(Fisher，2003)。已经建议每周一次以上静脉注射(i.v.)或皮下(s.c)注射这些ESA以维持治疗。非常担心的是疼痛、经常注射的不方便、以及由于与rHuEpo相关的天然抗原性的抗Epo抗体的发展(Bunn，2007)。此外，ESA在具有较高血红素水平的患者中造成安全风险，并且可能造成并发症，例如高血压、血栓性栓塞、铁缺乏和严重的纯红细胞发育不全(Wish和Coyne，2007)。

因此，本领域存在迄今为止解决的需要以解决上述的缺陷与不足，特别是与红细胞生成和肾功能相关。

发明内容

一方面，本发明涉及式(I)化合物，

其特征在于R是糖基，用于制备促进红细胞生成素形成的药物的用途。所述用途包括给予需要其的主体治疗有效量的药物。

所述糖基是单糖，其选自二羟基丙酮、葡萄糖、半乳糖、甘油醛、苏阿糖、木糖、甘露糖、核糖、核酮糖、木酮糖、塔格糖、阿洛酮糖(psicose)(阿卢糖(allulose))、果糖、山梨糖、鼠李糖、赤藓糖、赤藓酮糖、阿拉伯糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖与塔罗糖。

给予上述式(I)化合物用于促进组织和/或器官中红细胞生成素形成，所述组织和/或器官选自骨髓、肝脏、肾脏和其任何组合。

在另一方面，本发明涉及上述式(I)化合物用于制备治疗得益于红细胞生成素治疗的疾病和/或病症的药物的用途。所述用途包括给予需要其的个体治疗有效量的所述药物。

所述疾病和/或病症是至少选自贫血、肾衰竭和红细胞生成缺陷相关的疾病之一。

所述疾病和/或病症得益于红细胞生成素相关的保护作用。

所述红细胞生成素相关的保护作用是至少选自神经保护、心血管保护、肾保护作用以及保护免受组织局部缺血和局部缺血/多次灌注损伤之一。

在另一方面，本发明涉及上述式(I)化合物用于制备促进红细胞生成的药物的用途。所述用途包括给予需要其的主体治疗有效量的所述药物。

在另一方面，本发明涉及上述式(I)化合物用于制备促进肾功能的药物用途。所述用途包括给予需要其的主体治疗有效量的所述药物。

在另一方面，本发明涉及上述式(I)化合物用于制备增加肝细胞生长因子的表达的药物的用途。所述用途包括给予需要其的主体治疗有效量的所述药物。

在另一方面，本发明涉及上述式(I)化合物用于制备治疗得益于肝细胞生长因子治疗的疾病和/或病症的药物的用途。所述用途包括给予需要其的主体治疗有效量的所述药物。

在另一方面，本发明涉及上述式(I)化合物用于制备通过调节肝细胞生长因子的表达治疗疾病和/或不适的药物的用途。所述用途包括给予需要其的主体治疗有效量的所述药物。

所述疾病和/或病症是至少选自肝病、肾病、肺病、心血管疾病、消化疾病、神经疾病、骨病、关节病、肌肉病、皮肤病、挤压伤症候群、过敏性发炎与任何其组合之一。

所述肝病是至少选自急性肝炎、肝硬化、爆发性肝炎、脂肪肝和用于肝移植、部分切除和局部缺血的手术治疗之一。

所述肾病是至少选自肾脏纤维化、急性肾衰竭、慢性肾衰竭、糖尿病肾病变以及用于肾移植和局部缺血的手术治疗之一。

所述慢性肾衰竭至少是肾病综合症(nephritic syndrome)和梗阻性肾病(obstructive nephropathy)之一。

所述肺病是至少选自急性肺炎、肺纤维化以及用于肺移植、部分切除和局部缺血的手术治疗之一。

所述心血管疾病是至少选自炎症介质心脏病、心绞痛、心肌梗塞、心肌症和闭塞性动脉硬化之一。

所述炎症介质心脏病可包括心脏移植排斥和心肌炎。

所述消化疾病是至少选自肠黏膜损伤、炎性肠病、胃溃疡和糖尿病之一。

