CN104738302B - 利用闪式提取技术从大田废弃鲜烟叶中提取可溶性蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用闪式提取技术从大田废弃鲜烟叶中提取可溶性蛋白质的方法。本发明通过对大田废弃鲜烟叶进行前处理、脱色脱脂、闪式提取、离心、沉淀、干燥的方法，提取可溶性蛋白质。本发明的提取方法具有速度快、提取条件温和、提取效率高、操作简单和易于实现工业化生产等优点，为大田废弃鲜烟叶的利用及相应产品的开发提供了可以借鉴的方法。
Description
技术领域
本发明涉及烟叶可溶性蛋白质的提取方法，具体涉及一种利用闪式提取技术从大田废弃鲜烟叶中提取可溶性蛋白质的方法。
背景技术
烟草为茄科烟草属植物，是一种利用价值很高的天然植物。作为传统中药，烟草始载于《景岳全书》，也被《全国中草药汇编》等现代中草药专著收录，具有消肿、解毒、杀虫等功效。在过去的400多年里，烟草作为一种重要的经济作物被广泛种植。我国的烟草种植面积和产量均居世界首位，烟草种植与产品加工在国民经济发展中发挥着重要的作用。在我国农产品收入中，烟草仅次于稻、麦、棉、大豆、玉米，居第6位。作为烟草生产大国，除用于卷烟生产的烟叶外，每年有大量的低等和等外级烟叶、烟秆、烟梗、烟茎、烟花和烟籽等资源未能得到有效利用，或丢弃于田间地头，或被晒干焚烧，给环境带来污染的同时也造成了自然资源的极大浪费。目前我国面临着严峻的环境形势，环境污染已成为全民高度关注的问题，资源的高效利用和循环利用必将是今后各产业发展的方向，也必将是烟草行业发展的方向。
蛋白质是人类活动的重要物质基础。随着世界人口的不断增长和日益减少的耕地面积，蛋白质供给出现了严重不足。为了解决这一问题，世界各国尤其是不发达国家和地区，积极采取措施，试图从可以得到的可食用物质中获得有营养和廉价的蛋白质。在世界范围的蛋白质资源供给中，大部分为植物蛋白质，占蛋白质总量的70％，而动物蛋白质仅占30％。另外，具有经济性、营养性、功能性等优点的植物蛋白质在建立健康的饮食结构方面所起的作用也越来越受到人们的重视。叶蛋白是将新鲜植物绿叶切碎压榨后从汁液中分离出的蛋白质制品。大规模开发利用叶蛋白资源是提高蛋白质生产总量的有效途径，可缓解我国饲料蛋白质的严重不足，促进畜牧业发展，改善人民的膳食结构。
在烟叶众多成分中，以蛋白质含量最为丰富，如白肋烟中蛋白质含量高达20.48％。烟叶蛋白的动物实验表明，其营养价值高于大豆蛋白和酪蛋白。早在1979年，美国科学家就提倡将烟叶蛋白应用于食品工业。我国大田废弃鲜烟叶数量巨大，因此，研究将大田废弃鲜烟叶应用于蛋白质的提取，对于环境保护、缓解粮食危机和增加烟农收入都具有非常重要的意义。
发明内容
[要解决的技术问题]
本发明的目的是解决现有技术的问题，提供一种从大田废弃鲜烟叶中提取可溶性蛋白质的新方法。
[技术方案]
为了达到上述的技术效果，本发明采取以下技术方案：
本发明利用闪式提取技术从大田废弃鲜烟叶中提取可溶性蛋白质。
一种利用闪式提取技术从大田废弃鲜烟叶中提取可溶性蛋白质的方法，它包括以下步骤：
A，废弃鲜烟叶的前处理
取大田废弃鲜烟叶，去除其叶脉和叶梗，清洗、切碎后备用；
B，脱色脱脂
将步骤A前处理的废弃鲜烟叶置于容器中，加入正己烷浸泡1h后，置于闪式提取器上，设定提取电压、转速、提取次数和每次提取时间；提取完毕后过滤，滤渣低温干燥备用；滤液回收利用；所述废弃鲜烟叶与正己烷的质量比为1：10；
