CN104781672B

CN104781672B - 预测女性对象患癌症风险或诊断其癌症的方法

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Publication number: CN104781672B
Application number: CN201380051613.1A
Authority: CN
Inventors: 安德里亚斯·伯格曼; 欧勒·梅兰德
Original assignee: Si Fuyingao Tektronix Ltd
Current assignee: Si Fuyingao Tektronix Ltd
Priority date: 2012-10-02
Filing date: 2013-10-01
Publication date: 2019-07-05
Anticipated expiration: 2033-10-01
Also published as: PL2904398T3; EP2904398B1; RU2707755C2; RU2015116675A; CN104781672A; US20230147663A1; CA2886814C; RU2018138055A; WO2014053502A1; RU2018138055A3; US9702876B2; CA2886814A1; JP6392762B2; HK1212762A1; EP2904398A1; RU2019137669A; ES2676737T3; RU2019137669A3; DK2904398T3; CN110221071A

Abstract

本发明的主题为预测未患癌症的女性对象患癌症的风险或诊断女性对象的癌症的方法，包括：测定获自所述女性对象的体液中的脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段(包括Leu‑脑啡肽和Met‑脑啡肽)的水平；以及将所述脑啡肽原或其片段的水平与患癌症风险相关联，其中降低的水平预测增加的患癌症风险，或者诊断癌症，其中降低的水平与癌症的诊断相关。

Description

预测女性对象患癌症风险或诊断其癌症的方法

本发明的主题为用于预测未患癌症的女性对象患癌症的风险或诊断女性对象癌症的方法，包括：

·测定获自所述女性对象的体液中的脑啡肽原(PENK)或其具有至少5个氨基酸的片段(包括Leu-脑啡肽和Met-脑啡肽)的水平；以及

·将所述脑啡肽原或其片段的水平与患癌症风险相关联，其中降低的水平预测增加的患癌症风险，或者诊断癌症，其中降低的水平与癌症的诊断相关。

Met-脑啡肽是一种衍生自脑啡肽前体(前脑啡肽原)的具有5个氨基酸的肽，也称为“阿片生长因子”(OGF)，其与脑啡肽原片段一起释放。成熟肽结合不同的阿片受体(Koneru et al,2009)。已发现脑啡肽(OGF)具有多种生理功能。在CNS中，其下调P物质相关的疼痛信号转导，作为细胞因子起作用(Plotnikoff et al,1997)。脑啡肽原相关的肽展现抗菌作用(Goumon et al,1998)。脑啡肽原和脑啡肽展现抗肿瘤作用，并作为促细胞凋亡剂起作用(Tavish et al,2007,Donahue et a.,2011,Zagon et al,2009)。

用于预测男性的癌症风险的血管活性肽的使用已被Belting et al,Cancer,Epidemiology,Biomarkes & Prevention报导。测量了来自在1991-1994年的基线检查前无癌症的“马尔摩饮食与癌症研究”参与者(1768名男性和2293名女性)空腹血浆中的MR-pro-ANP、MR-pro-ADM和肽素。作者叙述到在女性中，生物标记和癌症发生之间没有关系。

本发明的主题是研究PENK用于预测癌症发生和预测癌症复发风险的预后和诊断力。为了解决这个问题，在所述瑞典前瞻性群组研究(马尔摩饮食与癌症研究)中测量了空腹血浆中稳定的脑啡肽原片段(Ernst et al,2006)以及该生物标记的基线水平与15年的随访期间的乳腺癌发生率的相关性。

令人吃惊地，显示脑啡肽原为针对女性的用于预测未患癌症的女性对象患癌症的风险或诊断女性对象的癌症的有力和高度显著的生物标记。

因此，本发明的主题为用于预测未患癌症的女性对象患癌症的风险或诊断女性对象的癌症的方法，包括：

·测定获自所述女性对象的体液中的脑啡肽原或具有其至少5个氨基酸的片段的水平；以及

·将所述脑啡肽原或其片段的水平与患癌症的风险相关联，其中降低的水平预测增加的患癌症风险，或者诊断癌症，其中降低的水平与癌症的诊断相关。

癌症的实例可选自：乳腺癌、肺癌、胰腺癌和结肠癌。

在整个说明书中，应理解术语脑啡肽原的片段还包括Leu-脑啡肽和Met-脑啡肽。

在本发明的具体实施方案中，所述癌症为乳腺癌。在本发明的另一具体实施方案中，所述癌症为肺癌。

因此，本发明的主题为测定女性患上癌症如乳腺癌、肺癌等的易感性。

本研究中获得的数据还揭示了男性对象患癌症的风险与获自所述男性对象体液中的脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段的水平之间的关联性；然而，尽管在男性中，在同样降低的PENK水平下具有明显的增加的癌症风险趋势，该关联性对于当前数据集来说在统计上并非显著性的。因此，本发明的方法同样对于男性对象具有价值，但在本研究中，对于男性所观察到的效应不如女性强烈。这可能主要是由于男性群体中的较少数目的癌症发生。

