CN104736557B - 嵌合成纤维细胞生长因子21蛋白及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包括偶连于C末端的N末端的嵌合蛋白，其中N末端包括旁分泌成纤维细胞生长因子(“FGF”)的一部分并且C末端包括FGF21分子的C末端部分。旁分泌FGF的所述部分被修饰来相较于不具有所述修饰的部分，减小针对肝素和/或硫酸类肝素的结合亲和力。本发明还涉及包括根据本发明的嵌合蛋白的药物组合物，用于治疗患有糖尿病、肥胖症或代谢综合征的受试者的方法，和筛选具有增强的针对βKIotho‑FGF受体复合物的结合亲和力的化合物的方法，所述方法涉及本发明的嵌合蛋白的使用。

Description

嵌合成纤维细胞生长因子21蛋白及其使用方法

本申请要求2012年6月7日提交的美国临时专利申请No.61/656,778、2012年6月25日提交的美国临时专利申请No.61/664,081和2013年3月15日提交的美国专利申请系列No.13/837,880的优先权利益，将所述美国临时专利申请或美国专利申请系列的每一个案子通过引用全文并入本文。

本发明是利用在由美国国立卫生研究院授予的基金号DE13686、DK077276、AG019712、DK091392和DK067158下的政府资助进行的。政府在本发明中具有某些权利。

发明领域

本发明涉及嵌合成纤维细胞生长因子(“FGF”)蛋白及其用途。

发明背景

2型糖尿病是慢性进行性病症，其由与胰腺的不充足胰岛素分泌组合的终末器官对胰岛素的作用的抵抗引起。与胰岛素抗性和分泌缺陷相关的代谢异常，特别地高血糖症在数年的过程中导致对多个器官包括心脏、血管、肾和眼的广泛的不可逆转的损伤。目前，将近2亿或2.9％的世界人口具有2型糖尿病(世界卫生组织，Diabetes Fact Sheet N°312,2011年1月；Wild等人，“Global Prevalence of Diabetes:Estimates for the Year2000and Projections for 2030,”Diabetes Care 27(5):1047-1053(2004))，其流行正以令人担忧的快速步伐上升，与之并行的是超重和肥胖症流行的上升(世界卫生组织，Diabetes and Overweight Fact Sheet N°311,2011年1月)。直至20世纪末，仅在成人中观察到2型糖尿病，但曾经称为“成年型糖尿病”的2型糖尿病现也在儿童和青少年中得到诊断，该日益增加的发病率可能与儿童和青少年中的超重和肥胖症的增加相关。前期糖尿病(正常葡萄糖动态平衡与糖尿病之间的中间代谢期)的流行甚至比2型糖尿病的流行更普遍。目前，仅在美国就有接近8000万或26％的人口具有前期糖尿病(疾病预防控制中心，National Diabetes Fact Sheet2011)，这样就处于进展至2型糖尿病的高风险中。2型糖尿病列于世界死亡的10个首要原因之列，世界卫生组织预计在下一个10年内因糖尿病(其90％为2型)引起的死亡率将超过2倍(世界卫生组织，Diabetes Fact Sheet N°312,2011年1月)。2型糖尿病也是失能的主要原因。作为糖尿病视网膜病变的结果，世界上约10％的所有糖尿病患者发生严重性视觉病症，并且2％失明在15年内形成疾病(世界卫生组织，Diabetes Fact Sheet N°312,2011年1月)。在世界范围内影响高达一半的所有糖尿病患者(世界卫生组织，Diabetes Fact Sheet N°312,2011年1月)的糖尿病神经病变占据大部分非创伤性下肢截肢。事实上，在其最近公布的关于非传染性疾病的第一世界报告中，世界卫生组织认为糖尿病与其它慢性非传染性疾病如癌症和心脏病一起是全球经济和社会负担，其超过因传染性疾病例如HIV/AIDS施加的负担。

2型糖尿病的当前药物疗法集中在纠正患者的高血糖症。虽然许多具有不同抗高血糖作用机制的小分子和生物制品可获得用作单一疗法或联合治疗，这些药物的大多数(如果不是全部的话)具有有限的功效、有限的耐受性和显著的有害效应(Moller,“NewDrug Targets f or Type 2Diabetes and the Metabolic Syndrome,”Nature 414(6865):821-827(2001))。例如，利用磺脲类、格列奈、噻唑啉二酮或胰岛素的治疗与体重增长相关，这是不期望的作用，因为超重被认为是2型糖尿病发病机制的驱动力。这些治疗中的一些治疗也与增加的低血糖症风险相关。对噻唑啉二酮的特殊限制是有可能引起不利的心血管效应(DeSouza等人，“Therapeutic Targets to Reduce Cardiovascular Di seasein Type 2Diabetes,”Nat Rev Drug Discov 8(5):361-367(2009))。关于噻唑烷二酮类药物罗格列酮()(其被广泛用于2型糖尿病的治疗)的临床数据的元分析发现药物增加2型糖尿病患者的心肌梗塞的风险(Nissen等人，“Effect of Rosiglitazone on theRisk of Myocardial Infarction and Death from Cardiovascular Causes,”NE ngl JMed 356(24):2457-2471(2007))。在所有糖尿病并发症中，心血管疾病是糖尿病患者的发病率和死亡率的主要原因(世界卫生组织，Diabetes Fact Sheet N°312,2011年1月国；疾病预防控制中心，National Diabetes Fact Sheet 2011)，因此药物治疗对心血管风险的加重是绝对不可接受的。在噻唑啉二酮的心血管安全的辩论之后不久，FDA颁布了关于评价治疗2型糖尿病的新型抗糖尿病疗法的心血管危险的指导(Opar A,“Diabetes Drugs PassCardiovascular Risk Check,”Nat Rev Drug Discov 8(5):343-344(2009))。同时，噻唑啉二酮失去了它们的受欢迎程度。即使对于胰高血糖素样肽1激动剂，被引入用于治疗2型糖尿病的最新种类的药物之一，已引起关于安全性的关注，即致癌性的潜能(Opar A,“Diabetes Drugs Pass Cardiova scular Risk Check,”Nat Rev Drug Discov 8(5):343-344(2009))。因此，需要比现有药物更有效更安全的新型疗法。由于目前可用的药物不直接靶向晚期糖尿病的并发症，特别地心血管疾病，因此特别期望不仅在降低血糖上有效而且还降低心血管风险因子例如血脂异常的疗法。

由Eli Lilly&Co.进行的关于治疗2型糖尿病的潜在新型生物治疗剂的研究导致作为以不依赖胰岛素的方式刺激葡萄糖至脂细胞的吸收的蛋白的成纤维细胞生长因子(FGF)21的发现(Kharitonenkov等人，“FGF-21as a Novel Metabolic Regulator,”J ClinInvest 115(6):1627-1635(2005))。FGF21此后出现为不仅葡萄糖代谢而且还有脂质代谢的至关重要的内分泌调节剂，并且已成为用于治疗2型糖尿病、肥胖症和代谢综合征的最有前景的药物候选者之一。在糖尿病和肥胖症的小鼠模型中，药物剂量的FGF21降低血糖，增强葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性，并且增强了胰腺β-细胞功能(Kharitonenkov等人，“FGF-21as a Novel Metabolic Regulator,”J Clin Invest 115(6):1627-1635(2005)；Coskun等人，“Fibroblast growth factor 21corre cts obesity in mice,”Endocrinology 149(12):6018-6027(2008)；Wen te等人，“Fibroblast Growth Factor-21ImprovesPancreatic Beta-Cell Function and Survival by Activation of ExtracellularSignal-Regulat ed Kinase 1/2and Akt Signaling Pathways,”Diabetes 55:2470-2478(2006))。同时，FGF21降低血浆甘油三酯和胆固醇，增强脂解和抑制脂肪生成，加带能量消耗，和逆转脂肪肝疾病(Kharitonenkov等人，“FGF-21as a Novel Metabolic Regulator,”J Clin Invest 115(6):1627-1635(2005)；Coskun等人，“Fibroblast growth factor21corrects obesity in mice,”Endocrinology 149(12):6018-6027(2008)；Xu等人，“Fibroblast Growth Factor 21Reverses Hepatic Steatosis,Increa ses EnergyExpenditure,and Improves Insulin Sensitivity in Diet-In duced Obese Mice,”Diabetes 58:250-259(2009))。在肥胖小鼠中，F GF21引起体重减轻，在瘦小鼠中，其为对体重具有中性作用(Kharit onenkov等人，“FGF-21as a Novel Metabolic Regulator,”JClin In vest 115(6):1627-1635(2005)；Coskun等人，“Fibroblast growth facto r21corrects obesity in mice,”Endocrinology 149(12):6018-6027(2008))。因此，FGF21具有一些用于治疗2型糖尿病的药物的最期望的特征；其不仅增强血糖控制，而且还直接影响心血管危险因子，例如高甘油三酯血症，和减轻肥胖，所述肥胖被认为是2型糖尿病的单一最重要促进因子。重要地，FGF21不诱发低血糖症(Kharitonenkov等人，“FGF-21as aNovel Metabolic Regulator,”J Clin Invest 115(6):1627-1635(2005))，其为可随几种目前的抗糖尿病疗法包括胰岛素发生的副作用。此外，FGF21在小鼠中未显示任何有丝分裂促进活性(Kharitonenkov等人，“FGF-21as a Novel Metabolic Regulator,”J ClinInvest 115(6):1627-1635(2005))，从而排除致癌危险性的可能性。在糖尿病小鼠模型中关于FGF21疗法的发现已在糖尿病恒河猴中重现(Kharitonenkov等人，“The MetabolicState of Diabetic Monk eys is Regulated by Fibroblast Growth Factor-21,”Endocrinology 148(2):774-781(2007))，并且在人中目前通过临床试验进行随访(Kharitonenkov等人，“FGF21Reloaded:Challenges of a Rapidly Growing Field,”TrendsEndocrinol Metab 22(3):81-86(2011))。FGF21疗法还导致促炎细胞因子的血清水平的降低，这可促成增强的胰岛素敏感性(Kharitonenkov等人，“The Metabolic State ofDiabetic Monkeys is Regulated by Fibroblast Growth Factor-21,”Endocrinology148(2):774-781(2007))并且还可能赋予FGF21抗动脉粥样硬化性质。然而，仍然存在对更有效的FGF21治疗剂的需要。

本发明克服了本领域的这些和其它不足。

发明概述

本发明的一个方面涉及嵌合蛋白。嵌合蛋白包括偶连于C末端的N末端，其中N末端包括旁分泌成纤维细胞生长因子(“FGF”)的一部分并且C末端包括FGF21分子的C末端部分。旁分泌FGF的所述部分被修饰来相较于无修饰的部分减小针对肝素和/或硫酸类肝素的结合亲和力。

本发明的另一个方面涉及用于治疗患有病症的受试者的方法。该方法包括选择患有病症的受试者和提供嵌合FGF蛋白，其中嵌合FGF蛋白包括偶连于C末端的N末端。N末端包括旁分泌FGF的一部分并且C末端包括FGF21的C末端部分。旁分泌FGF的所述部分被修饰来相较于无修饰的部分减小针对肝素和/或硫酸类肝素的结合亲和力。该方法还包括在对于治疗病症是有效的条件下给选择的受试者施用治疗有效量的嵌合FGF蛋白。

本发明的另一个方面涉及产生具有增强的内分泌活性的嵌合FGF蛋白的方法。该方法包括将一个或多个修饰引入FGF蛋白，其中修饰减小FGF蛋白对肝素和/或硫酸类肝素的亲和力并将Klotho共受体结合结构域偶连于修饰FGF蛋白的C末端，由此产生具有增强的内分泌活性的嵌合FGF。

本发明的另一个方面涉及有利于成纤维细胞生长因子受体(“FGFR”)-βKlotho共受体复合物形成的方法。该方法包括提供包括βKlotho共受体和FGFR的细胞和提供嵌合FGF蛋白。嵌合FGF蛋白包括FGF21的C末端和旁分泌FGF的一部分，其中旁分泌FGF的所述部分被修饰来相较于不具有所述修饰的部分减小针对肝素和/或硫酸类肝素的亲和力。该方法还包括在对于引起FGFR-βKlotho共受体复合物形成是有效的条件下将细胞与嵌合FGF蛋白接触。

然而本发明的其它方面涉及筛选能够在病症的治疗中有利于FGFR-βKlotho复合物形成的试剂的方法。该方法包括提供包括偶连于C末端的N末端的嵌合FGF，其中N末端包括旁分泌FGF的一部分，并且C末端包括FGF21的C末端。旁分泌FGF的所述部分被修饰来相较于不具有所述修饰的部分，减小针对肝素和/或硫酸类肝素的结合亲和力。该方法还包括提供二元βKlotho-FGFR复合物和提供一种或多种候选试剂。该方法还包括在这样的条件下组合嵌合FGF、二元βKlotho-FGFR复合物与一种或多种候选试剂，所述条件允许在所述一种或多种候选试剂不存在的情况下形成嵌合FGF与二元βKlotho-FGFR复合物之间的三元复合物。该方法还包括将一种或多种候选试剂鉴定为适合用于治疗病症，所述候选试剂相较于在一种或多种候选试剂不存在的情况下的二元复合物形成，减少嵌合FGF与二元βKlotho-FGFR复合物之间的三元复合物形成。

成纤维细胞生长因子(FGF)19、21和23为以Klotho共受体依赖性方式调节主要代谢过程例如葡萄糖和脂质代谢(FGF21)以及磷酸盐和维生素D动态平衡(FGF23)的激素。硫酸类肝素糖胺聚糖在内分泌FGF的细胞表面信号复合物的形成中的作用还不清楚。为破译HS在内分泌FGF信号转导中的作用，我们产生缺乏HS结合的FGF19和FGF23突变型配体，并将它们的信号转导能力与野生型配体的相比较。本文中提供的数据显示突变配体保持完全代谢活性，从而证明HS不参与内分泌FGF信号复合物的形成。此处显示硫酸类肝素不是FGF19和FGF23的信号转导单位的组分。通过减小旁分泌FGF的硫酸类肝素结合亲和力，并用其C末端尾替代包含Klotho共受体结合位点的内分泌FGF的C末端尾以使配体回到靶组织中来将旁分泌FGF转化成内分泌配体。配体转为工程化内分泌FGF-样分子以治疗代谢病症，包括全球流行病例2型糖尿病和肥胖症提供新型策略。

附图简述

图1A-1D为显示FGF2、FGF19和FGF23的HS结合位点的并排比较以及内分泌FGF信号转导复合物的两个工作模型的示意图。图1A显示在2:2FGF2-FGFR1c二聚体的晶体结构(PDBID:1FQ9；(Schlessinger等人，Mol.Cell 6:743-750(2000)，将其通过引用全文并入本文))中观察到的FGF2(图示)与肝素己糖(以图棒显示的)的相互作用。肝素己糖由3个1→4连接的N-硫酸化-6-O-硫酸化D-葡糖胺和2-O-硫酸化L-艾杜糖醛酸的二糖单位组成。注意，肝素己糖与FGF2的HS结合位点中的残基的侧链和骨架原子相互作用。虚线表示氢键。将与肝素己糖产生大部分氢键的K128、R129和K134加框。β-链命名遵循最初的FGF1和FGF2晶体结构(Ago等人，J.Biochem.110:360-363(1991)；Eriksson等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.88:3441-3445(1991)；Zhang等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.88:3446-3450(1991)；Zhu等人，Science 251:90-93(1991)，将其通过引用全文并入本文)。请注意，相较于在大豆胰蛋白酶抑制剂(PDB ID:1TIE；(Onesti等人，J.Mol.Biol.217:153-176(1991)，将其通过引用全文并入本文))和白细胞介素1β(PDB ID:1I1B；(Finzel等人，J.Mol.Biol.209:779-791(1989)，将其通过引用全文并入本文))中看到的典型β-三叶形折叠，在FGF2和其它旁分泌FGF中配对的β10-β11链界线不太明确。图1B和1C显示了在图1A中以与FGF2结构相同的取向显示的FGF19(PDB ID:2P23；(Goetz等人，Mol.Cell Biol.27:3417-3428(2007)，将其通过引用全文并入本文))(图1B)和FGF23(PDB ID:2P39；(Goetz等人，Mol.Cell Biol.27:3417-3428(2007)，将其通过引用全文并入本文))(图1C)的晶体结构的卡通图示。定位至这些配体的对应HS结合位点的残基的侧链以图棒显示。将FGF19和FGF23中被选择用于诱变以敲除残留HS结合的残基加框。NT和CT表示FGF的N和C末端。图1D为内分泌FGF-FGFR-Klotho共受体信号转导单位的两个工作模型的示意图。关于FGF21、FGFR1c与βKlotho之间的三元复合物形成的研究支持1:2:1模型而非2:2:2模型(Ming等人，J.Biol.Chem.287:19997-20006(2012)，将其通过引用全文并入本文)。为了比较，显示了旁分泌FGF-FGFR-HS信号转导单位的示意图，其是基于2:2:2FGF2-FGFR1c-HS复合物的晶体结构产生的(PDB ID:1FQ9；(Schlessinger等人，Mol.Cell 6:743-750(2000)，将其通过引用全文并入本文))。HS使旁分泌FGF与受体紧密结合以增强FGF对其第一和第二受体的结合，从而促进受体二聚化。问号表示HS是否也是内分泌FGF信号转导复合物的组分。

图2显示了内分泌FGF、FGF1和FGF2的序列比对。将成熟人FGF19、FGF21和FGF23配体的氨基酸序列对齐。还包括在比对中的是FGF1和FGF2(典型旁分泌FGF)的人序列，其用于本文中描述的实验，其中将FGF1和FGF2转化成内分泌FGF配体。对应于FGF1(SEQ ID NO:1)(GenBank登录号AAH32697，将其通过引用全文并入本文)、FGF2(SEQ ID NO:121)(GenBank登录号EAX05222，将其通过引用全文并入本文)、FGF19(SEQ ID NO:337)(GenBank登录号NP_005108，将其通过引用全文并入本文)、FGF21(SEQ ID NO:233)(GenBank登录号NP_061986，将其通过引用全文并入本文)和FGF23(SEQ ID NO:351)(GenBank登录号AAG09917，将其通过引用全文并入本文)的人序列的残基数目在比对左边的括号中。标记二级结构元件，将包括已知二级结构的这些元件的残基加框。空位(虚线)被引入来最优化序列比对。已知的FGF晶体结构的β-三叶形核心结构域以加以灰色阴影。比对顶部的蓝色条块表示HS结合区域的位置。被选择用于诱变的HS结合残基加以蓝色阴影。

