CN107441182B - 何首乌提取物的制备方法及其制剂和应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种何首乌提取物的制备方法，其中，该方法包括下列步骤：将粉碎的何首乌干燥块根，用50体积％乙醇在10‑35℃提取两次，每次24h，乙醇与何首乌药材的重量比为8:1，过滤，合并滤液，得何首乌第一提取物；将所述何首乌第一提取物采用大孔树脂吸附柱分离纯化，得何首乌第二提取物；将所述何首乌第二提取物采用硅胶柱精制，得到何首乌第三提取物；所获得的何首乌提取物中二苯乙烯苷的浓度为15‑99重量％。本申请还提供了所述何首乌提取物的制剂及其应用。本申请提供的何首乌提取物的制剂，可以改善放、化疗引起的骨髓抑制，能够实现对造血系统(特别是造血干细胞)的保护作用。

Description

何首乌提取物的制备方法及其制剂和应用
技术领域
本发明涉及但不限于医药领域，具体地，涉及但不限于何首乌提取物的制备方法及其制剂和应用。
背景技术
何首乌最早记载于《开宝本草》，为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorumThunb.的干燥块根。秋、冬二季叶枯萎时采挖，削去两端，洗净，个大的切成块，干燥。临床应用有生首乌和制首乌之别。生首乌能解毒、消痈、润肠通便，制首乌有补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨之功效，是临床常用中药和大众保健食品。
何首乌的主要成分二苯乙烯苷又名芪多酚，属多羟基芪类化合物，外观为白色粉末状结晶，易溶于水、甲醇、乙醇等低分子醇类溶剂，难溶于亲脂性有机溶剂。二苯乙烯苷在中性及弱碱性水溶液中较稳定，不耐高温，不耐光照。
二苯乙烯苷化学名称为2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷
化学结构式：
Figure BDA0001004196150000011
分子式C20H22O9
分子量406.39
目前肿瘤发病率日益增高，临床上主要采用放疗、化疗治疗恶性肿瘤，但其伴有严重副作用，最主要、最常见的毒副反应之一是骨髓抑制，这一毒副反应往往使化疗药物的剂量和疗程受到限制，直接影响到治疗效果及患者的生存质量。所以促进肿瘤患者造血功能恢复对于疾病的发生、发展和结局起着至关重要的作用。
迄今为止，未见何首乌提取物及其制剂在骨髓损伤修复作用及功能保护作用方面的研究报道，这在当今日备受关注的医疗卫生事业中凸现其重要的研究和开发价值。
发明内容
本申请提供了一种何首乌提取物的制备方法。具体地，该方法包括下列步骤：
将粉碎的何首乌干燥块根，用50体积％乙醇在10-35℃提取两次，每次24h，乙醇与何首乌药材的重量比为8:1，过滤，合并滤液，得何首乌第一提取物；
将所述何首乌第一提取物采用大孔树脂吸附柱分离纯化，得何首乌第二提取物；
将所述何首乌第二提取物采用硅胶柱精制，得到何首乌第三提取物；
所获得的何首乌提取物中二苯乙烯苷的浓度为15-99重量％。
本申请还提供了如上所述的方法制备的何首乌提取物在制备促进放疗造成的骨髓损伤修复的药物中的应用。
本申请还提供了如上所述的方法制备的何首乌提取物在制备促进放疗造成的造血干细胞损伤修复的药物中的应用。
本申请还提供了如上所述的方法制备的何首乌提取物在制备促进化疗造成的骨髓损伤修复的药物中的应用。
本申请还提供了如上所述的方法制备的何首乌提取物在制备促进化疗造成的造血干细胞损伤修复的药物中的应用。
本申请还提供了一种何首乌提取物的制剂，其中，所述制剂由上述何首乌提取物的制备方法制备的何首乌提取物和制剂辅料制备；