此外，本研究中获得的数据还揭示出女性对象的患癌症风险与获自所述女性对象体液中的脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段的水平之间的关联性，其中所述癌症不为肺癌或乳腺癌。然而，由于该特定群体中较少数目的发生，对于当前数据集来说，该关联性在统计上并不显著。尽管其不显著，仍然存在明显的趋势。此外，可信的是，由于已知脑啡肽(PENK的片段)的促细胞凋亡效应，当前数据表明主要的关联也存在于其他癌症中。从现有技术来看，令人吃惊的是脑啡肽原或其片段可以预测癌症。从当前的在统计上与乳腺癌和肺癌高度相关的数据来看，可以预期并且可信的是，其同样可以预测其他类型的癌症。

如本文所用的术语“对象”是指活的人或非人生物。优选地，在本文中所述对象为人对象。

术语“降低的水平”是指低于某个阈值水平的水平。

体液可选自：血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(csf)和唾液。

在本发明的一个实施方案中，在从所述女性对象采集体液样品时所述女性对象从未患有诊断的癌症。

在另一个实施方案中，所述女性对象在之前已被诊断为患有癌症且在从所述女性对象采集体液样品时已得到治愈，并且确定了患癌症的复发风险或者预测了癌症的复发。

脑啡肽原具有如下序列：

SEQ ID NO.1(脑啡肽原(1-243)

ECSQDCATCSYRLVRPADINFLACVMECEGKLPSLKIWETCKELLQLSKPELPQDGTSTLRENSKPEESHLLAKRYGGFMKRYGGFMKKMDELYPMEPEEEANGSEILAKRYGGFMKKDAEEDDSLANSSELLKELLETGDNRERSHHQDGSDNEEEVSKRYGGFMRGLKRSPQLEDEALELQKRYGGFMRRVGRPEWWMDYQKRYGGFLKRFAEALPSDEEGESYSKEVPEMEKRYGGF MRF

可在体液中测定的脑啡肽原的片段可以，例如选自如下片段：

SEQ ID NO.2(合成脑啡肽,脑啡肽原1-73)

ECSQDCATCSYRLVRPADINFLACVMECEGKLPSLKIWETCKELLQLSKPELPQDGTSTLRENSKPEESHLLA

SEQ ID NO.3(Met-脑啡肽)

YGGFM

SEQ ID NO.4(Leu-脑啡肽)

YGGFL

SEQ ID NO.5(脑啡肽原90-109)

MDELYPMEPEEEANGSEILA

SEQ ID NO.6(脑啡肽原119-159,中间区脑啡肽原-片段,MRPENK)

DAEEDDSLANSSDLLKELLETGDNRERSHHQDGSDNEEEVS

SEQ ID NO.7(Met-脑啡肽-Arg-Gly-Leu)

YGGFMRGL

SEQ ID NO.8(脑啡肽原172-183)

SPQLEDEAKELQ

SEQ ID NO.9(脑啡肽原193-203)

VGRPEWWMDYQ

SEQ ID NO.10(脑啡肽原213-234)

FAEALPSDEEGESYSKEVPEME

SEQ ID NO.11(脑啡肽原213-241)

FAEALPSKEEGESYSKEVPEMEKRYGGF M

SEQ ID NO.12(Met-脑啡肽-Arg-Phe)

YGGFMRF

测定脑啡肽原或其片段(包括Leu-脑啡肽和Met-脑啡肽)的水平可能指测定针对脑啡肽原或其片段(包括Leu-脑啡肽和Met-脑啡肽)的免疫反应性。根据结合区，用于测定脑啡肽原或其片段(包括Leu-脑啡肽和Met-脑啡肽)的结合剂可结合以上所示分子中的多于一种。这对本领域技术人员是清楚的。

因此，根据本发明，通过使用至少一种与以上肽和肽片段(即，根据序列1-12中的任一个所示的脑啡肽原(PENK)和片段)中任一个的氨基酸序列中的区域结合的结合剂，测定了获自所述对象体液中的免疫反应性分析物的水平；并与临床相关的特定实施方案相关联。

在根据本发明的方法的更具体的实施方案中，测定了MRPENK(SEQ ID NO.6:脑啡肽原119-159,中间区脑啡肽原-片段,MRPENK)的水平。在更具体的实施方案中，通过使用与MR-PENK结合的至少一种结合剂，测定了免疫反应性分析物的水平，并与根据本发明的临床相关的具体实施方案相关联。

测定脑啡肽原或其片段(包括Leu-脑啡肽和Met-脑啡肽或其片段)的水平，可能是指测定针对脑啡肽原或其片段(包括Leu-脑啡肽和Met-脑啡肽)的免疫反应性。根据结合区，用于测定脑啡肽原或其片段(包括Leu-脑啡肽和Met-脑啡肽)的结合剂可结合以上所示分子中的多于一种。这对于本领域技术人员来说是清楚的。在本发明的另一实施方案中，所述片段不为Leu-脑啡肽或Met-脑啡肽。在本发明的另一实施方案中，测定了针对脑啡肽原或其片段(不包括Leu-脑啡肽和Met-脑啡肽)的免疫反应性。

