CN104768539A - 非那雄胺聚合物纳米粒子、含有该粒子的水悬液、用于治疗脱发的组合物、制备所述组合物的方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明旨在提供一种用于治疗脱发的药物组合物，所述组合物包含含有非那雄胺的聚合物纳米粒子、优选地纳米囊、药学上可接受的添加物和载体，并且还涉及纳米粒子用于制备该用于治疗脱发的组合物的用途。本发明还包括一种用于制备非那雄胺纳米囊的方法，其中所述非那雄胺纳米囊适用于局部施用以治疗脱发的组合物。

Description

非那雄胺聚合物纳米粒子、含有该粒子的水悬液、用于治疗脱发的组合物、制备所述组合物的方法及其用途

技术领域

本发明涉及用于局部施用以治疗脱发的药物组合物，所述组合物包含含有非那雄胺的聚合物纳米粒子、优选地纳米囊、添加物和药学上可接受的载体；以及纳米粒子用于制备治疗脱发用的所述组合物的用途。本发明还包括一种用于制备非那雄胺纳米囊的方法，所述非那雄胺纳米囊适于用于治疗脱发的局部施用的组合物。

背景技术

掉发，也称作脱发，可以表现出许多形式。它可能是不可逆的，如在划归为存在毛囊破坏的瘢痕性脱发的病例中；或是可逆的，如在非瘢痕性病例中，非瘢痕性病例具有几种原因并可能源自药物治疗、膳食、生理或心理应激、真菌性感染、化疗或基因遗传。因为这个原因，在使用几种药物治疗和非药物治疗(植入和激光应用)以尝试逆转这种情况。

在毛细血管疗法中，为了使药物具有所需的作用，药物需要抵达造成引起疾病的酶所在的(表皮中的)毛囊，而不渗透向毛囊供血的毛细血管(避免全身性作用)。因此，为了制剂有效，制剂需要能够促进药物的渗透和在其作用部位停留(DRAKE,L.等人；"The effects of finasteride on scalp skin and serumandrogen levels in men with androgenetic alopecia(非那雄胺对头皮和血清雄激素水平与男性雄激素性脱发的影响)."Journal of the American Academy ofDermatology(美国科学院皮肤学报),1999年，第41卷，第4期，第550-554页)。

雄激素源性脱发是成熟毛囊(末梢)通过一系列毛细血管循环转化成不成熟毛囊(柔毛)，同时生长时期。因此，归因于生长和毛干形成的时间缩短，毛发变得逐渐更短、更稀疏并且经常无颜色(INUI,S.；ITAMI,S.；"Molecularbasis of androgenetic alopecia:From androgen to paracrine mediators throughdermal papilla(雄激素性脱发的分子基础：通过真皮乳头雄激素以旁分泌调解)."Journal of Dermatological Science(皮肤学科学杂志),2011，第61卷，第1-6页)。这是最常见类型的脱发并且它主要影响男性，连同其它因素一起与性激素的调节相关。对雄激素源性脱发的更充分理解来自Hamilton(1942年)的研究，Hamilton描述了掉发的模式和作为与毛囊遗传倾向相关的过程的生理学，所述过程在雄激素影响下出现(Trueb,RM；"Molecular mechanisms ofandrogenetic alopecia(雄激素性脱发的分子机制)."Experimental Gerontology(实验老年学),2002年，第37卷，第8-9期，第981-990页)。然而，在雄激素源性脱发和睾酮水平、游离睾酮和生物可利用睾酮之间不存在相关性。秃顶的致病基础可能通过毛囊中的细胞内信号传导来介导(INUI,S.；ITAMI,S.；"Molecular basis of androgenetic alopecia:From androgen to paracrine mediatorsthrough dermal papilla(雄激素性脱发的分子基础：通过真皮乳头雄激素以旁分泌调解)."Journal of Dermatological Science(皮肤学科学杂志),2011年，第61卷，第1-6页)。

通过5α-还原酶的作用，睾酮转化成更强有力的激素二氢睾酮(DHT)。出于两个主要原因，认为二氢睾酮的作用大于睾酮：(i)DHT不能由芳香酶转化成雌激素，仅维持其纯粹雄激素的活性，(ii)体外研究显示DHT以比睾酮更高的亲和力结合至雄激素受体(LIU,S.；YAMAUCHI,H.；"Different patternsof 5α-reductase expression,cellular distribution,and testosterone metabolism inhuman follicular dermal papilla cells(人卵泡毛乳头细胞中5α-还原酶表达、细胞分布和睾酮代谢的不同的方式)."Biochemical and Biophysical ResearchCommunications(生物化学和生物物理研究通讯),2008，368第858-864页)。这些雄激素通过它们穿过细胞膜散布而发生作用，旨在与细胞内雄激素受体结合。作为这种结合的结果，激素-受体复合体经历构象变化，因此使复合体与DNA中的启动子位点结合，触发产生将转录遗传响应的信使RNA(INUI,S.；ITAMI,S.；"Molecular basis of androgenetic alopecia:From androgen to paracrinemediators through dermal papilla(雄激素性脱发的分子基础：通过真皮乳头雄激素以旁分泌调解)."Journal of Dermatological Science(皮肤学科学杂志),2011年，第61卷，第1-6页)。在DHT与毛囊中存在的雄激素受体结合的情况下，该响应是毛发生长周期的生长阶段减少，因此使毛发进入早休止期(Ellis,JA；Harrap,SB；"The genetics of androgenetic alopecia(雄激素性脱发的遗传学)."Clinics in Dermatology(皮肤科临床),2001年，第19卷，第149-154页)。

雄激素源性脱发是掉发的一种模式，这促进诊断并且使其与其他类型容易区分。默认情况下，毛干的丢失初始出现在额部分上或仅出现在头顶上，并且可以扩展至其他区域。可以通过诺伍德-汉密尔顿(Norwood-Hamilton)量表确定脱发程度。该量表确定三个类型的掉发模式：头顶模式(其中毛干的丢失始于脑后)、额头模式(其中毛干的丢失始于额头)和正常模式(在额头和脑后同时开始丢失)，全部模式均分成7个掉发阶段(Sinclair,RD；"Maleandrogenetic alopecia(男性雄激素性脱发)."The Journal of Men's Health&Gender(男性健康与性别杂志),2004年，第1卷，第4期，第319-327页)。

目前，脱发治疗可以是局部的和全身性的。在巴西卫生监督局(ANVISA)(巴西)批准的药物当中，可以提到以下：(i)作为全身性药物，由非那雄胺(1mg)制成的口服使用药物，以商标名销售，其充当二氢睾酮(DHT)激素的阻滞剂；和(ii)作为局部用药物：(a)基于米诺地尔的药物，以商标名摩丝销售，含2％的米诺地尔(用于女性)和5％的米诺地尔(用于男性)，和(b)基于α-雌二醇的药物，以商标名销售，处于0.025％的溶液形式。

有效成分(非那雄胺)带来几项稳定性、生物利用度和配制难题，这因其物理化学和生物学/生理学特性所致。为了解决或减少有效成分的不利特征，研究替代物以“保护它免遭降解”或“增加它的溶解度”。

增强其治疗功效和使用安全性方面的改进目标在于通过改变药代动力学方面和药效动力学方面来开发新的给药系统。在胶态给药系统当中，存在聚合物纳米粒子和脂质体(Avnesh Kumari,Sudesh Kumar Yadav,Subhash C.Yadav,Biodegradable polymeric nanoparticle based drug delivery systems(基于生物降解的聚合物纳米颗粒的药物递送系统),Colloids and Surfaces B:Biointerfaces(胶体和表面B：生物界面)，第75卷，第1期，2010年1月，第1-18页；VladimirP.Torchilin,RECENT ADVANCES WITH LIPOSOMES ASPHARMACEUTICAL CARRIERS(脂质体作为药物载体最近进展),NATUREREVIEWS(自然综述),第4卷，2005年2月，第145页)。因为它们的治疗潜能和在储存期间和与体液接触时增强的稳定性，与脂质体相比，由生物可降解聚合物形成的聚合物纳米粒子已经吸引研究者日益增加的注意力(SCHAFFAZICK,SH等人；"Characterization and physicochemical stability ofnanoparticle polymeric systems for drug delivery(纳米颗粒的聚合物系统的用于药物递送的表征和物理化学稳定性)."New Chemistry(新化学)，2003年，第26卷，第5期，第726-737页)。