图3A-3G显示与通过定点诱变产生的FGF19和FGF23的残留肝素结合的敲除相关的表面等离子体共振(“SPR”)结果。图3A显示了举例说明FGF2、FGF19、FGF21和FGF23的肝素结合的SPR传感图的叠加(左图框)和FGF19-、FGF21-和FGF23-肝素相互作用的结合反应的分解图(右图框)。将肝素固定在生物传感器芯片上，将400nM的FGF2、FGF19、FGF21或FGF23通过芯片上方。注意，FGF19、FGF21和FGF23显示可测量的残留肝素结合，并且在这三种内分泌FGF之间存在肝素结合的差异。图3B-3D显示举例说明FGF19对肝素的结合的SPR传感图的叠加(图3B)以及FGF19^K149A突变体与肝素之间(图3C)和FGF19^K149A,R157A突变体与肝素之间(图3D)的相互作用的不存在。将肝素固定在生物传感器芯片上，将递增浓度的FGF19通过芯片上方。随后，以针对野生型配体测试的最高浓度在肝素芯片上方注射FGF19^K149A或FGF19^{K149A ,R157A}。图3E-3G显示举例说明FGF23对肝素的结合的SPR传感图的叠加(图3E)，FGF23^R48A,N49A突变体与肝素之间的较差相互作用(图3F)以及FGF23^R140A,R143A突变体与肝素之间的相互作用的不存在(图3G)。将肝素固定在生物传感器芯片，将递增浓度的FGF23通过芯片上方。随后以针对野生型配体测试的最高浓度在肝素芯片上方注射FGF23^R48A,N49A或FGF23^R140A,R143A。

图4A-4D显示证明HS不是FGF19和FGF23的代谢活性所必需的结果。图4A显示在利用FGF19^K149A突变体、FGF19^K149A,R157A突变体或野生型FGF19刺激后，H4IIE肝细胞瘤细胞中FRS2α(pFRS2α)和44/42MAP激酶(p44/42MAPK)的磷酸化的免疫印迹分析的结果。泳道上方的数字给出了以ng ml^-1表示的添加的蛋白质的量。总44/42MAPK蛋白表达用作上样对照。图4B显示在用FGF23^R48A,N49A突变体、FGF23^R140A,R143A突变体或野生型FGF23刺激后，HEK293-αKlotho细胞系中FRS2α(pFRS2α)和44/42MAP激酶(p44/42MAPK)的磷酸化的免疫印迹分析的结果。泳道上方的数字给出了以ng ml^-1表示的添加的蛋白质的量。总44/42MAPK蛋白和αKlotho蛋白表达表达用作上样对照。图4C显示了用FGF19^K149A、FGF19^K149A,R157A、FGF19或媒介物处理的小鼠的肝组织中CYP7A1和CYP8B1mRNA表达的定量分析的图表结果。提供1mg蛋白质/kg体重。数据表示平均值+SEM；***,P<0.001，利用学生氏t检验。图4D显示在FGF23^{R48A ,N49A}、FGF23^R140A,R143A、FGF23或媒介物注射之前和注射后8h小鼠中血清磷酸盐浓度(血清P_i)的分析的图表结果。给予野生型单个剂量的蛋白(0.29mg kg体重^-1)，然而Fgf23敲除小鼠接受两个各自0.71mg kg体重^-1的剂量。数据表示为平均值±SEM；*,P<0.05和**,P<0.01，利用ANOVA。

图5A-5G显示关于FGF2至内分泌配体的转化的设计和结果。图5A为人FGF2、FGF19、FGF21、FGF23以及工程化FGF2-FGF19、FGF2-FGF21和FGF2-FGF23嵌合物的示意图。每一个配体和嵌合物的每一个组分的氨基酸边界用残基字母和编号来标记。已知配体晶体结构的β-三叶形核心结构域加以灰色阴影。嵌合物的FGF2部分中的突变的HS结合残基用残基字母和编号来标记。还标记的是在FGF23和FGF2-FGF23嵌合物中突变成谷氨酰胺的FGF23的C末端区域中的蛋白水解切割位点的精氨酸残基。图5B和5C显示举例说明FGF2^WT核心-FGF21^C-尾(图5B)和FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾(图5C)对肝素的结合的SPR传感图的叠加，和拟合饱和结合曲线。将肝素固定在生物传感器芯片上，将递增浓度的FGF2^WT核心-FGF21^C-尾或FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾通过芯片上方。从饱和结合曲线推导出解离常数(K_Ds)。图5D和5E显示举例说明FGF2^WT核心-FGF23^C-尾(图5D)和FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾(图5E)对肝素的结合的SPR传感图的叠加。将递增浓度的FGF2^WT核心-FGF23^C-尾或FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾通过含有固定肝素的芯片上方。图5F和5G显示在用指示的嵌合物或天然FGF刺激后HEK293细胞中Egr1表达的免疫印迹分析的结果。泳道上方的编号给出了以纳摩尔表示的添加的蛋白质的量。GAPDH蛋白表达用作上样对照。

图6是举例说明FGF1至内分泌配体的转化的示意图。显示了人FGF1、FGF19、FGF21、FGF23以及根据本发明的示意性FGF1-FGF19、FGF1-FGF21和FGF1-FGF23嵌合物的示意图。每一个配体和嵌合物的每一个组分的氨基酸边界用残基字母和编号来标记。已知配体晶体结构的β-三叶形核心结构域加以灰色阴影。嵌合物的FGF1部分中的突变的HS结合残基用残基字母和编号来标记。还标记的是在FGF23和FGF1-FGF23嵌合物中突变成谷氨酰胺的FGF23的C末端区域中的蛋白水解切割位点的精氨酸残基。

图7A-7G显示证明FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾嵌合物显示FGF23-样活性的结果。图7A和7B显示举例说明FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾(图7A)或FGF23(图7B)对αKlotho-FGFR1c与固定在生物传感器芯片上的FGF23的结合的抑制的SPR传感图的叠加。将递增浓度的FGF2^ΔHBS核心-FGF23^{C -尾}或FGF23与固定浓度的αKlotho-FGFR1c复合物混合，随后将混合物通过FGF23芯片上方。图7C显示举例说明FGF2抑制αKlotho-FGFR1c对FGF23的结合失效的SPR传感图的叠加。以15:1的摩尔比混合FGF2与αKlotho-FGFR1c复合物，将混合物通过含固定FGF23的生物传感器芯片上方。图7D和7E显示举例说明FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾(图7D)或FGF23(图7E)对βKlotho-FGFR1c与FGF21的结合无抑制作用的SPR传感图的叠加。将FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾或FGF23与βKlotho-FGFR1c复合物以10:1的摩尔比混合，将混合物通过含固定FGF21的生物传感器芯片上方。图7F显示在FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾、FGF2^WT核心-FGF23^C-尾、FGF23或媒介物的腹膜内注射之前和注射之后8h小鼠中血清磷酸盐浓度(血清P_i)的分析。分别给予野生型小鼠和αKlotho敲除小鼠每kg体重0.21mg和0.51mg的蛋白。数据表示为平均值±SEM；**,P<0.01；***,P<0.001，利用ANOVA。图7G显示利用FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾、FGF2^WT核心-FGF23^C-尾、FGF23或媒介物注射的小鼠的肾组织中CYP27B1mRNA表达的定量分析。注射每kg体重0.21mg的蛋白。数据表示为平均值±SEM；***,P<0.001，利用ANOVA。

图8A-8G显示证明FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物显示FGF21-样活性的结果。图8A-8B显示举例说明FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾(图8A)或FGF21(图8B)对βKlotho-FGFR1c与固定在生物传感器芯片上的FGF21的结合的抑制的SPR传感图的叠加。将递增浓度的FGF2^ΔHBS核心-FGF21^{C -尾}或FGF21与固定浓度的βKlotho-FGFR1c复合物混合，随后将混合物通过FGF21芯片上方。图8C显示举例说明FGF2抑制βKlotho-FGFR1c对FGF21的结合失效的SPR传感图的叠加。以15:1的摩尔比混合FGF2与βKlotho-FGFR1c复合物，将混合物通过含固定FGF21的生物传感器芯片上方。图8D-8E显示举例说明FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾(图8D)或FGF21(图8E)对αKlotho-FGFR1c与FGF23的结合无抑制作用的SPR传感图的叠加。将FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾或FGF21与αKlotho-FGFR1c复合物以10:1的摩尔比混合，将混合物通过含固定FGF23的生物传感器芯片上方。图8F显示在FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾或FGF21刺激的HEK293-βKlotho细胞中Egr1表达的免疫印迹分析的结果。泳道上方的数字给出了以ng ml^-1表示的添加的蛋白质的量。GAPDH蛋白表达表达用作上样对照。注意，FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物在诱导Egr1表达上比天然FGF21更有效力，这表明嵌合物具有激动性质。这是预料之中的，因为FGF2的核心结构域固有地具有比FGF21的核心结构域更大的对于FGFR的结合亲和力(参见图10A和10C)。图8G显示在腹膜内注射单独的胰岛素、胰岛素加FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物、胰岛素加FGF21或单独的媒介物之后和注射后指定的时间点上小鼠的血糖浓度的分析的图表结果。注射每kg体重0.5个单位的胰岛素和每kg体重0.3mg FGF21配体。血糖浓度表达为注射前值的百分数。数据表示为平均值±SEM。

图9A-9C显示根据本发明的FGF1变体在ob/ob小鼠中的降糖作用。图9A显示在皮下注射FGF1或FGF21之前和注射之后指定的时间点上ob/ob小鼠的血糖浓度的分析的图表结果。图9B显示在皮下注射FGF1、FGF1^ΔNT或FGF1^ΔHBS之前和注射之后指定的时间点上ob/ob小鼠的血糖浓度的分析的图表结果。图9C显示在皮下注射FGF1或FGF1^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物之前和注射之后指定的时间点上ob/ob小鼠的血糖浓度的分析的图表结果。对于图9A-9C中显示的实验，以0.5mg FGF蛋白/kg体重的推注方式注射ob/ob小鼠。数据表示为平均值±SD。

图10A-10F显示证明内分泌FGF相较于FGF2具有低的对于FGFR1c的结合亲和力的结果。图10A-10D显示举例说明FGFR1c对FGF2(图10A)、FGF19(图10B)、FGF21(图10C)和FGF23(图10D)的结合的SPR传感图的叠加和拟合饱和结合曲线。将递增浓度的FGFR1c配体-结合结构域通过含固定FGF2、FGF19、FGF21或FGF23的生物传感器芯片上方。图10E显示举例说明αKlotho-FGFR1c复合物对FGF23的结合的SPR传感图的叠加。将递增浓度的αKlotho-FGFR1c复合物通过含固定FGF23生物传感器芯片上方。图10F显示显示FGF23的C末端尾肽与FGFR1c之间的相互作用不存在的SPR传感图的叠加。将FGF2^3C-尾固定在生物传感器芯片上，将递增浓度的FGFR1c配体-结合结构域通过芯片上方。从饱和结合曲线推导出图10A-10E中给出的解离常数(_KDs)。

图11显示人FGF19(SEQ ID NO:337)(GenBank登录号NP_005108，将其通过引用全文并入本文)、FGF21(SEQ ID NO:233)(GenBank登录号NP_061986，将其通过引用全文并入本文)和FGF23(SEQ ID NO:351)(GenBank登录号AAG09917，将其通过引用全文并入本文)的C末端尾序列的比对。残基数目在比对左边的括号中。空位(虚线)被引入来最优化比对。FGF19与FGF21之间相同的残基加以灰色阴影。注意，40％的这些残基被定位至C端最末的序列。

图12显示人FGF21(SEQ ID NO:233)(GenBank登录号NP_061986，将其通过引用全文并入本文)、FGF19(SEQ ID NO:337)(GenBan k登录号NP_005108，将其通过引用全文并入本文)和具有单个对于F GF19是独特的残基的氨基酸置换或插入的FGF21的变体的C末端尾序列的比对。天然FGF21和FGF19的序列的残基数目在比对左边的括号中。空位(虚线)被引入来最优化比对。在天然FGF19的序列中，对于FGF19是独特的残基以粗体和加框表示，并且在FGF21C末端尾的变体的序列中，引入的FGF19残基以相同的方式突出显示。

图13显示人FGF21(SEQ ID NO:233)(GenBank登录号NP_061986，将其通过引用全文并入本文)、FGF19(SEQ ID NO:337)(GenBank登录号NP_005108，将其通过引用全文并入本文)和FGF21的变体的C末端尾序列的比对，在所述FGF21的变体中对于FGF19是独特的残基逐渐替代FGF21的对应残基或被插入FGF21序列。天然FGF21和FGF19的序列的残基数目在比对左边的括号中。空位(虚线)被引入来最优化比对。在天然FGF19的序列中，对于FGF19是独特的残基以粗体和加框表示，并且在FGF21C末端尾的变体的序列中，引入的FGF19残基以相同的方式来突出显示。

发明详述

本发明的一个方面涉及嵌合蛋白。嵌合蛋白包括偶连于C末端的N末端，其中N末端包括旁分泌成纤维细胞生长因子(“FGF”)的一部分并且C末端部分包括FGF21分子的C末端部分。旁分泌FGF的所述部分被修饰来相较于不具有所述修饰的部分，减小针对肝素和/或硫酸类肝素的结合亲和力。

如由Goetz等人(Goetz等人，“Molecular Insights into the Klotho-Dependent,Endocrine Mode of Action of Fibroblast Growth Factor19SubfamilyMembers,”Mol Cell Biol 3417-3428(2007)，将其通过引用全文并入本文)所描述的，哺乳动物成纤维细胞生长因子(FGF)家族包括18个多肽(FGF1至FGF10和FGF16至FGF23)，其参与胚胎发生过程中的许多生物过程，包括但不限于原肠胚形成、体制(bod y plan)形成、体节发生和基本上每一个组织/器官例如四肢、肺、脑和肾的形态发生(Bottcher等人，“Fibroblast Growth Factor Signaling During Early Vertebrate Development,”Endocr Rev 26:63-77(2005),和Thisse等人，“Functions and Regulations ofFibroblast Growth Fac tor Signaling During Embryonic Development,”Dev Biol287:390-402(2005)，将其通过引用全文并入本文)。

FGF通过结合于FGFR酪氨酸激酶，使其二聚化并激活其执行它们的生物学作用，所述FGFR酪氨酸激酶由4个不同的基因(Fgfr1至Fgfr4)来编码。典型的FGFR由细胞外结构域(由3个免疫球蛋白样结构域组成)、单次跨膜结构域和负责酪氨酸激酶活性的细胞内结构域组成(Mohammadi等人，“Structural Basis for Fibroblast Growth Factor ReceptorActivation,”Cytokine Growth Factor Rev 16:107-137(2005)，将其通过引用全文并入本文)。

主要FGFR的数目因FGFR1至FGFR3的免疫球蛋白样结构域3的第二半中的主要组织特异性选择性剪接事件而从4个增加至7个，这产生了上皮谱系特异性“b”和间充质谱系特异性“c”同种型(Moham madi等人，“Structural Basis for Fibroblast Growth FactorReceptor Activation,”Cytokine Growth Factor Rev 16:107-137(2005)和Ornitz等人，“Fibroblast Growth Factors,”Genome Biol 2(3):reviews3005.1-r eviews3005.12(2001)，将其通过引用全文并入本文)。一般而言，FGF的受体-结合特异性沿着受体的该主要选择性剪接分开，则此FGFRb-相互作用FGF由上皮细胞产生，而FGFRc-相互作用FGF由间充质细胞产生(Ornitz等人，“Fibroblast Growth Factors,”Genome Biol 2(3):reviews3005.1-reviews3005.12(2001)，将其通过引用全文并入本文)。FGF和FGFR的这些相互表达模式导致上皮与间充质之间的特异性旁分泌FGF信号转导环建立，这对于胚胎发育过程中正确的器官发生和图式发育以及成体生物体中的组织动态平衡是必需的。

基于序列同源性以及系统发育和结构考虑，将18种哺乳动物FGF分类成6个亚家族(Itoh等人，“Fibroblast growth factors:from molecular evolution to roles indevelopment,metabolism,and disease,”J Biochem 149:121-130(2011)；Mohammadi等人，“Structural basis for fibroblast growth factor receptor activation,”Cytokine Growth Factor Rev 16:107-137(2005)，将所述文献通过引用全文并入本文)。FGF核心同源性结构域(约120个氨基酸长)侧翼连接有在长度和一级序列上，特别地在不同的FGF亚家族间是高度可变的N末端和C末端序列。FGF19的核心区域与FGF21(38％)和FGF23(36％)共有最高序列同一性，从而这些配体被认为形成一个亚家族。

基于作用模式，18种哺乳动物FGF被分类成旁分泌作用配体(5个FGF亚家族)和包含FGF19、FGF21和FGF23的内分泌作用配体(1个FGF亚家族)(Itoh和Ornitz,“FibroblastGrowth Factors:From Molecular Evolution to Roles in Development,Metabolismand Disease,”J.Biochem.149:121-130(2011)；Mohammadi等人，“Structural Basis forFibroblast Growth Factor Receptor Activation,”Cytokine Growth Factor Rev.16:107-137(2005)，将所述文献通过引用全文并入本文)。

旁分泌FGF指导胚胎发生过程中的多个过程，包括原肠胚形成、体节发生、器官发生和组织图式发育(Itoh和Ornitz,“Fibroblast Growth Factors:From MolecularEvolution to Roles in Development,Metabolism and Disease,”J.Biochem.149:121-130(2011)；Bottcher和Niehrs,“Fibroblast Growth Factor Signaling During EarlyVertebrate Development,”Endocr.Rev.26:63-77(2005)；Thisse等人，“Functions andRegulations of Fibroblast Growth Factor Signaling During EmbryonicDevelopment,”Dev.Biol.287:390-402(2005)，将所述文献通过引用全文并入本文)，并且还调节成体中的组织动态平衡(Hart等人，“Attenuation of FGF Signalling in MouseBeta-cells Leads to Diabetes,”Nature 408:864-868(2000)；Jonker等人，“A PPARγ-FGF1Axis is Required for Adaptive Adipose Remodelling and MetabolicHomeostasis,”Nature 485:391-394(2012)，将所述文献通过引用全文并入本文)。

