CN1047956C - 小麦醇溶蛋白的蛋白分子微胶囊制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明用凝胶过滤等手段纯化了一个天然蛋白质一小麦醇溶蛋白，该蛋白质在一定浓度的溶剂系统中经过搅拌处理可成膜成泡称为蛋白分子微胶囊。蛋白分子微胶囊在透射电子显微镜下观察直径为0.70-2.0μm，腔直径为0.66-1.89μm，膜的厚度为0.025μm，能包裹分子量为0.4kd-150kd的化合物。蛋白分子微胶囊具有良好的稳定性和通透性，经低温冷冻干燥后可压成鳞片状，加水后又可复原仍保持蛋白分子微胶囊的脱水、吸水、泡的稳定性(Dehydration-Rehydration-vesicles即DRV)。

Description

小麦醇溶蛋白的蛋白分子微胶囊制备方法

小麦醇溶蛋白的蛋白分子微胶囊技术，属生物技术领域。

现有技术：进入80年代后，随着分子改造，分子修饰研究的发展促进了以肽为原料的蛋白分子微胶囊研究兴起，从而拓宽了对人工膜的视野。在生物膜的分子间往往有不同蛋白质插入，无论插入部位深或浅都为实现其功能相统一。从分子水平分析生物膜结构的特点不外乎是蛋白质的结构不同，蛋白质与脂质之间出现的特殊分子排布所致。蛋白质分子的结构与功能也千差万别。蛋白分子微胶囊就其成膜条件而言也必需具有亲水和疏水的分子排布特点。

到目前为止文献中有关蛋白分子微胶囊的研究是通过分子改造的手段，对具有双功能骨架(multifunctional backbone)分子进行化学修饰，使其一端具有亲水特性，另一端具有疏水特性。关于头部修饰的手段有多种，如携带阳离子或非离子状态，以氟碳化合物或碳氢化合物的形式出现。头部与多功能骨架的连接往往通过水溶性羰二亚胺及超声波处理。头部的起点多为半胱氨酸或高半胱氨酸。R基团与氨基酸的连接除酯键外，还有季胺盐形式和烷氧基形式等等。目前仅处在理论研究阶段，尚未见实用。

美国食品和药物管理局1991年曾经用乳化剂取代方式对淀粉进行改性，用辛烯琥珀酸2％的取代使淀粉具有一定的疏水性质，这种改性淀粉有良好的微胶囊化效果，但抗氧化性差，很快又被禁用。因此，选择合适的天然蛋白质为原料用于食品和口服药物的微胶囊化研究在当前具有重要的理论意义和应用价值。

人工膜的研究有助于探讨生物膜的奥秘。在脂质体的研究领域中，由于成泡的原料不同，目前可将其分成磷脂为原料的脂质体；用肽为原料的蛋白分子微胶囊以及以多糖为原料的微胶囊。以磷脂为原料的脂质体的研究已有30多年的历史。从选材上多为天然化合物，如大豆磷脂、脑磷脂、卵磷脂及神经磷脂等。在制备脂质体时无论用单一组分还是几种组分的不同比例混合都不需要对分子进行修饰，只要满足成膜成泡条件便可顺利完成。脂质体成膜的基本条件是在于各种磷脂都具有天然的亲水头部和疏水的尾部，在成膜过程中满足合适的条件使分子呈有序排列，如双层膜之间是两个膜的疏水区而双层膜的两侧分别为亲水区。脂质体已用于药物载体，其缺点是载药范围及对膜多功能的修饰上有较大的局限性。

本发明的目的在于筛选出一种纯天然的，可用于人、畜、禽药物包被的无毒无害的原料，也可用于制备各种营养物质(油溶性、水溶性及醇溶性)包被外衣，甚至于用在化妆品和外用敷药等方面，这都需要无毒无害，纯天然的包被物质。

小麦醇溶蛋白及其类似物能满足以上需要。经世界专利数据库(WPI)及CA检索，说明该蛋白的提取及用于蛋白分子微胶囊的制备尚无先例，故表明本发明具有新颖性、创造性和实用性。