所述神经疾病是至少选自脑血管疾病、神经退行性疾病、脊髓损伤、糖尿病视网膜病变、周围神经病、椎管狭窄和失聪之一。

所述脑血管疾病是至少选自短暂性脑缺血发和中风之一。

所述神经退行性疾病是至少选自肌萎缩性侧索硬化症、阿兹海默病和帕金森病之一。

所述骨疾病和关节疾病可包括关节炎和/或类风湿性关节炎。

所述肌肉疾病可以是肌肉营养不良和/或肌肉萎缩症。

所述皮肤病是至少选自皮肤溃疡、灼伤和硬皮病之一。

尽管在不背离本公开新型概念的精神和范围下可以影响此处的变化和修饰，通过结合以下附图的优选的实施方案的描述这些和其它方面将变得明显。

随附的附图阐明本发明的一个或多个实施例，并且与书写的说明书一起提供本发明原理的解释。如果可能的话，整个附图使用相同的参考号以指实施方案的相同或相似元素。

附图说明

图1显示化合物A促进骨髓细胞中血红素水平。

图2显示在骨髓细胞上使用爆式红系集落形成单位(burst-formingunits-erythroid(BPU-E))分析的化合物A活化红细胞系细胞增生。

图3显示化合物A增加肾脏组织中红细胞生成素(Epo)的表达。

图4显示化合物A增加肝细胞中红细胞生成素(Epo)的表达。

图5显示在顺铂诱导的急性肾衰竭动物模型中，化合物A增加血红细胞的数量。

图6显示在顺铂诱导的急性肾衰竭动物模型中，化合物A减少血清血液尿素氮水平。

图7显示在顺铂诱导的急性肾衰竭动物模型中第23天，化合物A增加血红细胞数量。水平箭头代表化合物A治疗(毫克/公斤/天)。

图8显示在顺铂诱导的急性肾衰竭动物模型中第23天，化合物A减少血清血液尿素氮水平。水平箭头代表化合物A治疗(毫克/公斤/天)。

图9显示在顺铂诱导的急性肾衰竭动物模型中，化合物A增加红细胞生成素(Epo)的表达。水平箭头代表化合物A治疗(毫克/公斤/天)。

图10是显示在顺铂诱导的急性肾衰竭动物模型中，化合物A增加肝组织中肝细胞生长因子(HGF)表达的图表。水平箭头代表化合物A治疗(毫克/公斤/天)。

图11显示在顺铂诱导的急性肾衰竭动物模型中，使用爆式红系集落形成单位(BPU-E)分析测定的脊髓细胞上化合物A活化红细胞系细胞增生。

具体实施方式

定义

本说明书中使用的术语在本发明的上下文中和在每个术语使用的特定的上下文中通常具有它们在本领域中的普通含义。用于描述本发明的一些术语讨论如下，或者在本说明书的别处，以向从业人员提供关于本发明描述的另外的指南。为了方便，强调一些术语，例如使用斜体和/或括号。这些强调的使用不影响这些术语的范围和含义。无论是否强调，在相同的上下文中，一种术语的范围和含义是相同的。应领会相同的事物可用不同的方式表达。因此，不同的语言和同义词可以用于本文讨论的任何一个或多个术语，一个术语并没有根据是否在本文详细阐明或讨论而被列出任何特殊意义。提供某些术语的同义词。一个或多个同义词并不排除其它同义词的使用。包含本文讨论的任何术语的例子的本说明书中任何地方的实施例的使用实施例只是说明性的，并不限制本发明或者任何示例性术语的范围和含义。同样地，本发明不限于本说明书所给出的各种实施方案。

除非另有限定，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明适合的本领域技术人员通常理解的相同含义。在冲突的情况中，以包括限定的本文本为主。

本文使用的，“附近(around)”、“约(about)”或“大约(approximately)”通常意指给定的值或范围的20％以内、优选10％以内、更优选5％以内。本文给出的数字量是大约的，意思是如果没有特别声明可以推断是术语“附近”、“约”或“大概”。