内分泌FGF控制主要代谢过程例如胆汁酸动态平衡(Inagaki等人，“FibroblastGrowth Factor 15Functions as an Enterohepatic Sig nal to Regulate Bile AcidHomeostasis,”Cell Metab.2:217-225(2005)，将其通过引用全文并入本文)以及肝脏葡萄糖和蛋白质代谢(Kir等人，“FGF19as a Postprandial,Insulin-Independent Activatorof He patic Protein and Glycogen Synthesis,”Science 331:1621-1624(2011)；Potthoff等人，“FGF15/19Regulates Hepatic Glucose Metabolism by Inhibiting theCREB-PGC-1αPathway,”Cell Metab.13:729-738(2011)，将所述文献通过引用全文并入本文)(FGF19)、葡萄糖和脂质代谢(Badman等人，“Hepatic Fibroblast Growth Factor 21IsRegulat ed by PPARαand Is a Key Mediator of Hepatic Lipid Metabolism inKetotic States,”Cell Metab.5:426-437(2007)；Inagaki等人，“End ocrine Regulationof the Fasting Response by PPARalpha-mediated I nduction of Fibroblast GrowthFactor 21,”Cell Metab.5:415-425(2007)；Kharitonenkov等人，“FGF-21as a NovelMetabolic Regulator,”J.Clin.Invest.115:1627-1635(2005)；Potthoff等人，“FGF21Induces PGC-1alpha and Regulates Carbohydrate and Fatty Acid MetabolismDuring the Adaptive Starvation Response,”Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.106:10853-10858(2009)，将所述文献通过引用全文并入本文)(F GF21)和磷酸盐及维生素D动态平衡(White等人，“Autosomal Domina nt Hypophosphataemic Rickets is Associated withMutations in FGF23,”Nat.Genet.26:345-348(2000)；Shimada等人，“Targeted Ablation of Fgf23Demonstrates an Essential Physiological Role of FGF23in Phosphateand Vitamin D Metabolism,”J.Clin.Invest.113:561-568(2004)，将所述文献通过引用全文并入本文)(FGF23)。因此，这些配体作为用于治疗各种遗传性或获得性代病症的潜在药物已吸收许多注意力(Beenken和Mohammadi,“The FGF Family:Biology,Pathophysiology and Therapy,”Nat.Rev.Drug Discov.8:235-253(2009)；Beenken和Mohammadi,“The Structural Biology of the FGF19Subf amily,”in Endocrine FGFsand Klothos(Kuro-o,M.编辑),Landes Bioscience.pp 1-24(2012)，将所述文献通过引用全文并入本文)。

FGF共有具有约120个氨基酸的核心同源区，该同源区折叠成β-三叶形(Ago等人，J.Biochem.110:360-363(1991)；Eriksson等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.88:3441-3445(1991)；Zhang等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.88:3446-3450(1991)；Zhu等人，Science251:90-93(1991)，将所述文献通过引用全文并入本文)，该β-三叶形由旁分泌FGF中的12条β链(β1-β12)和内分泌FGF中的11条β链(β1-β10和β12)组成(Mohammadi等人，“Structural Basis for Fibroblast Growth Factor Receptor Activation,”CytokineGrowth Factor Rev.16:107-137(2005)；Goetz等人，Mol.Cell Biol.27:3417-3428(2007)，将所述文献通过引用全文并入本文)。保守的核心区域侧翼连接有不同的N和C末端，其在赋予FGF不同的生物活性中起着至关重要的作用(Mohammadi等人，“StructuralBasis for Fibroblast Growth Factor Receptor Activation,”Cytokine GrowthFactor Rev.16:107-137(2005)；Olsen等人，Genes Dev.20:185-198(2006)，将所述文献通过引用全文并入本文)。

所有FGF都与细胞外周的硫酸类肝素(HS)葡糖氨基聚糖相互作用，虽然以不同的亲和力(Asada等人，Biochim.Biophys.Acta.1790:40-48(2009)，将其通过引用全文并入本文)。FGF的HS结合位点由β1-β2环和β10与β12链之间的区域组成(Mohammadi等人，“Structural Basis for Fibroblast Growth Factor Receptor Activation,”Cytoki ne GrowthFactor Rev.16:107-137(2005)，将其通过引用全文并入本文)。HS与旁分泌FGF中的HS结合位点的侧链和主链原子相互作用(Schlessinger等人，Mol.Cell 6:743-750(2000)，将其通过引用全文并入本文)。内分泌FGF的HS结合位点偏离被旁分泌FGF采纳的共同构象，以便排除HS与HS结合位点的骨架原子的相互作用(Goetz等人，Mol.Cell Biol.27:3417-3428(2007)，将其通过引用全文并入本文)。因此，与旁分泌FGF相比较，内分泌FGF显示较差的针对H S的亲和力(Beenken和Mohammadi,“The FGF Family:Biology,Pat hophysiology andTherapy,”Nat.Rev.Drug Discov.8:235-253(2009)；Asada等人，Biochim.Biophys.Acta.1790:40-48(2009)，将所述文献通过引用全文并入本文)。较差的HS亲和力使得这些配体自由地从它们分泌的部位扩散开去并进入血液循环以到达它们的远端靶器官(Goetz等人，Mol.Cell Biol.27:3417-3428(2007)；Asada等人，Biochim.Biophys.Acta.1790:40-48(2009)，将所述文献通过引用全文并入本文)。

相比之下，由于它们的高HS亲和力(Asada等人，Biochim.Biop hys.Acta.1790:40-48(2009)，将其通过引用全文并入本文)，旁分泌FGF主要被固定在分泌这些配体的细胞附近，从而仅可在相同器官内起作用。有新现证据表明旁分泌FGF间的HS结合亲和力的差异转化为细胞外周基质中配体特异性梯度的形成(Kalinina等人，Mol.Cell Biol.29:4663-4678(2009)；Makarenkova等人，Sci.Signal 2:ra55(2009)，将所述文献通过引用全文并入本文)，这促成了这些配体的独特功能(Beenken和Mohammadi,“The FGF Family:Biology,Pathoph ysiology and Therapy,”Nat.Rev.Drug Discov.8:235-253(2009)；It oh和Ornitz,“Fibroblast Growth Factors:From Molecular Evolution to Roles inDevelopment,Metabolism and Disease,”J.Biochem.149:121-130(2011)，将所述文献通过引用全文并入本文)。

除了在细胞外空间中控制配体扩散以外，HS还促进2:2旁分泌F GF-FGFR信号转导单位的形成(Schlessinger等人，Mol.Cell 6:743-750(2000)；Mohammadi等人，Curr.Opin.Struct.Biol.15:506-516(2005)，将所述文献通过引用全文并入本文)。HS使配体与受体紧密结合以增强FGF针对受体的结合亲和力和促进配体-结合的受体二聚化。归功于它们的较差的HS-结合亲和力，内分泌FGF依赖于Kloth o共受体来结合它们的同源FGFR(Kurosu等人，J.Biol.Chem.282:26687-26695(2007)；Kurosu等人，J.Biol.Chem.281:6120-6123(2006)；Ogawa等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.104:7432-7437(2007)；Urakawa等人，Nature 444:770-774(2006)，将所述文献通过引用全文并入本文)。Klotho共受体为具有由两个I型β–糖苷酶结构域组成的细胞外结构域的单次跨膜蛋白(Ito等人，Mech.Dev.98:115-119(2000)；Kuro-o等人，Nature 390:45-51(1997)，将所述文献通过引用全文并入本文)。Klotho共受体组成型地与FGFR缔合以增强内分泌FGF对于它们在靶组织中的同源FGFR的结合亲和力(Kurosu等人，J.Biol.Chem.282:26687-26695(2007)；Kurosu等人，J.Biol.Ch em.281:6120-6123(2006)；Ogawa等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.104:7432-7437(2007)；Urakawa等人，Nature 444:770-774(2006)，将所述文献通过引用全文并入本文)。αKlotho为FGF23的共受体(Kurosu等人，J.Biol.Chem.281:6120-6123(2006)；Urakawa等人，Nature 444:770-774(2006)，将所述文献通过引用全文并入本文)，βKl otho为FGF19和FGF21的共受体(Kurosu等人，J.Biol.Chem.282:26687-26695(2007)；Ogawa等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.104:7432-7437(2007)，将所述文献通过引用全文并入本文)。内分泌FG F的C末端区域介导这些配体对FGFR-α/βKlotho共受体复合物的结合(Goetz等人，Mol.Cell Biol.27:3417-3428(2007)；Goetz等人，Pr oc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A 107:407-412(2010)；Micanovic等人，J.Cell Physiol.219:227-234(2009)；Wu等人，J.Biol.Chem.283:33304-33309(2008)；Yie等人，FEBS Lett,583:19-24(2009)；Goetz等人，Mol.Cell Biol.32:1944-1954(2012)，将所述文献通过引用全文并入本文)。

βKlotho通过使配体与受体同时通过两个不同结合位点紧密结合来促进FGF21对其同源FGFR的结合(Goetz等人，“Klotho Coreceptors Inhibit Signaling by ParacrineFibroblast Growth Factor 8Subfamily Ligands,”Mol Cell Biol 32:1944-1954(2012)，将其通过引用全文并入本文)。βKlotho在促进FGF19对其同源FGFR的结合中起着相同作用(Goetz等人，“Klotho Coreceptors Inhibit Signaling by ParacrineFibroblast Growth Factor 8Subfamily Ligands,”Mol Cell Biol32:1944-1954(2012)，将其通过引用全文并入本文)。βKlotho的结合位点在FGF21和FGF19上被定位至每一个配体的C末端区域，位于β-三叶形核心结构域之后(Goetz等人，“Klotho Coreceptors InhibitSignaling by Paracrine Fibroblast Growth Factor 8Subfamily Ligands,”Mol CellBiol 32:1944-1954(2012)，将其通过引用全文并入本文)。在这些研究的过程中，发现FGF21和FGF19的C末端尾肽共有βKlotho上的结合位点，并且FGF19的C末端尾对该位点的结合比FGF21的C末端尾对该位点的结合更紧密(Goetz等人，“Klotho Coreceptors InhibitSignaling by Paracrine Fibroblast Growth Factor 8Subfamily Ligands,”Mol CellBiol 32:1944-1954(2012)，将所述文献通过引用全文并入本文)。

内分泌FGF仍然具有残留的HS-结合亲和力，此外，在内分泌FGF间在该残留结合亲和力上存在差异(Goetz等人，Mol.Cell Biol.27:3417-3428(2007)，将其通过引用全文并入本文)。这些观察增加了HS可能在内分泌FGF信号转导中起作用的可能性。事实上，有几个报导显示HS可在Klotho共受体存在以及不存在的情况下促进内分泌FGF信号转导。已显示HS在过表达FGFR和Klotho共受体至少2倍的BaF3细胞中增强由内分泌FGF诱发的丝裂信号(Suzuki等人，Mol.Endocrinol.22:1006-1014(2008)，将其通过引用全文并入本文)。此外，即使在Klotho共受体不存在的情况下，HS使得内分泌FGF能够诱导过表达FGFR的BaF3细胞的增殖(Yu等人，Endocrinology146:4647-4656(2005)；Zhang等人，J.Biol.Chem.281:15694-15700(2006)，将其通过引用全文并入本文)。然而，相较于旁分泌FGF，需要显著更高浓度的配体和HS，并且细胞对内分泌FGF的增殖反应仍然落后于对旁分泌FGF的增殖反应约1个数量级(Zhang等人，J.Biol.Chem.281:15694-15700(2006)，将其通过引用全文并入本文)。

如本文中所用，术语“嵌合多肽”和“嵌合蛋白”包括这样的多肽，所述多肽具有包括第一多肽序列的全长序列的至少一部分和第二多肽序列的全长序列的至少一部分的序列，其中第一和第二多肽是不同的多肽。嵌合多肽还包括包括两个或更多个来源于相同多肽的非连续部分的多肽。嵌合多肽或蛋白还包括具有至少一个置换的多肽，其中嵌合多肽包括其中第一多肽序列的一部分已被第二多肽序列的一部分替代的第一多肽序列。

如本文中所用，术语给定的多肽序列的“N末端部分”是始于给定的多肽序列的N末端残基或其附近的给定的多肽序列的氨基酸的连续区段。给定的多肽的N末端部分可通过氨基酸的连续区段(例如，许多氨基酸残基)来确定。类似地，术语给定的多肽序列的“C末端部分”为终于给定的多肽序列的C末端残基或其附近的给定的多肽的连续长度。给定的多肽的C末端部分可通过氨基酸的连续区段(例如，许多氨基酸残基)来确定。

术语“部分”，当在本文中针对给定的多肽序列使用时，是指给定的多肽的序列的氨基酸的连续区段，所述区段短于给定的多肽的全长序列。给定的多肽的部分可通过其第一位置和其最终位置来确定，其中第一和终位置各自对应于给定的全长多肽的序列中的位置。对应于第一位置的序列位置被置于对应终位置的序列位置的N末端。所述部分的序列为始于对应于第一位置的序列位置并终于对应于终位置的序列位置的给定的多肽中的连续氨基酸序列或氨基酸的区段。部分还可通过参照给定的多肽序列中的位置和相对于参照位置的残基的长度来确定，由此所述部分的序列为给定的全长多肽中的连续氨基酸序列，其具有确定的长度并且在确定的位置上位于给定的多肽中。

如上文中指出的，根据本发明的嵌合蛋白可包括偶连于C末端的N末端。N末端和C末端在本文中用于分别指本发明的周期合蛋白的N末端区域或部分和C末端区域或部分。在本发明的一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白的C末端部分与N末端部分是连续连接的。在可选择的实施方案中，本发明的嵌合蛋白的C末端部分与N末端部分通过插入间隔子偶连。在一个实施方案中，间隔子可以是具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸残基的多肽序列。在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白的C末端部分与N末端部分可分别包括偶连于本发明的嵌合蛋白的C末端残基和/或N末端残基的另外的部分。在一些实施方案中，另外的部分可以是具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸残基的多肽序列。在一些实施方案中，具有这样的另外的部分的N末端部分和/或C末端部分将分别维持对应的非天然存在的N末端部分和/或C末端部分的活性。在一些实施方案中，具有这样的另外的部分的N末端部分和/或C末端部分相较于对应的天然存在的N末端部分和/或C末端部分分别具有增强的和/或延长的活性。在其它实施方案中，本发明的嵌合蛋白的C末端部分和/或N末端部分不包括分别偶连于本发明的嵌合蛋白的C末端残基和/或N末端残基的任何另外的部分。

旁分泌FGF的所述部分可来源于任何适当的旁分泌FGF。根据本发明的适当的旁分泌FGF包括FGF1、FGF2以及FGF4和FGF9亚家族的配体。本发明的某些实施方案可包括旁分泌FGF的全长氨基酸序列而非旁分泌FGF的一部分。

在一个实施方案中，旁分泌FGF的所述部分来源于哺乳动物FGF。在一个实施方案中，旁分泌FGF的所述部分来源于脊椎动物FGF。在一个实施方案中，旁分泌FGF的所述部分来源于人FGF。在一个实施方案中，旁分泌FGF来源于非人哺乳动物FGF。在一个实施方案中，旁分泌FGF的所述部分来源于非人脊椎动物FGF。在一个实施方案中，旁分泌FGF来源于人FGF的直系同源物或从一个物种获得的多肽或蛋白(所述多肽或蛋白为来自不同物种的多肽或蛋白的功能对应物)。

在根据本发明的一个实施方案中，嵌合蛋白的旁分泌FGF的所述部分包括旁分泌FGF的N末端部分。

在一个实施方案中，旁分泌FGF为FGF1。在一个实施方案中，FGF1的所述部分来自具有下列氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的人FGF1(GenBank登录号AAH32697，将其通过引用全文并入本文)：

在一个实施方案中，旁分泌FGF的所述部分包括始于SEQ ID NO:1(人FGF1)的残基1至25的任一个并终于残基150至155的任一个的氨基酸序列。在一个实施方案中，旁分泌FGF的所述部分包括FGF1(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基1-150、1-151、1-152、1-153、1-154、1-155、2-150、2-151、2-152、2-153、2-154、2-155、3-150、3-151、3-152、3-153、3-154、3-155、4-150、4-151、4-152、4-153、4-154、4-155、5-150、5-151、5-152、5-153、5-154、5-155、6-150、6-151、6-152、6-153、6-154、6-155、7-150、7-151、7-152、7-153、7-154、7-155、8-150、8-151、8-152、8-153、8-154、8-155、9-150、9-151、9-152、9-153、9-154、9-155、10-150、10-151、10-152、10-153、10-154、10-155、11-150、11-151、11-152、11-153、11-154、11-155、12-150、12-151、12-152、12-153、12-154、12-155、13-150、13-151、13-152、13-153、13-154、13-155、14-150、14-151、14-152、14-153、14-154、14-155、15-150、15-151、15-152、15-153、15-154、15-155、16-150、16-151、16-152、16-153、16-154、16-155、17-150、17-151、17-152、17-153、17-154、17-155、18-150、18-151、18-152、18-153、18-154、18-155、19-150、19-151、19-152、19-153、19-154、19-155、20-150、20-151、20-152、20-153、20-154、20-155、21-150、21-151、21-152、21-153、21-154、21-155、22-150、22-151、22-152、22-153、22-154、22-155、23-150、23-151、23-152、23-153、23-154、23-155、24-150、24-151、24-152、24-153、24-154、24-155、25-150、25-151、25-152、25-153、25-154或25-155。在一个实施方案中，旁分泌FGF的所述部分包括SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-150或25-150。

在一个实施方案中，旁分泌FGF的所述部分包括与始于SEQ ID NO:1(人FGF1)的残基1至25的任一个并终于残基150至155的任一个的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％,、至少95％、至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，旁分泌FGF的所述部分包括与始于SEQ ID NO:1(人FGF1)的残基1至25的任一个并终于残基150至155的任一个的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％,、至少95％、至少97％或至少99％的氨基酸序列同源性的氨基酸序列。

相对于给定的本文中鉴定的多肽序列的百分数(％)氨基酸序列同一性被定义为在对齐序列和必要时引入空位(以实现最大百分数序列同一性)后并且在不将任何保守置换当作序列同一性的部分的情况下，候选序列中与参照序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。相对于给定的本文中鉴定的多肽序列百分数(％)氨基酸序列同源性为在对齐序列和必要时引入空位(以实现最大百分数序列同源性)后，候选序列中与参照序列中的氨基酸残基相同或强相似的氨基酸残基的百分数。强相似的氨基酸残基可包括例如本领域已知的保守氨基酸置换。可以以在本领域技术人员能力范围内的各种方式，例如使用公共可获得的软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件，实现目的在于测定百分数氨基酸序列同一性和/或同源性的比对。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在待比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。