本发明的特点是：用无毒无害经纯化的天然蛋白质制成分子微胶囊，可囊括水溶性、脂溶性和醇溶性的物质，其分子量从0.4Kd至150Kd。具有良好的稳定性及良好的通透性，蛋白分子微胶囊的腔内径电镜下显示为0.66μm-1.89μm，膜的厚度为0.025μm。

优点及效果：成膜蛋白经修饰后制成蛋白分子微胶囊可包裹水溶性化合物如染料伊文斯兰(Evan′s blue)，不经修饰能包裹疏水化合物(美兰)。若在蛋白分子微胶囊中加入碱性品红染料，混匀后可见到红色透明的蛋白分子微胶囊出现，说明蛋白分子微胶囊具有良好的通透性。其通透性不限于上述染料或香料。

蛋白分子微胶囊包裹的荧光抗体用胃蛋白酶处理，经37℃24小时保温后，蛋白分子微胶囊的膜被胃蛋白酶消化呈网状结构。

蛋白分子微胶囊在pH5-8的介质中24小时或更长时间内未发现有任何变化，说明蛋白分子微胶囊在该pH范围内是稳定的。

蛋白分子微胶囊在室温下(15℃-25℃)几天，4℃下几个月，-20℃下数月存放不改变其形态特性。

纯化后的这种蛋白质，经氨基酸自动分析仪(Beckman 121BM)测定其氨基酸组成中含有五种脂肪烃侧链的氨基酸，即丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和脯氨酸以及一种芳香族氨基酸——苯丙氨酸。这六种具有不同疏水性质的氨基酸占该蛋白分子的26.4％，该蛋白质的N-未端为苯丙氨酸。该蛋白质的N-未端测定是在甲酸水(第一相)和苯-冰醋酸(第二相)系统中完成。点样后经双向层析，在苯丙氨酸位置出现了明显的荧光亮点，经DNS-phe标准样品与样品混合点样，证实二个样品落于一处。另外，在第一相层析后出现三个点，一点为原点，一点为ε-Lys，中心最亮的一点为DNS-OH，俗称鬼点。第二相DNS-OH与另一点分开，中心点即为该蛋白质的N-未端——苯丙氨酸。

蛋白分子微胶囊，脂质体和多糖的微胶囊都是良好的药物载体。由于成膜的原料不同，其分子结构也不同，显然与其生物学功能之间关系不容忽视。选择合适的天然蛋白质作为分子微胶囊的原料，用于食品和口服药物及化妆品的分子微胶囊化的研究，作为导向人工膜蛋白，受体人工膜蛋白，人工全合成膜蛋白分子的基因工程的研究。用该蛋白质为抗原所制备的抗体对小麦质量的鉴定及小麦新品种的选育，完善对麦粉的全面认识，更具有深远的理论意义和应用价值。

包裹药物的分子微胶囊用于口服定位释放，适用于对胃有刺激和有较大毒性不能直接服用的药物。口服的蛋白分子微胶囊是磷脂脂质体定位释放所不能及的。包裹香料的蛋白分子微胶囊用于化妆品同样可以解决延缓释放的问题。

本发明的技术内容及方案：

1.原料

麦粉经分离，纯化后得到的醇溶蛋白见附图1，其使用浓度为0.5-5.0mg/ml。麦粉除小麦面粉外还包括大麦、燕麦、高粱、玉米等种子面粉。

2.被包被液与麦醇溶蛋白溶液的比例

蛋白质溶液∶水∶伊文斯兰(Evan′s blue)以(3-4)∶(0-4)∶(1-3)的体积比混合，加入适量蔗糖脂肪酸酯，在室温下(15-25℃)200-1000rpm搅拌10-20分钟，制成蛋白分子微胶囊。

蛋白质∶氨基黑∶食用油以2∶1∶1体积比例混合后，加入与食用油相同体积的苏丹III，制成兰边红芯包油的蛋白分子微胶囊。

蛋白质溶液∶水∶荧光抗体以3∶(0-4)∶(0.5-2)的体积比混合，加适量蔗糖脂肪酸酯，在室温下(15-25℃)200-1000rpm搅拌10-20分钟，可制成荧光抗体掺入的蛋白分子微胶囊。