实施例

根据本发明实施方案的所述设备、装置、方法和它们相关的结果给出如下，但并不旨在限制本发明的范围。请注意，标题或次标题可以在实施例中使用以方便读者，并不是限制本发明的范围。再者，本文提出并公开一些理论；然而，无论对错，只要根据本发明实施本发明而无关于任何特别的实施理论和方案，它们并不限制本发明的范围。

实施例1

化合物A的纯化

2千克干何首乌(Polygonum multiflorum)在研磨机中研磨，研磨材料泡在2升的85％(v/v)乙醇中过夜以形成反应溶液。收集反应溶液，并将另外2升85％(v/v)乙醇加入至研磨的何首乌残余物中以根据上述步骤进一步提取提取。另外重复三次乙醇提取。使用气体-提取装置(用Whatman#l滤纸)过滤收集的溶液，然后在旋转蒸发仪(Buchi)中于40℃浓缩至体积减少6倍。将浓缩的滤液集在一起，用正己烷/H₂O＝1：1分配5次(总共5升)。收集水相，并进一步用乙酸乙酯水，EtOAc/Η₂O＝1：1(总共6.5升)分配6次，得到EtOAc层。将六次EtOAc层集在一起并浓缩，在冷冻干燥器(Kingmech，台湾)中干燥浓缩物，得到EtOAc提取物(称为“PoMuEPe”)。在HP-200柱(4.8x60cm；MitsubishiChemical)上，用甲醇：H₂O＝50：50溶剂系统，以2毫升/分钟流速柱层析PoMuEPe。收集馏分(fractions)、浓缩、干燥、并分析促进血红素形成的能力。收集显示活性的馏分，称为PoMuEPeD9。在Sephadex^TMLH20柱(2.6x100cm，GE Healthcare Life Science)上，用甲醇：H₂O＝100：0溶剂系统，以1毫升/分钟流速柱层析PoMuEPeD9。收集馏分(fractions)、浓缩、干燥、并分析促进血红素形成的能力。收集显示活性的馏分，称为PoMuEPeD9L11。

通过核磁共振(NMR)色谱(Bruker)与液相色谱/质谱仪(LC/MS，Bruker)测定PoMuEPeD9L11中主要成分的化学结构。鉴定所述主要成分是2,3,5,4’-四羟基茋2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，称为“化合物A”，具有式：

其中R是葡萄糖基。

实施例2

化合物A促进血红素形成

从国家实验动物中心(NLAC，台湾)购买8-10周龄的C57BL/6JNarl小鼠。通过以磷酸盐缓冲盐(PBS)中100毫克/千克的剂量单次腹腔内(i.p.)注射苯肼盐酸盐(Sigma-Aldrich)诱导急性溶血性贫血。注射后六天，从小鼠分离骨髓细胞，并根据微修饰的Worthington等人，(1987)和Rosenthal等人，(1987)描述的程序，培养该细胞。将细胞悬浮液调节至密度为在MEM阿尔法介质(α-MEM，Gibco)中约6x10⁵细胞/毫升，所述MEM阿尔法介质包含1％(v/v)胎牛血清白蛋白(BSA，Sigma-Aldrich)、7.5微摩2-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)、1.4毫摩L-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich)、10微摩的氯化铁(FeCl₃，Sigma-Aldrich)和50mU/毫升EPO(Recormon Epoetin，Roche)。在96孔板(Costar)中以大约1.5x10⁵细胞/孔放置细胞，并在含有5％CO₂～95％空气湿润的37℃培养箱中培养该细胞。

第二天，分别向细胞中加入不同浓度的化合物A(0、0.1、0.5、2.5、12.5和20微克/毫升)，并且培养4天。使用微修饰的根据Kaiho和Mizuno(1985)以及Wonhington(1987)的基于DAF血红素比色分析测定血红素的相对水平。简言之，用PBS洗涤细胞，并将细胞溶解在Nonidet^TM P 40(NP-40，Sigma-Aldrich)(0.01％(v/v)，50微升/孔)。然后用4,5-二氨基荧光素(DAF，Sigma-Aldrich)(100微克/毫升，100微升/孔)和30％过氧化氢(Sigma-Aldrich)(6微升/孔)培养细胞5-10分钟。通过Victor 21420多重计算器(Wallac，PerkinElmer)测量在610nm的吸光度。结果表示为相对指数±S.E.(n＝6)。用学生测试(student’s/test)评估统计显著性(**P<0.0l相对于对照组(0微克/毫升))。发现化合物A浓度在约0.1至约20微克/毫升之间明显促进血红素形成(图1)。