C，可溶性蛋白质的提取
将步骤B得到的滤渣，加入浓度为0.01mol/L的NaCl溶液，然后用浓度为0.1mol/LNaOH溶液调节pH值至7.0～8.0，浸泡一段时间后，置于闪式提取器上，设定提取电压、转速、提取次数和每次提取时间，提取后过滤，滤渣回收利用；滤液离心去除沉淀后，分取上清液备用；
D，可溶性蛋白质的沉淀及干燥
将中性盐加入到步骤C中的上清液中至盐溶液呈饱和状态，静置一定时间使蛋白质充分沉淀后，离心，沉淀采用透析法脱盐后，置于真空干燥箱中低温干燥，即得到所述的可溶性蛋白质。
本发明更进一步的技术方案，在步骤B中，所述提取电压为120V，转速为6000rpm/min，提取次数为5次，每次提取时间为45s。
本发明更进一步的技术方案，在步骤C中，所述滤渣与0.01mol/L的NaCl溶液的质量比为1：10～20。
本发明更进一步的技术方案，在步骤C中，所述浸泡时间为5～20h。
本发明更进一步的技术方案，在步骤C中，所述提取电压为100～150V、转速为5000～10000rpm/min、提取次数为3～8次、每次提取时间为30～60s。
本发明更进一步的技术方案，在步骤C中，所述滤渣回收利用是指用于制备动物饲料或肥料。
本发明更进一步的技术方案，在步骤D中，所述中性盐选自无水硫酸铵、无水氯化钠、无水硫酸镁、无水硫酸钠或无水磷酸钠；所述饱和状态是指饱和度为25～60％。
本发明更进一步的技术方案，在步骤D中，所述的静置时间为10～20h。
本发明更进一步的技术方案，在步骤B和步骤D中，所述低温干燥是指在温度不高于50℃的条件下进行的干燥。
下面将详细地说明本发明。
一种利用闪式提取技术从大田废弃鲜烟叶中提取可溶性蛋白质的方法，它包括以下步骤：
A，废弃鲜烟叶的前处理
取大田废弃鲜烟叶，去除其叶脉和叶梗，清洗、切碎后备用；
因为叶脉和叶梗中蛋白质含量很低，所以本发明先去除叶脉和叶梗。又因为本发明后面操作使用的闪式提取器本身具有破碎的功能，所以不需要事先研磨，只需要切碎就可以了。
B，脱色脱脂
将步骤A前处理的废弃鲜烟叶置于容器中，加入正己烷浸泡1h后，置于闪式提取器上，设定提取电压、转速、提取次数和每次提取时间；提取完毕后过滤，滤渣低温干燥备用；滤液回收利用；所述废弃鲜烟叶与正己烷的质量比为1：10；本步骤得到的滤液主要是正己烷溶液，可用于烟叶中脂溶性成分的提取。
C，可溶性蛋白质的提取
将步骤B得到的滤渣置于容器中，加入浓度为0.01mol/L的NaCl溶液，然后用浓度为0.1mol/L NaOH溶液调节pH值至7.0～8.0，浸泡一段时间后，置于闪式提取器上，设定提取电压、转速、提取次数和每次提取时间，提取后过滤，滤液离心去除沉淀后，分取上清液备用；滤渣回收利用；
由于烟叶中的蛋白质分为可溶性蛋白质和不溶性蛋白质，本发明选择性地提取可溶性蛋白质，因此需要去除不溶性蛋白质。本发明利用0.01mol/L的NaCl溶液是使可溶性蛋白质在该盐溶液中沉淀，并且因为各种蛋白质在不同盐溶液中的溶解度不同，本发明选择了浓度为0.01mol/L的NaCl溶液。
同时，利用0.1mol/L NaOH溶液调节pH至7.0～8.0是为了调节pH值为可溶性蛋白质的等电点，以使其溶解度最小，最易形成沉淀物。