3.被包被物的分子量范围

所制备的蛋白质分子微胶囊可包裹分子量0.4kD-150kD化合物，其中包括水溶性化合物(如染料Evan′s blue等)，脂溶性化合物和醇溶性化合物。

4.蛋白分子微胶囊成膜条件

上述被包被液与小麦醇溶蛋白溶液的体积比，加适量蔗糖脂肪酸酯，在室温下(15-25℃)下，200-1000rpm搅拌10-20分钟，可制成有良好稳定性和良好通透性的蛋白分子微胶囊，该蛋白分子微胶囊的腔直径为0.66-1.89μm，膜厚度为0.025μm。

5.按本发明制备的蛋白分子微胶囊，可用于包裹各种药物、维生素、营养素及其他化合物，可用于人、禽、畜药物载体，化妆品及食品中特殊成份的载体。该蛋白分子微胶囊可在常规条件下与抗体分子结合制成导向蛋白，例如：兔抗鼠、羊抗兔、兔抗豚鼠抗体，见附图3。

6.检测手段

蛋白质的含量用Folin-酚法测定或用紫外吸收法测定，蛋白分子微胶囊的检测用光学显微镜(200x，400x)，荧光显微镜及JEM-100CX透射电子显微镜观测。

实施例：

实例1

小麦醇溶蛋白的提取及纯化：小麦粉经过200目过筛，并以1∶4的重量比加入40-90％的乙醇进行浸泡提取，4-5小时后200目尼龙绸过滤，该滤液即为醇溶蛋白的粗制品。取占胶床体积1-3％的上述滤液，通过胶床体积为38.0毫升的Sephadex LH₂₀柱，其直径与高度的比为1.5厘米∶22.5厘米，在洗脱速度为0.2毫升/分钟条件下，经过40-90％的乙醇洗脱的第一个峰即为下述各实施例所采用的原料来源，见附图1。

实例2

小麦醇溶蛋白分子微胶囊的制备：用实例1经纯化的小麦醇溶蛋白以0.5-5.0mg/ml的浓度，以蛋白质溶液∶水∶伊文斯兰(Evan′s blue)以(3-4)∶(0-4)∶(1-3)的体积比例混合后，并加入占总体0.1％的蔗糖脂肪酸酯，在室温下(15-25℃)进行200-1000rpm 10-20分钟的混合搅拌，成为微胶囊悬液。再于-20℃冷冻干燥制成微胶囊干粉，此粉经加水至原体积复溶后仍保持原胶囊微型结构的膜完整性。此称为冷冻干燥及吸水复原特性或DRV特性。

实例3

小麦醇溶蛋白分子微胶囊包裹抗体的制备方法：经纯化的小麦醇溶蛋白以0.5-5.0mg/ml的浓度，以蛋白质溶液∶水∶荧光抗体(如GAR-FITC羊抗兔荧光抗体或GAH-FITC羊抗人荧光抗体或兔抗豚鼠荧光抗体，)为3∶(0-4)∶(0.5-2)的体积比，加入占总体0.1％的蔗糖脂肪酸酯，在室温(15-25℃)下进行200-1000rpm10-20分钟混合搅拌，制成定位释放微胶囊悬液，此悬液在荧光显微镜下可观察到黄绿色荧光球，见附图3。再加入过量的胃蛋白酶0.01g/200μl及200μl酸性缓冲液，以模拟胃内环境于37℃下作用24小时，荧光显微镜下观察到绿色荧光弥散及囊膜破坏成网状。

实例4

小麦醇溶蛋白分子微胶囊囊泡的检测方法：按实例1制成的蛋白分子微胶囊悬液，用0.25％戊二醛固定后，在45℃-50℃下加入等体积的0.1-0.16％琼脂，待冷后进行冰冻切片，JEM-100CX透射电镜观察，蛋白分子微胶囊的腔直径为0.66-1.89μm，膜的厚度为0.025μm。