在本发明的一个实施方案中，嵌合蛋白的旁分泌FGF的所述部分来源于人FGF1的直系同源物。在一个实施方案中，FGF1的所述部分来源于东非狒狒(Papio Anubis)、苏门达腊红毛猩猩(Pongo abeli i)、普通狨(Callithrix jacchus)、普氏野马(Equuscaballus)、普通黑猩猩(Pan troglodytes)、非洲象(Loxodonta Africana)、家犬(Canislupus familiaris)、大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)、亚马逊松鼠猴(Saimiriboliviensis boliviensis)、野猪(Sus scrofa)、小耳大婴猴(Otolemur gar nettii)、马铁菊头蝠(Rhinolophus ferrumequinum)、鼩鼱(Sorex araneu s)、欧洲野兔(Oryctolaguscuniculus)、中国地鼠(Cricetulus griseus)、袋獾(Sarcophilus harrisii)、小家鼠(Musmusculus)、荷兰猪(Cavia po rcellus)、短尾负鼠(Monodelphis domestica)、吸血蝠(Desmodus rotun dus)、黄牛(Bos taurus)、鸭嘴兽(Ornithorhynchus anatinus)、斑胸草雀(Taeniopygia guttata)、九带犰狳(Dasypus novemcinctus)、非洲蟾蜍(X enopusSilurana tropicalis)、裸鼹鼠(Heterocephalus glaber)、狐蝠(Pte ropus alecto)、树鼩(Tupaia chinensis)、原鸽(Columba livia)、卡拉库尔羔羊(Ovis aries)、原鸡(Gallusgallus)、小羊驼(Vicugna pacos)、绿色安乐蜥(Anolis carolinensis)、小耳大婴猴(Otolemur garnettii)、家猫(Felis catus)、中华鳖(Pelodiscus sinensis)、矛尾鱼(Latimeria chalumn ae)、宽吻海豚(Tursiops truncates)、蒙眼貂(Mustela putoriusfuro)、白颊长臂猿(Nomascus leucogenys)、大猩猩(Gorilla gorilla)、西欧刺猬(Erinaceus europaeus)、蹄兔(Procavia capensis)、奥氏更格卢鼠(Di podomys ordii)、海七鳃鳗(Petromyzon marinus)、小马岛猬(Echinops telfairi)、恒河猴(Macacamulatta)、马来大狐蝠(Myotis lucifugus)、小棕蝠(Pteropus vampyrus)、小嘴狐猴(Microcebus murinus)、北美鼠兔(Ochotona princeps)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、霍氏树懒(Choloepu s hoffmanni)、Ictidomys tridecemlineatus、菲律宾眼镜猴(Tarsiussyri chta)、北树鼩(Tupaia belangeri)、吐绶鸡(Meleagris gallopavo)、尤金袋鼠(Macropus eugenii)或斑马鱼(Danio rerio)。人旁分泌FGF1的直系同源物的所述部分包括对应于上文中鉴定的人FGF1的氨基酸序列的部分。对应部分可通过例如序列分析和结构分析来确定。

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白的FGF1的所述部分来源于具有表1中显示的氨基酸序列的人FGF1的直系同源物。

表1:

如上文中指出的，旁分泌FGF的所述部分可被修饰来相较于不具有所述修饰的部分减小针对肝素和/或硫酸类肝素的结合亲和力。在一个实施方案中，旁分泌FGF的修饰部分包括一个或多个置换、添加或缺失。

在一个实施方案中，一个或多个置换位于SEQ ID NO:1的一个或多个氨基酸残基上，所述氨基酸残基选自N33、K127、K128、N129、K133、R134、R137、Q142、K143及其组合。在一个实施方案中，一个或多个置换选自N33T、K127D、K128Q、N129T、K133V、R134L、R137H、Q142M、K143T/L/I及其组合。在一个实施方案中，修饰是位于对应于SEQ ID NO:1的残基的一个或多个氨基酸残基上的一个或多个置换，所述氨基酸残基选自N33、K127、K128、N129、K133、R134、R137、Q142、K143及其组合。在一个实施方案中，修饰是位于对应于SEQ ID NO:1的残基的一个或多个氨基酸残基上的一个或多个置换，所述氨基酸残基选自N33、K127、K128、N129、K133、R134、R137、Q142、K143及其组合。对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基的氨基酸残基可以通过例如序列分析和结构分析来测定。

本发明内还包括的是除FGF1外的旁分泌FGF(例如，FGF2、FGF4、FGF5、FGF6、FGF9、FGF16和FGF20)的部分。来源于除FGF1外的旁分泌FGF的所述部分包括对应于上文中鉴定的FGF1的氨基酸序列的部分。对应部分可以通过例如序列分析和结构分析来测定。

应理解根据本发明的旁分泌FGF的所述部分可来源于编码旁分泌FGF蛋白的核苷酸序列。例如，在一个实施方案中，核苷酸序列为编码人FGF1的核苷酸序列(GenBank登录号BC032697，将其通过引用全文并入本文)(SEQ ID NO:61)，所述序列如下：

在本发明的另一个实施方案中，嵌合蛋白的旁分泌FGF的所述部分可来源于编码人FGF1的直系同源物的核苷酸序列。编码FGF1直系同源物的核苷酸序列示于表2中。

表2:

如上文中指出的，本发明内还包括除FGF1外的旁分泌FGF(例如，FGF2、FGF4、FGF5、FGF6、FGF9、FGF16和FGF20)的部分。来源于旁分泌FGF2的所述部分包括对应于上文中鉴定的FGF1的氨基酸序列的部分。对应部分可以通过例如序列分析和结构分析来测定。

在一个实施方案中，旁分泌FGF为FGF2。在一个实施方案中，FGF2的所述部分来源于具有SEQ ID NO:121的氨基酸序列的人FGF2(GenBank登录号EAX05222，将其通过引用全文并入本文)，所述氨基酸序列如下：

在一个实施方案中，旁分泌FGF的所述部分包括始于SEQ ID NO:121的残基1至25的任一个并终于残基151至155的任一个的氨基酸序列。在一个实施方案中，旁分泌FGF的所述部分包括FGF2(SEQ ID NO:121)的氨基酸残基1-151、1-152、1-153、1-154、1-155、2-151、2-152、2-153、2-154、2-155、3-151、3-152、3-153、3-154、3-155、4-151、4-152、4-153、4-154、4-155、5-151、5-152、5-153、5-154、5-155、6-151、6-152、6-153、6-154、6-155、7-151、7-152、7-153、7-154、7-155、8-151、8-152、8-153、8-154、8-155、9-151、9-152、9-153、9-154、9-155、10-151、10-152、10-153、10-154、10-155、11-151、11-152、11-153、11-154、11-155、12-151、12-152、12-153、12-154、12-155、13-151、13-152、13-153、13-154、13-155、14-151、14-152、14-153、14-154、14-155、15-151、15-152、15-153、15-154、15-155、16-151、16-152、16-153、16-154、16-155、17-151、17-152、17-153、17-154、17-155、18-151、18-152、18-153、18-154、18-155、19-151、19-152、19-153、19-154、19-155、20-151、20-152、20-153、20-154、21-155、21-151、21-152、21-153、21-154、21-155、22-151、22-152、22-153、22-154、22-155、23-151、23-152、23-153、23-154、23-155、24-151、24-152、24-153、24-154、24-155、25-151、25-152、25-153、25-154或25-155。在一个实施方案中，旁分泌FGF的所述部分包括SEQID NO:121的氨基酸残基1-151或1-152。

在一个实施方案中，嵌合蛋白的旁分泌FGF的所述部分包括与天然旁分泌FGF的对应氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:121)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，旁分泌FGF的所述部分包括与始于SEQ ID NO:121的残基1至25的任一个并终于残基151至155的任一个的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，旁分泌FGF的所述部分包括与天然旁分泌FGF的对应氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:121)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，旁分泌FGF的所述部分包括与始于SEQ ID NO:121的残基1至25的任一个并终于残基151至155的任一个的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的氨基酸序列同源性的氨基酸序列。

本发明内还包括的是除FGF2外的旁分泌FGF(例如，FGF1、FGF4、FGF5、FGF6、FGF9、FGF16和FGF20)的部分。来源于除FGF2外的旁分泌FGF的所述部分包括对应于上文中鉴定的FGF2氨基酸序列的部分。对应部分可以通过例如序列分析和结构分析来测定。

在本发明的一个实施方案中，旁分泌FGF的所述部分来源于人旁分泌FGF的直系同源物。在本发明的一个实施方案中，嵌合蛋白的旁分泌FGF的所述部分来源于人FGF2的直系同源物。在一个实施方案中，FGF2的所述部分来源于大猩猩、苏门达腊猩猩、恒河猴、普通黑猩猩、倭黑猩猩(Pan paniscus)、亚马逊松鼠猴、白颊长臂猿、普氏野马、黄牛、东非狒狒、小羊驼、卡拉库尔羔羊、西方狍(Capre olus capreolus)、非洲象、野猪、大熊猫、霍氏树懒、印度水牛(Buba lus bubalis)、家犬、褐家鼠、裸鼹鼠、小耳大婴猴、小家鼠、Ictido mystridecemlineatus、家猫、荷兰猪、袋獾、短尾负鼠、欧洲野兔、吐绶鸡、原鸡、斑胸草雀、红腹蝾螈(Cynops pyrrhogaster)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、白腹负鼠(Didelphisalbiventris)、小棕蝠、绿色安乐蜥、九带犰狳、北树鼩、非洲蟾蜍、矛尾鱼、黑绿四齿鲀(Tetrao don nigroviridis)、三刺鱼(Gasterosteus aculeatus)、红鳍东方鲀(Takif ugurubripes)、虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)、大西洋鲑(Salmo salar)、斑马鱼、尼罗蒂长罗非鱼(Oreochromis niloticus)或青鳉鱼(Oryzias lat ipes)。人旁分泌FGF的直系同源物的所述部分包括对应于上文中鉴定的FGF2的氨基酸序列的部分。对应部分可通过例如序列分析和结构分析来测定。

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白的FGF2的所述部分来源于具有表3中显示的氨基酸序列的人FGF2的直系同源物。

表3:

如上文中指出的，旁分泌FGF的所述部分可被修饰来相较于不具有所述修饰的部分，减小针对肝素和/或硫酸类肝素的结合亲和力。在一个实施方案中，旁分泌FGF的修饰包括一个或多个置换、添加或缺失。

在一个实施方案中，修饰为位于SEQ ID NO:121的一个或多个氨基酸残基上的一个或多个置换，所述氨基酸残基选自N36、K128、R129、K134、K138、Q143、K144、C78、C96及其组合。在一个实施方案中，一个或多个置换选自N36T、K128D、R129Q、K134V、K138H、Q143M、K144T/L/I、C78S、C96S及其组合。在一个实施方案中，修饰为位于对应于SEQ ID NO:121的残基的一个或多个氨基酸残基残基上的一个或多个置换，所述氨基酸残基选自N36、K128、R129、K134、K138、Q143、K144、C78、C96及其组合。在一个实施方案中，修饰为位于对应于SEQID NO:121的残基的一个或多个氨基酸残基上的一个或多个置换，所述氨基酸残基选自N36、K128、R129、K134、K138、Q143、K144、C78、C96及其组合。对应于SEQ ID NO:121的氨基酸残基的氨基酸残基可以通过例如序列分析和结构分析来测定。

应理解根据本发明的旁分泌FGF的所述部分可来源于编码旁分泌FGF蛋白的核苷酸序列。例如，在一个实施方案中，核苷酸序列为编码人FGF2的核苷酸序列(GenBank登录号NM_002006，将其通过引用全文并入本文)(SEQ ID NO:171)，所述核苷酸如下：

在本发明的另一个实施方案中，嵌合蛋白的旁分泌FGF的所述部分可来源于编码人FGF2的直系同源物的核苷酸序列。编码FGF2直系同源物的核苷酸序列示于表4中。

表4:

如上文中所指出的，本发明中还包括除FGF1和/或FGF2外的旁分泌FGF(例如，FGF4、FGF5、FGF6、FGF9、FGF16和FGF20)的部分。旁分泌FGF的所述部分可来自人FGF4、FGF5、FGF6、FGF9、FGF16，和/或具有表5中显示的氨基酸序列的FGF20或其直系同源物。

表5:

应理解根据本发明的旁分泌FGF的所述部分可来源于编码人FGF4、FGF5、FGF6、FGF9、FGF16和/或FGF20(具有表6中显示的核苷酸序列)或其直系同源物的核苷酸序列。

表6:

如上文中所指出的，嵌合蛋白包括偶连于来源于FGF21分子的C末端区域的旁分泌FGF的一部分。FGF21为主要由胰腺表达的内分泌FGF(Fon Tacer等人，“ResearchResource:Comprehensive Expression Atlas of the Fibroblast Growth factorSystem in Adult Mouse,”Mol Endocrinol 24(10):2050-2063(2010)，将其通过引用全文并入本文)，并且具有与FGF19的代谢作用相似的代谢作用，例如增加的能量代谢、体重减轻、降低的血糖水平和对肥胖症及糖尿病的抗性(Kharitonenkov等人，“FGF-21 as aNovel Metabolic Regulator,”J Clin Invest 115(6),1627-1635(2005)；Coskun等人，“Fibroblast growth factor21 corrects obesity in mice,”Endocrinology 149(12):6018-6027(2008)，将所述文献通过引用全文并入本文)。过表达FGF21的转基因小鼠也抗饮食诱发的肥胖症(Kharitonenkov等人，“FGF-21 as a Novel Metabolic Regulator,”JClin Invest 115(6),1627-1635(2005)，将其通过引用全文并入本文)。此外，在糖尿病啮齿类动物模型中，FGF21施用降低血糖和甘油三酯水平(Kharitonenkov等人，“FGF-21 as aNovel Metabolic Regulator,”J Clin Invest 115(6),1627-1635(2005)，将其通过引用全文并入本文)。

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白的FGF21的C末端部分来自具有SEQ ID NO:233(GenBank登录号NP_061986，将其通过引用全文并入本文)的氨基酸序列的人FGF21，所述氨基酸序列如下：

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白的FGF21的C末端部分包括β-Klotho共受体结合结构域。

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白的FGF21的C末端部分包括SEQ ID NO:233的氨基酸残基168-209。

在一个实施方案中，嵌合蛋白的FGF21的C末端部分还包括一个或多个置换、缺失或添加。在一个实施方案中，嵌合蛋白的FGF21的C末端部分还包括一个或多个置换、缺失或添加，同时保留结合β-Klotho的能力。在一个实施方案中，嵌合蛋白的FGF21的C末端部分还包括一个或多个置换、缺失或添加，同时保持选择性结合β-Klotho的能力。在一个实施方案中，嵌合蛋白的FGF21的C末端部分还包括一个或多个置换、添加或缺失以增强针对β-Klotho的结合亲和力。

在本发明的一个实施方案中，根据本发明的嵌合蛋白的C末端部分为哺乳动物FGF21或来源于其。在本发明的一个实施方案中，根据本发明的嵌合蛋白的C末端部分为脊椎动物FGF21或来源于其。在一个实施方案中，根据本发明的嵌合蛋白的C末端部分来源于非人脊椎动物FGF21。应理解这包括人FGF21的直系同源物，或获自一个物种的为来自不同物种的多肽或蛋白的功能对应物的多肽或蛋白。在本发明的一个实施方案中，根据本发明的嵌合蛋白的FGF21的C末端部分来源于人、苏门达腊猩猩、普通黑猩猩、家犬、黄牛、普氏野马、大熊猫、欧洲野兔、大猩猩、白颊长臂猿、蹄兔、荷兰猪、北树鼩、鼩鼱、ictidomystridecemlineatus、非洲象、野猪、家猫、小耳大婴猴、褐家鼠、小家鼠、小羊驼、绿色安乐蜥、大西洋鳕、矛尾鱼、宽吻海豚、蒙眼貂、红鳍东方鲀、奥氏更格卢鼠、小马岛猬、恒河猴、小嘴狐猴、北美鼠兔、剑尾鱼、三刺鱼、袋獾、尤金袋鼠、非洲蟾蜍、斑马鱼、野牦牛(bosgrunniens mutus)、亚马逊松鼠猴、普通狨、树鼩、东非狒狒、狐蝠、裸鼹鼠、中国地鼠、家养绵羊(ovies aries)、倭黑猩猩、食蟹猴、金黄地鼠(mesocricetus auratus)或尼罗蒂长罗非鱼。

在本发明的一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白的FGF21的所述部分来自具有表7中显示的氨基酸序列的人FGF21的直系同源物。根据本发明的嵌合蛋白的人FGF21的直系同源物的所述部分包括对应上文中鉴定的人FGF21的氨基酸序列的部分。对应部分可以通过例如序列分析和结构分析来测定。

表7:

在根据本发明的某些实施方案中，本发明的嵌合蛋白的FGF21的C末端部分包括与SEQ ID NO:233的氨基酸残基168-209具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性的多肽序列。在根据本发明的某些实施方案中，本发明的嵌合蛋白的FGF21的C末端部分包括与SEQ ID NO:233的氨基酸残基168-209具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的氨基酸序列同源性的多肽序列。

应理解本发明的嵌合蛋白的FGF21的所述部分可来源于编码脊椎动物或无脊椎动物FGF21蛋白的核苷酸序列。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白的FGF21的所述部分可来源于编码哺乳动物FGF21蛋白的核苷酸序列。编码根据本发明的脊椎动物FGF21蛋白的核苷酸序列可包括但不限于表8中显示的那些核苷酸序列。来源于人FGF21的直系同源物的本发明的嵌合蛋白的FGF21的所述部分包括对应于上文中鉴定的FGF21的氨基酸序列的部分。对应部分可以通过例如序列分析和结构分析来测定。

表8：

在本发明的一个实施方案中，嵌合蛋白可包括一个或多个来自另一个FGF的氨基酸的置换或添加。在一个实施方案中，来自FGF21的C末端部分包括包括来自FGF19(包括人FGF19和人FGF19的直系同源物)的氨基酸残基的置换或添加的修饰。在一个实施方案中，FGF19为具有SEQ ID NO:337的氨基酸序列(GenBank登录号NP_005108，将其通过引用全文并入本文)的人FGF19蛋白或其部分或直系同源物，所述氨基酸序列如下：

这样的残基的示例性置换和添加示于图12和13中。

在一个实施方案中，来自FGF21的C末端部分包括包括来自FGF19分子的氨基酸残基的置换的修饰。在一个实施方案中，修饰包括SEQ ID NO:337(FGF19)的氨基酸残基169至216的置换或添加。在一个实施方案中，修饰为来自SEQ ID NO:337(FGF19)的氨基酸残基对对应的SEQ ID NO:233(FGF21)的氨基酸残基的置换。FGF的对应残基通过序列分析和/或结构分析来鉴定。参见，图2、11、12和13。在一个实施方案中，修饰包括SEQ ID NO:337(FGF19)的氨基酸残基169至216的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48个残基的连续区段对SEQ ID NO:233(FGF21)的氨基酸残基的对应连续区段的置换。在一个实施方案中，用选自包括SEQ ID NO:337(FGF19)的氨基酸残基169至216的序列的对应氨基酸残基置换SEQ ID NO:233(FGF21)的氨基酸残基168至209、191至209或198至209。

在一个实施方案中，修饰包括一个或多个来自SEQ ID NO:337(FGF19)的残基169至216的单个氨基酸残基对SEQ ID NO:233(FGF21)的对应氨基酸残基的置换。在一个实施方案中，C末端部分包括SEQ ID NO:233(FGF21)的氨基酸残基168、169、170、171、173、174、177、178、179、180、181、182、183、184、186、187、188、189、191、194、195、196、199、200、201、202、207、208或209的一个或多个对SEQ ID NO:337(FGF19)的对应氨基酸残基的置换。