在根据本发明的方法的更具体的实施方案中，测定了MRPENK(SEQ ID NO.6(脑啡肽原119-159,中间区脑啡肽原-片段,MRPENK,DAEEDDSLANSSDLLKELLETGDNRERSHHQDGSDNEEEVS)的水平。

可选地，可通过其他分析方法如质谱测定上述分析物中的任一种的水平。

在具体的实施方案中，利用免疫分析，使用结合脑啡肽原或其片段的抗体或抗体片段测量脑啡肽原或其片段的水平。可用于测定脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段的水平的免疫分析，可包括实施例2中概述的步骤。所有阈值和值必须理解为与根据实施例2所述使用的测试和校准相关。本领域技术人员可了解，阈值的绝对值可被所用的校准影响。这意味着，应当在本文(实施例2)中使用的校准的上下文中理解本文给出的所有值和阈值。

根据本发明，针对脑啡肽原的诊断性结合剂选自：抗体如IgG(一种典型的全长免疫球蛋白)，或至少包含重链和/或轻链的F-可变域的抗体片段如化学偶联的抗体(结合抗原的片段)，包括但不限于：Fab-片段包括Fab小抗体、单链Fab抗体、具有表位标签的单价Fab抗体如Fab-V5Sx2；与CH3结构域二聚化的二价Fab(小抗体)；二价Fab或多价Fab，例如在异源结构域的帮助下通过多聚化形成的，例如通过dHLX结构域的二聚化形成的如Fab-dHLX-FSx2；F(ab')2-片段、scFv-片段、多聚化的多价或/和多特异性scFv-片段、二价和/或双特异性双体、(双特异性T细胞连接物)、三功能抗体、多价抗体，例如来自不同于G的类型；单结构域抗体如来源于骆驼或鱼免疫球蛋白的纳米抗体。

在具体的实施方案中，使用与脑啡肽原或其片段结合的、选自适配子、非Ig支架的结合剂(在下文有更详细的描述)，利用分析来测量脑啡肽原或其片段的水平。

可用于测定脑啡肽原或其片段的水平的结合剂展现的与脑啡肽原的亲和常数为至少10⁷M^-1，优选10⁸M^-1，优选亲和常数大于10⁹M^-1，最优选大于10¹⁰M^-1。本领域技术人员了解，可考虑通过施用较高剂量的化合物来补偿较低的亲和力，并且这一措施不会导致本发明超范。可使用Biacore法测定结合亲和力,所述方法在例如Biaffin,Kassel,Germany(http://www.biaffm.com/de/)处作为服务分析提供。

人脑啡肽原对照样品可购自ICI-Diagnostics,Berlin,Germany http://www.ici-diagnostics.com/。测定还可通过合成(对于我们的实验，我们使用了合成的MRPENK,SEQ ID NO.6)或重组脑啡肽原或其片段来校准。

根据本发明的方法，用于测定女性对象患乳腺癌的风险或诊断女性对象的乳腺癌的阈值小于100pmol/l PENK，优选小于50pmol/l，更优选小于40.4pmol/l。在具体的实施方案中，所述阈值为约40.4pmol/l。这些阈值与上文提及的校准方法相关。小于所述阈值的PENK值意味着所述对象具有增加的患癌症风险或已患癌症。

在本发明的一个实施方案中，为了监测女性对象患乳腺癌的风险或为了监测治疗过程，实施所述方法多于一次。在一个具体的实施方案中，为了评估所述女性对象对采取的预防性和/或治疗性措施的反应而进行所述监测。

在本发明的一个实施方案中，使用了所述方法以将所述女性对象分级为风险组。

本发明的主题还为根据任何前述实施方案的用于预测女性的患癌症风险或确定女性对象具有增加的患癌症风险的方法，其中通过可选自如下的替代性方法，将获自所述女性对象体液中的脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段的水平单独或联合其他可用于预后的实验室或临床参数，用于预测对象发生不良事件的风险：

·在“健康的”或“表面上健康的”对象群体中的预定样品的总体中，与获自所述女性对象体液中的脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段的水平的中值比较，

·在“健康的”或“表面上健康的”对象群中的预定样品的总体中，与获自所述女性对象体液中的脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段的水平的分位数比较，

·基于Cox比例风险分析或者通过使用风险指数计算如NRI(净重新分类指数)或IDI(整合鉴别指数)来进行计算。

在本发明的一个实施方案中，本发明的主题还为根据任何前述实施方案的用于预测女性患癌症的风险或确定女性对象具有增加的患癌症风险的方法，其中获自所述女性对象体液中的脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段的水平单独或联合其他可用于预后的生物标记。这样的可用生物标记可为神经降压素原及其具有至少5个氨基酸的片段。