实施例3

化合物A活化细胞培养中的红系造血祖细胞

为了研究“化合物A”对于红系造血祖细胞的作用，根据修饰的Corazza等人(2004)和Jin等人(2003)描述的步骤，进行爆式红系集落形成单位分析。简言之，从国家实验动物中心(NLAC，台湾)购买6周龄的C57BL/6JNarl小鼠。从小鼠分离骨髓细胞。将细胞悬浮液调节至α-MEM中约8.3x10⁴细胞/毫升，所述α-MEM包含15％(v/v)FBS(胎牛血清，Gibco)、1％(v/v)BSA(Sigma-Aldrich)、0.8％(w/v)甲基纤维素(Sigma-Aldrich)、10微摩2-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)、2U/毫升EPO(Recormon Epoetin，Roche)、和10纳克/毫升IL-3(Sigma-Aldrich)。在24孔板(Falcon)中以大约7.5x10⁴细胞/孔放置细胞。将其分别与不同浓度的化合物A(0、0.1、0.5、2.5和12.5微克/毫升)在含有5％CO₂～95％空气的湿润的37℃培养箱中培养9天。用3-(4,5-二甲基-噻唑-2-基)-2,5-二苯基-四氮唑溴盐(50微克/50微升/孔)(MTT，Sigma-Aldrich)将集落染色。当数出50个细胞以上的集落时，将板拍照。结果表示为平均值±S.E.(n＝3)。通过学生测试(student’s/test)评估统计显著性(*P<0.05以及**P<0.0l相对于对照组(即0浓度))。化合物A浓度在0.5至12.5微克/毫升之间明显增加骨髓细胞的BFU-E集落数目(图2)。该结果显示化合物A通过增加血红素形成和活化红系造血祖细胞促进红细胞生成。

实施例4

化合物A促进肾脏Epo表达

从国家实验动物中心(NLAC，台湾)购买8-10周龄的C57BL/6JNarl小鼠。如上述修饰的方法制备小鼠肾切片(Parrish等人，1995，Obatomi等人，1998和De Kanter等人，1999)。简言之，用颈椎脱臼法处死小鼠，取出肾脏，并立即保存在通气的(95％O₂和5％CO₂)冰冷无菌Krebs-HEPES缓冲液(pH 7.4)中，该缓冲液包含20毫摩HEPES(USB)、128毫摩氯化钠(Sigma-Aldrich)、2.5毫摩氯化钾(Sigma-Aldrich)、2.7毫摩氯化钙(Sigma-Aldrich)、1毫摩氯化镁(Sigma-Aldrich)和16毫摩D-葡萄糖(Sigma-Aldrich)。将肾去膜并且垂直于肾皮质乳头去核。在填充通气的(95％O₂：5％CO₂)冰冷无菌Krebs-HEPES缓冲液的微切片器(D.S.K microslicer，DRK 1000，Dosaka EM Co)中制备肾切片(250微米)。收集肾切片，并储存在通气的(95％O₂，5％CO₂)冰冷无菌Krebs-HEPES缓冲液中的冰上，并且在切片制备10分钟内使用。