在本发明的一个实施方案中，来自FGF21的C末端部分包括修饰，所述修饰包括存在于来自FGF19的对应C末端部分中的氨基酸残基的添加。如图11、12和13中显示的，不存在于FGF21的对应C末端部分中的FGF19残基可通过序列分析和/或结构分析来鉴定。在一个实施方案中，修饰包括选自SEQ ID NO:337(FGF19)的残基204至216、197至216、174至216或169至216的氨基酸残基的添加。在一个实施方案中，修饰包括SEQ ID NO:337(FGF19)的氨基酸残基204的添加。在一个实施方案中，修饰包括SEQ ID NO:337(FGF19)的氨基酸残基178、179、180、181和/或182单个地或组合地添加。

应理解包括来自FGF19分子的氨基酸残基的置换的来自FGF21的C末端部分可使用核苷酸序列来产生，所述核苷酸序列编码具有SEQ ID NO:338的核苷酸序列(人FGF19基因编码序列(1-216)；GenBank登录号NM_005117，将其通过引用全文并入本文)的人FGF19蛋白或其部分或直系同源物，所述核苷酸序列如下：

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包括SEQ ID NO:339、SEQ ID NO:340、SEQID NO:341或SEQ ID NO:342的氨基酸序列，如表9中显示的。

表9:

根据本发明的嵌合蛋白可以是分离的蛋白质或多肽。可使用本领域已知的标准合成法，包括固相肽合成(Fmoc或Boc策略)或液相肽合成，制备本发明的分离的嵌合蛋白以用于根据本发明的用途。或者，可使用重组表达系统来制备本发明的肽。

因此，本发明的另一个方面涉及编码根据本发明的嵌合蛋白的分离的核酸分子。在一个实施方案中，核酸分子包括SEQ ID NO:343、SEQ ID NO:344、SEQ ID NO:345或SEQID NO:346的核苷酸序列(如表10中显示的)。

表10:

本发明的另一个方面涉及核酸构建体，其包括编码根据本发明的嵌合蛋白的核酸分子、5’DNA启动子序列和3’终止子序列。将核酸分子、启动子和终止子有效地连接以允许核酸分子转录。

还包括包括这样的核酸分子载体或表达载体，以及包括这样的核酸分子的宿主细胞。可按照本领域已知的技术在宿主细胞中表达根据本发明的核酸分子，和分离的编码的多核苷酸。

一般而言，重组表达系统的使用包括将编码期望的肽的氨基酸序列的核酸分子插入所述分子对其是异源的(即，通常不存在的)的表达系统。可将一个或多个编码本发明的肽的期望的核酸分子插入载体。当插入多个核酸分子时，多个核酸分子可编码相同或不同的肽。将异源核酸分子以相对于启动子和任何其它5’调控分子的正确的有义(5’→3’)方向和正确的读框插入表达系统或载体。

可使用如由Joseph Sambrook等人，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL(Cold Springs Harbor 1989)描述的本领域公知的标准克隆法进行核酸构建体的制备。属于Cohen和Boyer的美国专利No.4,237,224(将其通过引用全文并入本文)描述了使用限制性内切酶切割和利用DNA连接酶的连接进行的以重组质粒的形式存在的表达系统的产生。随后通过转化引入这些重组质粒并在适当的宿主细胞中复制其。

可将许多控制基因表达(例如，DNA转录和信使RNA(“mRNA”)翻译)的水平的遗传信号和加工事件整合入核酸构件体以使蛋白质表达最大化。为了表达编码期望的蛋白质的克隆的核酸序列，有利地使用强启动子来获得高水平的转录。取决于使用的宿主系统，可使用许多适当的启动子的任一个。例如，当在大肠杆菌(E.coli)中克隆时，可将其噬菌体或质粒、启动子例如T7噬菌体启动子、lac启动子、trp启动子、recA启动子、核糖体RNA启动子、大肠杆菌噬菌体λ和其它噬菌体(包括但不限于lacUV5、ompF、bla、lpp等)的P_R和P_L启动子用于指导相邻DNA区段的高水平转录。此外，通过重组DNA或其它合成DNA技术产生的杂交体trp-lacUV5(tac)启动子或其它大肠杆菌启动子可用于提供插入基因的转录。适合于在哺乳动物细胞中指导表达的常用启动子包括但不限于SV40、MMTV、金属硫蛋白-1、腺病毒Ela、CMV、立即早期免疫球蛋白重链启动子和增强子以及RSV-LTR。

存在在原核细胞中高效基因转录和翻译所需的其它特异性起始信号，所述信号可被包括在核酸构建体中来使蛋白质产量最大化。取决于使用的载体系统和宿主，可使用许多适当的转录和/或翻译元件，包括组成型、诱导型和可抑制型启动子以及最小5’启动子元件、增强子或前导序列。关于最大化基因表达的综述，参见Roberts和Lauer,“MaximizingGene Expression On a Plasmid Using Recombination In Vitro,”Methods inEnzymology 68:473–82(1979)，将其通过引用全文并入本文。

使用本领域的标准克隆法，例如Joseph Sambrook等人，MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL(Cold Springs Harbor1989)；Frederick M.Ausubel,SHORTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Wiley 1999)；和属于Cohen和Boyer的美国专利No.4,237,224(将所述参照资料和美国专利通过引用全文并入本文)中描述的方法，将编码本发明的分离的蛋白质的核酸分子、选择的启动子(包括但不限于增强子和前导序列)、允许在宿主中转录的适当的3’调控区和任何另外的期望的组分例如报道基因或标志基因克隆入选择的载体。

在将编码蛋白质的核酸分子克隆入表达载体后，准备将其整合入宿主。可使用本领域已知的标准克隆技术，如由JOSEPH SAMBROOK等人，MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL(Cold Springs Harbor 1989)(将其通过引用全文并入本文)描述的技术，通过但不限于转染(如果宿主是真核细胞的话)、转导、接合、动员或电穿孔、脂转染、原生质体融合、动员或微粒轰击将重组分子引入细胞。

许多适当的宿主-载体系统可用于表达重组蛋白或多肽。主要地，载体必须与使用的宿主兼容。宿主-载体系统包括但不限于下列：用噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌；微生物例如包括酵母载体的酵母；用病毒(例如，痘苗病毒、腺病毒等)感染的哺乳动物细胞；用病毒(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；和利用细菌感染的植物细胞。

可通过本领域易知的几个方法，包括离子交换层析、疏水相互作用层析、亲和层析、凝胶过滤和反相层析获得纯化的蛋白质。优选通过常规技术以纯化的形式(优选具有至少约80％或85％的纯度，更优选至少约90％或95％的纯度)产生蛋白质。取决于重组宿主细胞是否被产生来将蛋白质分泌至培养基中(参见属于Bauer等人的美国专利No.6,596,509，将其通过引用全文并入本文)，可通过离心(以将细胞组分与包括分泌的蛋白质的上清液分离)，随后上清液的连续硫酸铵沉淀来分离和纯化蛋白质。将包括蛋白质的级分在适当尺寸的葡聚糖或聚丙烯酰胺柱经历凝胶过滤来将目标蛋白质与其它蛋白质分离。必要时，可进一步通过HPLC纯化蛋白质级分。

本发明的另一个方面涉及包括根据本发明的嵌合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。

如本文中所用，“载体”包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，其在使用的剂量和浓度上对于将暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常地生理上可接受的载体是含水pH缓冲液。生理上可接受的载体的实例包括缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖以及其它糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖醇例如甘露醇或山梨醇；盐形成抗衡离子；和/或非离子型表面活性剂例如TWEEN^TM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS^TM。

术语“药学上可接受的”意指在扎实的医学判断的范围内适合用于与人和低等动物的细胞接触而无过度毒性、刺激、过敏反应等，并且与合理的效益/风险比相称。

在一个实施方案中，药物组合物包括向器官靶向剂。在一个实施方案中，靶向剂通过在生理条件下可被切割的接头共价地连接于嵌合蛋白。

根据本发明的嵌合和/或修饰蛋白还可使用一种或多种另外的或替代策略来修饰，以延长蛋白质的体内半衰期。一个这样的策略包括产生D-肽嵌合蛋白，其由不被内源蛋白酶切割的非天然氨基酸组成。或者，可将嵌合和/或修饰蛋白融合于蛋白质伴侣，该蛋白质伴侣在体内施用后赋予蛋白延长的半衰期。适当的融合伴侣包括但不限于免疫球蛋白(例如，IgG的Fc部分)、人血清白蛋白(HAS)(直接或通过添加链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域连接的)、胎球蛋白或这些蛋白的任何蛋白的片段。还可将嵌合和/或修饰蛋白融合于除在体内施用后赋予蛋白更长的半衰期的蛋白外的大分子。适当的大分子包括但不限于聚乙二醇(PEG)。将蛋白质或肽缀合于聚合物以增强治疗性施用的稳定性的方法描述于属于Ekwuribe的美国专利No.5,681,811(将其通过引用全文并入本文)中。核酸缀合物描述于属于Cook等人的美国专利No.6,528,631、属于Guzaev等人的美国专利No.6,335,434、属于Manoharan等人的美国专利No.6,235,886、属于Manoharan等人的美国专利No.6,153,737、属于Lin等人的美国专利No.5,214,136或属于Cook等人的美国专利No.5,138,045(将所述美国专利通过引用全文并入本文)中。

根据本发明的药物组合物可被配制来用于口服、胃肠外、皮下、静脉内、肌内、腹膜内途径，通过鼻内滴注、通过植入、通过腔内或膀胱内滴注、眼内、动脉内、病变内、经皮肤途径，或通过对粘膜的敷用来施用。可方便地以单位剂量形式提供制剂，可通过制药领域中公知的任何方法来制备制剂。

本发明的另一个方面涉及用于治疗患有病症的受试者的方法。该方法包括选择患有病症的受试者，和在对于治疗病症是有效的条件下给选择的受试者施用根据本发明的药物组合物。在一个实施方案中，病症为糖尿病、肥胖症或代谢综合征。

本发明的另一个方面涉及用于治疗患有病症的受试者的方法。该方法包括选择患有病症的受试者和提供嵌合FGF蛋白，其中嵌合FGF蛋白包括偶连于C末端的N末端。N末端包括旁分泌FGF的一部分并且C末端包括FGF21的C末端部分。旁分泌FGF的所述部分被修饰来相较于不具有所述修饰的部分，减小针对肝素和/或硫酸类肝素的结合亲和力。该方法还包括在对于治疗病症是有效的条件下给选择的受试者施用治疗有效量的嵌合FGF蛋白。

用于根据本发明的该方面的用途的适当的嵌合蛋白在上文中和整个本发明书中进行了描述。

在一个实施方案中，选择的受试者为哺乳动物。在一个实施方案中，选择的受试者为人。在另一个实施方案中，选择的受试者为啮齿类动物。

在一个实施方案中，选择的受试者需要增加的FGF21-βKlotho-F GF受体(“FGFR”)复合物形成。

在一个实施方案中，病症选自糖尿病、肥胖症和代谢综合征。如本文中所用，糖尿病包括I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病和药物引起的糖尿病。在另一个实施方案中，受试者具有肥胖症。在另一个实施方案中，受试者具有代谢综合征。

本发明的嵌合蛋白或其药物组合物可用于治疗许多病况。在一个实施方案中，病况是治疗结果包括血糖的减少、血液果糖胺的减少、能量消耗的增加、脂肪利用的增加、体重的减轻、体脂的减少、甘油三酯的减少、游离脂肪酸的减少、脂肪外泌的增加、胰腺β-细胞功能和质量的增强或甚至保持、总血液胆固醇的减少、血液低密度脂蛋白胆固醇的减少、血液高密度脂蛋白胆醇的增加、血液脂连素的增加、胰岛素敏感性的增强、瘦素敏感性的增强、血液胰岛素的减少、血液瘦素的减少、血液胰高血糖素的减少、脂肪细胞对葡萄糖吸收的增加、肝细胞中脂肪积累的减少和/或肝细胞中脂肪氧化的增加。这些参数的每一个可通过标准方法，例如通过测量氧气消耗(以测定代谢速率)，使用天秤测定重量，和测量瘦体质组成或质量(以测定脂肪)来进行测量。此外，甘油三酯、游离脂肪酸、葡萄糖和瘦素的存在和量可通过标准方法(例如，血液测试)来测定。

可按照本发明治疗的另外的病况包括1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病、药物引起的糖尿病、高血糖、代谢综合征、脂肪营养不良综合征、血脂异常、胰岛素抗性、瘦素抗性、动脉粥样硬化、血管疾病、炎性疾病、纤维变性疾病、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、非酒精性脂肪肝病、超重和肥胖症的一种或多种。

在一个实施方案中，将本发明的嵌合蛋白或其药物组合物与药学上可接受的载体一起施用。

根据本发明的嵌合蛋白或其药物组合物可通过口服、胃肠外、皮下、静脉内、肌内、腹膜内途径，通过鼻内滴注、通过植入、通过腔内或膀胱内滴注、眼内、动脉内、病变内、经皮肤途径，或通过对粘膜的敷用来施用。最适当的途径可取决于受者的病况和病症。可方便地以单位剂量形式提供包括根据本发明的嵌合蛋白的制剂，以及可通过制药领域中公知的任何方法来制备制剂。

本发明的药物组合物的剂量和期望的药物浓度，取决于预期的特殊用途，可而变化。施用的适当剂量或途径的确定完全在普通医生的能力范围内。本领域技术人员可容易地最优化包括根据本发明的嵌合蛋白的药物组合物的有效剂量和施用方案，如通过良好医疗实践和个体患者的临床状况确定的。

当体内施用本发明的嵌合蛋白时，常用剂量可以从例如约10ng/kg变化至高达100mg/kg哺乳动物体重或更多每日。在一个实施方案中，取决于施用途径，剂量可以为约1μg/kg/日至10mg/kg/日。在一个实施方案中，以约0.1至10mg/kg的剂量每日施用根据本发明的嵌合蛋白一次或两次。在一个实施方案中，以约1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2mg/kg的剂量施用根据本发明的嵌合蛋白。在一个实施方案中，剂量与天然FGF21治疗剂的剂量相同。在一个实施方案中，剂量低于天然FGF21治疗剂的剂量，但具有与更高剂量的天然FGF21治疗剂相同的作用。关于蛋白质的递送的具体剂量和方法的指导方针提供于文献中；参见，例如，美国专利No.4,657,760；5,206,344；或5,225,212，将所述美国专利通过引用全文并入本文。预期不同制剂对于不同治疗化合物和不同病症将是有效的，靶向一种器官或组织的施用例如可能必须以与针对另一种器官或组织的递送方式不同的方式来递送。

当在具有适合于需要施用本发明的嵌合蛋白的任何疾病或病症的治疗的释放特征的制剂中期望本发明的嵌合蛋白的持续释放施用时，考虑微囊化。已对人生长激素(rhGH)、干扰素-(rhIFN-)、白细胞介素-2和MN rgp120成功地进行了用于持续释放的重组蛋白的微囊化。Johnson等人，“Preparation and Characterization of Poly(D,L-lactide-co-glycolide)Microspheres for Controlled Release of Human Gro wthHormone,”Nat.Med.2:795-799(1996)；Yasuda,“Sustained Rele ase Formulation ofInterferon,”Biomed.Ther.27:1221-1223(1993)；Hora等人，“Controlled Release ofInterleukin-2from Biodegradable Microspheres,”Nat.Biotechnol.8:755-758(1990)；Cleland,“Design a nd Production of Single Immunization Vaccines UsingPolylactide P olyglycolide Microsphere Systems,”于VACCINE DESIGN:THE SUBUNI TAND ADJUVANT APPROACH 439-462(Powell和Newman，编辑。1995)；WO 97/03692；WO 96/40072；WO 96/07399和美国专利No.5,654,010，将所述文献、国际专利申请公布和美国专利通过引用全文并入本文。由于其生物相容性和宽范围的生物可降解性质，使用聚乳酸-羟乙酸共聚物(PLGA)聚合物来开发这些蛋白的持续释放制剂。PL GA的降解产物乳酸和羟乙酸可在人体内被快速清除。此外，取决于其分子量和组成，可将该聚合物的降解性从数月调整至数年。Lewis,“Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolidepoly mer,”于：BIODEGRADABLE POLYMERS AS DRUG DELIVERY SYSTEMS 1-41(M.Chasin和R.Langer编辑1990)，将其通过引用全文并入本文。

可能必需频繁地施用本发明的嵌合蛋白或其药物组合物以获得期望的治疗效应。一些患者可快速地对更高或更低的剂量作出反应，并且可发现弱得多的维持剂量是足够的。对于其它患者，根据每一个具体患者的生理需要，可能必需以每日1至4个剂量的速度进行长期治疗。对于其它患者，必需开出每日不超过1或2个剂量。

在一些实施方案中，将本发明的嵌合蛋白或其药物组合物以治疗有效量与治疗有效量的第二试剂组合施用。在一个实施方案中，将本发明的嵌合蛋白或其药物组合物与第二试剂结合施用，即，各自的施用期为单一施用方案的部分。在一个实施方案中，同时施用本发明的嵌合蛋白或其药物组合物和第二试剂，即各自的施用期彼此重叠。在一个实施方案中，不同时施用本发明的嵌合蛋白或其药物组合物和第二试剂，即各自施用期彼此不重叠。在一个实施方案中，相继施用本发明的嵌合蛋白或其药物组合物和第二试剂，即，在施用第二试剂之前和/或之后施用本发明的嵌合蛋白或其药物组合物。在一个实施方案中，将本发明的嵌合蛋白或其药物组合物和第二试剂作为分开的组合物同时施用。在一个实施方案中，将本发明的嵌合蛋白或其药物组合物和第二试剂作为相同组合物的部分同时施用。

在一个实施方案中，第二试剂为抗炎剂、抗纤维化剂、抗高血压剂、抗糖尿病剂、降甘油三酯剂和/或降胆固醇药例如“他汀”类的药物。在一个实施方案中，第二试剂为胰岛素。在一个实施方案中，胰岛素是速效、短效、定期作用(regular acting)、中效或长效胰岛素。在一个实施方案中，胰岛素为和/或包括Lispro、 Aspart、普通胰岛素、NPH、Lente、Ultralente、Glargine、或Detemir。在一个实施方案中，第二试剂为他汀。在一个实施方案中，他汀为和/或包括阿托伐他汀(例如，或)、西立伐他汀(例如，或)、氟伐他汀(例如，或)、洛伐他汀(例如，或)、美伐他汀、匹伐他汀(例如，或)、普伐他汀(例如，Selektine或)、瑞舒伐他汀(例如，)、辛伐他汀(例如，或)、Besylate或

在本发明的一个实施方案中，将根据本发明的嵌合蛋白或其药物组合物与抗炎剂、抗纤维化剂、抗高血压剂、抗糖尿病剂、降甘油三酯剂和/或降胆固醇剂一起施用。

本发明的另一个方面涉及产生具有增强的内分泌活性的嵌合FGF蛋白的方法。该方法包括将一个或多个修饰引入FGF蛋白，其中修饰减小FGF蛋白对肝素和/或硫酸类肝素的亲和力并将Klotho共受体结合结构域偶连于修饰FGF蛋白的C末端，由此产生具有增强的内分泌活性的嵌合FGF。