所述何首乌提取物中二苯乙烯苷浓度为15-99重量％；
所述制剂中所述何首乌提取物的含量≥50重量％。
在本申请实施方式中，所述制剂的类型包括丸剂、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、膏剂、溶液和注射液剂中的一种或多种。
本申请实施方式提供的何首乌提取物的制剂，可以改善放、化疗引起的骨髓抑制，能够实现对造血系统(特别是造血干细胞)的保护作用。
附图说明
图1显示中药颗粒剂(SGB)对全身半致死剂量照射(TBI)放疗后造血干细胞(HSC)各类群的影响。
图2显示SGB对TBI放疗后诱导的骨髓淋系祖细胞(CLP)凋亡的影响。
图3显示SGB对TBI放疗后B淋巴细胞分化、发育的影响。
图4显示SGB对TBI放疗后诱导的造血干细胞活性氧簇(ROS)水平的影响。
图5显示SGB对TBI放疗后诱导的造血干细胞DNA损伤的影响。
图6显示SGB对TBI放疗后诱导的造血干细胞克隆功能的影响。
图7显示SGB对卡铂(CB)化疗后造血干细胞(HSC)各类群的影响。
图8显示SGB对CB化疗后诱导的骨髓淋系祖细胞(CLP)凋亡的影响。
图9显示SGB对CB化疗后B淋巴细胞分化、发育的影响。
图10显示SGB对CB化疗后诱导的造血干细胞活性氧簇(ROS)水平的影响。
图11显示SGB对CB化疗后诱导的造血干细胞DNA损伤的影响。
图12显示SGB对CB化疗后诱导的造血干细胞克隆功能的影响。
在上述附图中，0Gy H2O表示灌胃生理盐水且没有经受全身半致死剂量照射(TBI)的一组小鼠，0Gy SGB表示灌胃SGB且没有经受全身半致死剂量照射(TBI)的一组小鼠，4GyH2O表示灌胃生理盐水且经受全身半致死剂量照射(TBI)的一组小鼠，4Gy SGB表示灌胃SGB且经受全身半致死剂量照射(TBI)的一组小鼠。
在上述附图中，H2O表示灌胃生理盐水且没有注射化疗药物CB的一组小鼠，SGB表示灌胃SGB且没有注射化疗药物CB的一组小鼠，CB-H2O表示灌胃生理盐水且注射化疗药物CB的一组小鼠，CB-SGB表示灌胃SGB且注射化疗药物CB的一组小鼠。
具体实施方式
下面通过实施例来描述本申请的实施方式，本领域的技术人员应当认识到，这些具体的实施例仅表明为了达到本申请的目的而选择的实施技术方案，并不是对技术方案的限制。根据本申请的教导，结合现有技术对本申请技术方案的改进是显然的，均属于本申请保护的范围。
本申请提供了一种何首乌提取物的制备方法，其中，该方法包括下列步骤：将粉碎的何首乌干燥块根，用50体积％乙醇在10-35℃提取两次，每次24h，乙醇与何首乌药材的重量比为8:1，过滤，合并滤液，得何首乌第一提取物；将所述何首乌第一提取物采用大孔树脂吸附柱分离纯化，得何首乌第二提取物；将所述何首乌第二提取物采用硅胶柱精制，得到何首乌第三提取物；所获得的何首乌提取物中二苯乙烯苷的浓度为15-99重量％。
在本申请实施方式中，上述制备方法制备的何首乌提取物中二苯乙烯苷的浓度随着提取次数的增加而明显提高。本领域技术人员可以根据实际需要来选择不同浓度二苯乙烯苷的何首乌提取物。另外，通过上述制备方法获得何首乌提取物，还可以通过进一步提纯来获得二苯乙烯苷化合物。
本申请还提供了如上所述的方法制备的何首乌提取物在制备促进放疗造成的骨髓损伤修复的药物中的应用。
本申请还提供了如上所述的方法制备的何首乌提取物在制备促进放疗造成的造血干细胞损伤修复的药物中的应用。
本申请还提供了如上所述的方法制备的何首乌提取物在制备促进化疗造成的骨髓损伤修复的药物中的应用。
本申请还提供了如上所述的方法制备的何首乌提取物在制备促进化疗造成的造血干细胞损伤修复的药物中的应用。