聚合物纳米粒子是具有10nm至1000nm的直径并且根据其超分子构造分成囊泡或基体的胶态药物载体系统。纳米囊(囊泡)具有聚合物基体包围的油质芯部，这允许药物分散于该芯部中和/或吸附在聚合物壁内。纳米球(基体)不具有油质芯，仅具有聚合物结构，从而药物可以吸附或保留在聚合物基体中。优选的是由生物可降解聚合物制成的纳米粒子，原因在于它们潜在地具有更大的治疗效能，以及在生物流体中和储存期间的高稳定性(SCHAFFAZICK,SH等人；"Characterization and physicochemical stability of nanoparticle polymericsystems for drug delivery(纳米颗粒的聚合物系统的用于药物递送的表征和物理化学稳定性)."New Chemistry(新化学)，2003年，第26卷，第5期，第726-737页)。

不同的物理化学方法可以用于制备这些纳米粒子体系，如：(i)预聚物的界面沉积、(b)盐析和(c)乳化-扩散。在用于制备纳米囊的主要技术当中，突出的是1989年Fessi等人提出的预聚物界面沉积法(FESSI,H.等人；"Nanocapsule formation by interfacial polymer deposition following solventdisplacement(通过界面聚合物沉积然后排量溶剂形成纳米胶囊)."InternationalJournal of Pharmaceutics(药剂学国际期刊)，1989年，第55卷，第1期，第R1-R4页)，其中将聚合物连同油质组分、亲脂性表面活性剂和待囊化的药物或有效成分一起于有机溶剂中。将这种有机相/油相在温和搅拌下加注在由水和亲水性表面活性剂组成的水相上。这种混合物自发地产生平均直径在200nm至500nm之间的纳米囊。最后，移除有机溶剂和过量的水。

用于水-醇溶液中的有效成分来配制可用于治疗脱发的大多数局部用产品。但是，由于一些药物通过角蛋白层的低渗透性，仅部分所施用的剂量渗透毛孔和毛囊抵达作用部位(TSUJIMOTO,H.等人；"Evaluation of the permeability ofhair growing ingredient encapsulated PLGA nanospheres to hair follicles and theirhair growing effects(评价PLGA纳米球包封的头发生长成分对毛囊的渗透性和头发生长的影响)."Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters(生物有机和药物化学快报)，2007年，第17卷，第4771-4777页)。作为结果，使用这些产品时的毛发生长未超过顾客期望，导致缺少对治疗的依从性。最近的研究已经证实纳米粒子可以有效渗透到毛囊中的假设(Lademann,J.等人；"Nanoparticles-An efficient carrier for drug delivery into the hair follicles(纳米粒子——一个有效的药物递送入毛囊的载体)."European Journal of Pharmaceutics andBiopharmaceutics(欧洲药剂学与生物药剂学杂志)，2007年，第卷66，第2期，第159-164页)，纳米粒子抵达深部功能性结构，并且在其中保持储存一些天。在非颗粒物质的情况下，这类长期作用尚未在毛囊中或角质层中观察到。原则上，角质层缺少用于局部所施用物质的储器特性，因为这些物质仅局部保持在皮肤表面上或仅保留在上细胞层中(该层因剥落被连续移除)。因此，在长期上，毛囊变成局部使用的非颗粒物质的唯一储器。这些观察结果显示，毛囊是给药的重要靶，因为它们被致密的毛细血管网和树突细胞(朗格汉斯细胞)包围。

例如，体内评估了含有用于毛发生长的三种不同有效成分(桧木醇、甘草次酸和6-苄氨基嘌呤)的聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)的纳米球的效果(TSUJIMOTO,H.等人；"Evaluation of the permeability of hair growingingredient encapsulated PLGA nanospheres to hair follicles and their hair growingeffects(评价PLGA纳米球包封的头发生长成分对毛囊的渗透性和头发生长的影响)."Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters(生物有机和药物化学快报)，2007年，第17卷，第4771-4777页)。分析这些有效成分在人头皮活组织检查样品中的荧光强度，作者发现与缓冲溶液(PBS)中相同有效成分的对照组相比时，纳米球在孔中具有2至2.5倍的更高的渗透作用。还可能观察到毛细血管活动性增加，所述毛细血管的循环从休止期变成生长期，表明PLGA纳米球可能是用于毛囊中药物的有前景载体。

迄今，文献中存在报告在纳米粒子体系中纳入非那雄胺的少数论文。伊兰制药国际有限公司(Elan Pharma International Limited)拥有的文献US20060204588公开了一种药物组合物，所述药物组合物含有纳米颗粒状非那雄胺(具有小于2000nm的平均尺寸)和至少一种可以由有效成分表面吸附或与之结合的表面稳定剂。关于制备纳米颗粒状非那雄胺制剂的方法，这种方法在于分散非那雄胺于液体分散介质中并且用机械方式降低其粒度。

富士胶卷公司(Fujifilm Corporation)拥有的专利申请US 20110117045是一种含有毛发治疗用有效成分的基于蛋白质纳米粒子的产品；该产品由从蛋白质(如酪蛋白、胶原蛋白、明胶、白蛋白等)产生的纳米粒子组成，还含有促进毛发生长的有效成分，并且包含非那雄胺和米诺地尔作为这些有效成分之一。

爱茉莉太平洋集团(Amorepacific Corporation)拥有的文献WO2005000258描述了包含两亲聚合物和生理活性成分的自装配聚合物纳米粒子；其中两亲聚合物包含聚己内酯和聚乙二醇作为疏水性嵌段和亲水性嵌段，并且生理活性成分由所述两亲聚合物组成。该生理活性成分可以是非那雄胺(根据权利要求10中所述；还参见实施例45-47)或米诺地尔(参见第8页，第8-18行)。要求保护的改善的动机，即在形成含有有效成分的纳米粒子时使用两亲聚合物，是旨在降低造成沉淀或絮凝的胶态不稳定性，其中制备纳米粒子中使用疏水聚合物时，所述沉淀或絮凝出现。

但是，需要使用一种均聚物，所述均聚物比实际上作为聚合物嵌段结构的共聚物在技术上更不复杂且更简单地获得，在共聚物中难以控制亲水部分和亲脂部分的比例，因此在后续形成纳米粒子、特别是纳米囊时造成问题。

另外，使用按亲水部分和亲脂部分的1：1比率制备的嵌段共聚物造成缺乏亲水-亲脂平衡值(HLB)的灵活性，这会限制纳米技术制剂的品质。能够改变稳定剂(亲水性乳化剂或表面活性剂)的浓度是制备纳米粒子的优点。可以通过在制剂中使用不同比例的稳定剂，将亲脂性均聚物配制为纳米粒子，这允许优化纳米胶体的物理稳定性。

发明内容

本发明旨在提供用于局部治疗脱发的药物组合物，所述组合物包含含有非那雄胺的聚合物纳米粒子、优选地纳米囊、添加物和药学上可接受的载体。本发明还包括一种用于制备非那雄胺纳米囊的方法，所述非那雄胺纳米囊适用于治疗脱发的局部施用的组合物。

本发明的第一实施方案涉及一种局部用药物组合物，所述局部用药物组合物包含治疗有效量的稳定分散于药学上可接受的载体中的聚合物纳米粒子、优选地非那雄胺纳米囊；并且可选地含有添加物。