在一个实施方案中，该方法包括选择Klotho共受体结合结构域，其中Klotho共受体结合结构域被选择来靶向内分泌FGF靶组织。在一个实施方案中，Klotho共受体结合结构域被选择来使嵌合FGF蛋白回到内分泌FGF的靶组织。在一个实施方案中，Klotho共受体结合结构域被选择来靶向白脂肪组织、棕色脂肪组织、骨骼肌、胰腺和/或肝。

在一个实施方案中，Klotho共受体结合结构域包括β-Klotho共受体结合结构域。在一个实施方案中，β-Klotho共受体结合结构域包括来自FGF21的C末端部分。在一个实施方案中，来自FGF21的C末端部分包括SEQ ID NO:233的氨基酸残基168-209。在一个实施方案中，来源于FGF21的C末端部分还包括一个或多个置换，同时保持结合β-Klotho的能力。在一个实施方案中，来源于FGF21的C末端部分还包括一个或多个置换以增强其对β-Klotho的结合亲和力。在一个实施方案中，来自FGF21的C末端部分来源于哺乳动物FGF21。在一个实施方案中，来源于FGF21的C末端部分来自脊椎动物FGF21。适当的FGF21分子、其C末端部分和对其的修饰在上文中进行了描述。

在一个实施方案中，嵌合FGF蛋白对于FGFR具有比对于具有Klotho共受体结合结构域的天然内分泌FGF配体更大的结合亲和力。在一个实施方案中，嵌合FGF蛋白相较于在修饰或Klotho共受体结合结构域不存在的情况下的嵌合FGF蛋白具有更强的内分泌活性。在一个实施方案中，具有Klotho共受体结合结构域的天然内分泌FGF配体是天然FGF21。在一个实施方案中，FGFR为FGFR1c、FGFR2c或FGFR4。

在一个实施方案中，嵌合FGF蛋白具有比具有Klotho共受体结合结构域的天然内分泌FGF配体更大的稳定性。在一个实施方案中，增强稳定性包括相较于野生型蛋白或天然内分泌FGF配体，蛋白质的热稳定性的增强。在一个实施方案中，增加稳定性包括相较于野生型蛋白或天然内分泌FGF配体增加蛋白质在血液循环中的半衰期。

在一个实施方案中，方法包括将一个或多个修饰引入FGF蛋白，其中修饰改变FGF蛋白的受体结合特异性。在一个实施方案中，方法包括将一个或多个修饰引入FGF蛋白，其中修饰改变FGF蛋白的受体-结合亲和力。

在一个实施方案中，FGF来源于哺乳动物FGF。在一个实施方案中，FGF来源于脊椎动物FGF。在一个实施方案中，FGF蛋白为旁分泌FGF分子。在一个实施方案中，FGF分子为FGF1或FGF2。在一个实施方案中，FGF蛋白为对于FGF受体固有地具有比对于天然内分泌FGF配体更大的结合亲和力的FGF蛋白。在一个实施方案中，FGF蛋白为固有地具有比天然内分泌FGF配体大的热稳定性的FGF蛋白。在一个实施方案中，方法包括将一个或多个修饰引入FGF蛋白，其中修饰改变FGF蛋白的受体-结合特异性和/或受体–结合亲和力。在一个实施方案中，方法包括将一个或多个修饰引物FGF蛋白，其中修饰改变FGF蛋白的稳定性。例如，天然地结合所有7种主要FGFR的FGF1的受体-结合特异性可被改变来例如减小不利效应(例如，丝裂原活性)的任何危险。旁分泌FGF、旁分泌FGF的各部分以及对其的修饰在上文中进行了描述。

在一个实施方案中，嵌合FGF蛋白对于治疗糖尿病、肥胖症和/或代谢综合征是有效的。

产生根据本发明的嵌合蛋白的适当方法包括本领域已知的标准合成方法，如上文中描述的。

本发明的另一个方面涉及有利于成纤维细胞生长因子受体(“FGFR”)-βKlotho共受体复合物形成的方法。该方法包括提供包括βKlotho共受体和FGFR的细胞和提供嵌合FGF蛋白。嵌合FGF蛋白包括FGF21的C末端部分和旁分泌FGF的一部分，其中旁分泌FGF的所述部分被修饰来相较鱼无修饰的部分，减小针对肝素和/或硫酸类肝素的结合亲和力。该方法还包括在对于引发FGFR-βKlotho共受体复合物形成是有效的条件下将细胞与嵌合FGF蛋白接触。

旁分泌FGF的所述部分还可被修饰来改变FGF的受体-结合特异性和/或受体-结合亲和力，如上文中指出的。用于根据本发明的用途的旁分泌FGF的适当部分以及改变FGF的受体-结合特异性和/或受体-结合亲和力的修饰在上文中进行了描述。对用于根据本发明的用途的旁分泌FGF的适当修饰也在上文中进行了描述。来自FGF21的适当的C末端部分在上文中和整个本说明书中进行了描述。

在根据本发明的一个实施方案中，βKlotho为哺乳动物βKlotho。在一个实施方案中，βKlotho为人或小鼠βKlotho。在本发明的一个具体实施方案中，βKlotho为分别具有SEQID NO:347(即，GenBank登录号NP_783864，将其通过引用全文并入本文)或SEQ ID NO:348(即，GenBank登录号NP_112457，将其通过引用全文并入本文)的氨基酸序列的人或小鼠βKlotho，所述序列如下：

SEQ ID NO：347：

SEQ ID NO：348：

在本发明的一个具体实施方案中，βKlotho为由分别具有如下SEQ ID NO:349(GenBank登录号NM_175737，将其通过引用全文并入本文)和SEQ ID NO:350(GenBank登录号NM_031180，将其通过引用全文并入本文)的核苷酸序列的核苷酸序列编码的人或小鼠βKlotho：

SEQ ID NO:349(人βKlotho基因编码序列)：

SEQ ID NO:350(家鼠βKlotho基因编码序列)：

在一个实施方案中，FGFR为FGFR1c、FGFR2c或FGFR4。在本发明的一个实施方案中，FGF受体为FGFR1c受体。在一个具体实施方案中，FGFR1c受体为人FGFR1c受体(GenBank登录号NP_075598，将其通过引用全文并入本文)。在另一个实施方案中，FGF受体为FGFR2c受体。在一个具体实施方案中，FGFR2c受体为人FGFR2c受体(GenBank登录号NP_000132，将其通过引用全文并入本文)。在另一个实施方案中，FGF受体为FGFR4受体。在一个具体实施方案中，FGFR4受体为人FGFR4受体(GenBank登录号NP_002002，将其通过引用全文并入本文)。

在一个实施方案中，体外进行有利于FGFR-βKlotho共受体复合物形成的方法。在一个实施方案中，在脂肪细胞中进行所述方法。在另一个实施方案中，在骨骼肌细胞、胰腺β细胞或肝细胞中进行所述方法。

在一个实施方案中，在体内进行有利于FGFR-Klotho共受体复合物形成的方法。在一个实施方案中，在哺乳动物中进行所述方法。在一个具体实施方案中，哺乳动物为小鼠。

本发明的其它方面涉及筛选能够在病症的治疗中有利于FGFR-βKlotho复合物形成的试剂的方法。该方法包括提供包括偶连于C末端的N末端的嵌合FGF，其中N末端包括旁分泌FGF的一部分并且C末端包括FGF21的C末端部分。所述旁分泌FGF的所述部分被修饰来相较于不具有所述修饰的部分，减小针对肝素和/或硫酸类肝素的结合亲和力。该方法还包括提供二元βKlotho-FGFR复合物和提供一种或多种候选试剂。该方法还包括在这样的条件下将嵌合FGF、二元βKlotho-FGFR复合物与所述一种或多种候选试剂组合，所述条件允许在一种或多种候选试剂不存在的情况下形成嵌合FGF与二元βKlotho-FGFR复合物之间的三元复合物。该方法还包括将一种或多种候选试剂鉴定为适合用于治疗病症，所述候选试剂相较于在一种或多种候选试剂不存在的情况下的三元复合物形成，减少嵌合FGF与二元βKlotho-FGFR复合物之间的三元复合物形成。

旁分泌FGF的所述部分还可被修饰来相较于不具有所述修饰的部分，改变受体-结合特异性和/或减小受体-结合亲和力。

用于根据本发明的该方面的用途的适当嵌合蛋白在上文中和整个本申请中进行了描述。适当的旁分泌FGF以及相较于不具有所述修饰的部分减小针对肝素和/或硫酸类肝素的结合亲和力、改变受体-结合特异性和/或减小受体-结合亲和力的适当修饰也在上文中进行了描述。

在一个实施方案中，调节是嵌合FGF与一个或多个候选试剂之间对结合二元βKlotho-FGFR复合物的的竞争性相互作用。

在一个实施方案中，FGFR为FGFR1c、FGFR2c或FGFR4。

在一个实施方案中，病症选自糖尿病、肥胖症和代谢综合征。在一个实施方案中，病症为选自II型糖尿病、妊娠糖尿病或药物引起的糖尿病的糖尿病。在一个实施方案中，病症为I型糖尿病。在一个实施方案中，病症为肥胖症。在一个实施方案中，病症为代谢综合征。

在本发明的筛选方面的一个实施方案中，测试多种化合物或试剂。候选试剂可包括小分子化合物或更大的分子(例如，蛋白质或其片段)。在一个实施方案中，候选化合物为生物分子。在一个实施方案中，生物分子为蛋白质。在一个实施方案中，生物分子为肽。在一个实施方案中，候选物为肽或具有与天然FGF配体相似的结构特性的肽。在一个实施方案中，候选试剂为第二嵌合FGF分子。在一个具体实施方案中，肽为合成肽。在一个实施方案中，化合物为小有机分子。

在本发明的筛选方面的一个实施方案中，使用基于细胞的测定法进行方法。在一个实施方案中，使用基于细胞的测定进行鉴定。

在本发明的筛选方面的一个实施方案中，使用结合测定法进行方法。在一个实施方案中，结合测定法为直接结合测定法。在一个实施方案中，结合测定法为竞争性结合测定法。在一个实施方案中，调节稳定嵌合FGF分子与二元βKlotho-FGFR复合物之间的三元复合物。在一个实施方案中，将稳定与天然三元复合物比较。

在一个实施方案中，调节为变构调节或动力学调节。在一个实施方案中，将变构调节或动力学调节与天然三元复合物相比较。这样的稳定或变构或动力学调节可使用本领域已知的方法(例如，通过使用在下文中描述的的表面等离子体共振(SPR)光谱实验)来测量。

在一个实施方案中，使用表面等离子体共振光谱进行结合测定法。在一个实施方案中，使用结合测定法进行鉴定。在一个实施方案中，使用表面等离子体共振光谱进行鉴定。

在本发明的筛选方面的一个实施方案中，利用脂肪细胞进行基于细胞的测定法。在一个实施方案中，使用骨骼肌细胞进行基于细胞的测定法。在一个实施方案中，使用胰腺β细胞进行基于细胞的测定法。在一个实施方案中，使用肝细胞进行基于细胞的测定法。在一个实施方案中，葡萄糖吸收的刺激是测定读出。在一个实施方案中，葡萄糖转运蛋白1基因表达的诱导是测定读出。在一个实施方案中，产生候选化合物对葡萄糖吸收的刺激的剂量-反应曲线以测定候选化合物的效力和效率。在一个实施方案中，产生生候选化合物对葡萄糖转运蛋白1基因表达的诱导的剂量-反应曲线以测定候选化合物的效力和效率。例如，如果剂量-反应曲线相较于针对嵌合FGF蛋白获得的剂量-反应曲线向左偏移，则候选化合物具有比嵌合FGF蛋白和/或天然FGF21更大的效率。在一个实施方案中，从候选化合物的剂量-反应曲线推导出IC₅₀值来测定候选化合物的效力。比针对嵌合FGF蛋白获得的IC₅₀值更小的IC₅₀值将候选化合物鉴定为比嵌合FGF蛋白和/或天然FGF21更有效力。

在本发明的筛选方面的一个实施方案中，使用异位表达βKlotho的哺乳动物细胞进行基于细胞的测定法。在一个具体实施方案中，细胞为HEK293细胞。在一个实施方案中，FGF受体的活化为测定读出。在一个实施方案中，FGF受体底物的酪氨酸磷酸化用作FGF受体活化的读出。在一个具体实施方案中，FGF受体底物为FGF受体底物2α。在一个实施方案中，FGF信号转导的下游介质的活化用作FGF受体活化的读出(或指示剂)。在一个具体实施方案中，FGF信号转导的下游离介质为44/42丝裂原活化蛋白激酶。在一个实施方案中，FGF信号转导的下游介质为转录因子。在一个具体实施方案中，转录因子为早期生长反应1。在一个实施方案中，产生候选化合物对FGF受体的βKlotho-依赖性活化的剂量-反应曲线以测定候选化合物的效力和效率。例如，如果剂量-反应曲线相较于针对嵌合FGF蛋白获得的剂量-反应曲线向左偏移，则候选化合物具有比嵌合FGF蛋白和/或天然FGF21更大的效力。在一个实施方案中，从候选化合物的剂量-反应曲线推导出IC₅₀值来测定候选化合物的效力。比针对嵌合FGF蛋白获得的IC₅₀值更小的IC₅₀值将候选化合物鉴定为比嵌合FGF蛋白和/或天然FGF21更有效力。

在本发明的筛选方面的一个实施方案中，使用嵌合FGF蛋白作为偶连于生物传感器芯片的配体进行基于表面等离子体共振光谱的测定法。在一个实施方案中，将βKlotho胞外结构域与递增浓度的候选化合物的混合物在包括嵌合FGF蛋白的生物传感器芯片上方通过。在一个实施方案中，将FGFR配体-结合结构域与βKlotho胞外结构域的二元复合物和递增浓度的候选化合物的混合物在包括嵌合FGF蛋白的生物传感器芯片上方通过。在一个具体实施方案中，FGFR配体-结合结构域为FGFR1c配体-结合结构域。在一个实施方案中，绘制候选化合物的抑制-结合曲线以测定候选化合物的效力。例如，如果抑制-结合曲线相较于针对嵌合FGF蛋白获得的抑制-结合曲线向左偏移，则候选化合物具有比嵌合FGF蛋白和/或天然FGF21更大的效力。在一个实施方案中，从候选化合物的抑制-结合曲线推导出IC₅₀值，以测定候选化合物的效力。比针对包括嵌合FGF蛋白获得的IC₅₀值更小的IC₅₀值将候选化合物鉴定为比嵌合FGF蛋白和/或天然FGF21更具效力。在一个实施方案中，测定候选化合物的抑制常数K_i以测定候选化合物的效力。比针对天然FGF21获得的K_i值更小的K_i值将候选化合物鉴定为比嵌合FGF蛋白和/或天然FGF21更具效力。

在本发明的筛选方面的一个实施方案中，体内进行方法。在一个实施方案中，在哺乳动物中进行方法。在一个具体实施方案中，哺乳动物为小鼠。在一个实施方案中，哺乳动物具有肥胖症、糖尿病或相关代谢综合征。在一个实施方案中，候选化合物增强胰岛素的降血糖作用的能力用作FGF21-样代谢活性的读出。这包括在胰岛素注射之前使哺乳动物禁食一段时间和测量空腹血糖水平。随后单独地用胰岛素注射哺乳动物或用胰岛素+候选化合物共注射哺乳动物。注射后在几个时间点测量血糖水平。如果候选化合物使胰岛素的降血糖作用增强至比嵌合FGF蛋白和/或天然FGF21的所述增强作用更大的程度，则候选化合物显示增强的效率。同样地，如果候选化合物使胰岛素的降血糖作用增强至与嵌合FGF蛋白和/或天然FGF21的所述增强作用相似的程度，但使用的剂量低于嵌合FGF蛋白和/或天然FGF21的剂量和/或持续比嵌合FGF蛋白和/或天然FGF21更长的时间，则候选化合物具有增强的激动性质。在一个实施方案中，候选化合物在具有糖尿病、肥胖症或相关代谢综合征的哺乳动物的降血糖作用的能力用作FGF21-样代谢活性的读出。这包括用候选化合物注射患有糖尿病、肥胖症或相关代谢综合征的哺乳动物。在注射之前和在注射后几个时间点上测量血糖水平。如果候选化合物具有比嵌合FGF蛋白和/或天然FGF21的降血糖作用更大的降血糖作用，则候选化合物显示增强的效率。同样地，如果候选化合物显示与嵌合FGF蛋白和/或天然FGF21的降血糖作用相似的降血糖作用，但使用的剂量比嵌合FGF蛋白和/或天然FGF21的剂量低和/或持续的时间比嵌合FGF蛋白和/或天然FGF21长，则候选化合物具有增强的激动性质。

实施例

实施例1-FGF、FGFR和Klotho蛋白的纯化

从细菌内含体体外再折叠人FGF19(SEQ ID NO:337)(R23至K216)、人FGF21(SEQID NO:233)(H29至S209；图5A)和人FGF23(SEQ ID NO:351)(Y25至I251；图5A)的N末端六组氨酸标记的成熟形式，通过公开的方案(Ibrahimi等人，Hum.Mol.Genet.13:2313-2324(2004)；Plotnikov等人，Cell 101:413-424(2000)，将所述文献通过引用全文并入本文)纯化其。人FGF23的氨基酸序列(SEQ ID NO:351)(GenBank登录号AAG09917，将其通过引用全文并入本文)如下：

通过与野生型蛋白相似的方案从细菌内含体纯化FGF19(K149A)和FGF23(R140A/R143A)的HS结合位点突变体。为了使FGF23野生型和突变型蛋白的蛋白水解降至最低，用谷氨酰胺替代蛋白水解切割位点¹⁷⁶RXXR¹⁷⁹的精氨酸残基176和179，正如其在磷酸消瘦症“常染色体显性遗传性低磷性佝偻病”(ADHR)中发生的一样(White等人，Nat.Genet.26:345-348(2000)；White等人，Kidney Int.60:2079-2086(2001)，将所述文献通过引用全文并入本文)。通过公开的方案(P lotnikov等人，Cell 101:413-424(2000)；Olsen等人，J.Biol.Chem.278:34226-34236(2003)，将所述文献通过引用全文并入本文)纯化人FGF1(SEQ ID NO:1)(M1至D155；图6)、N末端截短的人FGF1(K25至D155，称为FGF1^ΔNT；图6)、人FGF2(SEQ ID NO:121)(M1至S155；图5A)和人FGF同源因子1B(FHF1B；M1至T181)。