在根据本发明的方法更具体的实施方案中，除了测定脑啡肽原及其片段外还测定了神经降压素原1-117的水平。

因此，本发明的主题还为用于预测未患癌症的女性对象患癌症的风险或者诊断女性对象的癌症的方法，包括：

·测定获自所述女性对象体液中的脑啡肽原或其具有至少5个氨基酸的片段(包括Leu-脑啡肽和Met-脑啡肽)的水平；以及

·测定获自所述女性对象的体液中的神经降压素原或其具有至少5个氨基酸的片段的水平；以及

·将所述脑啡肽原或其片段以及神经降压素原或其具有至少5个氨基酸的片段的水平与患癌症风险相关联，其中降低的脑啡肽原水平预测增加的患癌症风险，或者诊断癌症，其中降低的水平与癌症的诊断相关，并且其中增加的神经降压素原水平预测增加的患癌症风险，或者诊断癌症，其中增加的水平与癌症的诊断相关。

SEQ ID NO.13(神经降压素原1-147)

SDSEEEMKAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS WKMTLLNVCS LVNNLNSPAE

ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DGFSLEAMLT IYQLHKICHS RAFQHWELIQ

EDILDTGNDK NGKEEVIKRK IPYILKRQLY ENKPRRPYIL KRDSYYY

SEQ ID NO.14(神经降压素原1-125(大神经介肽N))

SDSEEEMKAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS WKMTLLNVCS LVNNLNSPAE

ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DGFSLEAMLT IYQLHKICHS RAFQHWELIQ

EKILDTGNDK NGKEEVIKR KIPYIL

SEQ ID NO.15(神经介肽N)

KIPYILSEQ ID NO.16(神经降压素)

pyroQLYENKPRRP YIL

SEQ ID NO.17(神经降压素原1-117)

SDSEEEMKAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS WKMTLLNVCS LVNNLNSPAE

ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DGFSLEAMLT IYQLHKICHS RAFQHWELIQ

EDILDTGNDK NGKEEVI

SEQ ID NO.18(神经降压素原1-132)

SDSEEEMKAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS WKMTLLNVCS LVNNLNSPAE

ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DGFSLEAMLT IYQLHKICHS RAFQHWELIQ

EDILDTGNDK NGKEEVIKRK IPYILKRQLY EN

SEQ ID NO.19(神经降压素原120-140)

KIPYILKRQL YENKPRRPYI L

SEQ ID NO.20(神经降压素原120-147)

KIPYILKRQL YENKPRRPYIL KRDSYYY

SEQ ID NO.21(神经降压素原128-147)

QLYENKPRRP YILKRDSYYY

在具体的实施方案中，利用免疫分析测量神经降压素原的水平。更具体地，按Ernst et al.(Peptides(2006),(27)1787-1793)中所述使用免疫分析。可用于测定神经降压素原或其具有至少5个氨基酸的片段的水平的免疫分析可包括实施例2中所概述的步骤。所有阈值和值必须理解为与按实施例2中所述使用的测试和校准相关联。本领域技术人员可了解，阈值的绝对值可被所用的校准影响。这意味着，应在本文(实施例2)中使用的校准的上下文中理解本文中给出的所有值和阈值。人神经降压素原-校准器可购自ICI-Diagnostics,Berlin,Germany。可选地，还可通过合成或重组P-NT 1-117或其片段来校准所述分析(还参见Ernst et al,2006)。

可用于测定神经降压素原或其片段的水平的结合剂展现的与神经降压素原的亲和常数为至少10⁷M-¹，优选10⁸M-¹，优选亲和常数大于10⁹M-¹，最优选大于10¹⁰M-¹。本领域技术人员了解，可考虑通过施用较高剂量的化合物来补偿较低的亲和力，并且这一措施不会导致本发明超范围。可使用Biacore法测定结合亲和力，所述方法在例如Biaffin,Kassel,Germany(http://www.biaffin.com/de/)处作为服务分析提供。根据本发明的方法，用于测定女性对象患乳腺癌的风险或诊断女性对象的乳腺癌的阈值大于78pmol/l PNT，优选100pmol/l，更优选150pmol/l。在一个具体的实施方案中，所述阈值约100pmol/l。这些阈值与以上提及的校准方法相关。P-NT值大于所述阈值意味着对象具有增加的患癌症风险或已患癌症。

在本发明的一个实施方案中，为了监测女性对象患乳腺癌的风险，或为了监测治疗过程，实施所述方法多于一次。在一个具体的实施方案中，为了评估所述女性对象对采取的预防性和/或治疗性措施的反应而进行所述监测。

在本发明的一个实施方案中，使用所述方法以将所述女性对象分级为风险组。

在本发明的一个实施方案中，癌症选自乳腺癌和肺癌。

本发明的主题还为用于测定样品中的脑啡肽原和脑啡肽原片段的分析，其包含与脑啡肽原区中的两个不同区域即氨基酸133-140(LKELLETG,SEQ ID NO.22)和氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ ID NO.23)结合的两种结合剂，其中所述区域中的每个包含至少4或5个氨基酸。

在根据本发明的用于测定样品中的脑啡肽原或脑啡肽原片段的分析的一个实施方案中，所述分析的分析灵敏度能够定量健康对象的脑啡肽原或脑啡肽原片段，并且<15pmol/，优选<10pmol/l，并且更优选L<6pmol/L。

