CN104740656A - 负载氧化铁纳米颗粒的γ-聚谷氨酸水凝胶的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及负载氧化铁纳米颗粒的γ-聚谷氨酸水凝胶的制备及其应用。所述的制备方法包括：(1)温和还原法合成PEI包覆的Fe₃O₄纳米颗粒(PEI-Fe₃O₄)；(2)γ-聚谷氨酸的水溶液先经EDC活化，然后经过双乳化的方法反应形成W/O/W的聚合物乳液；(3)将(1)中的PE-Fe₃O₄作为交联剂加入到(2)中的聚合物溶液中发生交联反应，除去有机溶剂和表面活性剂后，即得到负载氧化铁纳米颗粒的γ-聚谷氨酸水凝胶。本发明工艺简单，易于操作分离，原料来源广泛，成本低廉；制备的γ-聚谷氨酸水凝胶粒径分布均匀，弛豫率较高，造影效果显著，具有良好的水溶性、胶体稳定性、细胞相容性和血液相容性，对生物体无不良影响。

Description

负载氧化铁纳米颗粒的γ-聚谷氨酸水凝胶的制备及其应用

技术领域

本发明属于磁共振造影剂的制备领域，特别涉及一种负载氧化铁纳米颗粒的γ-聚谷氨酸纳米水凝胶的制备方法。

背景技术

纳米水凝胶是由亲水性或两亲性的高分子链通过物理或者化学交联的方式组成的三维网状结构的水凝胶颗粒，它是一种纳米尺度的软体材料。纳米水凝胶具有许多优良的特性，如良好的胶体稳定性、细胞相容性、高负载能力、易于多功能化、易进入肿瘤组织等，促进了其在诸多领域的应用。天然多聚氨基酸(如γ-聚谷氨酸)具有良好的细胞相容性和生物可降解性，同时价廉易得，广泛用于合成纳米水凝胶。γ-聚谷氨酸(γ-Polyglutamic Acid，γ-PGA)是自然界中微生物发酵产生的水溶性多聚氨基酸，其结构为谷氨酸单元通过α-氨基和γ-羧基形成肽键的高分子聚合物，其结构如式所示。γ-聚谷氨酸具有优良的水溶性、超强的吸附性和生物可降解性，是一种优良的环保型高分子材料，已广泛用于生物医学领域。

磁共振成像(MRI)技术是七十年代发展起来的一种先进医学成像诊断技术，已广泛用于人体多种疾病的检测和早期诊断。MRI具有较高的分辨率，较高的空间和断层成像能力，没有放射引起的电离损害，同时可获得解剖及生理信息，具有其他医学成像无可比拟的优点。MRI在疾病监测领域发挥越来越重要的作用。但MRI的弱点是其敏感性较低，而且不同器官或肿瘤组织的弛豫时间相互 重叠使MRI诊断困难。近年来，通过注射MRI成像造影剂的方法可以有效解决MRI敏感性较低的问题，显著提高成像的对比度和清晰度。因此选择合适的MRI成像造影剂就显得尤为重要。

磁性四氧化三铁纳米颗粒(Fe₃O₄)近年来在生物医学领域有着越来越广泛的应用，尤其是在MRI成像造影剂方面的应用更是受到了普遍的关注。Fe₃O₄纳米颗粒具有独特的磁学性质以及较高的信号强度、较低的使用剂量、良好的细胞相容性和较低的制造成本等特点。本课题组之前采用还原法制备超顺磁性氧化铁纳米颗粒的结果表明，通过还原法制备的四氧化三铁纳米颗粒尺寸较小，粒径均匀，并且表现出极高的r₂弛豫率，且其表面存在大量的氨基活性基团，可作为纳米水凝胶合成的交联剂(沈明武，李静超，胡勇，孙文杰，史向阳。一种叶酸修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法。中国发明专利，申请号：201410182821.1，申请日期：2014-4-30)。本发明以还原法合成的PEI-Fe₃O₄为交联剂合成γ-聚谷氨酸纳米水凝胶，构建了负载Fe₃O₄纳米颗粒的γ-聚谷氨酸水凝胶用作MRI成像造影剂，其表面丰富的羧基可以进一步修饰功能化试剂，为本发明的进一步深入研究开发提供了很大的空间。