本申请还提供了一种何首乌提取物的制剂，其中，所述制剂由上述何首乌提取物的制备方法制备的所述何首乌提取物和制剂辅料制备；所述何首乌提取物中二苯乙烯苷浓度为15-99重量％；所述制剂中所述何首乌提取物的含量≥50重量％。
在本申请实施方式中，制剂辅料可以为本领域技术人员已知的任意一种药学上可接受的制剂辅料。本领域技术人员可以根据制剂剂型的实际情况进行选择。
在本申请实施方式中，所述制剂可以根据实际需要制备成各种类型。例如，所述制剂类型包括丸剂、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、膏剂、溶液和注射液剂型中的一种或多种。
在本申请实施方式中，上述制备方法中三种何首乌提取物都可以制成清膏或冷冻干燥成粉，与制剂辅料混合制备制剂。
例如，可以将清膏浓缩成在40℃相对密度为1.20-1.30g/ml，可选地为1.23-1.27g/ml的稠膏，与制剂辅料混合制备口服液。
例如，可以将清膏冷冻干燥成粉，与制剂辅料混合均匀制备颗粒剂、片剂或胶囊剂。
本申请实施方式提供的何首乌提取物的制剂，例如，以二苯乙烯苷118mg/kg(小鼠体重)的量进行给药，能够有效抑制造血干细胞凋亡，增加小鼠造血系统不同分化程度细胞的数量或比例，促进DNA损伤修复，促进骨髓细胞体外培养集落的形成，促进T、B淋巴细胞增殖，抑制放、化疗引起的慢性氧化应激，从而对放、化疗导致的骨髓损伤具有促进修护的作用。
以下实施例中所使用的原料和试剂，如无特别说明，均为普通市售商品。相同的产品或设备来源相同。
何首乌提取物中的二苯乙烯苷的含量通过高效液相色谱仪检测，具体参照何首乌中国药典(2015版)质量标准。
实施例1
将粉碎的何首乌块根，以8倍重量的50％乙醇在10℃提取两次，每次24小时，过滤，合并滤液，浓缩，得二苯乙烯苷含量约为10重量％的何首乌第一提取物。
采用大孔树脂吸附柱(D101大孔吸附树脂，购自西安蓝晓科技有限公司)分离纯化，得二苯乙烯苷含量为50重量％的何首乌第二提取物。
采用硅胶柱(200-300目硅胶，购自青岛海洋化工厂)进一步精制，得到二苯乙烯苷含量大于98重量％的何首乌第三提取物。
将第三提取物浓缩至相对密度为1.2-1.3g/ml(40℃)的稠膏。
实施例2
将粉碎的何首乌块根，以8倍重量的50％乙醇在35℃提取两次，每次24小时，过滤，合并滤液，浓缩，得二苯乙烯苷含量约为10重量％的何首乌第一提取物。
采用大孔树脂吸附柱分离纯化，得二苯乙烯苷含量为50重量％的何首乌第二提取物。
采用硅胶柱进一步精制，得到二苯乙烯苷含量为98重量％的何首乌第三提取物。
将上述第三提取物浓缩至相对密度为1.2g/ml-1.3g/ml(40℃)的稠膏。
取上述何首乌提取物稠膏1份、糊精粉1份、适量红糖粉混合均匀，至色泽均匀为止，制成软材，用80体积％乙醇作为湿润剂，使之“捏之成团，触之即散”。
将上述制备好的药物放入14目筛，用手拍打筛的边缘，筛出颗粒状药物，烘干颗粒。辅以药学上可接受的载体包装，每小袋的质量为6g，其中何首乌提取物含量3g。如此获得了中药颗粒剂(SGB)。
实施例3
将粉碎的何首乌块根，以8倍重量的50％乙醇在25℃提取两次，每次24小时，过滤，合并滤液，浓缩，得二苯乙烯苷含量约为10重量％的何首乌第一提取物。
采用大孔树脂吸附柱分离纯化，得二苯乙烯苷含量为50重量％的何首乌第二提取物。
采用硅胶柱进一步精制，得到二苯乙烯苷含量为98重量％的何首乌第三提取物。
将上述第三提取物浓缩至相对密度为1.20-1.30g/ml(40℃)的稠膏并冷冻干燥成粉。