在第二实施方案中，所述聚合物纳米粒子、优选地纳米囊通过制备有机相和水相形成，其中：

-有机相包含：(a)疏水聚合物、(b)油或油混合物、(c)至少一种低HLB亲脂性表面活性剂、(d)溶剂和(e)非那雄胺；和

-水相包含：(a)至少一种亲水性表面活性剂，和(b)水。

在第三实施方案中，本发明包含聚合物纳米粒子、优选地纳米囊用于制备用于治疗脱发的药物组合物的用途。

用于制备本发明组合物的方法包括两个阶段。第一阶段涉及制备本发明的聚合物纳米粒子、优选地纳米囊，包括步骤：

(i)通过在有机溶剂中疏水聚合物和非那雄胺、油或油混合物、至少一种低HLB表面活性剂，制备有机相；

(ii)通过在水中混合至少一种亲水性表面活性剂、优选地中性亲水性表面活性剂，制备水相；

(iii)在水相中注入有机相以通过有机相在介质中扩散以引起纳米结构瞬时形成，同时将混合物搅拌足够时间以便这类扩散有助于非那雄胺适当囊化；

(iv)移除有机溶剂以允许回收含有纳米囊的水相。

在制备纳米囊后，将其悬浮于合适的载体中，所述载体可选地含有添加物如分散剂、保湿剂、软化剂、增稠剂、掩蔽剂、防腐剂、抗氧化剂、芳香剂等。

附图说明

图1显示含有非那雄胺的纳米囊(NF25)的透射电子显微照片。图像右角中的黑色线是0.2微米。

图2显示经过30天在收集之前静置的等分试样(灰色)和搅拌的等分试样(黑色)(二者来自相同批次)中测定的纳米囊的非那雄胺浓度。

图3显示在第1天(第1列)、15天后(第2列)和23天后(第3列)各处理组的动物的照片，所述各组用NF25(A)；NEF25(B)；悬浮于中水的药物(C)和水(D)处理。

图4显示各组的组织学分析：NF25(A)、NEF25(B)、C2+(C)和C-(D)。

图5显示对于处理C-(水)、C2+(游离药物)、NEF25(纳米乳液)和NF25(纳米囊)的每个所分析的组织学视域中成熟毛囊的数目(n＝12)。

图6显示NPXF05制剂以体积计的粒度分布(激光衍射)。

图7显示在允许静置30日的制剂(三重批次)NF25(A)和NPXF05(B)的上清液中存留的药物的百分数分析。

图8显示在第0日(照片1)和在第15日(照片2)和第23日(照片3)的用NF25(A)和NPXF05(B)治疗的治疗组动物的照片。

图9显示从用NPXF05(A)和NF25(B)治疗23日后的动物的背部取下的皮肤的组织病理学分析。

图10显示用NF25制剂(A)和NPXF05制剂(B)治疗的动物的以组织学方式检查的每个视域中的成熟毛囊平均数。

具体实施方式

本发明涉及一种有效用于局部治疗脱发的药物组合物，所述组合物包含纳米粒子体系，优选地包含非那雄胺纳米囊、药学上可接受的载体；并且可选地含有添加物。

本发明还包括一种用于制备由所述组合物组成的聚合物纳米粒子、优选地非那雄胺的纳米囊的方法。

非那雄胺是对5α-还原酶2型酶具有强力选择性拮抗作用的合成性偶氮类固醇(synthetic azosteroid)。非那雄胺通过与该酶不可逆结合而发挥作用，阻止睾酮转化为其活性代谢物二氢睾酮(DHT)。非那雄胺的用途最初经批准用于减小与尿路阻塞相关的前列腺尺寸(良性前列腺增生)，由于虽然DHT在男性中负责前列腺生长，但是它可能参与增生的形成。但是，已经观察到服用这种药物的患者还表现出脱发症状的逆转。出于这个原因，调查非那雄胺在治疗秃顶方面潜力的研究已经开始形成(Sinclair,RD,"Male androgenetic alopecia:Part II(男性雄激素性脱发：第二部分)."The Journal of Men's Health&Gender，2005，第2卷，第1期，第38-44页)。Kaufmann等人(2008年)对1553位年龄在18岁至41岁之间的男性的研究评价了按每日1mg的剂量持续5年时，非那雄胺相对于安慰剂的作用。与安慰剂治疗的患者中明显掉发的可能性增加相比，非那雄胺治疗的结果导致明显掉发的概率下降。在这项研究中，在5年结束时，75％的用安慰剂治疗的患者形成秃顶，并且仅10％的用非那雄胺治疗的患者出现病情。评审使用非那雄胺治疗女性雄激素源性脱发的安全性和有效性，得出以下结论：在用米诺地尔局部治疗无效的病例中，可以安全和有效地使用这种药物(Stout,SM；STUMPF,JL；"Finasteride Treatment of Hair Loss inWomen(非那雄胺治疗女性的脱发)."The Annals of Pharmacotherapy(药物治疗年报)，2010，第44卷，第6期，第1090-1097页)。

通过提供用于治疗脱发的非那雄胺的局部施用药物组合物，本发明避免与全身性施用非那雄胺相关的缺点和副作用。

本发明基于通过预聚物界面沉积法制备非那雄胺纳米囊，其中首先在有机溶剂中非那雄胺、疏水聚合物、至少一种油或油掺混物和至少一种低HLB(亲水亲脂平衡值)表面活性剂以形成有机相；并且在水中混合至少一种亲水性表面活性剂，优选地中性亲水性表面活性剂以形成水相。

本发明特别地涉及聚合物纳米粒子的制备，优选地通过下述方法进行：纳米囊从溶液自组织，结果是聚合物界面沉积，原因在于其在胶态分散体的内相和外相中的不性。但是，应当是清楚其他方法也可以用来产生本发明的纳米囊。

所述聚合物纳米粒子，优选地纳米囊从有机相和水相如下形成：

-有机相包含：(a)疏水聚合物、(b)油或油混合物、(c)至少一种低HLB亲脂性表面活性剂、(d)溶剂和(e)非那雄胺；和

-水相包含：(a)至少一种亲水性表面活性剂，和(b)水。

用来囊化非那雄胺的所述聚合物是疏水聚合物，其选自乙烯基聚合物、聚酯、聚酰胺、聚氨酯、丙烯酸聚合物和聚碳酸酯。优选地，所用的疏水聚合物是来自具有小于120℃熔点的聚酯类的生物可降解聚合物。更优选地，生物可降解疏水聚合物来自聚酯类，即聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)的共聚物、聚己内酯、聚己内酯与聚酯、与聚酰胺、与聚氨酯或与乙烯基聚合物的共聚物，并且最优选地，是聚(ε-己内酯)

在制备本发明的纳米囊的有机相中使用的油或油混合物选自中等链长甘油三酯、芥花油、大豆油、橄榄油、米糠油、葡萄籽油、鱼油、亚麻籽油和精油所组成的组。

优选地使用中等链长甘油三酯；其中，中等链长甘油三酯是选自癸酸和辛酸的甘油三酯、丙二醇二辛酰癸酸酯(dicaprilocaprato de propilenoglicol)、油酸聚乙二醇甘油酯、月桂酸聚乙二醇甘油酯、亚油酸聚乙二醇甘油酯(macrogolglicerídeos de oleíla,laurolia,linoleoila)及它们的混合物所组成的组。其中，精油是选自芳樟醇、法呢醇及它们的混合物的那些。

在本发明的第一实施方案中，优选地使用辛酸和癸酸的甘油三酯。

并且在本发明的第二实施方案中，优选地使用辛酸和癸酸的甘油三酯和S-69的混合物。S-69是芳樟醇和法呢醇的混合物，一种在市场上可获得的精油混合物。

本发明的第二实施方案是通过在制剂的脂质芯组合物中添加新油，增加非那雄胺的囊化，其中所述新油在制剂的脂质芯组合物中的溶解度在比在辛酸和癸酸甘油三酯中更大。为此目的，优选使用S-69(一种商业混合物)，并且它由法呢醇和芳樟醇组成，非那雄胺在其中的溶解度是约90mg/mL(通过HPLC定量供给)。法呢醇是倍半萜醇，并且芳樟醇是萜醇，二者均存在于多种精油中并且不溶于水中，但是与油和其他有机溶剂如丙酮和乙醇可溶混。因为有挥发性，将S-69与甘油三酯按比率2.3：1(v/v)(S-69:甘油三酯)混合。然而，考虑到非那雄胺在S-69中的饱和，可以在制备药物浓度为2.0mg/ml的制剂时使用这个比例，原因在于S-69的挥发性并且在于随后溶剂因压力的减小而蒸发的过程期间的蒸汽造成的抽吸所致的油损耗，制备了非那雄胺浓度为0.5mg/ml的制剂，以确保该体系的纳米特征。包含新脂质芯的这种制剂表示本发明的第二实施方案。