在根据本发明的用于测定样品中的脑啡肽原或脑啡肽原片段的分析的一个实施方案中，所述结合剂展现的与其结合伴侣的结合亲和力为至少10⁷M^-1，优选10⁸M^-1，优选地亲和常数小于10⁹M^-1，最优选小于10¹⁰M^-1。本领域技术人员了解，可考虑通过施用较高剂量的化合物来补偿较低的亲和力，并且这一措施不会导致本发明的超范围，可按如上所述测定结合亲和力。

在根据本发明的用于测定样品中的脑啡肽原或脑啡肽原片段的分析的一个实施方案中，该为三明治型分析，优选为全自动化的分析。其可为ELISA全自动化的或手动的。其可为所谓的POC检测(现场护理(point-of-care))。自动化或全自动化的分析的实例包括可用于如下体系中一种的分析：RocheAbbottSiemensBrahmsBiomerieuxAlere检测形式的实例在上文有提供。

在根据本发明的用于测定样品中的脑啡肽原或脑啡肽原片段的分析的一个实施方案中，所述两种结合剂中的至少一种被标记以被检测。标记的实例在上文有提供。

在根据本发明的用于测定样品中的脑啡肽原或脑啡肽原片段的分析的一个实施方案中，所述两种结合剂中的至少一种与固相结合。固相的实例在上文有提供。

在根据本发明的用于测定样品中的脑啡肽原或脑啡肽原片段的分析的一个实施方案中，所述标记选自：化学发光标记、酶标记、荧光标记、放射碘标记。

本发明的其他方面为试剂盒，其包含根据本发明的分析，其中所述分析的组分可包含在一个或多个容器中。

实施例

实施例1

抗体的开发

肽

合成了肽(JPT Technologies,Berlin,Germany)。

用于免疫的肽/缀合物：

利用用于将肽与牛血清白蛋白(BSA)缀合的另外的N端半胱氨酸氨基合成了用于免疫的肽(JPT Technologies,Berlin,Germany)。通过使用硫代SMCC(Perbio-science,Bonn,Germany)将肽与BSA共价连接。根据Perbio手册进行偶联方案。

表1：

用于免疫的肽	脑啡肽序列
		(C)DAEEDD	119-125
(C)EEDDSLANSSDLLK	121-134
		(C)LKELLETG	133-140
(C)TGDNRERSHHQDGSDNE	139-155

(C)SDNEEEVS

152-159

根据以下方法产生了抗体：

在第0天和14天以100μg肽-BSA缀合物(在100μl完全弗氏佐剂中乳化)免疫BALB/c小鼠，并在第21和28天以50μg(在100μl不完全弗氏佐剂中)免疫。在进行融合实验前3天，动物接受了溶解于100μl盐水中的50μg的缀合物，给出为一次腹膜内和一次静脉内注射。

37℃下将来自免疫的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系SP2/0的细胞与1ml 50％聚乙二醇融合30s。洗涤后，将细胞接种在96孔细胞培养平板中。通过在HAT培养基[RPMI 1640培养基，补充有20％胎牛血清和HAT-补充物]培养来挑选杂合子克隆。2周后，将HAT培养基替换为HT培养基，传代3代，然后回复至正常细胞培养基。

在融合后3周，首先筛选细胞培养上清液的抗原特异性IgG抗体。将阳性测试微量培养物转移至24孔板用于繁殖。再次测试后，使用有限稀释技术克隆和再克隆所挑选的培养物，并测定了同种型。

(Lane,R.D.“A short-duration polyethylene glycol fusiontechnique forincreasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas”,J.Immunol.Meth.81:223-228；(1985),Ziegler,B.et al.“Glutamate decarboxylase(GAD)is not detectable on the surface of rat islet cells examined bycytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity ofmonoclonal GAD antibodies”,Horm.Metab.Res.28:11-15,(1996))。

单克隆抗体制备

通过标准抗体制备方法(Marx et al.,Monoclonal Antibody Production(1997),ATLA 25,121)制备抗体，并通过蛋白A-色谱法纯化。基于SDS凝胶电泳分析的抗体纯度>95％。

抗体的标记和包被

根据以下方案用吖啶酯标记所有抗体：

标记的化合物(示踪物)：100μg(100μl)抗体(1mg/ml于PBS中,pH7.4),与10μl吖啶NHS-酯(1mg/ml于乙腈中,InVent GmbH,Germany)(EP 0353971)混合，并在室温下孵育20min。在Bio-Sil SEC 400-5(Bio-Rad Laboratories,Inc.,USA)上通过凝胶过滤HPLC来纯化标记的抗体。将纯化的标记抗体稀释在(300mmol/l磷酸钾、100mmol/l NaCl、10mmol/lNa-EDTA、5g/l牛血清白蛋白，pH 7.0)中。终浓度为每200μl约800.000相对光单位(RLU)的标记的化合物(约20ng标记的抗体)。

通过使用AutoLumat LB 953(Berthold Technologies GmbH & Co.KG)来测量吖啶酯化学发光。

固相抗体(包被的抗体)：

固相：用抗体(1.5μg抗体/0.3ml 100mmol/l NaCl,50mmol/l Tris/HCl,pH 7.8)包被聚苯乙烯管(Greiner Bio-One International AG,Austria)(18h，室温)。在用5％牛血清白蛋白封闭后，用PBS,pH 7.4洗涤管子，并真空干燥。