实例5

包油分子微胶囊制备方法及检测手段：经纯化的小麦醇溶蛋白以0.5-5.0mg/ml的浓度，按蛋白质∶氨基黑∶食用油以2∶1∶1体积比例，加或不加蔗糖脂肪酸酯在室温(15-25℃)下进行200-1000rpm10-20分钟混合搅拌，加入苏丹III染料，再混匀，在光学显微镜下可观察到兰边红芯小泡，即包油的蛋白分子微胶囊，见附图2。

实例6

实例6

小麦醇溶蛋白分子微胶囊稳定性的观察：按实例1样品所用蛋白质浓度，以蛋白质∶美兰∶水按12∶2∶1的体积比例，在室温(15-25℃)下以200-1000rpm搅拌10-20分钟，制成蛋白分子微胶囊，光学显微镜下可见兰色蛋白分子微胶囊。将样品于4-6℃及-15--20℃下存放数月，再用显微镜400x下观察，未见微胶囊形态任何变化。

实例7

小麦醇溶蛋白分子微胶囊通透性的检测：按实例1所用蛋白质浓度，以蛋白质∶水以(1-5)∶(5-15)体积比例制成的蛋白分子微胶囊，再加入适量美兰溶液，混匀后在光学显微镜下见到兰色蛋白分子微胶囊。美兰在1-2分钟内进入微胶囊内。证明蛋白分子微胶囊有良好的通透性。

实例8

用大麦、高粱、玉米和燕麦粉替代小麦粉作醇溶蛋白的原料：除按实例1用小麦面粉经过200目筛网外还可用大麦、高粱、玉米和燕麦粉过200目筛网，并以1∶4的重量比加入40-90％的乙醇溶液进行浸泡提取，4-6小时后经200目尼龙绸过滤，该滤液即为醇溶蛋白粗品，纯化后获得的醇溶蛋白亦可用于蛋白分子微胶囊的制备。

附图说明：

图1  小麦醇溶蛋白的Sephadex LH₂₀凝胶过滤纯化洗脱图

图2  小麦醇溶蛋白分子微胶囊包裹食用油光学显微镜照片

     3.3×10

图3  小麦醇溶蛋白分子微胶囊包裹兔抗豚鼠荧光抗体光学

     显微镜照片10×40

Claims (1)

1.纯化后的小麦醇溶蛋白的蛋白分子微胶囊制备方法，其特征是：包括小麦醇溶蛋白的纯化方法、微胶囊悬液和微胶囊干粉的制备方法，

1)小麦醇溶蛋白的纯化方法：

小麦粉经过200目过筛，并以1∶4的重量比加入40-90％的乙醇进行浸泡提取，经4-6小时后200目尼龙绸过滤，该滤液用于醇溶蛋白的纯化；取占胶床体积1-3％的上述滤液，通过胶床体积为38.0毫升的Sephadex LH₂₀柱层析纯化，其柱直径与高度的比为1.5厘米∶22.5厘米，洗脱速度为0.2毫升/分钟，在此条件下，经过40-90％的乙醇洗脱得到的第一个峰值即为纯化的小麦醇溶蛋白，该蛋白组成中疏水氨基酸为26.4％-32.9％，其中含有五种脂肪族侧链氨基酸即丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和脯氨酸，另有一种芳香族氨基酸为苯丙氨酸，该蛋白的N-未端氨基酸为苯丙氨酸；

2)用上述经纯化的小麦醇溶蛋白以0.5-5.0mg/ml的浓度与水，伊文斯兰(Evan′s blue)混合，蛋白质溶液，水，伊文斯兰(Evan′sblue)三者的体积比为(3-4)∶(0-4)∶(1-3)混合后加入蔗糖脂肪酸酯为总体积的0.1％，在室温(15-25℃)下进行200-1000rpm，10-20分钟的混合搅拌，制备成为微胶囊悬液；再于-20℃下冷冻干燥，制成微胶囊干粉。

Images