利用与针对天然FGF2使用的方案(Plotnikov等人，Cell 101:413-424(2000)，将其通过引用全文并入本文)相同的方安纯化由FGF2的核心结构域(M1至M151)和FGF21(P168至S209)或FGF23(R161至I251)的C末端区域组成的嵌合物(分别地称为FGF2^WT核心-FGF21^C-尾和F GF2^WT核心-FGF23^C-尾；图5A)。利用离子交换层析和大小排阻层析从可溶性细菌细胞裂解物级分纯化在FGF2核心的HS结合位点中包括3个突变(K128D/R129Q/K134V)的类似嵌合物(分别称为FGF2^ΔHBS核心-F GF21^C-尾和FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾，图5A)。为了使包括FGF23的R161至I251的C末端序列的嵌合物的蛋白水解降至最低，利用谷氨酰胺替代位于该序列内的蛋白水解切割位点¹⁷⁶RXXR¹⁷⁹的精氨酸残基176和179，正如其在ADHR中发生的一样(White等人，Nat.Genet.26:345-348(2000)；White等人，Kidney Int.60:2079-2086(2001)，将其通过引用全文并入本文)。此外，为了防止二硫化物介导的FGF2与嵌合FGF2蛋白的二聚化，将半胱氨酸残基78和96突变成丝氨酸。利用离子交换层析和大小排阻层析从可溶性细菌细胞裂解物级分纯化FGF1的HS结合位点突变体(K127D/K128Q/K133V)(称为FGF1^{ΔHB S核心}；图6)和由FGF1的HS结合位点突变体的核心结构域(M1至L150，K127D/K128Q/K133V)和FGF19(L169至K216)或FGF21(P168至S209)的C末端区域组成的嵌合物(分别称为FGF1^ΔHBS核心-FGF19^C-尾和FGF1^ΔHBS核心-FGF21^C-尾；图6)。通过公开的方案(Goetz等人，Proc.N at’l.Acad.Sci.U.S.A107:407-412(2010)，将其通过引用全文并入本文)纯化FGF23的N末端六组氨酸标记的C末端尾肽(S180至I251，称为FGF23^C-尾)。在体外从细菌内含体再折叠人FGFR1c的配体-结合结构域(D142至R365)，利用公开的方案(Ibrahimi等人，Hum.Mol.Genet.13:2313-2324(2004)；Plotnikov等人，Cell 101:413-424(2000)，将所述文献通过引用全文并入本文)进行纯化。将鼠αKlotho的胞外结构域(A35至K982)和鼠βKlotho的胞外结构域(F53至L995)作为与C末端FLAG标记的融合蛋白在HEK293细胞中表达(Kurosu等人，J.Biol.Chem.281:6120-6123(2006)；Kurosu等人，Science 309:1829-1833(2005)，将其通过引用全文并入本文)。利用公开的方案(Go etz等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A 107:407-412(2010)，将其通过引用全文并入本文)制备FGFR1c配体-结合结构域与αKlotho胞外结构域的二元复合物(称为αKlotho-FGFR1c复合物)。以与αKlotho-F GFR1c复合物相同的方式制备FGFR1c配体-结合结构域与βKlotho胞外结构域的二元复合物(称为βKlotho-FGFR1c复合物)。

实施例2-利用表面等离子体共振光谱分析FGF-肝素与FGF-FGFR-α/βKlotho的相互作用

在Biacore 2000仪(Biacore AB)上进行表面等离子体共振(SPR)实验，在25℃于HBS-EP缓冲液(10mM HEPES-NaOH,pH 7.4,150mM NaCl,3mM EDTA,0.005％(v/v)聚山梨醇20)中研究相互作用。为了研究内分泌FGF-肝素相互作用，通过将生物素化肝素(Sigma-Aldrich)固定在研究级链霉抗生物素芯片(Biacore AB)的流道上来制备肝素芯片。偶连密度为～5fmol mm^-2的流道。为了测量嵌合FGF2蛋白对肝素的结合，将生物素化肝素以低至约1/4的密度(如基于针对FGF1获得的结合反应判断的)偶连至链霉抗生物素芯片。为了研究FGF-FGFR-α/βKlotho相互作用，通过将在FGF蛋白通过它们的游离氨基共价偶连在研究级CM5芯片(Biacore AB)的流道上来制备FGF芯片。在芯片上方以50μl min^-1的流速注射蛋白质，在每一次蛋白质注射(分别地180和300s)结束时，将HBS-EP缓冲液(50μl min^-1)流过芯片上方以监控解离，进行180或240s。通过注射肝素50μl的10mM醋酸钠，pH 4.5中的2.0MNaCl再生芯片表面。对于FGF芯片，通过注射2.0M的10mM磷酸钠/钾，pH 6.5中的NaCl实现再生。为了在其中将FGF配体固定在芯片上的实验中控制非特异性结合，将FHF1B(其与FGF共有结构相似性但不显示任何FGFR结合(Olsen等人，J.Biol.Chem.278:34226-34236(2003)，将其通过引用全文并入本文))偶连于芯片的控制流道(～15-30fmol mm^-2)。在其中将肝素固定芯片上的实验中，使对照流道空白。利用BiaEvaluation软件(Biacore AB)处理数据。对于肝素芯片上方的每一次蛋白质注射，从针对肝素流道记录的反应扣除来自对照流道的非特异性反应。类似地，对于FGF芯片上方的每一次蛋白质注射，从针对FGF流道记录的反应扣除来自FHF1B对照流道的非特异性反应。当可能时，从拟合的饱和结合曲线计算平衡解离常数(K_Ds)。基于残留的分布(等于和接近0)和χ²(<10％的R_max)将拟合结合曲线调整为精确。

为了检查K149A突变是否消除FGF19的残留肝素结合，将递增浓度的野生型FGF19通过肝素芯片上方。此后，以针对野生型配体测试的最高浓度在肝素芯片上方注射FGF19^K149A突变体。以相同的方式检查FGF23的HS结合位点中的R140A/R143A双突变对残FGF23的残留肝素结合的影响，同样地检查FGF19中的HS结合位点突变的作用。

为了验证FGF2核心结构域的HS结合位点中的K128D/R129Q/K134V三重突变减小FGF2核心的肝素-结合亲和力，将递增浓度的F GF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾和FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾通过肝素芯片上方。作为对照，研究FGF2^WT核心-FGF21^C-尾和FGF2^WT核心-FGF23^C-尾对肝素的结合。

为了检查FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾嵌合物是否可与FGF23竞争对αKlotho-FGFR1复合物的结合，将FGF23固定在芯片上(～16fmol mm^-2的流道)。将递增浓度的FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾与固定的αKlotho-FG FR1c复合物于HBS-EP缓冲液中混合，在FGF23芯片上方注射该混合物。作为对照，利用FGF23或FGF2作为竞争剂在溶液中进行结合竞争。作为另外的特异性对照，研究FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾嵌合物与FGF21竞争对αKlotho-FGFR1c复合物的结合的。将αKlotho-FGF R1c复合物以1:10的摩尔比与FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾或FGF23混合，在含固定FGF21的芯片(～12fmol mm^-2的流道)上方注射该混合物。

为了测试FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物是否可与FGF21竞争对βKlotho-FGFR1c复合物的结合，将递增浓度的FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾与固定浓度的βKlotho-FGFR1c复合物于HBS-EP缓冲液中混合，将混合物通过含固定FGF21的芯片上方(～19fmol mm^-2的流道)。作为对照，利用FGF21或FGF2作为竞争剂在溶液中进行结合竞争。作为另外的特异性对照，研究FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物与FGF23对与αKlotho-FGFR1c复合物的结合的竞争。将αKlotho-FGFR1c复合物以1:10的摩尔比与FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾或FGF21混合，在含固定FGF23的芯片上方注射混合物(～12fmol mm^-2的流道)。

为了测量FGFR1c对3种内分泌FGF的每一种的结合，在含固定FGF19、FGF21和FGF23的芯片上方注射递增浓度的FGFR1c配体-结合结构域(～30fmol mm^-2的流道)。作为对照，研究FGFR1c对固定在芯片上的FGF2的结合。作为另外的对照，测量αKlotho-FGFR1c复合物对FGF23的结合和FGFR1c对FGF23的C末端尾肽的结合。

实施例3-肝细胞瘤和上皮细胞系中的FRS2α和44/42MAP激酶的磷酸化的分析

为了检查FGF19^K149A和FGF23^R140A/R143A突变体是否可以以α/βKl otho-依赖性方式活化FGFR，FGFR底物2α(FRS2α)的酪氨酸磷酸化和MAP激酶级联的下游活化的诱导用作FGFR活化的读出。将H4II E大鼠肝细胞瘤细胞系的亚汇合细胞(其内源地表达βKlotho(Kurosu等人，J.Biol.Chem.282:26687-26695(2007)，将其通过引用全文并入本文))血清饥饿16h，随后用FGF19^K149A突变体或野生型FGF19(0.2ng ml^-1至2.0μg ml^-1)刺激10min。类似地，用FGF23^R140A/R143A突变体或野生型FGF23(0.1至100ng ml^-1)处理异位表达鼠αKlotho的跨膜同种型的HEK293细胞系的亚汇合细胞(Kurosu等人，J.Biol.Chem.281:6120-6123(2006)，将其通过引用全文并入本文)。刺激后，裂解细胞(Kurosu等人，Science 309:1829-1833(2005)，将其通过引用全文并入本文)，将细胞蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，随后转移至硝酸纤维素膜。用针对磷酸化FRS2α、磷酸化44/42MAP激酶、总(磷酸化和非磷酸化)44/42MAP激酶和αKlotho的抗体探测蛋白质印迹。除抗-αKlotho抗体(KM2119)(Kato等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.267:597-602(2000)，将其通过引用全文并入本文)外，所有抗体来自Cell Signaling Technology。

实施例4-上皮细胞系中Egr1蛋白表达的分析

为了检查FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾和FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾嵌合物是否可以以HS依赖性方式活化FGFR，将转录因子早期生长反应1(Egr1)(已知的FGF信号转导的下游介质)的蛋白质表达的诱导用作FGFR活化的读出。将HEK293细胞血清饥饿过夜，用FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾或FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾(0.1和0.3nM)刺激90min。利用FGF2^WT核心-FGF21^C-尾、FGF2^WT核心-FGF23^C-尾、FGF21和FGF23的细胞刺激用作对照。为了测试FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物是否可以以βKlotho-依赖性方式活化FGFR，将利用鼠βKlotho转染的HEK293细胞血清饥饿过夜，随后用FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾或FGF21(3至300ng ml^-1)刺激90min。刺激后，裂解细胞(Kurosu等人，Science309:1829-1833(2005)，将其通过引用全文并入本文)，将细胞蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，随后转移至硝酸纤维素膜。用针对Egr1和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的抗体探测蛋白质印迹。抗-Egr1抗体来自Cell Signaling Technology，抗-GAPDH抗体来自Abcam。

实施例5-鼠肝组织中CYP7A1和CYP8B1mRNA表达的分析

为了在体内检查FGF19^K149A突变体的代谢活性，将6至8周龄C57BL/6小鼠禁食过夜，随后腹膜内给予单剂(1mg kg体重^-1)FGF19^K149A或FGF19作为对照。注射后6h，处死小鼠，切取肝组织并冷冻。从肝组织分离总RNA，使用先前所述的定量实时RT-PCR(Inagaki等人，Cell Metab.2:217-225(2005)；Kim等人，J.Lipid Res.48:2664-2672(2007)，将其通过引用全文并入本文)测量胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)和固醇12α-羟化酶(CYP8B1)的mRNA水平。Dallas的The University of Texas Southwestern Medical Center的机构动物管理及使用委员会已批准该实验。

实施例6-小鼠中血清磷酸盐的测量

在正常小鼠和Fgf23敲除小鼠中检查FGF23^R140A/R143A突变体的代谢活性。给4或5周龄C57BL/6小鼠腹膜内施用单剂(0.29mg kg体重^-1)FGF23^R140A/R143A或FGF23作为对照。在注射之前和注射后8h，从颊囊抽取血液，以3,000xg离心10min以获得血清。使用PhosphorusLiqui-UV测试(Stanbio Laboratory)测量血清中的磷酸盐浓度。以8h间隔给6至8周龄Fgf23敲除小鼠(Sitara等人，Matrix Biol.23:421-432(2004)，将其通过引用全文并入本文)(56)注射2次FGF23^R140A/R143A或FGF23(各自0.71mg kg体重^-1)，在第一次注射前和第二次注射后8h采集血液样品以用于磷酸盐分析。

为了测试FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾嵌合物是否显示FGF23-样代谢活性，给5至6周龄C57BL/6小鼠单次注射FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾(0.21mg kg体重^-1)。作为对照，用FGF2^WT核心-FGF23^C-尾或FGF23注射小鼠。注射前和注射后8h，采集血液样品以用于测量血清磷酸盐。为了确认αKlotho是FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾嵌合物的代谢活性所需的，用FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾或FGF23(0.51mg kg体重^-1)注射7-8周龄αKlotho敲除小鼠(Lexicon Genetics)一次作为对照。在注射前和注射后8h，采集血液样品以用地磷酸盐分析。哈弗大学动物管理及研究委员会已批准所有实验。

实施例7-鼠肾组织中CYP27B1mRNA表达的分析

FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾嵌合物减少25-羟基维生素D₃1α-羟化酶(CYP27B1)的肾表达的能力用作FGF23-样代谢活性的另一个读出。在蛋白质注射后8h，处死用FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾、FGF2^WT核心-FG F23^C-尾或FGF23注射的C57BL/6小鼠，切取肾组织，将其冷冻。使用先前描述的实时定量PCR(Nakatani等人，FASEB J.23:3702-3711(2009)；Ohnishi等人，Kidney Int.75:1166-1172(2009)，将所述文献通过引用全文并入本文)测量总的肾组织RNA中的CYP27B1mRNA水平。哈弗大学动物管理及研究委员会已批准所有实验。

实施例8-小鼠的胰岛素耐受性测试

FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物增强胰岛素的降血糖作用的能力用作FGF21-样代谢活性的读出(Ohnishi等人，FASEB J.25:2031-2039(2011)，将其通过引用全文并入本文)。使8至12周龄C57BL/6小鼠保持正常饮食。在胰岛素耐受性测试的当天，将小鼠禁食4h，随后从颊囊放血以测量空腹血糖水平。随后，给小鼠腹膜内施用单独的胰岛素(0.5个单位kg体重^-1)或胰岛素(0.5个单位kg体重^-1)+FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物(0.3mg kg体重^-1)。作为对照，用胰岛素+FGF21共注射小鼠。在注射后指定的时间点(图7G)上，从尾静脉抽取血液。使用Bayer血糖测试条(Bayer Corp.)测定血液样品的葡萄糖浓度。哈弗大学动物管理及研究委员会已批准所述实验。

实施例9-ob/ob小鼠中的血糖分析

用FGF1^ΔNT、FGF1^ΔHBS或FGF1^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物皮下注射ob/ob小鼠。天然FGF1或天然FGF21的注射用作对照。以0.5mg蛋白/kg体重的单次推注方式进行注射。基于在该剂量上看到天然FGF1的降血糖作用的最大功效选择该剂量。在蛋白质注射之前和注射之后指定的时间点上(图9A-9C)，使用OneTouch Ultra血糖测计仪(Lifescan)测量血糖浓度。LaJolla的Salk Institute for Biological Sciences的机构动物管理及使用委员会已批准该实验。

实施例10-统计分析

数据表达为平均值±SEM。适当时将学生氏t检验或方差分析(ANOVA)用于进行统计比较。P<0.05的值被认为是显著的。

实施例11-HS不是FGF19和FGF23的代谢活性所必需的

为了工程化内分泌FGF以避免HS结合，将FGF19的晶体结构(PDB ID:2P23；(Goetz等人，Mol.Cell Biol.27:3417-3428(2007)，将其通过引用全文并入本文)与结合于肝素己糖的FGF2的晶体结构相比较(PDB ID:1FQ9；(Schlessinger等人，Mol.Cell 6:743-750(2000)，将其通过引用全文并入本文))。该分析显示FGF19的暴露于溶剂的残基K149、Q150、Q152和R157位于该配体的对应HS结合位点上，从而可解释FGF19的残留HS结合(图1A、1B和2)。同样地，FGF23的晶体结构(PDB ID:2P39；(Goetz等人，Mol.Cell Biol.27:3417-3428(2007)，将其通过引用全文并入本文)(29))与肝素结合的FGF2的晶体结构(PDB ID:1FQ9；(Schlessinger等人，Mol.Cell6:743-750(2000)，将其通过引用全文并入本文))的比较分析指出R48、N49、R140和R143为介志该配体的残HS结合的候选者(图1A、1C和2)。与结构预测一致，用丙氨酸替代FGF19中单独的K149和用丙氨酸组合替代FGF23中的R140和R143足以消除这些配体的残留HS结合(图3B–3G)。

为了测试敲除FGF19的残留HS结合对该配体介导的信号转导的影响，用FGF19^K149A突变体或野生型FGF19刺激H4IIE肝细胞瘤细胞。H4IIE细胞内源地表达FGFR4和βKlotho(Kurosu等人，J.Biol.Chem.282:26687-26695(2007)，将其通过引用全文并入本文)，分别为FGF19的相关受体和共受体。FGF19^K149A突变体在诱导FRS2α的酪氨酸磷酸化和MAP激酶级联的下游离活化中与野生型FGF19一样有效(图4A)。这些数据显示残留HS结合的消除对FGF19在培养细胞中发信号的能力没有影响。为测试对于FGF23信号转导是否也是如此，用αKlotho(FGF23的共受体)的跨膜同种型转染HEK293细胞，该细胞天然地表达FGF23的3个相关受体中的2个，即FGFR1c和FGFR3c(Kurosu等人，J.Biol.Chem.281:6120-6123(2006)，将其通过引用全文并入本文)。用FGF23^R140A/R143A双突变体或野生型FGF23处理这些细胞。FGF23^R140A/R143A突变体在诱导FRS2α的磷酸化和MAP激酶级联的下游活化中具有与野生型FGF23相同的能力(图4B)。这些数据显示与FGF19类似，FGF23不需要结合HS来在培养细胞中活化FGFR。

为了在细胞中证实发现，在体内比较野生型与突变配体的代谢活性。用FGF19^K149A突变体或野生型FGF19注射小鼠，分析CYP7A1和CYP8B1的肝基因表达，所述CYP7A1和CYP8B1为主要胆汁酸生物合成途径中的关键酶(Russell,D.W.,Annu.Rev.Biochem.72:137-174(2003)，将其通过引用全文并入本文)。与野生型FGF19一样，FGF19^K149A突变体显著降低CYP7A1和CYP8B1mRNA水平(图4C)，从而证明残留HS结合的敲除不影响FGF19的代谢活性。为了检查残留HS结合对于FGF23的代谢活性是否也不是必需的，用FGF23^R140A/R143A突变体或野生型FGF23注射小鼠，测量血清磷酸盐浓度。FGF23^R140A/R143A突变体与野生型FGF23一样有效地减少血清磷酸盐(图4D)。此外，当注射入Fgf23敲除小鼠时，FGF23^R140A/R143A突变体显示与野生型FGF23一样多的降磷酸盐活性(图4D)。这些数据显示，与在FGF19的情况下一样，残留HS结合的消除不影响FGF23的代谢活性，从而得出结论：HS不是内分泌FGF信号转导单位的组分(图1D)。