抗体特异性：

不同抗体的交叉反应列出在表2中。

表2：

用于免疫的肽	前脑啡肽原序列	抗体名称
			(C)DAEEDD	119-125	NT-MRPENK
(C)EEDDSLANSSDLLK	121-134	NM-MRPENK
			(C)LKELLETG	133-140	MR-MRPENK
(C)TGDNRERSHHQDGSDNE	139-155	MC-MRPENK
			(C)SDNEEEVS	152-159	CT-MRPENK

按如下所述测定抗体交叉反应：

将于300μl PBS,pH 7,4中的1μg肽移取至聚苯乙烯管中，并在室温下孵育1h。孵育后，使用于PBS,pH 7,4中的5％BSA将管子洗涤5次(每次1ml)。添加每种标记的抗体(300μl于PBS中,pH 7.4,800.000RLU/300μl)，并在室温下孵育2h。在洗涤5次(每次1ml的洗涤溶液(20mmol/l PBS,pH 7.4,0.1％Triton X 100)后，使用AutoLumat LB 953定量剩余的冷光(标记的抗体)。将MRPENK-肽用作参照物质(100％)。

表3：

所有抗体均结合MRPENK肽，这与用于免疫的肽相当。除了NT-MRPENK-抗体(与EEDDSLANSSDLLK的10％的交叉反应)外，没有抗体显示与不用于抗体的免疫的MR-PENK肽的交叉反应。

脑啡肽原免疫测定:

将50μl的样品(或校准物)吸入至包被的管中，在添加标记的抗体(200μl)后，将管子在18-25℃下孵育2h。通过用洗涤溶液(20mmol/l PBS,pH7.4,0.1％Triton X-100)洗涤5次(每次1ml)来去除未结合的示踪物。通过使用Luminumeter LB 953和固定浓度的1000pmol/l的MRPENK来测量与管子结合的标记的抗体。不同抗体组合的信号(RLU,1000pmol MRPENK/l)与噪声(RLU，无MRPENK)比给出在表4中。所有抗体均能够与任何其他抗体产生三明治复合物。令人惊奇的是，通过将MR-MRPENK-20和CT-MRPENK抗体组合产生了最强的信噪比(最佳灵敏度)。随后，我们使用该抗体组合进行MRPENK-免疫测定，用于进一步研究。将MR-MRPENK抗体用作管子包被抗体，并将CT-MRPENK抗体用作标记的抗体。

表4：

校准：

使用稀释于20mM K₂PO₄、6mM EDTA、0.5％BSA、50μΜ氨肽酶抑制剂、100μΜ亮抑酶肽,pH 8.0中的合成MRPENK的溶液来校准测定。脑啡肽原对照血浆购自ICI-diagnostics,Berlin,Germany。

图1显示了典型的脑啡肽原剂量/信号曲线。标准曲线脑啡肽原。

测定灵敏度为20次测定0-校准物(未添加MRPENK)+2SD)5.5pmol/L。

群体研究

方法

我们测量了来自1991-1994年中的基于群体的“马尔摩饮食与癌症研究”基线检查的2559名女性参与者的空腹血浆中的脑啡肽原(年龄58±6岁，及59％的女性)。我们使用了多变量调整的(所有常规的心血管风险因子、糖尿病风险因子以及分析癌症和癌症的遗传性)Cox比例风险模型，将基线PENK(风险比/对数转换的PENK的每个标准偏差增加)与多于12年的中值随访时间期间的每个研究终点的第一个事件的时间关联。通过瑞典国立医院出院登记(Swedish National Hospital Discharge Registry)、瑞典心肌梗死登记(SwedishMyocardial Infarction Registry)、马尔摩中风登记(Stroke in Malmo Registry)和瑞典癌症登记(Swedish Cancer Registry)检索获得终点。对通过这些登记检索获得的终点进行了验证，且发现其是准确的(还参见Belting et al.Cancer Epidemiol BiomarkersPrev；1-10.2012AACR)。

研究中的女性的临床特征

表5：

图2：女性群体中的脑啡肽原的频率分布：

平均值为47.2pmol/L，标准偏差＝1.2pmol/L。x轴为PENK浓度的自然对数(LN)。所有结果均位于测定的测量中，最低PENK浓度为9pmol/L。这些结果指示了所用的测定的适合性(测定灵敏度为5.5pmol/L)。

PENK和乳腺癌的预测

我们评估了脑啡肽原与乳腺癌之间的关系(表6)。女性中脑啡肽原与乳腺癌之间存在强的关联。在完全调整的模型中，脑啡肽原的每个SD增加与28.6％的风险降低相关，或者脑啡肽原(revPENK)的降低的每个SD与40％增加的未来乳腺癌风险相关(表5)，并且脑啡肽原的最高与最低四分位比确定了多于3倍的乳腺癌风险的差异(参见表7和图3)。