在制备本发明聚合物纳米粒子的有机相中使用的所述亲脂性表面活性剂是低HLB表面活性剂，优选地具有3至6范围内的值，为固态或液态，优选地为固态，选自山梨糖醇酐单硬脂酸酯、山梨糖醇酐二硬脂酸酯、山梨糖醇酐三硬脂酸酯、辛酰己酰基聚乙二醇甘油酯、丙二醇月桂酸酯、丙二醇辛酸酯、甘油单硬脂酸酯、聚甘油油酸酯或它们的混合物所组成的组。优选地，在本发明有机相中使用的亲脂性表面活性剂是山梨糖醇酐单硬脂酸酯。

在制备本发明的这些聚合物纳米粒子的有机相中使用的溶剂是选自以下的有机溶剂：丙酮、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二烷、碳酸丙烯酯、二乙醚、四氢呋喃、有机卤素、乙酸乙酯、乙腈、甲乙酮、其混合物，或显示出与水发生分子间相互作用的物理化学特性的任何其他溶剂。在本发明的一个优选实施方案中，有机溶剂优选地是丙酮。

水相含有用于制备本发明的纳米粒子的至少一种亲水性表面活性剂，优选地是乳化剂(如多氧取代的聚合物)，或离子型表面活性剂(如卵磷脂)，或中性表面活性剂，其选自聚山梨醇酯20、60或80、聚乙二醇硬脂酸酯、聚乙二醇鲸蜡硬脂基醚、聚乙二醇月桂基醚、聚乙二醇油基醚、聚乙二醇油酸酯、聚氧乙烯蓖麻油、氢化聚氧乙烯蓖麻油或其混合物。优选地，使用聚山梨醇酯，和更优选地，选择使用聚山梨醇酯80，用于制备本发明纳米粒子的水相。

以下是本发明的具体实施方案。然而，应当理解仅出于示意性目的提供这类实施方案，并且根据本文中公开的实施方案，多种修改或变化可由本领域技术人员得出并且必须纳入本公开的精神和范围内和后续权利要求的范围内。

聚合物纳米粒子的水悬液包含：

-有机相中：

(a)0.001％至80.0％(w/w)的非那雄胺；

(b)0.01％至30.0％(w/w)的疏水聚合物；

(c)0.01％至50.0％(w/w)的油或油混合物；

(d)0.01％至50.0％(w/w)的至少一种低HLB亲脂性表面活性剂、优选地呈固态，和

(e)10％至80％(w/w)的有机溶剂；和

-水相中

(a)0.05％至20.0％(w/w)的至少一种亲水性表面活性剂，和

(b)10％至90％(w/w)的水。

在水悬液的第一优选制剂中，聚合物纳米粒子、优选地纳米囊，包含：

-有机相中

(a)0.005％至50.0％(w/w)的非那雄胺；

(b)0.05％至20.0％(w/w)的疏水聚合物、优选地聚(ε-己内酯)；

(c)0.05％至20.0％(w/w)的油、优选地中等链长甘油三酯；

(d)0.05％至20.0％(w/w)的至少一种亲脂性表面活性剂、优选地山梨糖醇酐单硬脂酸酯；和

(e)10％至80％(w/w)的有机溶剂、优选地丙酮；和

-水相中

(a)0.05％至20.0％(w/w)的至少一种亲水性表面活性剂、优选地聚山梨醇酯；和

(b)10％至90％(w/w)的水。

在水悬液的第二优选制剂中，聚合物纳米粒子、优选地纳米囊，包含：

-有机相中

(a)0.005％至50.0％(w/w)的非那雄胺；

(b)0.05％至20.0％(w/w)的疏水聚合物、优选地聚(ε-己内酯)；

(c)0.05％至20.0％(w/w)的油混合物、优选地辛酸和癸酸的甘油三酯与法呢醇和芳樟醇(S-69)的混合物；

(d)0.05％至20.0％(w/w)的至少一种亲脂性表面活性剂、优选地山梨糖醇酐单硬脂酸酯；和

(e)10％至80％(w/w)的有机溶剂，优选地丙酮；和

-水相中

(a)0.05％至20.0％(w/w)的至少一种亲水性表面活性剂、优选地聚山梨醇酯；和

(b)10％至90％(w/w)的水。

用于治疗脱发的药物组合物含有：

(A)本发明的纳米囊，包含：

(a)0.01％至2.5％(w/w)的非那雄胺；

(b)0.1％至10.0％(w/w)的疏水聚合物、优选地聚(ε-己内酯)；

(c)0.1％至5.0％(w/w)的油和/或油混合物、优选地中等链长甘油三酯和/或中等链甘油三酯与S-69的混合物；

(d)0.1％至5.0％(w/w)的至少一种低HLB亲脂性表面活性剂、优选地山梨糖醇酐单硬脂酸酯；

(e)0.001％至10％(w/w)的亲水性表面活性剂、优选地聚山梨醇酯80；以及

(B)药学上可接受的载体，其中纳米囊的组分的量以最终制剂的百分数计并且所述纳米囊分散于所述药学上可接受的载体中。

本发明用于治疗脱发的优选药物组合物包含处于聚合物纳米粒子形式、优选地处于纳米囊形式、分散于药学上可接受的载体中的0.01％至1.0％(w/w)的非那雄胺。

用于治疗脱发的药物组合物可选地含有添加物，如分散剂、表面活性剂、润湿剂、软化剂、增稠剂、掩蔽剂、防腐剂、抗氧化剂、芳香剂等。

以下是本发明的具体实施方案。然而，应当理解仅出于示意性目的提供这类实施例，并且根据本文中公开的实施方案，多种修改或变化可由本领域技术人员得出并且必须纳入本公开的精神和范围内和后续权利要求的范围内。

实施例1：含有0.25％的非那雄胺的本发明纳米囊－本发明的第一实施方案

实施例1.1：根据本发明的第一实施方案制备非那雄胺纳米囊(NF25)

使用表1中描述的组成，从有机相和水相制备非那雄胺纳米囊悬液。

表1.根据本发明第一实施方案[NF25]制备的含有0.25％的非那雄胺的聚(ε-己内酯)纳米囊悬液的组成

有机相	量
		癸酸和辛酸的甘油三酯	3.30mL
山梨糖醇酐单硬脂酸酯	770mg
		聚(ε-己内酯)	1000mg
丙酮	250mL
		非那雄胺	250mg
水相	量
		聚山梨醇酯80	770mg
蒸馏水	500mL

将聚合物(聚(ε-己内酯))随非那雄胺、癸酸和辛酸的甘油三酯以及低HLB表面活性剂(山梨糖醇酐单硬脂酸酯)一起在20℃至40℃之间、优选地在40℃温和加热下溶解于有机相中，使用丙酮作为溶剂。将中性表面活性剂(聚山梨醇酯80)溶解于水中以形成水相。在有机相和水相的全部组分溶解后，使用漏斗，将有机相加注在水相上。

在形成本发明纳米囊的主乳液后，将该乳液在中速搅拌下维持10分钟，并且随后在恒温槽中旋转蒸发器内蒸发烧瓶中10℃至80℃之间，优选地30℃至45℃之间降低的压力下浓缩至最终体积100ml，以消除溶剂和过量的水，以调节非那雄胺的最终浓度。这种制剂称作NF25。

实施例1.2：纳米乳液非那雄胺(NEF25)的制备

出于比较目的，还制备浓度为0.25％的非那雄胺纳米乳液制剂。制备方法与非那雄胺纳米囊(NF25)的制备方法相同，然而不包含(聚(ε-己内酯))聚合物。表2显示表示为NEF25的这种制剂的组成。