闪式提取技术是近几年最新研发的一种提取技术。此技术依据组织破碎提取的原理，利用适当溶剂在闪式提取器里将物料快速破碎至适当粒度，同时伴有高速搅拌、超强振动、负压渗滤等功能来达到提取目的，最大限度保留植物有效成分不会受热破坏，具有提取速度快、提取条件温和、提取效率高、操作简单和易于实现工业化生产等优点。
D，可溶性蛋白质的沉淀及干燥
将中性盐加入到步骤C中的上清液中至盐溶液呈饱和状态，然后静置一段时间使蛋白质充分沉淀后，离心，沉淀采用透析法脱盐后，置于真空干燥箱中低温干燥，即得到所述的可溶性蛋白质。
在步骤D中，加入中性盐是因为中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，之后蛋白质分子之间聚集而沉淀。
本发明更进一步的技术方案，在步骤B中，所述提取电压为120V，转速为6000rpm/min，提取次数为5次，每次提取时间为45s。在上述条件下脱色脱脂的效果最好。
本发明更进一步的技术方案，在步骤C中，所述滤渣与0.01mol/L的NaCl溶液的质量比为1：10～20。
在上述质量比下，得到的可溶性蛋白质量最多。
本发明更进一步的技术方案，在步骤C中，所述浸泡时间为5～20h。
在步骤C中，选择浸泡5～20h，是为了更多地沉淀可溶性蛋白质，并且浸泡时间再延长也不能得到更多的可溶性蛋白质。
本发明更进一步的技术方案，在步骤C中，所述提取电压为100～150V、转速为5000～10000rpm/min、提取次数为3～8次、每次提取时间为30～60s。
本发明在实验中发现，提取电压和提取转速过小时提取率偏低，而提取电压和提取转速过大则接近或超出仪器规定的工作范围，从而影响仪器的使用寿命。提取次数过少和每次提取时间过短时提取率不高，而提取次数过多对进一步提高提取率的作用不大，每次提取时间过长则有可能导致高速电机烧坏。因此在本发明给出的提取电压、转速、提取次数和每次提取时间的参数下，不仅能获得较多的可溶性蛋白，增加提取效率，而且能最大程度不影响仪器的使用寿命。
本发明更进一步的技术方案，在步骤C中，所述滤渣回收利用是指用于制备动物饲料或肥料。
本发明更进一步的技术方案，在步骤D中，所述中性盐选自无水硫酸铵、无水氯化钠、无水硫酸镁、无水硫酸钠或无水磷酸钠；所述饱和状态是指饱和度为25～60％。
选择该饱和度的盐溶液沉淀蛋白质的原因是不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同，选择该饱和度的盐溶液是为了使本发明要提取的可溶性蛋白质从其他蛋白质中分离出来。因此，该饱和度下沉淀的可溶性蛋白质更多，纯度更高。
本发明更进一步的技术方案，在步骤D中，所述的静置时间为10～20h。
该步骤静置的原因是为了使可溶性蛋白质充分沉淀下来。
本发明更进一步的技术方案，在步骤B和步骤D中，所述低温干燥是指在温度不超过50℃的条件下进行的干燥。
低温干燥的原因是蛋白质在高温下容易变性。为了防止蛋白质变性，需要保证在低温下进行干燥。
[有益效果]
本发明与现有技术相比，具有以下的有益效果：
本发明利用闪式提取技术对大田废弃鲜烟叶中蛋白质进行提取，具有提取速度快、提取条件温和、提取效率高、操作简单和易于实现工业化生产等优点，是一种新型的叶蛋白提取方法；与传统的叶蛋白提取方法相比，本法可降低能耗，从而降低生产成本；本发明为大田废弃鲜烟叶的利用及相应产品的开发提供了可借鉴的方法。
附图说明
图1为本发明从大田废弃鲜烟叶中提取可溶性蛋白质的流程图。