将肾切片在95％O₂：5％CO₂气氛室中于37℃预先培养在含有1.0毫升/孔通气的(95％O₂，5％CO₂)新鲜培养液(DMEM/F12(Gibco/Invitrogen)含有15毫摩HEPES(USB)、20毫摩碳酸氢钠(Sigma-Aldrich))和5％(v/v)FBS(Gibco)的24孔板(Falcon)中90-120分钟。然后，在50％O₂：5％CO₂：45％N₂气氛室中于37℃分别用不同浓度的化合物A(0、0.6、2.5、10、40和100微克/毫升)培养肾切片16小时。用RNA-Bee^TMRNA分离溶剂(Tel-test)提取肾切片的核糖核酸(RNA)。使用MMLV反转录酶(Promega)，用总RNA(5微克)制备互补的脱氧核糖核酸(cDNA)。通过使用ABI Prism 7700序列检测系统(Applied Biosystems)和SYBR Green Master Mix试剂盒(AppliedBiosystems)的实时PCR分析反转录的cDNA样品。使用靶向于小鼠β-肌动蛋白(SEQ ID NOs：1和2)和红细胞生成素(Epo)(SEQ ID NOs：3和4)(表1)的实时PCR引子。实时PCR条件如下：95℃变性10分钟，然后40个周期的95℃进行30秒、58℃进行35秒和72℃进行40秒。β-肌动蛋白的表达水平用作内部参考。使用2^{^△△CT}计算相对基因表达水平。结果与对照组(0微克/毫升)比较，并表示为相对指数。结果显示化合物A增加肾脏组织中Epo的表达(图3)。

表1

实施例5

化合物A促进Epo的肝细胞表达

从国家实验动物中心(NLAC，台湾)购买8-10周龄的C57BL/6JNarl小鼠。如上述修饰的方法分离肝细胞(Kreamer等人，1986)。简言之，用Avertin(2％(w/v)2,2,2-三溴乙醇，i.p.，400毫克/千克体重)麻醉小鼠，通过下腔静脉原位灌注含有0.5毫摩乙二醇-双(2-氨乙基醚)-N,N,N’,N’-四乙酸(EGTA；Sigma-Aldrich)的无钙Hank’s平衡盐溶液(HBSS)至肝脏。流速为1毫升/分，灌注液通过门静脉流入。灌注10分钟后，含有0.05％(w/v)胶原蛋白酶(II型；Worthinglon Biochemical Corporation)和1毫摩氯化钙(Sigma-Aldrich)的HBSS被导入灌注装置。以相同流速持续灌注另外的10分钟。移除部分消化的肝脏，将其置于含有HBSS的60-毫米培养皿中(BD Falcon)，并且温和切碎打开肝脏囊。通过尼龙网(约300微米孔径)过滤切碎的肝脏悬浮液，以50xg离心3分钟，得到细胞颗粒。制备密度1.06克/毫升的细胞分离液(GE Healthcare)介质。将细胞颗粒悬浮在DMEM介质(Gibco/Invitrogen)中，与细胞分离液介质于4℃以50xg离心10分钟，用DMEM介质洗涤一次，然后通过50xg离心2分钟得到肝细胞。

在湿润的含有5％CO₂～95％空气的37℃培养箱中将分离的肝细胞以在DMHM介质(Gibco/Invitrogen)中约6x10⁵细胞/孔(2毫升/孔)置于6孔板(Costar)中，所述DMEM介质含有10％FBS(Gibco)。3小时后，移除介质，分别用不同浓度的化合物A(0、0.1、0.5、2.5和12.5微克/毫升)培养细胞24小时。用RNA-Bee^TMRNA分离溶剂(Tel-test)提取肝细胞的RNA，用于反转录，并通过前述的PCR分析转录。结果显示化合物A促进肝细胞中Epo的表达(图4)。

实施例6

在顺铂诱导的急性肾衰竭动物模型中化合物A促进肾功能

研究化合物A对于顺铂诱导的急性肾衰竭动物模型的治疗作用。从国家实验动物中心(NLAC，台湾)购买(8周龄)C57BL/6JNarl小鼠。以1毫克/毫升浓度将顺铂(顺氯氨铂(II)，Sigma-Aldrich)溶解于生理盐水(0.9％(w/v)氯化钠，Sigma-Aldrich)，并且根据以下计划腹腔注射(i.p.)至小鼠：第1天，7毫克/千克；第5天，6毫克/千克；以及第9天，6毫克/千克。对于未用顺铂处理的正常小鼠组，平行腹腔注射相应体积的生理盐水。在第13天，收集血清样品并分析血液尿素氮(BUN)含量。BUN水平100毫克/分升的注射顺铂的小鼠以及未用顺铂处理的正常小鼠进一步被分为5组，每组6只，饲养2周：(1)正常组：小鼠注射生理盐水，然后用标准饲料喂养；(2)对照组：小鼠注射顺铂，然后用标准饲料喂养；(3)化合物A 10毫克/千克/天组：小鼠注射顺铂，然后以10毫克/千克/天的剂量用化合物A喂养；(4)化合物A 30毫克/千克/天组：小鼠注射顺铂，然后以30毫克/千克/天的剂量用化合物A喂养；(5)化合物A 90毫克/千克/天组：小鼠注射顺铂，然后以90毫克/千克/天的剂量用化合物A喂养。