将上述何首乌提取物稠膏或干粉3份、糊精粉1份、淀粉1份混合均匀，50％糖浆制备合适软材，用16目筛网制粒，鼓风干燥60min，整粒，加入润滑剂硬脂酸镁(1％)混合均匀，上机压片，得产品(规格0.3g片剂)，其中何首乌提取物含量0.15g/片。
下面是本申请的中药提取物的制剂的药理作用实验方法及结果。以实施例2制备的中药颗粒剂(SGB)为例：
为了确定何首乌提取物是否可以通过抑制辐射引起的骨髓损伤来保护小鼠，我们采用将小鼠暴露于半致死剂量照射(4Gy)或一次性腹腔注射CB方式，使其能在放疗或化疗损伤中存活，以便进行造血功能分析。
放疗实验：8-10周龄C57BL/6-Ly-5.2野生型雄性小鼠随机分为四组，两组每天灌胃118mg二苯乙烯苷重量/kg(小鼠体重)的SGB溶液(适量SGB溶于生理盐水，每天灌胃含SGB240.82mg/kg小鼠体重的生理盐水溶液)，其余两组灌胃等体积的生理盐水，七天后，全身半致死剂量照射(TBI)灌胃SGB溶液的其中一组和灌胃生理盐水的其中一组一次，继续灌胃一个月后，脱颈处死小鼠，分离骨髓细胞进行流式分析。在灌胃期间，每10天测量一次小鼠体重，根据体重调整灌胃SGB溶液和生理盐水的剂量。
化疗实验：分组及处理方式与上述放疗实验相同，不同的是，七天后一次性腹腔注射化疗药物CB 125mg/kg给灌胃SGB溶液的其中一组和灌胃生理盐水的其中一组一次。
骨髓细胞分离：
1)脱颈处死小鼠，然后用75体积％酒精消毒小鼠后，置于超净台内的锡箔上；
2)双手用酒精消毒后进入超净台，无菌条件下取双侧股骨和腔骨，剔除肌肉放入培养皿中(如需大量骨髓细胞，继续将小鼠骼骨、上肢骨及脊柱骨取出)；
3)将双腿胫骨、股骨、骼骨、上肢骨及脊柱骨置于预冷的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，分2次每次加入4ml 0.2％BSA溶液(牛血清蛋白粉末溶于PBS)于研钵中，将骨压扁，使用移液枪吹打成单细胞悬液，使用300μm的尼龙滤膜过滤细胞悬液，过滤至15ml离心管中，计数；
4)400g离心5分钟，去上清，使用BSA调整全骨髓细胞悬液浓度至1×108cell/ml。
所有流式细胞仪检测结果使用FlowJo 7.6.1软件进行数据分析(Tree-Star,Ashland,OR,USA)。
测试例1流式细胞仪分析TBI放疗后骨髓造血干/祖细胞数量
取50μl(浓度为1×108cell/ml)上述全骨髓细胞悬液，加入生物素(Biotin)偶联的7种lineage(Lin)抗体(CD1lb-Biotin、Grl-Biotin、Terl19-Biotin、IL-7R-Biotin、B220-Biotin、CD4-Biotin、CD8-Biotin)，并利用流式细胞仪((FAsCArial,BeetonDickinso)检测，实验中所用抗体均购自美国Becton Dickinson公司。每只小鼠收集l×106细胞，计算表面标记为Lin-scal+c-kit+骨髓造血干细胞(LSK-HSC)、Lin-scallowc-kitlowCD34+IL-7R+的淋系共同祖细胞(CLP)、Lin-scal+c-kit+CD34-Flt3-的长期骨髓造血干细胞(LT)、Lin-scal+c-kit+CD34+Flt3-的短期骨髓造血干细胞(ST)、Lin-scal+c-kit+CD34+Flt3+的骨髓多潜能祖细胞(MPP)、Lin-scal-c-kit+CD16/32-CD34+的共同髓系祖细胞(CMP)、Lin-scal-c-kit+CD16/32-CD34-的巨核细胞-红细胞系祖细胞(MEP)及Lin-scal-c-kit+CD16/32+CD34+的粒细胞-单核细胞祖细胞(GMP)所占的数目。
骨髓造血干/祖细胞染色方案