表6：

方程式中的变量^D

表7：

基线脑啡肽原相对于乳腺癌发生率的多元Cox比例风险模型。

图3：Kaplan Meier图，示出了女性第1四分位数(Q)(小于40.4pmol/l)、第2四分位数(40.4-47.1pmol/l)、第3四分位数(47.2-54.1pmol/l)、第4四分位数(大于54.1pmol/l)的累积乳腺癌诊断。降低的PENK指示乳腺癌发展的长期增加的风险。因为排除了在基线(血液采样)当天具有癌症史的任何女性，脑啡肽原能高度预测未来乳腺癌发展。总之，相比来自Q4的女性，来自Q1的女性具有3.6倍高的发展乳腺癌的风险。

组合脑啡肽原和神经降压素原

由于最近显示增加的神经降压素原对乳腺癌具有高度预测性，我们组合了生物标记用于乳腺癌预测。

实施例

神经降压素原测定

按如上所述产生了抗体。针对P-NT 1-19(H-CSDSEEEMKALEADFLTNMH(SEQ ID NO:24))产生了用于标记的抗体(LA)，并针对肽P-NT 44-62(CNLNSPAEETGEVHEEELVA(SEQ IDNO:25))产生了固相抗体(SPA)。

用于定量人神经降压素原的免疫测定

所用的技术为基于吖啶酯标记的三明治包被的管发光免疫测定。

标记的化合物(示踪物)：将100μg(100μl)LA(1mg ml于PBS中,pH7.4)与10μl吖啶NHS-酯(1mg/ml于乙腈中,InVent GmbH,Germany)(EP0353971)混合，并在室温下孵育20min。在Bio-Sil SEC 400-5(Bio-Rad Laboratories,Inc.,USA)上通过凝胶过滤HPLC来纯化的标记的LA。将纯化的LA稀释于(300mmol/l磷酸钾,100mmol/l NaCl,10mmol/l Na-EDTA,5g/l牛血清白蛋白,pH 7.0)中。终浓度为每200μl约800.000相对光单位(RLU)的标记的化合物(约20ng标记的抗体)。通过使用AutoLumat LB 953(Berthold TechnologiesGmbH&Co.KG)测量吖啶酯化学发光。

固相：用SPA(1.5μg SPA/0.3ml 100mmol/l NaCl,50mmol/l Tris/HCl,pH 7.8)包被聚苯乙烯管(Greiner Bio-One International AG,Austria)(18h,室温)。在用5％牛血清白蛋白封闭后，用PBS,pH 7.4洗涤管子，并真空干燥。

校准：

使用包含人血清的神经降压素原的稀释液校准测定。用马血清(Biochrom AG,Deutschland)稀释具有高神经降压素原免疫反应性的人血清库(InVent Diagostika,Hennigsdorf,Germany)(测定标准)。

通过使用人神经降压素原-校准物(ICI-Diagnostics,Berlin,Germany)来校准标准。可选地，可通过合成或重组P-NT 1-117或其片段来校准测定(还参见Ernst et al.,2006)。

ProNT免疫测定：

将50μl的样品(或校准物)吸入至SPA包被的管中，在添加标记的LA(200μl)后，于18-25℃下将管子孵育16-22h。通过用洗涤溶液(20mmol/l PBS,pH 7.4,0.1％Triton X-100)洗涤5次(每次1ml)来去除未结合的示踪物。通过使用Luminumeter LB 953测量与管子结合的LA。从校准曲线计算结果。

女性群体中脑啡肽原和PNT的组合分析：

脑啡肽原与神经降压素原之间无显著相关性(p＝0.56)。在组合的模型中，使用两种生物标记，我们发现它们在乳腺癌预测中是独立的。

在完全调整的模型中，PNT的每个SD增加与未来乳腺癌49.9％的风险增加相关。令人吃惊地，在添加PNT至方程式中后，PENK相比无PNT时甚至更强，并显示脑啡肽原的每个SD增加与30.8％的风险降低相关，或者脑啡肽原(revPENK)的每个SD降低与44.5％的未来乳腺癌风险增加相关(表8)。

表8：用于乳腺癌预测的PNT与PENK的组合分析。

表8：方程式中的变量

最高相对于最低四分位数PNT指示了乳腺癌发展的2.56倍风险，并且PNT最低相对于最高四分位数(rev＝反转的四分位数Q1＝Q4,Q2＝Q3,Q3＝Q2,Q4＝Q1))上部的脑啡肽原独立地为3.6倍风险(表9)。

组合PNT的最高四分位数和最低脑啡肽原四分位数相对于最低PNT-与最高脑啡肽原四分位数显示了6.17的组合风险(参见图3)。

表9：用于乳腺癌预测的PNT和PENK的组合分析。

表9：

方程式中的变量

图4：用于乳腺癌预测的脑啡肽原的组合分析的示例：

我们组合了具有最低脑啡肽原(第1)四分位数和最高(第4)神经降压素原四分位数(第3组)的女性。在高风险组中，约19.02％的女性在随后的15年中发展了乳腺癌。

第2组为具有第3四分位数的神经降压素原和第2四分位数的脑啡肽原加第2四分位数的神经降压素原和第3四分位数的脑啡肽原的女性的组合。在中间风险组中，约7.48％的女性在随后的15年中发展了乳腺癌。