检索国内外文献发现，尚没有发现关于以还原法合成的PEI-Fe₃O₄为交联剂制备γ-聚谷氨酸水凝胶作为MR成像造影剂研究的相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种γ-聚谷氨酸纳米水凝胶的制备及其在MR造影剂方面的应用，该方法工艺简单，易于操作分离，原料来源广泛；制备的γ-聚谷氨酸纳米水凝胶能稳定地分散于水溶液中，粒径分布均匀，弛豫率高、造影效果显著，具有良好的医用前景。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种负载氧化铁纳米颗粒的γ-聚谷氨酸水凝胶的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1：将铁盐(III)溶解，通入N₂鼓吹搅拌，将亚硫酸钠(Na₂SO₃)水溶液滴加到上述溶液中，搅拌10min-1h；将超支化聚乙烯亚胺(PEI)水溶液加入到上述溶液中，搅拌混合均匀；将氨水(NH3.H2O)加入到上述溶液，在60-70℃下反应10min-1h，在室温下继续反应1-3h，反应结束后，将反应液离心洗涤，即得PEI包裹的四氧化三铁纳米颗粒(PEI-Fe3O4)；

步骤2：配制γ-聚谷氨酸的水溶液，先加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化1-3h，再加入碳酸氢钠(NaHCO3)继续反应0.5-1.5h；然后将上述溶液逐滴加入到磺基琥珀酸二辛酯钠(AOT)的二氯甲烷(DCM)溶液中，搅拌3-8分钟，形成W/O乳液；然后将该W/O乳液逐滴加入到聚乙烯醇(PVA)的水溶液中，搅拌5-15分钟，形成W/O/W的聚合物乳液；

步骤3：将步骤1制备的PEI包裹的四氧化三铁纳米颗粒逐滴加入到步骤2制备的W/O/W的聚合物乳液中，搅拌过夜，蒸发除去有机溶剂，然后离心洗涤，即得到负载氧化铁纳米颗粒的γ-聚谷氨酸水凝胶。

优选地，所述的步骤1中的铁盐、亚硫酸钠、超支化聚乙烯亚胺和氨水的用量配比为2.6g∶0.4g∶1g∶4mL，氨水的浓度为25.0％-28.0％。

优选地，所述的步骤1中的铁盐为FeCl₃·6H₂O。

优选地，所述的步骤2中的γ-聚谷氨酸的水溶液的浓度为1wt％。

优选地，所述的步骤2中的γ-聚谷氨酸与碳酸氢钠(NaHCO₃)的质量比为1∶1.3。

优选地，所述的步骤2中的AOT的二氯甲烷(DCM)溶液的浓度为2.5wt％。

优选地，所述的步骤2中的聚乙烯醇(PVA)的水溶液的浓度为2wt％。

优选地，所述的步骤2中的γ-聚谷氨酸水溶液、AOT的二氯甲烷(DCM)溶液和聚乙烯醇(PVA)的水溶液的体积比为1∶2∶15。

优选地，所述的步骤3中所用的PEI包裹的四氧化三铁纳米颗粒和步骤2中所用的γ-聚谷氨酸的质量比为3∶1。

本发明还提供了一种MR成像造影剂，其特征在于，含有上述方法制备的负载氧化铁纳米颗粒的γ-聚谷氨酸水凝胶。

本发明所制备的负载氧化铁纳米颗粒的γ-聚谷氨酸水凝胶是由γ-聚谷氨酸与PEI-Fe₃O₄的静电相互作用和化学作用交联而成。本发明先利用还原法合成PEI包裹的Fe₃O₄磁性纳米颗粒，然后将其加入到经EDC活化和双乳化的γ-聚谷氨酸溶液中，发生交联反应形成负载Fe₃O₄纳米颗粒的γ-聚谷氨酸纳米水凝胶。本发明操作简单，易于分离，原料来源广泛。制备的γ-聚谷氨酸水凝胶粒径分布均匀，弛豫率较高、造影效果显著，具有良好的水溶性、胶体稳定性、细胞相容性和血液相容性，对生物体无不良影响，易于被肿瘤细胞吞噬。肿瘤成像结果显示， 本发明制备的负载Fe₃O₄纳米颗粒的γ-聚谷氨酸水凝胶具有显著的造影效果，在磁共振成像造影剂领域有潜在的应用价值。

