CN104761626A - 植物抗病性相关蛋白VrNPR1及其编码基因与应用 - Google Patents

植物抗病性相关蛋白VrNPR1及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，提供了一种植物抗病性相关蛋白VrNPR1及其编码基因VrNPR1与应用。所述植物抗病性相关蛋白VrNPR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明通过实验证明，通过农杆菌转化法将VrNPR1基因导入水稻，经过潮霉素初筛、分子检测、接种白叶枯菌检测抗病性等手段，筛选到抗病能力显著提高的转基因水稻株系。本发明对于培育抗病转基因豆科作物具有重要价值。

Description

植物抗病性相关蛋白VrNPR1及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种植物抗病性相关蛋白VrNPR1及其编码基因与应用。
背景技术
绿豆(Vigna radiata(Linn.)Wilczek.)，属于豆科，在中国已有两千年的栽培史。是我国重要的粮食作物。因其具有重要的营养价值和医用价值，现已作为重要的功能型食品进行开发。近年来，随着种植业结构的调整和人们膳食结构的改变，人们对绿豆的需求量日益增加，种植面积逐年扩大。研究表明病虫害严重影响绿豆种子萌发和产量等方面。鉴于此，深入研究绿豆NPR1参与抗病的机理，对筛选出抗病较强的品种及抗病育种材料的筛选具有十分重要的意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种植物抗病性相关蛋白VrNPR1及其编码基因与应用。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种植物抗病性相关蛋白VrNPR1，来源于绿豆(Vigna radiata(Linn.)Wilczek.)，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
所述一个或几个氨基酸残基的替换和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的替换和/或缺失和/或添加。
本发明还提供了一种与植物抗病性相关的基因VrNPR1，所述基因可编码前述植物抗病性相关蛋白VrNPR1。
进一步地，所述基因含有如SEQ ID No.2中第7-1782bp所示的核苷酸序列。
更进一步地，当所述基因用于构建重组载体、工程菌、转基因细胞系或表达盒时，可根据本领域常规技术在其末端构建酶切位点。
在本发明的一个具体实施方式中，本发明提供一个5’末端的第1-6位核苷酸是SacI酶切位点，第1783-1788位核苷酸是SalI的酶切位点的核苷酸序列，该核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了用于扩增前述基因的引物对，所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
本发明还提供了含有前述基因的载体，所述载体为将前述基因插入载体pCAMBIA2300的SacI和SalI酶切位点之间得到的重组表达载体。
本发明还提供了含有前述基因的工程菌。
本发明还提供了前述基因在培育转基因植物提高抗病性中的应用。
进一步地，所述应用为利用前述重组表达载体或工程菌将所述与植物抗病性相关的基因VrNPR1导入目的植物得到抗病性提高的转基因植物。
其中，所述抗病性为抗白叶枯病。
所述植物为双子叶植物或单子叶植物，所述单子叶植物优选禾本科植物，具体可为稻属植物，更具体可为水稻品种“日本晴”。
本发明的有益效果在于：
本发明的实验证明，本发明从豆科植物绿豆中筛选到一个基因VrNPR1，通过农杆菌转化法将VrNPR1导入水稻，经过潮霉素初筛、分子检测、接种白叶枯菌检测抗病性等手段，筛选到抗病能力显著提高的转基因水稻株系。本发明对于培育抗病转基因豆科作物具有重要价值。
附图说明
图1为本发明所述载体pCAMBIA2300-VrNPR1构建流程图。
图2为本发明T1代转基因水稻的PCR检测结果；
其中：M：1kb DNA ladder，由下到上分别为250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp；16：阴性对照；17：阳性对照，pCAMBIA2300-VrNPR1载体；1、2、4-8，10和13-15：PCR鉴定阳性植株；3、9、115和12：PCR鉴定阴性植株。
图3为本发明T1代转基因水稻和野生型水稻接种白叶枯菌菲律宾6号小种PXO99两周被接种叶片的照片。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
pCAMBIA2300-Actin载体：公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；参考文献：Kejian Wang，Ding Tang，Lilan Hong，WenyingXu，Jian Huang，Ming Li，Minghong Gu，Yongbiao Xue，Zhukuan Cheng.DEP and AFO Regulate Reproductive Habit in Rice.January 2010.Volume 6。