表2.含有0.25％的非那雄胺的纳米乳液组合物(NEF25)

有机相	量
		癸酸和辛酸的甘油三酯	3.30mL
山梨糖醇酐单硬脂酸酯	770mg
		丙酮	250mL
非那雄胺	250mg
		水相	量
聚山梨醇酯80	770mg
		蒸馏水	500mL

实施例1.3：本发明第一实施方案的0.25％的非那雄胺纳米囊的物理及化 学表征

A.pH的测定

通过电位计直接在悬液中测定pH，所述电位计用pH 4.0和7.0的缓冲溶液校准。

B.通过多重光散射测定粒径和多分散指数

使用美国马尔文公司(Malvern，US)的nano-仪器型号ZEN 3600ZS以通过动态光散射法测定纳米粒子悬液的直径和多分散性。为此目的，将样品在室温于水(经Millipore Millex-HP 0.45微米滤器过滤)中稀释500倍，并且通过三次重复的平均数确定结果。

C.通过激光衍射测量确定粒度分布

为了评估在纳米粒子制剂中是否存在伴随的微米级群体，通过激光衍射法(一项能够测量具有宽范围直径(0.02微米至2000微米)的粒子的技术)(Mastersizer 2000,Malvern,英国)进行分析。通过添加含有约100ml蒸馏水的辅助分散体制剂的样品，实施分析。添加的量足以实现0.02至0.10之间的遮蔽。为了防止干扰，在分析之前测量背景信号。

D.ζ电位

通过使用nano-仪器(型号ZEN 3600ZS(Malvern，美国))的电泳方法测定纳米囊悬液的ζ电位。以(经Millipore Millex-HP 0.45微米滤器过滤的)10mM的NaCl溶液中稀释500倍开始，实施该测定，并且获得的结果是三次测量的均值。

E.粘度

使用振动式粘度计(SV-10，爱安德公司(A&D Company)，日本)测量悬液的粘度。为实现这种测量，在25±1.0℃温度于悬液中直接测量粘度30秒，每隔5秒采集数据。

结果：

下表(表3)展示对本发明第一实施方案的非那雄胺纳米囊制剂(NF25)所获得的pH值、直径、多分散指数、ζ电位和粘度。制剂(一式三份为一批)在宏观上均匀，具有乳状外观，并且稀释时，具有淡蓝色调(丁达尔效应)，这表明存在至少一种纳米粒子群体。

表3.非那雄胺纳米囊制剂(NF25)的pH、平均直径、多分散指数、ζ电位和粘度。

参数	NF25
		pH	4.6±0.1
平均直径(nm)	222±3
		多分散指数	0.14±0.03
ζ电位(mV)	-14.6±0.6
		粘度(mPa·s)	1.21±0.07
非那雄胺浓度(％)	0.25

含有非那雄胺的纳米囊悬液(NF25)的pH维持在约4.5。此外根据文献，这种pH范围适于局部施用(SZNITOWSKA等人，2001)。

悬液具有大约220nm的直径，多分散性为0.14。迄今，含有非那雄胺的毛囊局部施用的颗粒状体系的文献中数篇报告之一提及了分别具有1.9μm和4.4μm粒度的脂质体和溶酶体微粒物制剂(TABBAKHIAN等人，2006)。因此，本发明中开发的含有非那雄胺的制剂(NF25)具有降低的直径(在纳米尺度上)和如较低的多分散指数(<0.2)所显示的窄粒子分布。

平均ζ电位(对于一式三份制剂而言)是大约-14mV。通过用制剂水相中所用的聚山梨醇酯80表面活性剂涂覆粒子(这防止体系因空间位阻而聚结)，推算出这些值。

实施例1.4：透射电子显微术

为了更好地评价非那雄胺纳米囊悬液的形态特征，进行透射电子显微术分析。

采用在80kV运行的透射电子显微镜(JEOL，JEM 1200Exll，电子显微术中心-UFRGS)进行分析。将稀释的悬液沉积在网格中的碳支持膜上，用乙酸双氧铀溶液(2％w/v)负染并且以250000倍的倍率观察(图1)。

实施例1.5：研究本发明第一实施方案的非那雄胺纳米囊的稳定性

为了确定非那雄胺纳米囊(NF25)的稳定性，评价以下项目：

A.纳米囊中非那雄胺的定量

将纳米囊悬液在乙腈中用超声法处理(30分钟)，造成制剂组分溶解。使用高效液相色谱(HPLC)得出非那雄胺的定量。

使用210nm的可见紫外检测器，LiChrospher 100RP-18(5μm，250x 4mm)柱，相同材料的前置柱(5μm)和等强度流动相乙腈：水(75：25)，流速1mL/min和进样量100μL，在珀金埃尔默(Perkin Elmer)色谱图系列200上分析。

B.验证晶体的存在

当药物的浓度超过其在纳米囊核内所用的油中的溶解度时，可能同时出现纳米晶体的形成，所述纳米晶体可以具有与已形成的纳米囊相同的水动力半径，因而产生相对于纳米囊而言并无不同的窄尺寸分布。另外，随时间推移，这些晶体可以因沉淀而出现尺寸增加。

因此，通过使用两种技术来量化悬液中的非那雄胺，以监测制剂稳定性并且确定可能同时存在的纳米晶体。将每个批次分成两份样品：允许一份样品沉淀并且保持另一份样品不处理直至分析，而分析时搅拌该样品。为了分析，静置样品的上清液的等分试样(在第0日和第30日)和不处理样品的等分试样(在涡旋混合15秒后)，从而可能通过静置样品中药物含量的减少分辨已沉淀晶体的存在，并通过搅拌样品的等分试样(通过HPLC测量)分辨可能的药物降解。

结果：

为了检验纳米囊制剂的稳定性，在第0日和在储存30日后(40℃和75％相对湿度)就直径、多分散性、ζ电位和非那雄胺测定值方面评价三个批次以表征这些体系的行为。表4中显示结果。

表4.根据本发明第一实施方案制备的非那雄胺纳米囊制剂(NF25)在0日和30日(在40℃和相对湿度75％储存)的稳定性结果

日期	直径(nm)	多分散指数	ζ电位(mV)	含量(mg/ml)
					0	222±3	0.14±0.03	-14.9±3.0	2.3±0.3
30	243±5	0.16±0.03	-14.1±1.3	2.6±0.2

在30日储存期间，直径、多分散指数或ζ电位的值无明显变化。对于剂量，在第30日显示的药物浓度等于起初使用的浓度。即，纳米囊具有与制备时所用的非那雄胺浓度(0.25％)相似的非那雄胺浓度，同时尺寸无变化并且在HPLC分析降解色谱图中没有出现额外的峰。值得注意，在这个实验中，在搅拌后的悬液等分试样中确定非那雄胺浓度随储存时间变化而变化。图2显示这次验证的结果。

对于定量之前搅拌的样品，可以看出，经过30日储存，非那雄胺含量不存在下降，这表明这些储存条件下不存在降解。

实施例1.6：确定毛发恢复能力的体内研究

对于本实验，使用来自塔雅伊谷大学(University of Vale do Itajaí，UNIVALI)动物饲养室的B6CBAF1杂交雌性小鼠。小鼠B6CBAF1系来自雌性C57BL系和雄性CBA系之间的繁殖。杂交的B6CBAF1显示一种突变，这种突变造成动物在每日接受睾酮或二氢睾酮补充物时形成雄激素源性脱发的病理状况。雄激素源性脱发自发出现，因背部毛发稀疏而被察觉。可以通过皮下施用0.1mL的具有最低浓度为1％的睾酮或二氢睾酮的悬液常规地实现弥漫性毛发减少(MATIAS等人，1989；Sundberg等人，1999)。因此，使用这个剂量诱导脱发，选择B6CBAF1系动物用于本研究。

动物在整个实验期间处于标准温度和相对湿度条件下，昼夜循环各12小时。全部动物均以1mg/日的剂量接受皮下注射1％的睾酮，所述睾酮分散于水中的聚山梨醇酯80混合物中(100mg/ml)。