本发明使用Zeta电势及动态光散射分析(DLS)、X射线衍射分析(XRD)、傅里叶转换红外光谱分析(FTIR)、热重分析(TGA)、扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)和磁共振(MR)分析等手段表征制备的负载Fe₃O₄纳米颗粒的γ-聚谷氨酸纳米水凝胶(γ-PGA/PEI-Fe₃O₄)。然后利用刃天青还原法评价纳米水凝胶的细胞毒性，并用相差显微镜获取与材料共培养后的细胞的形貌；随后评价肿瘤细胞对该纳米水凝胶的吞噬能力。最后进行体外细胞、裸鼠体内肿瘤模型的MR成像实验，考察γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶的体内外MR成像效果。此外，通过组织分布实验研究γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶在生物体内的代谢情况。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明采用还原法合成的Fe₃O₄-PEI作为交联剂制备γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶用于MR成像造影剂，该方法工艺简单，易于操作分离，原料来源广泛价廉生物可降解，具有良好的发展前景。

(2)本发明制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶粒径分布均匀，具有良好的水溶性、胶体稳定性、细胞相容性和血液相容性，弛豫率高，造影效果显著，该水凝胶表面拥有大量的活性基团可用于进一步的修饰和深入开发，在磁共振成像诊断领域有潜在的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶水溶液的粒径分布图(a)及其在不同储存时间的水动力学直径变化(b)；

图2为本发明实施例1制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶和和裸露的Fe₃O₄纳米颗粒(共沉淀法)的X射线衍射分析(XRD)图片；

图3为本发明实施例1制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶、γ-PGA和PEI-Fe₃O₄纳米颗粒的傅立叶变换红外光谱分析(FTIR)图片；

图4为本发明实施例1制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶、裸露的Fe₃O₄纳米颗粒(共沉淀法)和PEI-Fe₃O₄纳米颗粒的的热重分析(TGA)图片；

图5为本发明实施例1制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶的透射电子显微镜(TEM，左图)和扫描电子显微镜(SEM，右图)图片；

图6为本发明实施例1制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶的T₂驰豫时间倒数随Fe浓度变化的关系曲线；

图7为HeLa细胞经本发明实施例1制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶处理24小时后的刃天青还原分析图(Fe浓度为0.01、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2mM)；

图8为本发明实施例1制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶的对HeLa细胞处理24小时后(Fe浓度为0.01、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2mM)的细胞相差形貌图片。

图9为本发明实施例1制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶的HeLa细胞吞噬量随Fe浓度的变化关系(Fe浓度为0.01、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2mM)；

图10为本发明实施例1制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶对细胞处理后的细胞MR成像图片(a)和体外细胞MR成像信噪比随Fe浓度变化的关系图(b)；

图11为注射本发明实施例1制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶(200μL，[Fe]＝51.04mM)后在不同时间点下体内Hela肿瘤模型的MR成像图片(a)及其信噪比图片(b)；

图12本发明实施例1制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶(200μL，[Fe]＝51.04mM)组织分别在荷兰裸鼠(a)和正常白鼠(b)体内代谢的组织分布图片；

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

将2.6g六水合氯化铁(FeCl₃·6H₂O)倒入三口烧瓶中，加入40ml超纯水溶解，通入N₂鼓吹搅拌；将15ml 26.67g/L亚硫酸钠(Na₂SO₃)水溶液缓慢滴加到上述溶液中，搅拌30min；将10ml100g/L超支化聚乙烯亚胺(PEI，Mw＝25kDa)水溶液加入到上述溶液中，搅拌混合均匀；将4ml浓度为25.0％-28.0％的氨水(NH₃.H₂O)加入到上述溶液，在60-70℃下反应0.5h，在室温下继续反应2h。反应结束后，将反应液在6000rpm离心并用超纯水洗涤3次，即得PEI 包裹的四氧化三铁纳米颗粒PEI-Fe₃O₄。将20mgγ-聚谷氨酸(γ-PGA，Mw＝1000kDa)溶解于2.4ml超纯水配制γ-聚谷氨酸的水溶液，先加入0.6ml50g/L EDC溶液活化2h；将26mg碳酸氢钠(NaHCO₃)加入到上述溶液中继续反应1h；然后将上述溶液逐滴加入到6ml 33.5g/LAOT的二氯甲烷(DCM)溶液中，搅拌5分钟，形成W/O乳液；然后将该W/O乳液逐滴加入到44.1ml 20.4g/L聚乙烯醇(PVA，醇解度88％，Mw＝20-30kDa)的水溶液中，搅拌10分钟，形成W/O/W的聚合物乳液。取5ml 1.34g/L PEI-Fe₃O₄逐滴加入到上述W/O/W的聚合物乳液中，搅拌过夜，蒸发除去有机溶剂，然后5000rpm离心并用超纯水洗涤3次以除去表面活性剂，即得到负载氧化铁纳米颗粒的γ-聚谷氨酸水凝胶(γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶)。