实施例12-旁分泌FGF至内分泌配体的转化确认HS不是内分泌FGF的代谢活性所必需的

如果HS不是内分泌FGF的代谢活性所必需的，那么通过消除旁分泌FGF的HS-结合亲和力和用其C末端尾替代包括Klotho共受体结合位点的内分泌FGF的C末端尾来将旁分泌FGF转化成内分泌FGF是可行的。减小HS-结合亲和力将允许配体自由地扩散和进入血液循环，同时附上内分泌FGF的C末端尾将使配体回归至其靶组织。FGF2(典型的旁分泌FGF)被选择用于分别转化成FGF23样和FGF21样配体。FGF2被选择作为该蛋白工程实践的旁分泌配体，因为其优先结合FGFR1的“c”同种型，分别介导FGF23(Gattineni等人，Am.J.Physiol.Renal Physiol.297:F282-291(2009)；Liu等人，J.Am.Soc.Nephrol.19:2342-2350(2008)，将其通过引用全文并入本文)和FGF21(Kurosu等人，J.Biol.Chem.282:26687-26695(2007)，将其通过引用全文并入本文)的代谢活性的主要受体的主要受体。在肝素结合的FGF2的晶体结构(PDB ID:1FQ9；(Schlessinger等人，Mol.Cell6:743-750(2000)，将其通过引用全文并入本文))中，K128、R129和K134介导大部分与肝素的氢键，从而预测这些残基的突变引起FGF2的HS-结合亲和力的显著减小(图1A、2和5A)。因此，突变这3个残基，随后用FGF23的C末端尾(R161至I251)或FGF21的C末端尾(P168至S209)替代突变的FGF2的短C末端尾(图5A)。所得的嵌合物称为FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾和FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾(图5A)。为了证明HS-结合亲和力的减小是将FGF2转化成内分泌配体所需的，产生其中FGF2核心的HS结合位点保留完整的两个对照嵌合物(FGF2^WT核心-FGF23^C-尾和FGF2^WT核心-FGF21^C-尾；图5A)。

与结构预测一致，FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾和FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾显示相较于具有完整HS结合位点的对应对照嵌合物较弱的针对HS的结合亲和力(图5B–5E)。由于HS是旁分泌FGF信号转导中的辅因子，因此预测FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾和FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物丧失以HS依赖性方式活化FGFR1c的能力。为了测试该预测，用F GF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾或FGF2^WT核心-FGF23^C-尾刺内源地表达FGFR1c的HEK293细胞。转录因子Egr1(已知的FGF信号转导的下游介质)的蛋白表达的诱导用作FGFR活化的读出。如图5G中显示的，FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾嵌合物，与天然FGF23一样，在于FGF2^WT核心-FGF23^C-尾嵌合物引发接近最大效应时所处的浓度上诱导Egr1表达中是有效的。对于FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物获得相同观察(图5F)。这些数据显示，与天然FGF23和FGF21类似，FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾和FG F2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物丧失以HS依赖性的旁分泌方式活化FGFR的能力。

为了确定FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾和FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物是否获得以Klotho共受体依赖性内分泌方式发信号的能力，首先分析这些嵌合物是否可与FGFR1c和Klotho共受体形成三元复合物。为此目的，使用基于SPR的结合竞争测定。将FGF23固定在SPR生物传感器芯片上，将固定浓度的二元αKlotho-FGFR1c复合物与递增浓度的FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾嵌合物的混合物通过芯片上方。FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾以剂量依赖性方式与固定FGF23竞争对αKlotho-FGFR1c复合物的结合(图7A)，从而证明嵌合物，与天然FGF23一样(图7B)，能够与FGFR1c和αKlotho形成三元复合物。为了测试FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物是否能够同样地与FGFR1c和βKlotho形成三元复合物，将FGF21偶连于SPR生物传感器芯片，将二元βKlotho-FGFR1c复合物与FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾的混合物通过芯片上方。FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾有效地与固定FGF21竞争对βKlotho-FGFR1c复合物的结合(图8A)，从而证明嵌合物，与天然FGF21一样(图8B)，能够与FGFR1c和βKlotho形成三元复合物。值得注意地，天然FGF2不能与FGF23竞争对αKlotho-FGFR1c复合物的结合(图7C)以及不能与FGF21竞争对βKlotho-FGFR1c复合物的结合(图8C)，因为其不存在Klotho共受体结合结构域。为了进一步确认FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾嵌合物对于αKlotho-FGFR1c复合物的结合特异性，将FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾和βKlotho-FGFR1c复合物以10:1的摩尔比混合，在包括固定FGF21的芯片上方注射混合物。FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾，与天然FGF23一样，不能与FGF21竞争对βKlotho-FGFR1c复合物的结合(图7D和7E)。类似地，FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物，与天然FGF21一样，不能与FGF23竞争对αKlotho-FGFR1c复合物的结合(图8D和8E)。对于FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物，我们研究其在细胞中是否能够以βKlotho依赖性的方式活化FGFR1c。用βKlotho转染HEK293细胞，随后用FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾或FGF21刺激。与天然FGF21类似，FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物在HEK293-βKlotho细胞中诱导Egr1蛋白表达(图8F)，这表明嵌合物能够在βKlotho存在的情况下活化FGFR1c。

为了提供配体转化的明确证据，测试嵌合物的体内代谢活性。具体地，为了确定FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾嵌合物是否显示FGF23-样代谢活性，检查其降低血清磷酸盐和减少CYP27B1(其催化维生素D至其生物活性形式的转化)的肾基因表达的能力(Shimada等人，“Cloning a nd Characterization of FGF23as a Causative Factor of Tumor-Induced Osteomalacia,”Proc Natl Acad Sci USA 98:6500-6505(2001)；Sai to等人，“HumanFibroblast Growth Factor-23Mutants Suppress Na⁺-Dependent Phosphate Co-Transport Activity and 1alpha,25-Dihydroxy vitamin D3Production,”J Biol Chem278:2206-2211(2003)；Shimad a等人，“Targeted Ablation of FGF23Demonstrates anEssential Phys iological Role of FGF23in Phosphate and Vitamin D Metabolism,”J Clin Invest 113:561-568(2004)，将所述文献通过引用全文并入本文)。用FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾或对照注射小鼠，测量FGF23或FGF2^WT核心-FGF23^C-尾以及血清磷酸盐浓度和肾CYP27B1mRNA水平。与天然FGF23类似，FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾嵌合物引起野生型小鼠的血清磷酸盐降低(图7F)。嵌合物还诱导CYP27B1mRNA水平的显著降低，正好与天然FGF23配体一样(图7G)。这些数据显示FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾嵌合物用作FGF23样激素。重要地，FGF2^WT核心-FGF23^C-尾嵌合物不能降低磷酸盐或CYP27B1mRNA水平(图7F和7G)。这并不出人意料，因为归因于其对于HS的高亲和力，该嵌合物应当被捕获在注射部位附近，从而不能进入血液循环。此外，这些数据显示添加Klotho共受体结合位点不足以将旁分泌FGF转化成内分泌配体。为了确认FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾嵌合物的代谢活性依赖于αKlotho(Ku rosu等人，“Regulationof Fibroblast Growth Factor-23Signaling by Klotho,”J Biol Chem 281(10):6120-6123(2006)；Urakawa等人，“Klo tho Converts Canonical FGF Receptor into aSpecific Receptor for FGF23,”Nature 444(7120):770-774(2006)；Nakatani等人，“Inactivatio n of Klotho Function Induces Hyperphosphatemia Even in Presenceof High Serum Fibroblast Growth Factor 23Levels in a Genetically EngineeredHypophosphatemic(Hyp)Mouse Model,”FASEB J 23:3702-3711(2009)，将所述文献通过引用全文并入本文)，用FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾或FGF23注射敲除αKlotho小鼠作为对照，测量磷酸盐的血清浓度。如图7F中显示的，FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾不能降低血清磷酸盐，从而证明嵌合物，与天然FGF23一样(图7F)，需要αKlotho来发挥代谢活性。

为了确定FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物是否显示FGF21-样代谢活性，检查其增强胰岛素的降血糖作用的能力(Ohnishi等人，FASEB J.25:2031-2039(2011)，将其通过引用全文并入本文)。用胰岛素+FG F2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾、胰岛素+FGF21或单独的胰岛素注射小鼠，监控血糖浓度直至注射后1小时。与FGF21类似，FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物增强胰岛素的降血糖作用(图8G)，从而证明嵌合物用作FGF21样激素。

为了进一步证实FGF配体转化的概念，使用FGF1作为旁分泌F GF工程化另一种FGF21样配体，在糖尿病和肥胖症的小鼠模型中体内测试工程蛋白的代谢活性。除了用作另外的概念验证以外，FGF1用于该特定配体转化的用途也非常吸引人，因为FGF1自身在葡萄糖代谢中起着基本作用(Jonker等人，“A PPARγ-FGF1Axis is Required for AdaptiveAdipose Remodelling and Metabolic Homeostasis,”Nat ure 485:391-394(2012)，将其通过引用全文并入本文)。值得注意地，与FGF21类似，FGF1在食后于性腺的白色脂肪组织中通过细胞核激素受体PPARγ(过氧化物酶体增殖子活化的受体-γ)(Jonker等人，“A P PARγ-FGF1Axis is Required for Adaptive Adipose Remodelling an d MetabolicHomeostasis,”Nature 485:391-394(2012)；Dutchak等人，“Fibroblast Growth Factor-21Regulates PPARγActivity and the Ant idiabetic Actions ofThiazolidinediones,”Cell 148:556-567(2012)，将所述文献通过引用全文并入本文)来诱导。FGF1是重塑脂肪组织以适应养分可利用性的波动所需要的(Jonker等人，“A PPARγ-FGF1Ax is is Required for Adaptive Adipose Remodelling and Metabolic Homeostasis,”Nature 485:391-394(2012)，将其通过引用全文并入本文)，该过程受FGF21影响(Hotta等人，“Fibroblast Growth Factor 21Regu lates Lipolysis in WhiteAdipose Tissue But is Not Required for K etogenesis and TriglycerideClearance in Liver,”Endocrinology 150:4625-4633(2009)；Dutchak等人，“FibroblastGrowth Factor-21Regul ates PPARγActivity and the Antidiabetic Actions ofThiazolidinedio nes,”Cell 148:556-567(2012)，将所述通过引用全文并入本文)。作为正反馈环的部分，FGF21在脂细胞中刺激PPARγ活性(Dutchak等人，“Fibroblast GrowthFactor-21Regulates PPARγActivity and the Ant idiabetic Actions ofThiazolidinediones,”Cell 148:556-567(2012)，将其通过引用全文并入本文)，从而产生FGF21通过PPARγ在脂肪组织中调控FGF1信号转导的吸引人的可能性。以与FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物相同的方式产生FGF1^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物(图5和6)。具体地，将对应于在肝素结合的FGF2(PDB ID:1FQ9；(Schlessinger等人，Mol.Cell 6:743-750(2000)，将其通过引用全文并入本文))的晶体结构中鉴定的至关重要的HS结合残基的FGF1的K127、K128和K133突变，随后用FGF21的C末端尾(P168至S209)替代突变的FGF1的短C末端尾(图6)。将具有HS结合位点突变的全长FGF1蛋白用作对照(图6)。与结构预测一致，该蛋白显示相较于野生型FGF1较弱的针对HS的结合亲和力，如通过如下事实证明的：与野生型配体不同，突变蛋白不结合肝素琼脂糖柱。FGF1^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物的皮下推注引发ob/ob小鼠的降血糖作用(图9C)，从而证明嵌合物具有代谢活性。所述作用具有与针对天然FGF1观察到的作用相似量级(图9C)，所述天然FGF1本身在ob/ob小鼠中具有比天然FGF21大得多的降血压作用(图9A)。作为对照包括在这些实验中的FGF1的HS结合位点突变体显示与野生型配体相似的降血糖作用(图9B)，从而表明HS-结合亲和力的丧失对FGF1的代谢活性没有影响。为了改变FGF1的受体-结合特异性以便FGF1选择性结合FGFR1的“c”剪接同种型，产生介导FGF21的代谢活性的主要受体，N末端截短的FG F1蛋白(图6)。截短的FGF1配体缺少N末端的24个残基，包括对于FGF1对FGFR1-3的两个剪接同种型的泛滥结合是至关重要的9个残基(Beenken等人，“Plasticity in Interactions of Fibroblast Growth Factor 1(FGF1)N Terminuswith FGF Receptors Underlies Promisc uity of FGF1,”J Biol Chem 287(5):3067-3078(2012)，将其通过引用全文并入本文)。基于FGF1-FGFR复合物的晶体结构，还预测截短减小FGF1的受体-结合亲和力，从而减小配体的丝裂原活性。截短的F GF1蛋白在ob/ob小鼠中诱导与天然FGF1相似的降血糖作用，从而表明FGF1的代谢活性是通过FGFR的“c”剪接同种型介导的。综上所述，这些发现为工程化FGF1配体提供了起点，所述FGF1配体不具有丝裂原活性但相较于天然FGF1具有相同或增强的代谢活性。

证明的通过将旁分泌FGF转化成内分泌配体(通过减小旁分泌FGF的HS-结合亲和力和添加Klotho共受体结合位点)的能力证实顾HS不参与内分泌FGF信号转导单位的形成。HS对于内分泌FGF的代谢活性的非必需性在这些FGF如何演化成激素方面具有吸引人的意义。这些配体似乎失去对结合HS以发信号的需要，然而获得了结合Klotho共受体的能力，这是指导这些配体到达它们的靶器官所必需的。

在靶组织中，Klotho共受体组成型地与内分泌FGF的相关受体缔合以补内分泌FGF的固有地低的受体-结合亲和力(图10B–10D；K urosu等人，J.Biol.Chem.282:26687-26695(2007)；Kurosu等人，J.Biol.Chem.281:6120-6123(2006)；Ogawa等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.104:7432-7437(2007)；Urakawa等人，Nature 444:770-774(2006)，将所述文献通过引用全文并入本文)。该低结合亲和力是因内分泌FGF的β-三叶形核心中的至关重要的受体-结合残基被对于受体结合是亚最佳的残基替代而引起(Goetz等人，Mol.Cell Biol.27:3417-3428(2007)，将其通过引用全文并入本文)。为了测量Klotho共受体增强内分泌FGF的受体-结合亲和力所达到的程度，作为实例，使用FGF23和FGFR1c以及αKlotho共受体进行SPR实验(参见图10A-10F)。SPR数据显示αKlotho使FGF23对FGFR1c的亲和力增强超过20倍(图10D和10E)。在αKlotho存在的情况下FGF23对于FG FR1c的亲和力可与FGF2在其HS辅因子不存在的情况下对于FGFR1c的亲和力相当(图10A和10E)。然而，应指出，HS还使FGF2对于FGFR1c的结合亲和力增强至少一个数量级(Pantoliano等人，Biochemistry 33:10229-10248(1994)；Roghani等人，J.Biol.Chem.269:3976-3984(1994)，将所述文献通过引用全文并入本文)。因此，在αK lotho共受体存在的情况下FGF23的受体-结合亲和力仍然低于FGF2在HS辅因子存在的情况下的结合亲和力。这些观察表明内分泌FGF信号转导单位的信号转导能力应当比旁分泌FGF信号转导单位的信号转导能力弱。事实上，基于细胞的研究显示即使在它们的Klotho共受体存在的情况下，内分泌FGF在活化FGFR诱导的细胞内信号转导途径上次于旁分泌FGF(Kurosu等人，J.Biol.Chem.282:26687-26695(2007)；Urakawa等人，Nature 444:770-774(2006)，将所述文献通过引用全文并入本文)。

内分泌FGF不必依赖于HS进行信号转导的发现在Klotho共受体的作用方面具有另一个重要意义。由于FGFR二聚化通常是FGF信号转导的前提，因此有人提出Klotho共受体不仅增强内分泌配体对受体的结合亲和力而且还在配体结合后促进受体二聚化。换句话说，Klotho共受体必须实现HS通过旁分泌FGF在信号转导中起作用的相同双重作用(图1D)。配体转化还提供了用于治疗代谢综合征的内分泌FGF样分子的合理设计的框架。FGF23样分子例如用于治疗遗传性或获得性高磷血症，FGF21样分子例如用于治疗2型糖尿病、肥胖症和相关代谢综合征。

尽管已在本文中描绘和描述了优选实施方案，但对于相关领域技术人员来说很明显可在不背离本发明的精神的情况下产生各自变动、添加、置换等，从而这些变化被认为在下列权利要求中定义的本发明的范围内。

Claims (14)

1.FGF1肽片段在生产用于降低血糖的药物中的用途，所述FGF1肽片段包含具有K127D、K128Q和K133V置换的SEQ ID NO:1的氨基酸1-155(FGF1^ΔHBS)或SEQ ID NO:1的氨基酸25-155(FGF1^ΔNT)。

2.一种嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白由氨基酸序列SEQ ID NO:339、SEQ ID NO:340、SEQ ID NO:341或SEQ ID NO:342组成。

3.一种药物组合物，其包含权利要求2所述的嵌合蛋白和药学上可接受的载体。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其还包含：

一种或多种选自抗炎剂、抗纤维化剂、抗高血压剂、抗糖尿病剂、降甘油三酯剂和降胆固醇剂的试剂。

5.嵌合成纤维细胞生长因子(“FGF”)蛋白在制备用于治疗患有病症的受试者的药物中的用途，其中所述嵌合FGF蛋白由氨基酸序列SEQ ID NO:339、SEQ ID NO:340、SEQ ID NO:341或SEQ ID NO:342组成，且所述病症选自由糖尿病、肥胖症和代谢综合征组成的组。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述病症是II型糖尿病、妊娠糖尿病或药物引起的糖尿病。

7.根据权利要求5所述的用途，其中所述病症是I型糖尿病。

8.根据权利要求5所述的用途，其中所述病症是肥胖症。

9.根据权利要求5所述的用途，其中所述病症是代谢综合征。

10.根据权利要求5所述的用途，其中所述药物通过胃肠外、皮下、静脉内、肌内、腹膜内途径，通过鼻内滴注，通过植入，通过腔内或膀胱内滴注、眼内、动脉内、病变内、经皮肤途径，或通过对粘膜的敷用来施用。

11.根据权利要求5所述的用途，其中将所述嵌合FGF蛋白与药学上可接受的载体一起施用。

12.根据权利要求5所述的用途，其中所述受试者为哺乳动物。

13.根据权利要求5所述的用途，其中所述受试者为人。

14.根据权利要求5所述的用途，其中将所述嵌合FGF与一种或多种试剂共施用，所述试剂选自抗炎剂、抗纤维化剂、抗高血压剂、抗糖尿病剂、降甘油三酯剂和降胆固醇剂。