在第一周中，动物仅接受皮下注射睾酮(1)。在实验第二周的第一天，将全部动物均用脱毛乳膏剂从其背部移除毛发，以便总体移除毛发。在脱毛后，维持每日注射睾酮，并且根据处理组(安慰剂组、治疗组、对照组)添加每日局部施用制剂。用以下制剂处理各组：水(阴性对照)、水和聚山梨醇酯80中的非那雄胺悬液(阳性对照1)、非那雄胺纳米乳液(NEF25-2阳性对照)和非那雄胺纳米囊(NF25)。

对于这个试验，选择使用两个阳性对照。一个对照由处于粗分散体(含0.77％的聚山梨醇酯80的水中)的药物组成，其中附聚物具有3.2微米的平均直径(D[4.3])和1.481的跨度(Span)，并且另一个对照由直径为276nm及跨度(Span)为1.523的纳米群体的纳米乳液制剂(NEF25)组成(同时存在平均直径12.8μm的小微米群体)。与纳米乳液制剂的比较意在验证纳米囊是否因其构造(聚合物壳)而具有效果或这种作用是否仅因药物(其部分)的纳米囊化(nanoencapsulation)发生出现。为了监测毛发生长，在第1日、第15日和第23日拍照。

结果：

如可以在图3中见到，用非那雄胺纳米囊(NF25)治疗显示加速的毛发生长，在23日后毛发覆盖动物的几乎整个背部。余下的治疗仅恢复皮肤的小块区域，并且用水治疗仅显示生长的开始。结果还展示含非那雄胺纳米囊(NF25)的制剂的优效性，与纳米乳液制剂(NEF25)相反。

实施例1.7：组织病理学分析

在确定毛发恢复能力的体内研究后，在第24日，通过颈椎脱臼法处死动物以进行组织病理学的检验。将一小片皮肤从动物背部(代表每个组)取下并进行组织学分析以可视化每个组的毛发的生长阶段。

为实现这个目的，制备切片并用苏木精伊红染色。随后，进行分析(Zeiss光显微镜-First Star，其连接于Canon Power Shot照相机，PC1250)以确定毛发处于哪个生长阶段。

为了量化通过组织学获得的数据，继续对来自每个组的每块组织学切片进行成熟毛囊(具有色素沉着并插入在脂肪组织中)计数。为此，每组分析4块切片，并且计数基于相同切片的3个不同灶点(foci)，总计每组分析12个视域。为了组间比较，通过ANOVA(α＝0.05)进行统计分析。图4显示各组的组织病理学检验结果。

组织学分析证实非那雄胺纳米囊(NF25)治疗的有效性。在图4中，在A中(NF25治疗)，可以观察到存在大量终毛囊(terminal follicle)(成熟/发育完成)，原因在于大量存在黑色素(由毛囊的暗中心代表)以及其是基于脂肪组织发育的(深插入皮肤中)，这代表发育中的终毛囊。这种解释在科学文献中得到支持(Meidan等人,2005；VOGT等人，2006；OTBERG等人，2007)。

进而，对于NEF25和C2+，观察到在真皮附近以更大的量存在的色素沉着少(或无色素沉着)的毛囊存在减少，那样的毛囊表明终毛囊退化成毫毛囊(无色素沉着并在真皮上层中发育)。这种解释在科学文献中得到支持(Sinclair等人,2003；Meidan等人,2005；VOGT等人，2006；OTBERG等人，2007)。

额外地，基于切片观察结果，分析每视域的成熟毛囊计数。图5显示按所评价组的基于每视域毛囊平均数(n＝12个视域)的结果。

如可以在图5中见到，在水组、游离非那雄胺组和非那雄胺纳米乳液(NEF25)组之间不存在显著差异，分别显示11±15个、4±8个和18±13个细胞/视域。然而，非那雄胺纳米囊制剂(NF25)显示82±14个细胞/视域并且比其他制剂显著更高(ANOVA,α0.05)。这些结果显示非那雄胺纳米囊(NF25)局部用制剂加速毛发生长和易遭受雄激素源性脱发的毛囊的发育，而非那雄胺纳米乳液制剂(NEF25)未显示令人满意的结果。

实施例2：含有0.05％的非那雄胺的本发明纳米囊－本发明第二实施方案

实施例2.1：根据本发明的第二实施方案制备非那雄胺纳米囊(NPXF05)

使用表5中描述的组成，从有机相和水相制备非那雄胺纳米囊悬液。

表5.根据本发明的第二实施方案制备的含有0.05％的非那雄胺的聚(ε-己内酯)纳米囊悬液[NPXF05]的组成

将聚合物(聚(ε-己内酯))随非那雄胺、中等链长甘油三酯、S-69和低HLB表面活性剂(山梨糖醇酐单硬脂酸酯)一起在20℃至40℃之间、优选地在40℃温和加热下溶解于有机相中，使用丙酮作为溶剂。将中性表面活性剂(聚山梨醇酯80)溶解于水中以形成水相。在有机相和水相的全部组分溶解后，使用漏斗，将有机相加注在水相上。

在形成本发明纳米囊的主乳液后，将该乳液在中速搅拌下维持10分钟，并且随后在恒温槽中旋转蒸发器内蒸发烧瓶中，在10℃至80℃之间，优选地在30℃至45℃之间降低的压力下浓缩至最终体积100ml，以消除溶剂和过量的水，以调节非那雄胺的最终浓度。这种制剂称作NPXF05。

实施例2.2：本发明第二实施方案的0.05％的非那雄胺纳米囊(NPXF05) 的物理化学表征

A.pH的测定

通过电位计直接在悬液中测定pH，所述电位计用pH 4.0和7.0的缓冲溶液校准。

B.通过多重光散射测定粒径和多分散指数

为了通过动态光散射法测定纳米粒子悬液的直径和多分散性，使用美国马尔文公司(Malvern)的nano-仪器型号ZEN 3600ZS。为此目的，将样品在室温于水(经Millipore Millex-HP 0.45微米滤器过滤)中稀释500倍，并且通过三次重复的平均数确定结果。

C.通过激光衍射测量确定粒度分布

为了评估在纳米粒子制剂中是否存在伴随的微米级群体，通过激光衍射法(Mastersizer 2000,Malvern,英国)进行分析，所述激光衍射法是一项能够测量具有宽范围直径(0.02微米至2000微米)的粒子的技术。通过添加含有约100ml蒸馏水的辅助分散体制剂的样品，实施分析。添加的量足以实现0.02至0.10之间的遮蔽。为了防止干扰，在分析之前测量背景信号。

D.ζ电位

通过使用nano-仪器型号ZEN 3600ZS(Malvern，美国)的电泳方法测定纳米囊悬液的ζ电位。从在10mM的NaCl溶液(经MilliporeMillex-HP 0.45微米滤器过滤)中稀释500倍开始实施测定，并且获得的结果为三次测定的平均数。

E.粘度

使用振动式粘度计(SV-10，爱安德公司(A&D Company)，日本)测量悬液的粘度。为此目的，在25±1.0℃温度于悬液中直接测量粘度30秒，每隔5秒采集数据。

结果：

证实了根据本发明第二实施方案制备的纳米囊的制剂在宏观上均匀，具有S-69的常见气味。下表(表6)显示本发明第二实施方案的非那雄胺纳米囊制剂(NPXF05)的pH值、直径、多分散指数、ζ电位和粘度。出于比较目的，将制剂NPXF05的结果与制剂NF25的结果一起显示。

表6.比较本发明的第二和第一实施方案的制剂的物理化学表征结果。

从物理化学分析可以见到，虽然经修改，这些制剂仍显示相似的特性。然而，激光衍射直径分析显示，用S-69和辛酸甘油三酯及癸酸的混合物所制备的含有0.05％的非那雄胺的制剂(NPXF05)仅显示纳米级的群体(图6)。