实施例2

取实施例1中制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶，将其用超纯水稀释100倍后，用于测表面电势和水动力直径。Zeta电势测定结果表明γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶的表面电势为-6.55±0.42mV，从而有效避免了PEI-Fe₃O₄表面氨基产生的细胞毒性，也证明了γ-PGA和PEI-Fe₃O₄的成功交联。其水动力学直径为239.4±3.8nm，粒径分布均一，且水动力直径能长时间保持几乎不变(如图1)，从而说明γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶(实施例1)具有良好的胶体稳定性。接着本发明通过测定XRD(如图2)和FTIR(如图3)，本发明制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶的XRD图谱(参见附图2)表明：所制备的水凝胶的衍射峰在位点220、311、400、422、511和440处与四氧化三铁纳米颗粒的衍射峰位点非常吻合。衍射峰峰型尖锐，说明反应制得了晶型良好的四氧化三铁纳米晶体。本发明制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶的FTIR图谱(参见附图3)表明：在598cm^-1、1630cm^-1、1737cm^-1、2925cm^-1三处，吸收峰强度明显增加。这说明PEI-Fe₃O₄很好的交联了γ-PGA，形成纳米水凝胶，表明了PEI-Fe₃O₄和γ-PGA成功交联。然后本发明对γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶进行了TGA(如图4)分析，结果表明水凝胶中的四氧化三铁含量为38％，γ-PGA的含量为50％。之后通过透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)观察实施例1中制备γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶的形貌(如图5)。结果表明所形成的 γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶的形貌呈球形或准球形，尺寸均匀，凝胶直径大小约为130nm，没有明显的团聚现象，在溶液中分散良好而且不发生聚集。

实施例3

通过ICP-AES测试法测定实施例1制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶中Fe元素的含量。分别配制Fe元素浓度为0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2mM的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶水溶液2mL，通过磁共振成像分析仪测定材料在不同Fe浓度下的T₂弛豫效应(如图6)。

Fe₃O₄纳米材料可以用作核磁共振成像的阴性造影剂，随着Fe浓度的增加，MRI信号强度逐渐减弱。弛豫率(r₂)反映Fe₃O₄纳米材料作为MRI造影剂的成像效率，为单位摩尔浓度铁的横向弛豫时间，可通过不同浓度下的弛豫时间(T₂)的倒数拟合计算得到。

通过本发明制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶T₂弛豫时间倒数与Fe浓度的线性拟合图，可以看出这种γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶的弛豫时间倒数随着铁浓度的增加(在0.0125～0.2mM浓度范围内)，具有良好的线性关系。随着Fe浓度的增高，其MR信号强度明显减弱。不同浓度样品的磁共振成像可以看出纳米颗粒具有良好的体外成像效果。通过计算得出γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶的r₂值为171.1mM^-1s^-1(参见附图6)。因此，本发明所制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶可以作为MR分子影像学诊断中的优良T₂信号衰减造影剂。

实施例4

刃天青还原实验和相差显微镜测试结果：

通过刃天青荧光比色法测定HeLa细胞的活力来评价本发明制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶的细胞相容性。配制不同浓度的实施例1制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶水溶液。收集对数生长期HeLa细胞，按照10000细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板上，加入DMEM培养基，细胞培养板置于CO₂浓度为5％和温度为37℃的环境中培养24小时。弃掉培养基后，每孔更换180μL DMEM培养基，并分别添加20μL不同浓度的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶(最终Fe元素浓度为0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2mM)和纯 PBS(对照组)，每种浓度设定5个平行样。将细胞培养板继续放置在5％CO₂，37℃继续孵育24h。倒掉原有培养基并用无菌PBS清洗3遍，每孔加入20μL刃天青溶液(1mg/mL)，避光环境下37℃恒温培养4h。按顺序每孔吸取上层培养液100μL于黑色96孔板中，在多功能荧光酶标仪上检测各孔在激发波长λ＝530nm，发射波长λ＝590nm处的荧光值，荧光值的大小可以反映活细胞的数量(如图7)。结果显示，与PBS对照组相比，γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶在试验浓度范围内对HeLa细胞没有明显细胞毒性，细胞存活率均在100％以上，说明γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶具有非常好的细胞相容性，可以安全地应用于生物体内MRI成像。同时，本发明通过相差显微镜观察法进一步验证了γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶对细胞形貌的影响。如图8所示，不同Fe浓度γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶(Fe浓度为0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.02mM)在37℃下与细胞共培养24小时后，细胞形貌与PBS处理的细胞没有明显的变化，进一步说明了γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶具有良好的细胞相容性。