第1组为具有第1四分位数的神经降压素原和第4四分位数的脑啡肽原的女性的组合。在低风险组中，约3.08％的女性在随后的15年中发展了乳腺癌。第1组合第3组之间的危害风险为约6.17。

肺癌

脑啡肽原还预测女性的肺癌。

40名女性在观察期间发展了肺癌。吸烟和不吸烟女性的脑啡肽原没有不同(p＝0.44)。如同所预期的，吸烟为肺癌的强风险预测标志物(p<0.0001)。令人吃惊地，尽管吸烟为方程式的一部分，低脑啡肽原指示了发展肺癌的3.2倍的风险(表10a和10b)。

表10a和10b：PENK预测女性肺癌。将女性分为3组(参见表10a)，然后分析肺癌发展(参见表10b)。rev＝最高三分位数(第3三分位数),rev(1)＝第2三分位数，并且rev(2)＝最低三分位数(第1三分位数)。

表10a：

PENK[pmol/L]

表10b：

方程式中的变量

附图说明

图1:示出了典型的脑啡肽原剂量/信号曲线。标准曲线脑啡肽原。

图2:女性群体中脑啡肽原的频率分布：

图4:用于乳腺癌预测的脑啡肽原的组合分析的示例。

Claims

1.结合剂在制备用于预测未患癌症的女性对象患癌症的风险的试剂中的用途，其中所述结合剂可测定获自所述女性对象的体液中的脑啡肽原或其至少5个氨基酸片段的水平，并且其中所述脑啡肽原或其至少5个氨基酸片段选自包含以下序列的组：SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ IDNo.11，其中所述癌症为乳腺癌或肺癌。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述女性对象在从所述女性对象采集所述体液样品时从未有过癌症诊断史。

3.如权利要求1所述的用途，其中所述女性对象有过癌症诊断史并且在从所述女性对象采集所述体液样品时已被治愈，并且确定了患乳腺癌的复发风险。

4.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中在从所述女性对象采集体液样品时，所述女性对象已被诊断为患有心血管疾病或糖尿病。

5.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中另外确定了选自包含以下参数的组的至少一项临床参数：年龄、存在糖尿病、当前在抽烟。

6.如权利要求4所述的用途，其中另外确定了选自包含以下参数的组的至少一项临床参数：年龄、存在糖尿病、当前在抽烟。

7.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中利用免疫分析测量脑啡肽原的水平。

8.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中为了监测女性对象患乳腺癌的风险或为了监测治疗过程，使用所述试剂多于一次。

9.如权利要求8所述的用途，其中为了评估所述女性对象对采取的预防性和/或治疗性措施的反应而进行所述监测。

10.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其用于将所述女性对象分级为风险组。

11.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述试剂还包含测定获自所述女性对象的体液中的神经降压素原1-117(SEQ ID No.17)的水平的结合剂。

12.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中降低的脑啡肽原或其片段的水平预测增加的患癌症风险，其为低于阈值的水平，其中所述阈值小于100pmol/l。

13.如权利要求11所述的用途，其中增加的神经降压素原或其片段的水平预测增加的患癌症风险，其为高于阈值的水平，其中所述阈值大于78pmol/1。

14.如权利要求12所述的用途，其中增加的神经降压素原或其片段的水平预测增加的患癌症风险，其为高于阈值的水平，其中所述阈值大于78pmol/1。

15.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述体液为血液、或血浆、或血清。

16.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中测定了MR-脑啡肽原(SEQ ID No.6)和/或神经降压素原1-117(SEQ ID No.17)的水平。

17.如权利要求11所述的用途，其中测定了MR-脑啡肽原(SEQ ID No.6)和/或神经降压素原1-117(SEQ ID No.17)的水平。

18.用于测定样品中的脑啡肽原和脑啡肽原片段的试剂盒，其包含与脑啡肽原区中的两个不同区域即氨基酸133-140(LKELLETG,SEQ ID NO.22)和氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ ID NO.23)结合的两种结合剂。

19.如权利要求18所述的试剂盒，其中所述试剂盒对于定量健康对象的脑啡肽原或脑啡肽原片段足够灵敏，并且具有<10pmol/L的分析测定灵敏度。

20.如权利要求18或19所述的试剂盒，其中所述脑啡肽原和脑啡肽原片段的水平被用于预测未患癌症的女性对象患癌症的风险，并且其中所述癌症为乳腺癌或肺癌。

21.两种结合剂在制备用于预测未患癌症的女性对象患癌症的风险，和/或用于将所述女性对象分级为风险组的试剂中的用途，其中所述两种结合剂与脑啡肽原区中的两个不同区域即氨基酸133-140(LKELLETG,SEQ ID NO.22)和氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ IDNO.23)结合。

22.两种结合剂在制备用于将女性对象分级为应当接受阿片生长因子(OGF)治疗的组的试剂中的用途，其中所述两种结合剂与脑啡肽原区中的两个不同区域即氨基酸133-140(LKELLETG,SEQ ID NO.22)和氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ ID NO.23)结合。