Figure BDA0001004196150000091
上述经过放疗实验的四组小鼠流式分析骨髓造血干细胞(HSC)。TBI放疗对小鼠HSC各类群数量的影响如图1所示。
图1中，A表示细胞表面标记为Lin-scal+c-kit+的造血干细胞(LSK-HSC)数目；B表示淋系祖细胞(CLP)数目；C表示HSC中长期骨髓造血干细胞(LT)、短期骨髓造血干细胞(ST)、骨髓多潜能祖细胞(MPP)数目；D表示造血祖细胞(HPC)下共同髓系祖细胞(CMP)、巨核细胞-红细胞系祖细胞(MEP)及粒细胞-单核细胞祖细胞(GMP)所占的数目。数据以平均数±标准误差表示。N＝6只/组。﹡p<0.05vs H2O+TBI；﹡﹡p<0.01vs H2O+TBI。
从图1可以看出，TBI放疗后，各组LSK-HSC、CLP数表现出大幅减少。与4Gy H2O组的小鼠相比，4Gy SGB组的小鼠的LSK-HSC、CLP数都有显著回升。同时，LSK-HSC下游的LT、ST、MPP的减少都有明显抑制，如图1-C所示。这一发现表明，SGB可以有效治疗放疗诱导的造血干细胞干性及淋系祖细胞的骨髓细胞损伤。
测试例2流式细胞仪分析TBI放疗后骨髓细胞凋亡
取10μl(浓度为1x108cell/ml)全骨髓细胞悬液，置于流式管中，如上述长期造血干细胞染色方案(不同的是，没有PE Flt3、perCp-Cy5.5IL-7R抗体)染色，用100μl 1×binding buffer重悬细胞同时加入ArmexinV-PE及7-AAD-PerCP-Cy5.5抗体，室温孵育15分钟，加入100μl 1×binding buffer，流式细胞仪分析。
SGB对TBI诱导后骨髓细胞凋亡的影响见图2。数据分析方式与图1阐述的相同。
从图2可以看出，TBI放疗后，4Gy H2O组比0Gy H2O组的CLP凋亡率显著升高，但是经过SGB给药(给药含SGB 240.82mg/kg小鼠体重的生理盐水溶液)后，4Gy SGB组的CLP凋亡率与4Gy H2O组相比，显著降低，基本恢复至0Gy H2O组的水平。表明SGB可以抑制放射线诱导的造血干细胞的凋亡，修复受损造血干细胞的造血功能。
测试例3流式细胞仪分析TBI放疗后骨髓B淋巴细胞分化、发育各阶段细胞数目
取10μl(浓度为1x108cell/ml)全骨髓细胞悬液，抗体染色(如下表)，冰上避光孵育30min，加入l ml BSA 400g/min 5min离心，弃上清后，加入200μl BSA重新悬浮细胞，准备流式分析。每只小鼠收集lx105细胞，计算细胞表面标记CD43-B220+lgM-lgD-的pre-Bcell、CD43-B220+IgM+IgD-的immature-B cell及CD43-B220+lgM+190+的mature-B cell等各阶段细胞数量。
骨髓B淋巴细胞发育各阶段细胞染色方案
Figure BDA0001004196150000101
SGB对TBI放疗后B淋巴细胞分化、发育的影响见图3。图3中，A表示骨髓细胞中前祖B细胞(pre-pro B)及祖B细胞(pro B)的数目；B：前B细胞(pre B)、不成熟B细胞(imm B)及成熟B细胞(mature B)的数目。数据分析方式与图1阐述的相同。
从图3可以看出，SGB对TBI诱导后骨髓B淋巴细胞各分化、发育各阶段数目较TBI生理盐水对照组均增多，特别是pre-pro B淋巴细胞与matureB淋巴细胞显著增加，如图3的pre-pro B、B mature项下，提示骨髓B细胞比例升高可能是由于SGB促进pre-pro B细胞更前体的细胞发育分化所致，mature B细胞比例增加而其上游B细胞并无显著增加，可能是由于SGB在辐射诱导的骨髓损伤中mature B细胞发育过程某一阶段起到保护作用。