在第0、5、10、13、18、23和28天，从小鼠的眼后静脉窦收集血液样品。通过使用Kx-21血液分析器的完全血液细胞计数测定红细胞(RBC)浓度。用尿素酵素GLDH方法(UreaFS，DiaSys)测定血液尿素氮(BUN)水平。结果表示为平均值±S.E.(n＝5～6)。用学生测试(student’s/test)评估统计显著性(##P<0.01相对正常组以及**P<0.0l相对对照组)。结果显示浓度30-90毫克/千克/天的化合物A治疗增加红细胞(RBCs)数目并减少血清BUN水平(图5)。在第23天，浓度在30-90毫克/千克/天的化合物A显著增加红细胞(RBCs)数目(图7)而减少血清BUN水平(图8)。图7和图8的水平箭头代表化合物A治疗(毫克/千克/天)。数据显示化合物A治疗促进肾功能，并且减少顺铂诱导急性肾衰竭动物模型中的贫血。结果与化合物A促进红细胞生成素的能力相同。

实施例7

在顺铂诱导的急性肾衰竭动物模型中化合物A增加Epo的肝脏表达和肝细胞生长因子

在实施例6的最后(即第28天)，处死小鼠，移除肾脏与肝脏组织，并分离骨髓细胞。用RNA-Bee^TMRNA分离溶剂(Tel-test)提取组织与骨髓细胞的RNA。使用MMLV反转录酶(Promega)，用总RNA(5微克)制备cDNA。通过使用ABI GeneAmp^TM系统2700(Applied Biosystems)和SYBR Green Master Mix试剂盒(Applied Biosystems)的PCR，使用靶向于小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(SEQ ID NOs：5和6)、红细胞生成素(Epo)(SEQ ID NOs：3和4)以及肝细胞生长因子(HGF)(SEQID NOs：7和8)的引子，分析反转录的cDNA样品(表1)，。实时PCR条件如下：95℃变性10分钟，然后40个周期的95℃进行30秒、58℃进行35秒以及72℃进行40秒。GAPDH的表达水平用作内部参考。用2^{^△△CT}计算相对基因表达水平。结果表示为相对指数±S.E.(n＝5-6)。用学生测试(student’s/test)评估统计显著性(##P<0.01相对正常组，以及*P<0.05、**P<0.0l相对对照组)。

结果显示相较于未处理的对照组，在顺铂诱导的急性肾衰竭动物模型中，浓度30-90毫克/千克/天的化合物A明显增加Epo的肝脏表达(图9)。肝脏与肾脏是制造Epo的两个主要器官。发现化合物A促进肾脏组织(图3)、肝细胞(图4)和肝组织(图9)中的Epo表达。所述结果与化合物A促进Epo表达的能力相同。再者，化合物A(10-90毫克/千克/天)治疗也促进肝脏组织中HGF的表达(图10)。图9与图10中的水平箭头代表化合物A治疗(毫克/千克/天)。

实施例8

顺铂诱导的急性肾衰竭动物模型中化合物A活化红系造血祖细胞

基于实施例7，在含有5％CO₂～95％空气的湿润的37℃培养箱中培养分离的骨髓细胞12天，以用于如上所述的爆式红系集落形成单位(burst-forming units-erythroid(BPU-E))分析。结果表示为相对指数±S.E.(n＝5-6)。用学生测试(student’s/test)评估统计显著性(##P<0.01相对正常组，以及*P<0.05、**P<0.0l相对对照组)。发现浓度10-90毫克/千克/天的化合物A显著增加骨髓细胞的BFU-E群落数目(图11)。图11的水平箭头代表化合物A治疗(毫克/千克/天)。结果显示化合物A活化红系造血祖细胞以及促进红细胞生成。