实施例2.3：研究本发明第二实施方案的非那雄胺纳米囊的稳定性

为了确定非那雄胺纳米囊(NPXF05)的稳定性，评价以下项目：

A.纳米囊中非那雄胺的定量

将纳米囊悬液按超声法用乙腈处理(30分钟)，引起制剂组分溶出。通过高效液相色谱(HPLC)对非那雄胺定量。

使用210nm的可见紫外检测器，LiChrospher 100RP-18(5μm，250x 4mm柱)，相同材料的前置柱(5微米)和等强度流动相乙腈：水(75:25)，流速1ml/min和进样量100μL，在珀金埃尔默(Perkin Elmer)色谱图系列200上分析。

B.验证晶体的存在

为了验证分散于外相中的药物的存在，通过HPLC从新鲜制备的制剂对非那雄胺进行量化。将制剂分成两份样品，允许前者静止并且在样品制备后30日实施测定法之前将第二份样品搅拌。仅从维持静止的样品采集上清液等分试样(防止任何移动)。从另一份样品，涡旋混合15秒后收集等分试样(对应于20％的上清液)。

结果：

此外，评估保持静止持续30天时间的一式三份NPXF25制剂的晶体的沉淀(通过上清液的HPLC分析)。将结果与NF25制剂的那些结果比较并在图7中显示。

如所示，向辛酸和癸酸的甘油三酯添加S-69允许在不丧失体系的纳米技术特征情况下实现非那雄胺的更多囊化。如所示，NPXF05制剂中有效成分浓度不存在明显的衰减，与原始浓度相比仅为4.1±0.4％。

实施例2.4：确定毛发恢复能力的体内测定法

对于本实验，使用来自塔雅伊谷大学(University of Vale do Itajaí，UNIVALI)动物饲养室的B6CBAF1杂交雌性小鼠。动物在实验期间处于常规温度和相对湿度条件下，昼夜循环各12小时。全部动物均以1mg/日的剂量接受1％睾酮的皮下注射，所述睾酮分散于水中的聚山梨醇酯80混合物中(100mg·.mL^-1)。每周注射5次持续4周。

再次实施加速毛发生长检验，并且这次，测试非那雄胺纳米囊制剂(NPXF05)。在第一周中，动物仅接受睾酮注射。在实验第二周的第一天，将全部动物均用脱毛乳膏剂移除其背部毛发，以便总体移除毛发。在移除毛发后，维持每日注射睾酮，并且根据处理组(安慰剂组、治疗组、对照组)向处理添加每日局部施用制剂。测试组是根据本发明第二实施方案制备的含有0.05％的非那雄胺的纳米囊制剂(NPXF05)，其与根据本发明第一实施方案制备的含有0.25％的非那雄胺的纳米囊制剂(NF25)的结果比较。

为了监测毛发生长，在第0日、第15日和第23日拍照。

结果：如可以在图8中见到，与含有0.25％的非那雄胺的纳米囊制剂(NF25)相比，用S-69和辛酸及癸酸的甘油三酯之组合制备的含有0.05％非那雄胺的纳米囊制剂(NPXF05)显示更多的生长。通过分析第15日的照片，观察到用含有0.05％的非那雄胺的纳米囊制剂(NPXF05)治疗的动物具有更多的生长。

实施例2.5：组织病理学分析

在确定毛发恢复能力的体内分析后，在第24日，通过颈椎脱臼法处死动物以进行组织病理学的检验。将一小片皮肤从动物背部(代表每个组)取下并进行组织学分析以可视化每个组的毛发的生长阶段。

为实现这个目的，制备切片并用苏木精伊红染色。随后，进行分析(Zeiss光显微镜-First Star，其连接于Canon Power Shot照相机，PC1250)以确定毛发所处于的生长阶段。

为了量化通过组织学获得的数据，对每个组的每块组织学切片进行成熟毛囊计数(具有色素沉着并在脂肪组织中插入)。因此，我们分析4块切片/组，并且计数基于相同切片的3个不同灶点(foci)，每组总计分析12个视域。为了组间比较，通过ANOVA(α＝0.05)进行统计分析。

图9显示各组的组织病理学检验结果。如可以在图9中见到，与非那雄胺纳米囊制剂(NF25)相比，用S-69和辛酸及癸酸的甘油三酯之组合制备的纳米囊制剂(NPXF05)显示更多的生长。通过分析第15日照片，观察到用NPXF05制剂治疗的动物比其他动物显示更多的毛发生长。

图10显示分析的每个组织学视域的成熟毛囊平均数。这些分析揭示，尽管具有更少的通过组织学视域分析的成熟毛囊数，NPXF05制剂显示加速的毛发生长和似乎比NF25制剂更多的毛发生长。

实施例3：包含非那雄胺纳米囊的药物组合物

实施例3.A-局部用溶液形式的制剂

如实施例1.1和2.1中所述制备非那雄胺纳米囊。制备局部用溶液剂，产生表7的制剂。

表7：具有含0.25％的非那雄胺(NF25－第一实施方案)和含0.05％的非那雄胺(NPXF05－第二实施方案)纳米囊悬液的局部用溶液形式的制剂

实施例3.B–局部用凝胶制剂

如实施例1.1和2.1中所述制备非那雄胺纳米囊。

用0.2％卡波普(Carbopol)对如实施例3.A中所述那样制备的纳米囊悬液增稠。添加适量三乙醇胺以获得用于局部施用的合适粘度。所得到的凝胶具有表8中显示的配方。

表8：具有含0.25％的非那雄胺(NF25－第一实施方案)和0.05％的非那雄胺(NPXF05－第二实施方案)的纳米囊悬液的局部用凝胶剂形式的制剂

实施例3.C：局部用洗剂形式的制剂

起初，使用表9的第1相的组成，如实施例3.A中所述那样制备第1相。分别将来自第2相的组分在水浴中在50℃熔化，且在融合后从热源上移走。将第3相添加至第1相并且在恒定磁力搅拌下分散。将第3相和第1相的这种混合物至熔融的第2相并且在避免掺入空气的中速机械搅拌下冷却至40℃。

表9：具有含0.25％的非那雄胺和0.1％的非那雄胺的纳米囊悬液的局部用洗剂形式的制剂。

本说明书中提到的全部出版物及专利申请表示的是本发明相关领域的技术人员的水平。全部出版物及专利申请通过引用的方式以相同程度并入本文，如同通过引用方式专门且独自地分别并入每份单独的出版物或专利申请。

尽管已经描述一些实施方案，它们仅以实施例模式展示并且不意在限制本发明的范围。实际上，本文所述的新实施方案可以按多种其他方式实施；除此之外，可以不偏离本发明精神的情况下做出对本文所述实施方案形式的各种省略、替换和变化。本发明书后附的权利要求及其等同物视为覆盖这类形式或修改，因为它们可以处于本发明的精神和范围内。

Claims (30)

1.包含有效成分非那雄胺的聚合物纳米粒子，其特征在于，所述纳米粒子从制备有机相和水相形成，其中：

(a)有机相，其包含：(i)疏水聚合物、(ii)油或油混合物、(iii)至少一种低HLB亲脂性表面活性剂、(iv)有机溶剂和(v)非那雄胺；和

(ii)水相，其包含：(vi)至少一种亲水性表面活性剂和(vii)水。

2.根据权利要求1所述的聚合物纳米粒子，其特征在于，所述聚合物纳米粒子处于纳米囊形式。

3.根据权利要求1所述的聚合物纳米粒子，其特征在于，所述疏水聚合物选自乙烯基聚合物、聚酯、聚酰胺、聚氨酯、丙烯酸聚合物和聚碳酸酯所组成的组。

4.根据权利要求3所述的聚合物纳米粒子，其特征在于，所述疏水聚合物是来自具有小于120℃熔点的聚酯类的生物可降解聚合物。

5.根据权利要求4所述的聚合物纳米粒子，其特征在于，所述疏水性生物可降解聚合物来自具有小于120℃熔点的聚酯类，所述聚酯类选自聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)共聚物、聚己内酯，以及聚己内酯与聚酯、与聚酰胺、与聚氨酯或与乙烯基聚合物的共聚物。