测试例4TBI放疗后造血细胞ROS水平检测
本法检测LSK-HSC细胞内ROS的水平，对于每一个样本，最低获得100,000Lin细胞，加载DCFH-DA探针(10μM,30min at 37℃)，用流式细胞仪检测细胞内表示ROS水平的DCF平均荧光强度(MFI,n＝3)。
SGB对TBI诱导后的造血干细胞ROS产量的影响见图4。数据分析方式与图1阐述的相同。
从图4可以看出，4Gy H2O组造血干细胞中的ROS水平较0Gy H2O组大幅度增高，但4Gy SGB组造血干细胞中的ROS水平较4Gy H2O组明显降低，说明SGB给药后显著降低了TBI诱导的ROS产生。表明SGB可以降低辐射暴露小鼠造血细胞氧化，进而减小造血系统氧化损伤。
测试例5TBI放疗后小鼠中LSK细胞中DNA损伤(53BP1)分析
我们采用NDA损伤检验点分子53BP1的灶点观察分析DNA损伤。将收集好的细胞滴片用PBS缓冲液洗3遍，加入0.3％的Ttiton-100通透10min,PBS洗涤，封闭血清BlockingBuffer(20ml/L驴血清，30g/L牛血清白蛋白，0.3ml/L的Ttiton-100，PBS稀释)。封闭30min，加兔抗人一抗53BP1(1:2000)，37℃恒温孵育30min,PBS洗涤3遍，加入Cy3标记的抗兔荧光标记抗体，37℃恒温孵育30min，PBS洗涤3遍，用DAPI抗淬灭溶液封片。荧光显微镜观察结果并拍照。
SGB对TBI诱导造血干细胞DNA损伤的影响见图5。数据分析方式与图1阐述的相同。
从图5可以看出，4Gy SGB组与4Gy H2O组相比，显著降低LSK细胞的53PB1灶点数(灶点代表双链断裂及复制应激数量和大小与双链断裂数量一致)，表明SGB可以减小辐射所致的DNA损伤。同时，说明SGB可促进肿瘤放疗抵抗，而放疗抵抗的很大原因在于细胞DNA损伤修复。因此，SGB可能通过修复造血干细胞DNA损伤对肿瘤进行辅助治疗。
测试例6TBI放疗后的骨髓干细胞体外克隆形成实验
分选单个HSC到96孔板。细胞在200ml的添加有10％胎牛血清、1％牛血清白蛋白2ml谷氨酰胺，50μM 2-β-巯基乙醇、10μg/ml干细胞因子，血小板生成素，和IL-3的IMDM中培养。14d时记录克隆的数目和大小，判断长期造血干细胞的数量和自我更新能力。
SGB对TBI诱导后的造血干细胞克隆功能的影响见图6。数据分析方式与图1阐述的相同。
从图6可以看出，TBI放疗后，4Gy SGB组与4Gy H2O组相比，放疗后LT-HSC形成大克隆能力显著增强，总克隆数与对照组没有增加。提示SGB可使LT数目扩增，很可能是由于SGB对干细胞维持自身功能发挥的很重要作用，显示SGB可以从一定程度上改善放疗诱导的长期骨髓损伤。
测试7流式细胞仪分析CB化疗后骨髓造血干/祖细胞数量
对上述经过化疗实验的四组小鼠流式分析骨髓造血干细胞(HSC)。本测试的染色和分析方案同测试1。CB化疗对小鼠HSC各类群数量的影响如图7所示。
图7中，A表示细胞表面标记为Lin-scal+c-kit+的造血干细胞(LSK-HSC)数目；B表示淋系祖细胞(CLP)数目；C表示HSC中长期骨髓造血干细胞(LT)、短期骨髓造血干细胞(ST)、骨髓多潜能祖细胞(MPP)数目；D表示造血祖细胞(HPC)下共同髓系祖细胞(CMP)、巨核细胞-红细胞系祖细胞(MEP)及粒细胞-单核细胞祖细胞(GMP)所占的数目。数据以平均数±标准误差表示。N＝6只/组。﹡p<0.05vs H2O+CB；﹡﹡p<0.01vs H2O+CB。