实施例5

一种理想的造影剂纳米材料应该易于被肿瘤细胞吞噬，才能更好的应用于肿瘤的MRI成像，因此本发明对γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶被肿瘤细胞的吞噬情况进行了评价。

配制不同浓度的实施例1制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶水溶液，将HeLa细胞接种在96孔细胞培养板上(接种密度为每孔50万)，加180μL DMEM培养基，细胞培养板置于CO₂浓度为5％和温度为37℃的环境中培养24小时。分别加入所配制的不同浓度的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶水溶液(Fe元素终浓度为0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2mM)，在5％CO₂，37℃条件下共培养6小时，以PBS培养作为空白对照组。PBS清洗细胞3遍之后，用王水(盐酸/硝酸；体积比3∶1)消化，然后利用电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)测量细胞吞噬的Fe浓度。附图9结果显示，经γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶(0.2mM)处理的细胞的吞噬量非常高，达到10.8pg/cell。这一结果说明γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶易于被肿瘤细胞所吞噬，从而获得理想的造影效果。

实施例6

在体内实验之前，本发明评价了本发明制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶的细胞MRI成像效果，配制不同浓度的实施例1制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶水溶液，将HeLa细胞接种在96孔细胞培养板上(接种密度为每孔50万)，加具体什么培养基，多少体积，什么条件下培养12h，分别加入所配制的不同浓度的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶水溶液(Fe元素终浓度为0.025、0.05、0.1、0.2mM)，在5％CO₂，37℃下共培养6小时，并且以PBS处理的细胞作为对照组，在培养结束后细胞用PBS清洗5次，再胰酶消化、离心、过滤，最后分散在1mL PBS(含0.5％琼脂糖)中，用核磁共振成像仪测各细胞样品的T₂弛豫效应(如图10)。在图10a中，随着Fe浓度的增加，γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶处理后的细胞表现出MR信号衰减的趋势，说明随着Fe浓度的增加，细胞对纳米水凝胶的吞噬量也增加。图10b是细胞经过不同浓度的纳米水凝胶处理后的MR成像信噪比值，从图中明显看出，随着Fe浓度的增加，细胞的MRI信噪比均逐渐减少。这些结果说明制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶具有很好的细胞MR成像效果。

实施例7

在裸鼠体内构建HeLa皮下瘤模型，通过尾静脉注射本发明实施例1制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶的PBS溶液(200μL，[Fe]＝51.04mM)来评价肿瘤部位MR成像效果(参见附图11a)。与注射前的对照组相比较，在注射后2小时内，注射γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶的裸鼠肿瘤逐渐变暗，在注射后4h时，裸鼠的肿瘤部位变得最暗，说明γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶易被肿瘤细胞所吞噬，具有明显的MRI肿瘤诊断效果。在注射后6h，实验组的裸鼠肿瘤部位明暗程度逐渐开始恢复。说明此时纳米材料随着血液流通从肿瘤部位逐渐代谢出去(参见附图11a)。图11b是相应注射时间的肿瘤MRI信噪比变化，在注射后2h，裸鼠肿瘤部位信噪比有所降低，在注射后4h，裸鼠肿瘤部位信噪比达到最低，在注射后6h，裸鼠肿瘤部位MRI信号值开始上升，这与图11a的结果一致，说明纳米材料逐渐从肿瘤部位代谢出去。肿瘤MR成像结果说明本发明制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶可以应用于体内肿瘤MR成像诊断的造影剂。