中绿5号绿豆种子：由中国农业科学院作物科学研究所培育(该种子向公众免费赠予)。
农杆菌EHA105记载在Days to heading 7,a major quantitativelocus determining photoperiod sensitivity and regional adaptation in rice,He Gao et al,PNAS,2014,111(46)，16337–16342中，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
白叶枯菌菲律宾6号小种PXO99：公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得；参考文献：郑崇珂，王春连，于元杰，梁云涛，赵开军.水稻抗白叶枯病新基因Xa32(t)的鉴定和初步定位.作物学报，2009，35(7)：1173-1180。
实施例1VrNPR1基因的克隆
1、设计特异性引物对(VrNPR1＿5’和VrNPR1＿3’)，由Invitrogen公司合成。
VrNPR1＿5’：5’-GAGCTCATGGCAGCTTATTCAGCCGAACCC-3’；
VrNPR1＿3’：5’-GTCGACATTCACTTTCCTAGCCCTGTAATGTAC-3’。
2、提取绿豆(Vigna radiata(Linn.)Wilczek.)整株植物的RNA，反转录为cDNA；
3、以步骤2的cDNA为模板，用步骤1的特异性引物对VrNPR1-5’和VrNPR1-3’进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
4、将步骤3的PCR扩增产物进行测序。
测序结果为，该PCR产物的基因的序列为序列表中的序列2，编码区为序列2的自5’末端的第7-1782位核苷酸，自5’末端的第1-6位核苷酸是SacI酶切位点，第1783-1788位核苷酸是SalI的酶切位点。将该基因命名为VrNPR1，该基因编码的蛋白命名为VrNPR1，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列1所示，序列1由591个氨基酸残基组成。
5、将上述PCR产物插入pMD18T-simple载体(购自TaKaRa生物工程公司)，得到载体pMD18T-simple-VrNPR1，测序，结果为载体pMD18T-simple-VrNPR1为将序列表中的序列2插入pMD18T-simple载体得到的载体。
实施例2转基因水稻的获得和功能研究
一、转基因拟南芥的获得
1、重组载体(pCAMBIA2300-VrNPR1)的构建
构建过程如图1所示。
(1)用限制性内切酶SacI和SalI双酶切载体pMD18T-simple-VrNPR1，回收小片段。
(2)用限制性内切酶SacI和SalI双酶切pCAMBIA2300(购自Center for the Application of Molecular Biology to InternationalAgriclture,www.cambia.org)，回收载体骨架。
(3)将步骤(1)的小片段与步骤(2)的载体骨架连接，得到连接产物，将该连接产物转化大肠杆菌DH5a，得到转化子，提取转化子的质粒，送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列2插入pCAMBIA2300的SacI和SalI酶切位点之间得到的重组载体，将该质粒命名为pCAMBIA2300-VrNPR1。
2、转基因拟南芥的获得
(1)农杆菌感受态细胞的制备
挑取农杆菌EHA105单菌落接种于100ml YEB液体培养基中，220rpm、28℃振荡培养至OD600＝0.5；转入无菌离心管，5000rpm离心5min，去上清，加入10ml预冷的0.15M的CaCl2水溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min；4℃、5000rpm离心5min，去上清，加入4ml预冷的含10％甘油(体积百分含量)和0.15M CaCl2的水溶液，轻轻悬浮；得到农杆菌悬浮液(EHA105感受态细胞)，分装于无菌eppendorf管中，每管200μl，于液氮中速冻1min，冻存于-70℃。
(2)pCAMBIA2300-VrNPR1转化农杆菌EHA105
取1μg上述得到的pCAMBIA2300-VrNPR1加入200μl EHA105感受态细胞中，混匀，静止5min；液氮中速冻1min，37℃水浴5min，加入1ml YEB液体培养基，28℃、150rpm振荡培养4h；5000rpm离心3min，弃上清，加入0.1ml YEB液体培养基，重新悬浮细胞；涂布于含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平的YEB固体平板上，28℃培养约48h，得到转化子。将转化子进行菌液PCR鉴定，鉴定所用引物如下：
5’引物：5’-GAGCTCATGGCAGCTTATTCAGCCGAACCC-3’；
3’引物：5’-GTCGACATTCACTTTCCTAGCCCTGTAATGTAC-3’。