从图7可以看出，CB化疗后，各组LSK-HSC、CLP数表现出大幅减少，CB-SGB组与CB-H2O组相比，小鼠骨髓LSK-HSC、CLP数则有显著回升。同时，下游的LT、ST、MPP的减少都有明显抑制，如图7-C所示。SGB对CB化疗后诱导的髓系祖细胞(CMP)减少有明显改善，如图7-D所示。这一结果表明，SGB可以有效治疗CB化疗后的骨髓损伤，明显表现在对造血干细胞干性、淋系祖细胞及髓系祖细胞的保护。
测试例8流式细胞仪分析CB化疗后骨髓细胞凋亡
本测试与测试7阐述的给药方式和数据分析方式相同，其染色和流式分析方案与测试2类同。SGB对CB化疗后骨髓细胞凋亡的影响见图8。
从图8可以看出，CB化疗后，CB-H2O组比H2O组CLP凋亡率显著升高，但是经过SGB给药(给药含SGB 240.82mg/kg小鼠体重的生理盐水溶液)后，CB-SGB组的CLP凋亡率与CB-H2O组相比，显著降低，基本接近H2O组水平。表明SGB可以抑制化学药物治疗引起的造血干细胞的凋亡，修复受损造血干细胞的造血功能。
测试例9流式细胞仪分析CB化疗后骨髓B淋巴细胞分化、发育各阶段细胞数目
本测试与测试7阐述的给药方式和数据分析方式相同，其染色和流式分析方案与测试3类同。SGB对CB化疗后B淋巴细胞分化、发育的影响见图9。图9中，A：骨髓细胞中前祖B细胞(pre-pro B)及祖B细胞(pro B)的数目；B：前B细胞(pre B)、不成熟B细胞(imm B)及成熟B细胞(matureB)的数目。
从图9可以看出，SGB对CB化疗后骨髓B淋巴细胞各分化、发育各阶段数目较CB生理盐水对照组均增多，特别是pre-pro B淋巴细胞与mature B淋巴细胞显著增加，如图9的pre-pro B、B mature项下，与图3相比，总体化疗后给药SGB较放疗后给药SGB的回升效果较好一些，如图9-A所示，CB对imm B也有很好的改善。表明骨髓B细胞比例升高可能是由于SGB促进了pre-pro B细胞更前体的细胞分化发育所致，亦或是SGB对pre-pro B细胞发育阶段的保护，imm B比例增加而其上游B细胞无显著增加，说明SGB可能对imm B发育过程某些阶段起到保护，mature B细胞比例增加可能是由于上游imm B细胞比例增加亦或是在化疗诱导的骨髓损伤中SGB对mature B细胞发育过程某些阶段起到保护作用。
测试例10CB化疗后造血细胞ROS水平检测
本测试与测试7阐述的给药方式和数据分析方式相同，其染色和流式分析方案与测试4类同。SGB对CB化疗后的造血干细胞ROS产量的影响见图10。
从图10可以看出，CB化疗后，CB-H2O组比H2O组造血干细胞中的ROS水平大幅度增高，但经过SGB给药后，CB-SGB组的ROS水平比CB-H2O组显著降低。显示SGB可以降低化疗损伤小鼠造血细胞RSO水平，进而减小造血系统氧化损伤。
测试例11半CB化疗后小鼠中LSK细胞中DNA损伤(53BP1)分析
本测试与测试7阐述的给药方式和数据分析方式相同，其染色和流式分析方案与测试5类同。SGB对CB化疗后造血干细胞DNA损伤的影响见图11。
从图11可以看出，CB-SGB组与CB-H2O组相比，显著降低LSK细胞的53PB1灶点数(灶点代表双链断裂及复制应激数量和大小与双链断裂数量一致)，提示SGB可减小CB所致的DNA损伤。同时，说明SGB可促进肿瘤化疗抵抗，因为化疗抵抗的很大原因在于细胞DNA损伤修复。因此，SGB可能通过修复化疗诱导的造血干细胞DNA损伤对肿瘤病人进行辅助治疗。
测试例12CB化疗后骨髓干细胞体外克隆形成实验
本测试与测试7阐述的给药方式和数据分析方式相同，其染色和流式分析方案与测试6类同。SGB对CB化疗后的造血干细胞克隆功能的影响见图12。