实施例8

以实施例7构建的HeLa肿瘤模型裸鼠(如图12a)和未构建HeLa肿瘤模型的白鼠(如图12b)来研究本发明制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶在生物体内各组织的分布代谢情况。向裸鼠尾静脉注射本发明实施例1制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶的PBS溶液(200μL，[Fe]＝51.04mM)，在2h、4h、6h时间点处死裸鼠；向白鼠尾静脉注射本发明制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶(200μL，[Fe]＝51.04mM)，饲养7d、14d、30d后处死白鼠。老鼠处死后取出各个器官并称重，然后切成小片段，并加入3mL王水浸泡2天，用ICP-AES测定各个组织器官中铁的含量，并以空白老鼠作为参考对照。如图12a所示，在注射材料后，肝、脾和肺中铁的含量较注射前均明显增加，而在其他的器官，比如：心、肾和肿瘤，铁的聚集较少，其结果与裸鼠MR成像结果一致；如图12b所示，在注射材料7d之后，白鼠体内的铁基本代谢干净，说明本发明制备的γ-PGA/PEI-Fe₃O₄纳米水凝胶能在白鼠体内正常的代谢清除。

对比例1

将Fe(II)和Fe(III)按照1∶2的比例混合溶解于HCl溶液中，将上述混合液逐滴滴加到持续搅拌的2mol/L的NaOH溶液中，80℃反应1小时后，冷却至室温继续反应2小时。反应结束后，磁分离洗涤三次，5000rpm离心去除大颗粒，即得到共沉淀法制备的裸露的Fe₃O₄纳米颗粒。

Claims (10)

1.一种负载氧化铁纳米颗粒的γ-聚谷氨酸水凝胶的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1：将铁盐溶解，通入N₂鼓吹搅拌，将亚硫酸钠水溶液滴加到上述溶液中，搅拌10min-1h；将超支化聚乙烯亚胺水溶液加入到上述溶液中，搅拌混合均匀；将氨水加入到上述溶液，在60-70℃下反应10min-1h，在室温下继续反应1-3h，反应结束后，将反应液离心洗涤，即得PEI包裹的四氧化三铁纳米颗粒；

步骤2：配制γ-聚谷氨酸的水溶液，先加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化1-3h，再加入碳酸氢钠继续反应0.5-1.5h；然后将上述溶液逐滴加入到磺基琥珀酸二辛酯钠的二氯甲烷溶液中，搅拌3-8分钟，形成W/O乳液；然后将该W/O乳液逐滴加入到聚乙烯醇的水溶液中，搅拌5-15分钟，形成W/O/W的聚合物乳液；

步骤3：将步骤1制备的PEI包裹的四氧化三铁纳米颗粒逐滴加入到步骤2制备的W/O/W的聚合物乳液中，搅拌过夜，蒸发除去有机溶剂，然后离心洗涤，即得到负载氧化铁纳米颗粒的γ-聚谷氨酸水凝胶。

2.如权利要求1所述的负载氧化铁纳米颗粒的γ-聚谷氨酸水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的步骤1中的铁盐、亚硫酸钠、超支化聚乙烯亚胺和氨水的用量配比为2.6g∶0.4g∶1g∶4mL，氨水的浓度为25.0％-28.0％。

3.如权利要求1所述的负载氧化铁纳米颗粒的γ-聚谷氨酸水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的步骤1中的铁盐为FeCl₃·6H₂O。

4.如权利要求1所述的负载氧化铁纳米颗粒的γ-聚谷氨酸水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的步骤2中的γ-聚谷氨酸的水溶液的浓度为1wt％。

5.如权利要求1所述的负载氧化铁纳米颗粒的γ-聚谷氨酸水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的步骤2中的γ-聚谷氨酸与碳酸氢钠的质量比为1∶1.3。

6.如权利要求1所述的负载氧化铁纳米颗粒的γ-聚谷氨酸水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的步骤2中的AOT的二氯甲烷溶液的浓度为2.5wt％。

7.如权利要求1所述的负载氧化铁纳米颗粒的γ-聚谷氨酸水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的步骤2中的聚乙烯醇的水溶液的浓度为2wt％。

8.如权利要求1所述的负载氧化铁纳米颗粒的γ-聚谷氨酸水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的步骤2中的γ-聚谷氨酸水溶液、磺基琥珀酸二辛酯钠的二氯甲烷溶液和聚乙烯醇的水溶液的体积比为1∶2∶15。

9.如权利要求1所述的负载氧化铁纳米颗粒的γ-聚谷氨酸水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的步骤3中所用的PEI包裹的四氧化三铁纳米颗粒和步骤2中所用的γ-聚谷氨酸的质量比为3∶1。

10.一种MR成像造影剂，其特征在于，含有上述方法制备的负载氧化铁纳米颗粒的γ-聚谷氨酸水凝胶。