具体实施方式
下面结合本发明的实施例对本发明作进一步的阐述和说明。
下面实施例1～5均使用图1的流程图提取的可溶性蛋白质。
实施例1
取大田废弃鲜烟叶，去除叶脉和叶梗，清洗、切碎，称取100g置容器中，加入烟叶质量10倍量的正己烷浸泡1小时，置于闪式提取器上，设定提取电压为120伏，提取转速为6000rpm/min，提取5次，每次提取45秒；提取完毕后过滤，滤渣低温干燥备用，正己烷滤液留着其它用途(如用于烟叶中脂溶性成分的提取)。
取低温干燥后的滤渣置容器中，加入0.01mol/L NaCl溶液1000g，用0.1mol/LNaOH溶液调节pH至7.0，浸泡5小时，置于闪式提取器上，设定提取电压为100伏，提取转速为5000rpm/min，提取3次，每次提取30秒；提取完毕后过滤，滤液离心除去沉淀，分取上清液置容器中备用。
根据上清液体积向其中添加无水硫酸铵至溶液中硫酸铵的饱和度为30％，充分搅拌后静置10小时；离心，取沉淀用透析法脱盐后，置真空干燥箱中低温干燥，得烟叶蛋白质5.6g；以牛血清白蛋白为标样，采用Lorry法测定其中蛋白质的含量为81.6％。
实施例2
取大田废弃鲜烟叶，去除叶脉和叶梗，清洗、切碎，称取100g置容器中，加入烟叶质量10倍量的正己烷浸泡1小时，置于闪式提取器上，设定提取电压为120伏，提取转速为6000rpm/min，提取5次，每次提取45秒；提取完毕后过滤，滤渣低温干燥备用，正己烷滤液留着其它用途(如用于烟叶中脂溶性成分的提取)。
取低温干燥后的滤渣置容器中，加入0.01mol/L NaCl溶液1000g，用0.1mol/LNaOH溶液调节pH至7.5，浸泡10小时，置于闪式提取器上，设定提取电压为120伏，提取转速为6000rpm/min，提取5次，每次提取30秒；提取完毕后过滤，滤液离心除去沉淀，分取上清液置容器中备用。
根据上清液体积向其中添加无水硫酸铵至溶液中硫酸铵的饱和度为40％，充分搅拌后静置10小时；离心，取沉淀用透析法脱盐后，置真空干燥箱中低温干燥，得烟叶蛋白质6.5g；以牛血清白蛋白为标样，采用Lorry法测定其中蛋白质的含量为82.2％。
实施例3
取大田废弃鲜烟叶，去除叶脉和叶梗，清洗、切碎，称取100g置容器中，加入烟叶质量10倍量的正己烷浸泡1小时，置于闪式提取器上，设定提取电压为120伏，提取转速为6000rpm/min，提取5次，每次提取45秒；提取完毕后过滤，滤渣低温干燥备用，正己烷滤液留着其它用途(如用于烟叶中脂溶性成分的提取)。
取低温干燥后的滤渣置容器中，加入0.01mol/L NaCl溶液1200g，用0.1mol/LNaOH溶液调节pH至7.5，浸泡10小时，置于闪式提取器上，设定提取电压为130伏，提取转速为6000rpm/min，提取5次，每次提取45秒；提取完毕后过滤，滤液离心除去沉淀，分取上清液置容器中备用。
根据上清液体积向其中添加无水硫酸铵至溶液中硫酸铵的饱和度为50％，充分搅拌后静置15小时；离心，取沉淀用透析法脱盐后，置真空干燥箱中低温干燥，得烟叶蛋白质7.2g；以牛血清白蛋白为标样，采用Lorry法测定其中蛋白质的含量为83.7％。
实施例4
取大田废弃鲜烟叶，去除叶脉和叶梗，清洗、切碎，称取100g置容器中，加入烟叶质量10倍量的正己烷浸泡1小时，置于闪式提取器上，设定提取电压为120伏，提取转速为6000rpm/min，提取5次，每次提取45秒；提取完毕后过滤，滤渣低温干燥备用，正己烷滤液留着其它用途(如用于烟叶中脂溶性成分的提取)。