从图12可以看出，CB化疗后，SGB治疗小鼠组的LT-HSC总克隆数与生理盐水对照组相比显著性增加。具体为，SGB对LT-HSC形成大克隆和中克隆能力显著增强，如图12中CB-SGB项下Big及Middle。结果提示SGB可使LT在单细胞水平体外形成克隆能力显著增强，尤其是形成大克隆和中克隆能力，很可能是由于SGB对干细胞维持自身功能发挥很重要的作用，提示SGB可以基于保护造血干细胞功能进而改善化疗诱导的长期骨髓损伤。
综上，可见本发明实施方式提供的何首乌提取物制剂能够有效抑制放疗、化疗造成的造血干细胞凋亡，增加小鼠造血系统不同分化程度细胞的数量或比例，促进DNA损伤修复，促进骨髓细胞体外培养集落的形成，促进T、B淋巴细胞增殖，抑制放疗、化疗引起的慢性氧化应激，从而对放疗、化疗导致的骨髓损伤具有促进修护的作用。
本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明基本效应，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有更多突破和延伸，为临床辅助治疗造血功能障碍提供了更充分的实验依据。这些深化都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (8)

1.何首乌提取物及其制剂在制备促进放疗造成的骨髓损伤修复的药物中的应用，所述何首乌提取物的有效成分是二苯乙烯苷。
2.如权利要求1所述的应用，其中，所述制剂由所述何首乌提取物和制剂辅料制备；
所述何首乌提取物中二苯乙烯苷浓度为15-99重量％；
所述制剂中所述何首乌提取物的含量≥50重量％。
3.如权利要求2所述的应用，其中，所述制剂的类型包括丸剂、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、膏剂、溶液和注射液剂中的一种或多种。
4.如权利要求1-3中任一项所述的应用，其中，所述何首乌提取物通过下述方法制备得到：
将粉碎的何首乌干燥块根，用50体积％乙醇在10-35℃提取两次，每次24h，乙醇与何首乌药材的重量比为8:1，过滤，合并滤液，得何首乌第一提取物；
将所述何首乌第一提取物采用大孔树脂吸附柱分离纯化，得何首乌第二提取物；
将所述何首乌第二提取物采用硅胶柱精制，得到何首乌第三提取物；
所获得的何首乌提取物中二苯乙烯苷的浓度为15-99重量％。
5.何首乌提取物及其制剂在制备促进放疗造成的造血干细胞损伤修复的药物中的应用，所述何首乌提取物的有效成分是二苯乙烯苷。
6.如权利要求5所述的应用，其中，所述制剂由所述何首乌提取物和制剂辅料制备；
所述何首乌提取物中二苯乙烯苷浓度为15-99重量％；
所述制剂中所述何首乌提取物的含量≥50重量％。
7.如权利要求6所述的应用，其中，所述制剂的类型包括丸剂、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、膏剂、溶液和注射液剂中的一种或多种。
8.如权利要求5-7中任一项所述的应用，其中，所述何首乌提取物通过下述方法制备得到：
将粉碎的何首乌干燥块根，用50体积％乙醇在10-35℃提取两次，每次24h，乙醇与何首乌药材的重量比为8:1，过滤，合并滤液，得何首乌第一提取物；
将所述何首乌第一提取物采用大孔树脂吸附柱分离纯化，得何首乌第二提取物；
将所述何首乌第二提取物采用硅胶柱精制，得到何首乌第三提取物；
所获得的何首乌提取物中二苯乙烯苷的浓度为15-99重量％。
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