6.根据权利要求5所述的聚合物纳米粒子，其特征在于，所述聚己内酯是聚(ε-己内酯)。

7.根据权利要求1所述的聚合物纳米粒子，其特征在于，所述油选自中等链长甘油三酯、芥花油、大豆油、橄榄油、米糠油、葡萄籽油、鱼油、亚麻籽油、精油及它们的混合物所组成的组。

8.根据权利要求7所述的聚合物纳米粒子，其特征在于，所述中等链长甘油三酯选自癸酸和辛酸的甘油三酯、丙二醇二辛酰癸酸酯(dicaprilocapratode propilenoglicol)、油酸聚乙二醇甘油酯、月桂酸聚乙二醇甘油酯、亚油酸聚乙二醇甘油酯(macrogolglicerídeos de oleíla,laurolia,linoleoila)及它们的混合物所组成的组。

9.根据权利要求7所述的聚合物纳米粒子，其特征在于，所述精油选自芳樟醇、法呢醇及它们的混合物所组成的组。

10.根据权利要求7所述的聚合物纳米粒子，其特征在于，所述油是辛酸和癸酸的甘油三酯。

11.根据权利要求7所述的聚合物纳米粒子，其特征在于，所述油混合物是辛酸和癸酸的甘油三酯以及芳樟醇与法呢醇的混合物。

12.根据权利要求1所述的聚合物纳米粒子，其特征在于，所述亲脂性表面活性剂具有3至6范围内的低HLB值并且选自山梨糖醇酐单硬脂酸酯、山梨糖醇酐二硬脂酸酯、山梨糖醇酐三硬脂酸酯、辛酰己酰聚乙二醇甘油酯(macrogolglicerídeos caprilocaproílico)、丙二醇月桂酸酯、丙二醇辛酸酯、甘油单硬脂酸酯、聚甘油油酸酯及它们的混合物所组成的组。

13.根据权利要求12所述的聚合物纳米粒子，其特征在于，所述低HLB亲脂性表面活性剂是山梨糖醇酐单硬脂酸酯。

14.根据权利要求1所述的聚合物纳米粒子，其特征在于，所述有机溶剂是具有与水发生分子间相互作用的物理化学特性的溶剂，并且所述有机溶剂选自丙酮、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、N－甲基吡咯烷酮、二烷、碳酸丙烯酯、二乙醚、有机卤代物、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙腈、甲乙酮及它们的混合物所组成的组。

15.根据权利要求14所述的聚合物纳米粒子，其特征在于，所述有机溶剂是丙酮。

16.根据权利要求1所述的聚合物纳米粒子，其特征在于，所述亲水性表面活性剂选自聚氧化聚合物、离子型表面活性剂和中性表面活性剂所组成的组。

17.根据权利要求16所述的聚合物纳米粒子，其特征在于，所述亲水性表面活性剂是中性表面活性剂，所述中性表面活性剂选自聚山梨醇酯20、60或80、聚乙二醇硬脂酸酯、聚乙二醇鲸蜡硬脂基醚、聚乙二醇月桂基醚、聚乙二醇油基醚、聚乙二醇油酸酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油及它们的混合物所组成的组。

18.根据权利要求17所述的聚合物纳米粒子，其特征在于，所述中性亲水性表面活性剂是聚山梨醇酯80。

19.根据权利要求1至18中任一项所限定的聚合物纳米粒子的水悬液，其特征在于，所述悬液包含：

(i)有机相，其包含：

(a)0.001％至80.0％(w/w)的非那雄胺；

(b)0.01％至30.0％(w/w)的疏水聚合物；

(c)0.01％至50.0％(w/w)的油或油混合物；

(d)0.01％至50.0％(w/w)的至少一种低HLB亲脂性表面活性剂，优选地呈固态；和

(e)10％至80％(w/w)的有机溶剂；以及

(ii)水相，其包含

(f)0.05％至20.0％(w/w)的至少一种亲水性表面活性剂，和

(g)10％至90％(w/w)的水。

20.根据权利要求19所述的聚合物纳米粒子的水悬液，其特征在于，所述悬液包含：

(i)有机相，其包含：

(a)0.005％至50.0％(w/w)的非那雄胺；

(b)0.05％至20.0％(w/w)的聚(ε-己内酯)；

(c)0.05％至20.0％(w/w)的中等链长甘油三酯；

(d)0.05％至20.0％(w/w)的山梨糖醇酐单硬脂酸酯；和

(e)10％至80％(w/w)的丙酮；以及

(ii)水相，其包含：

(f)0.05％至20.0％(w/w)的聚山梨醇酯；和

(g)10％至90％(w/w)的水。

21.根据权利要求19所述的聚合物纳米粒子的水悬液，其特征在于，所述悬液包含：

(i)有机相，其包含：

(a)0.005％至50.0％(w/w)的非那雄胺；

(b)0.05％至20.0％(w/w)的聚(ε-己内酯)；

(c)0.05％至20.0％(w/w)的油混合物，所述油混合物包含辛酸和癸酸的甘油三酯以及芳樟醇和法呢醇(S-69)；

(d)0.05％至20.0％(w/w)的山梨糖醇酐单硬脂酸酯；和

(e)10％至80％(w/w)的丙酮；以及

(ii)水相，其包含：

(f)0.05％至20.0％(w/w)的聚山梨醇酯；和

(g)10％至90％(w/w)的水。

22.一种用于治疗脱发的药物组合物，其特征在于，包含：

(A)如权利要求1至18中任一项所限定的聚合物纳米粒子，所述纳米囊包含

(a)0.01％至2.5％(w/w)的非那雄胺；

(b)0.1％至10.0％(w/w)的疏水聚合物，优选地聚(ε-己内酯)；

(c)0.1％至5.0％(w/w)的油和/或油混合物，优选地中等链长甘油三酯和/或中等链长甘油三酯与S-69的混合物；

(d)0.1％至5.0％(w/w)的至少一种低HLB亲脂性表面活性剂，优选地山梨糖醇酐单硬脂酸酯；

(e)0.001％至10％(w/w)的亲水性表面活性剂，优选地聚山梨醇酯80；以及

(B)药学上可接受的载体，其中纳米囊的组分的量以最终制剂的百分数计并且所述纳米囊分散于所述药学上可接受的载体中。

23.根据权利要求20或21所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含纳米囊，所述纳米囊分散于含有0.01％至1.0％(w/w)的非那雄胺的药学上可接受的载体中。

24.根据权利要求23所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于局部施用并且处于溶液、凝胶或洗剂形式。

25.根据权利要求22、23或24所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含添加物，所述添加物选自分散剂、表面活性剂、润湿剂、软化剂、增稠剂、掩蔽剂、防腐剂、抗氧化剂、芳香剂等所组成的组。

26.制备根据权利要求1至18中任一项所限定的聚合物纳米粒子的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(i)通过在有机溶剂中溶解疏水聚合物和非那雄胺、不挥发性油或油混合物和至少一种低HLB表面活性剂，制备有机相；

(ii)通过在水中混合至少一种亲水性表面活性剂，优选中性的亲水性表面活性剂，制备水相；

(iii)在水相中注入有机相以引起纳米粒子的主乳液在两个相的界面上形成，维持混合物处于搅拌下持续足够使有效成分充分囊化的时间；

(iv)移除至少一种有机溶剂并回收含有纳米囊的水相。

27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述疏水聚合物选自乙烯基聚合物、聚酯、聚酰胺、聚氨酯、丙烯酸聚合物和聚碳酸酯所组成的组。

28.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述聚酯具有小于120℃的熔点并且选自聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)的共聚物、聚己内酯、聚己内酯与聚酯、与聚酰胺、与聚氨酯或与乙烯基聚合物的共聚物所组成的组。

29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，通过预聚物界面沉积法获得非那雄胺纳米囊，即在第一步骤中，使非那雄胺、疏水聚合物、不挥发性油或油混合物和至少一种低HLB表面活性剂溶解在有机溶剂中以形有机相；并且在第二步骤中，在水中混合至少一种亲水性表面活性剂以形成水相。

30.根据权利要求1至18中任一项所限定的纳米囊的用途，其特征在于，所述纳米囊用于制备用于治疗脱发的药物组合物。