取低温干燥后的滤渣置容器中，加入0.01mol/L NaCl溶液1200g，用0.1mol/LNaOH溶液调节pH至7.5，浸泡15小时，置于闪式提取器上，设定提取电压为140伏，提取转速为7000rpm/min，提取6次，每次提取45秒；提取完毕后过滤，滤液离心除去沉淀，分取上清液置容器中备用。
根据上清液体积向其中添加无水硫酸铵至溶液中硫酸铵的饱和度为60％，充分搅拌后静置20小时；离心，取沉淀用透析法脱盐后，置真空干燥箱中低温干燥，得烟叶蛋白质8.2g；以牛血清白蛋白为标样，采用Lorry法测定其中蛋白质的含量为84.3％。
实施例5
取大田废弃鲜烟叶，去除叶脉和叶梗，清洗、切碎，称取100g置容器中，加入烟叶质量10倍量的正己烷浸泡1小时，置于闪式提取器上，设定提取电压为120伏，提取转速为6000rpm/min，提取5次，每次提取45秒；提取完毕后过滤，滤渣低温干燥备用，正己烷滤液留着其它用途(如用于烟叶中脂溶性成分的提取)。
取低温干燥后的滤渣置容器中，加入0.01mol/L NaCl溶液1200g，用0.1mol/LNaOH溶液调节pH至8.0，浸泡20小时，置于闪式提取器上，设定提取电压为150伏，提取转速为7000rpm/min，提取7次，每次提取45秒；提取完毕后过滤，滤液离心除去沉淀，分取上清液置容器中备用。
根据上清液体积向其中添加无水硫酸铵至溶液中硫酸铵的饱和度为60％，充分搅拌后静置20小时；离心，取沉淀用透析法脱盐后，置真空干燥箱中低温干燥，得烟叶蛋白质8.3g；以牛血清白蛋白为标样，采用Lorry法测定其中蛋白质的含量为85.6％。
从上述实施例可见，使用本发明的闪式提取方法从大田废弃鲜烟叶中提取可溶性蛋白质，得到的蛋白质纯度大于80％。
尽管这里参照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述，上述实施例仅为本发明较佳的实施方式，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。
Claims (1)
1.一种从大田废弃鲜烟叶中提取可溶性蛋白质的方法，其特征在于它包括以下步骤：
取大田废弃鲜烟叶，去除叶脉和叶梗，清洗、切碎，称取100g置容器中，加入烟叶质量10倍量的正己烷浸泡1小时，置于闪式提取器上，设定提取电压为120伏，提取转速为6000rpm/min，提取5次，每次提取45秒；提取完毕后过滤，滤渣低温干燥备用；
取低温干燥后的滤渣置容器中，加入0.01mol/L NaCl溶液1200g，用0.1mol/L NaOH溶液调节pH至8.0，浸泡20小时，置于闪式提取器上，设定提取电压为150伏，提取转速为7000rpm/min，提取7次，每次提取45秒；提取完毕后过滤，滤液离心除去沉淀，分取上清液置容器中备用；
根据上清液体积向其中添加无水硫酸铵至溶液中硫酸铵的饱和度为60％，充分搅拌后静置20小时；离心，取沉淀用透析法脱盐后，置真空干燥箱中低温干燥，得烟叶蛋白质8.3g；以牛血清白蛋白质为标样，采用Lorry法测定其中蛋白质的含量为85.6％。
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