结果显示得到约1788bp的片段，证明pCAMBIA2300-VrNPR1已经成功转入EHA105中。再将PCR鉴定阳性的转化子提取质粒，送去测序，结果为该质粒为pCAMBIA2300-VrNPR1，进一步证明，将载体pCAMBIA2300-VrNPR1已经成功转入EHA105中，将含有pCAMBIA2300-VrNPR1的转化子命名为重组农杆菌EHA105/pCAMBIA2300-VrNPR1。
(3)转化水稻
①将重组农杆菌EHA105/pCAMBIA2300-VrNPR1接种于10ml含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平的YEB液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养过夜；
②转化前一天以1:50比例(体积比)接种于200ml含相同抗生素的YEB培养基中，扩大培养至OD600为0.8，5000rpm、15min离心集菌，重悬于渗入缓冲液，使OD600为0.6，即为重组农杆菌EHA105/pCAMBIA2300-VrNPR1菌液；
③将步骤②得到的重组农杆菌与水稻的成熟胚愈伤组织共培养，采用120-200μg/L G418筛选抗性愈伤组织，然后经过预分化、分化、生根后得到T0代植株。
3、T0代，用NPT_F和NPT_R组成的引物对进行PCR鉴定，目的条带约1788bp，PCR鉴定中扩增得到目的条带的植株即为转基因植株。
(4)转基因水稻的分子鉴定
提取T2代转VrNPR水稻株系的基因组DNA为模板，以质粒p2300-VrNPR1为阳性对照，水稻品种“日本晴”(野生型)的基因组DNA为阴性对照，用如下引物进行PCR扩增：
5’引物：5’-GAGCTCATGGCAGCTTATTCAGCCGAACCC-3’；
3’引物：5’-GTCGACATTCACTTTCCTAGCCCTGTAATGTAC-3’。
PCR体系(25μl)：10×Ex Taq PCR Buffer 2.5μl，dNTP(25mM)2.0μl，5’引物(5pmol/μl)1.0μl，3’引物(5pmol/μl)1.0μl，ExTaq酶(5U/μl)1.0μl，模板(1μg/μl)1.0μl，ddH2O 16.5μl。
PCR程序为：第一轮：94℃变性5min；第二轮：94℃变性50sec，52℃复性50sec，72℃延伸2min，30个循环；第三轮：72℃延伸10min。
反应结束后，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果见图2所示的PCR扩增产物电泳图，M为1kb DNA ladder，由下到上分别为250bp、500bp、750bp、1000bp、1500bp、2000bp；16为阴性对照；17为阳性对照；1、2、4-8，10和13-15为PCR阳性植株，3、9、11和12为PCR阴性植株；可以看出，能扩增出VrNPR1基因特异条带(约1788bp)的植株为PCR鉴定阳性T2代转VrNPR1水稻植株，得到11个PCR鉴定阳性T0代转VrNPR1水稻植株。
二、转基因水稻的的抗病性鉴定
分别将T0代转pCAMBIA2300-VrNPR1载体和水稻品种“日本晴”各8株正常培养至分蘖盛期，采用Kauffman等(1973年)的人工剪叶接种白叶枯菌菲律宾6号小种PXO99，具体如下：每株植株接种3-5个叶片，接种时先把剪刀在白叶枯菌菲律宾6号小种PXO99的菌液(溶剂为无菌水，菌浓度为109个细胞/ml)菌液中浸泡一下，然后用剪刀剪去每个要被接种的叶片顶端3-5cm，接种两周后观察各个植株上被接种叶片的表型并拍照，根据叶片的表型进行病情分级。水稻对白叶枯菌病情的分级标准见表1。
表1 水稻对白叶枯菌病情的分级标准
各个转pCAMBIA2300-VrNPR1载体植株均为高抗表型。
各个水稻品种“日本晴”均为高感表型。
照片见图3，A为水稻品种“日本晴”，B为转pCAMBIA2300-VrNPR1载体植株。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种植物抗病性相关蛋白VrNPR1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.一种与植物抗病性相关的基因VrNPR1，其特征在于，所述基因可编码权利要求1所述的蛋白。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因含有如SEQID No.2中第7-1782bp所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID No.2所示。
5.用于扩增权利要求2所述基因的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
6.含有权利要求2-4任一项所述基因的载体。
7.含有权利要求2-4任一项所述基因的工程菌。
8.权利要求2-4任一项所述的基因在培育转基因植物提高抗病性中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，利用权利要求6所述的载体或权利要求7所述的工程菌将权利要求2-4任一项所述的基因导入目的植物得到抗病性提高的转基因植物。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抗病性为抗白叶枯病。
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