在几种植物中已经发现2,3,5,4’-四羟基茋2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，即化合物A。根据文献，化合物A具有以下药学作用：通过活化酪氨酸酶而刺激黑色素生成(Guan等人，2008)、抑制脂肪过氧化(Kimura等人，1983)、通过减缓氧与氮自由基水平和下调可诱导的一氧化氮合成酶表达对结肠炎具有保护作用(Wang等人，2008)、通过其对于脂蛋白氧化的对抗作用而具有抗关节炎作用、冠状动脉平滑肌细胞一氧化氮含量增殖和减少(Liu等人，2007)、具有关于抑制环氧酶-2-酶活性和表达的抗炎功能(Zhang等人，2007)、以及有利于阿兹海默病和认知障碍(Wang等人，2007)。

美国公开号20050042314(题目为何首乌提取物和制备工艺及其使用)公开了何首乌根的提取产物可增加血液细胞与骨髓细胞的增殖、生长和/或分化。何首乌根包含许多化学成分，例如大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酸、大黄酚蒽酮、白藜芦醇、云杉新苷、2,3,5,4’-四羟基茋2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、2,3,5,4’-四羟基茋2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷-2”-O-没食子酸酯、2,3,5,4’-四羟基茋-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷-3”-O-没食子酸酯、没食子酸、儿茶素、表儿茶素、3-O-没食子(-)-儿茶素、和3-O-没食子(-)-表儿茶素、3-O-没食子-原花青素B-2,3,3’-二-O-没食子-原花青素B-2、和β-谷甾醇。美国公开号20050042314并未提到哪一个化合物是有活性的。

如上所述，已证实化合物A具有增加Epo生成和促进红细胞生成以及肾脏功能的生物活性。化合物A的糖基可被单糖替代，例如二羟丙酮、半乳糖、甘油醛、苏阿糖、木糖、甘露糖、核糖、核酮糖、木酮糖、塔格糖(阿卢糖)、果糖、山梨糖、鼠李糖、赤藓糖、赤藓酮糖、阿拉伯糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、艾杜糖与塔罗糖。

众所公知Epo刺激红细胞生成，并且Epo是红细胞生成必须的(Moritz等人，1991)。已经有报导Epo具有肾脏保护作用(Sepodes等人，2006和Arcasoy，2008)。除了增加Epo生成，化合物A促进红细胞生成和肾脏功能。

HGF是多功能的细胞因子，其与细胞存活、生长、移动和型态、组织再生、保护与修复有关。已经报导HGF活化从Epo受体的信号传递(Iguchi等人，1999和Isobe等人，2006)。已经显示HGF具有对以下病症的治疗潜力：过敏发炎(Ito等人，2008)、骨关节炎、类风湿性关节炎、肌肉营养不良、肌肉萎缩、皮肤溃疡、灼伤、硬皮症、挤压伤症候群(Funakoshi和Nakamura，2003)、脑血管疾病例如短暂性脑缺血和中风、神经退行性疾病例如肌萎缩性侧索硬化症、阿兹海默病与和帕金森病、脊髓损伤、糖尿病视网膜病变、周边神经病变、椎管狭窄、失聪(Funakoshi和Nakamura，2003以及Takeo等人，2007)、急性肝炎、肝硬化、爆发性肝炎、脂肪肝、肝脏移植、部分切除和局部缺血的手术治疗(Funakoshi和Nakamura，2003和Mizuno和Nakamura，2007)、肾纤维化、急性肾衰竭、慢性肾衰竭例如肾病综合症和梗阻性肾病、肾移植与局部缺血的手术治疗、糖尿病肾病变(Matsumoto和Nakamura.2001；Funakoshi和Nakamura，2003以及Liu，2004)、急性肺炎、肺纤维化、用于肺移植、部分切除与局部缺血的手术治疗(Funakoshi和Nakamura，2003)、炎症介导的心脏病例如心脏移植排斥与心肌炎、心血管疾病例如心绞痛、心肌梗塞、心肌症和闭塞性脉管炎(Funakoshi和Nakamura，2003和Isobe等人，2006)、肠粘膜损伤、发炎性肠病(Ido等人，2005)、胃溃疡和糖尿病(Funakoshi和Nakamura，2003)。

化合物A具有基于3,4',5-三羟基-反-茋的结构，其是天然化合物，具有许多生物活性，包括通过一氧化氮依赖和/或抗氧化剂机制的肾脏保护(Sharma等人，2006；Shankar等人，2007；Do Amaral等人，2008以及Orallo,2008)。发现化合物A比3,4',5-三羟基-反-茋更能促进肾脏功能和改善贫血(数据未显示)。

rHuEpo和NESP已经用于血管内(i.v.)或皮下(s.c.)注射以治疗CKD贫血、接受化学治疗的癌症患者的贫血、感染人类免疫缺陷病毒的且接受齐多夫定治疗的患者的贫血(Fisher，2003)。已经建议每周给予一次以上以维持治疗。成本、经常注射的不方便(腹腔注射)以及由于rHuEpo固有的抗原性而发展抗Epo抗体皆指出需要发展改善的治疗剂。口服化合物A，3,4',5-三羟基-反-茋类似物之一，可增加Epo形成、促进红细胞生成和肾脏功能，以及减少贫血。

已经报导化合物3,4',5-三羟基-反-茋通过一氧化氮依赖和/或抗氧化物机制具有肾脏保护作用。化合物A在促进红细胞生成和肾脏功能中优于3,4',5-三羟基-反-茋。再者，化合物A具有重组Epo没有的优点：口服给予化合物A并不造成重组Epo具有的固有的抗原性。另外，给予rEpo的途径不方便，因为其需要频繁注射。化合物A可能有助于疾病相关的贫血，例如CKD、癌症、急性与慢性感染、自体免疫、炎症、固态器官移植后的慢性排斥、化学治疗诱发的贫血和组织局部缺血。

本发明之前描述的示例性实施方案只是用于阐明和说明的目的而提出，并不旨在排除或限制本发明于公开的明确形式。根据以上教导，许多修饰和变化是可能的。

选择和描述实施方案和实施例以解释本发明的原理和其实践应用以使本领域技术人员利用本发明，，并且不同的实施方案以及不同的修饰适合于预期的特别使用。作为选择的实施方案对于本发明适合的本领域技术人员将在不背离其精神和范围下变得明显。因此，通过附上的权利要求而不是之前的说明和此处描述的示例性的实施方案限定本发明的范围。

在本发明的说明书中引用并讨论一些参考文献，其可包括专利、专利申请和各种公开。这些参考文献的引用和/或讨论仅是被提供以阐明本发明的说明，而不是承认任何这些参考文献是本文描述的发明的“现有技术”。在本说明书中的所有参考文献和讨论以它们完全引用的形式并入本文，并且以同样的程度犹如每个参考文献单独以引用的形式并入本文。

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Claims

1.式(I)化合物用于制备治疗选自肾衰竭和红细胞生成素缺陷相关疾病之一的疾病和/或病症的药物的用途，其中所述式(I)化合物是

其中R是葡萄糖。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述式(I)化合物用于促进组织和/或器官中红细胞生成素形成，所述组织和/或器官选自骨髓、肝脏、肾脏和其任何组合。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述疾病和/或病症将得益于红细胞生成素相关的保护作用。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述红细胞生成素相关的保护作用是至少选自神经保护、心血管保护、肾保护作用和保护免于组织局部缺血和局部缺血损伤之一。

5.式(I)化合物用于制备治疗得益于肝细胞生长因子治疗的疾病和/或病症的药物，其中所述疾病和/或病症是至少选自肝病、肾病、肺病、心血管疾病、消化疾病、神经疾病、骨疾病、关节疾病、肌肉疾病、皮肤病、压挤症候群、过敏性发炎和其任何组合之一，其中所述式(I)化合物是

其中R是葡萄糖。