CN104719210B - 基于仔稚鱼体氨基酸平衡的轮虫卤虫氨基酸强化法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于仔稚鱼体氨基酸平衡的轮虫卤虫氨基酸强化法，属于水产养殖饲料加工技术领域。其特点是基于比较鲆鲽仔稚鱼体与活饵料的必需氨基酸组成的基础上，以所判定潜在的限制性氨基酸为原料，采用直接强化法或脂质体包被氨基酸强化法，使限制性氨基酸在轮虫、卤虫体内积累，从而改变轮虫、卤虫氨基酸平衡状态，使其接近仔稚鱼体氨基酸组成，仔稚鱼摄食轮虫、卤虫后最大程度的保留利用所吸收的轮虫、卤虫整体氨基酸。达到生物饵料氨基酸的最大化利用，促进仔稚鱼的快速生长发育，减少畸形率和死亡率，使仔稚鱼在进入幼鱼期时获得最大的体积体重。且此方法培育的幼鱼转饵适应性强，生长迅速，抗病能力强。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于仔稚鱼体氨基酸平衡的轮虫卤虫氨基酸强化法，具体说是依据仔稚鱼体氨基酸组成来调节轮虫、卤虫等体内的氨基酸平衡，使其接近所培育仔稚鱼的体氨基酸组成，从而解决由于仔稚鱼生物饵料氨基酸不平衡导致的生长阻滞现象，发挥仔稚鱼生长的最大潜力。属于水产养殖饲料加工技术领域。
背景技术
鲆鲽鱼类的仔稚鱼在发育过程中一般要经历卵黄囊期、开口期以及变态期等几个重要的时期，在这期间仔鱼的消化功能虽然较弱，但是已经具备一定的代谢吸收能力，表现为转运载体的出现、代谢酶活的提高以及肝脏的血管化等。就目前的实际养殖生产来讲，微粒子饲料在早期完全替代生物饵料还存在一系列难度，轮虫和卤虫仍是仔稚鱼培养过程中主要的天然饵料，负责提供给仔稚鱼早期发育所需的全部营养，其质量的优劣直接影响仔稚鱼的成活率和生长速度。为了增加轮虫和卤虫的营养价值，目前的做法主要是对轮虫卤虫进行DHA强化，这种强化方案主要是建立在前期对一些仔稚鱼对DHA需求研究的基础上。然而无论卵是否含有油球，仔稚鱼从胚胎发育开始就对氨基酸表现出极大的依赖性，大部分的游离氨基酸在仔稚鱼期被消耗转化成能量或者聚合成为体蛋白，从而支持仔稚鱼的快速生长。近年来的一些研究发现，轮虫和卤虫的氨基酸序列和仔稚鱼的体蛋白氨基酸序列相差较大，难以满足需求，从而导致某些氨基酸成为限制性氨基酸，该氨基酸的不足导致的“水桶效应”降低了对摄入的氨基酸的整体利用，使仔稚鱼的生长远低于最大生长潜力。使用藻类强化虽然能提高轮虫卤虫体游离氨基酸的含量，但是无法改变其整体氨基酸的平衡性。
目前生产中轮虫强化主要以脂肪酸DHA的强化较为重视，而忽视了各种氨基酸在仔稚鱼生长发育过程中的作用。通常采用的藻类强化轮虫卤虫的方法也无法解决氨基酸平衡的问题，因为藻类所含必需氨基酸一般与鱼体必需氨基酸组成相差较大。
发明内容
本发明的目的在于解决仔稚鱼培育中所使用的生物饵料的氨基酸不平衡情况，针对不同的鲆鲽类幼鱼的体氨基酸组成，提供一种平衡轮虫和卤虫氨基酸组成的工艺和方法，以促进仔稚鱼苗种的快速生长，提高苗种的成活率，减少非正常苗种的比例，减少死亡率。
本发明采用科学手段定向调控轮虫卤虫体内的限制性氨基酸含量，通过适当补充潜在的限制性氨基酸，使轮虫卤虫的体氨基酸组成接近于仔稚鱼的体氨基酸组成，从而提高各种氨基酸利用，最大程度的发挥仔稚鱼的生长潜力。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
基于仔稚鱼体氨基酸平衡的轮虫卤虫氨基酸强化法，其特别之处在于，基于比较鲆鲽仔稚鱼体与活饵料的必需氨基酸组成的基础上，以所判定潜在的限制性氨基酸为氨基酸原料，采用直接强化法或脂质体包被氨基酸强化法，使限制性氨基酸在轮虫、卤虫体内积累，从而改变轮虫、卤虫氨基酸平衡状态，使其接近仔稚鱼体氨基酸组成，仔稚鱼摄食轮虫、卤虫后最大程度的保留利用所吸收的轮虫、卤虫整体氨基酸。
所述限制性氨基酸定义为：（饵料中某必需氨基酸A/E值-鱼体内某必需氨基酸A/E值) /(鱼体某必需氨基酸A/E值)×100, 按其绝对值大小分别为潜在性第一限制性氨基酸、第二限制性氨基酸……。
所述必需氨基酸A/E值计算公式为: 该必需氨基酸含量/总必需氨基酸量×100。
具体方法如下：
将所育对象仔稚鱼与其所食饵料轮虫、卤虫的体必需氨基酸进行比对，当轮虫、卤虫体内的必需氨基酸A/E值比仔稚鱼体必需氨基酸A/E值低10%以上时，即认为它是潜在的限制性氨基酸，需要对其进行强化。
所述强化方法有直接强化法和脂质体包被氨基酸强化法。
所述直接强化法操作步骤为：
在过滤海水中加入所需的限制性氨基酸，搅拌均匀，要求溶液中该氨基酸的浓度达到5.0-30.0mM，温度要求为25-30℃，然后加入轮虫或卤虫，并缓慢搅拌使其均匀分布，轮虫密度要求为300-400个/ml，卤虫密度要求为卤虫无节幼体100-200个/ml，对其进行强化孵育培养，在孵育培养的过程中充入空气并注意缓慢搅拌。经过强化孵育培养后，将强化后的轮虫或卤虫直接投到仔稚鱼的培育池中，供仔稚鱼食用。
所述孵育培养时间为16-19h。
经过强化后的轮虫、卤虫体内氨基酸的含量较未强化的轮虫卤虫高3倍以上，且在24h内仍具有较高的保留。
所述脂质体包被氨基酸强化法的操作步骤为：
1）将卵磷脂和胆固醇按质量比5:1~2 w/w配好后，溶于体积比为1.8~2.2:1 v/v的氯仿-甲醇溶液中，溶质与溶剂比例为1:8~15 w(g)/v(ml)，配制溶液，取一定量体积的此溶液放入圆底容器中。
2）将容器接入旋转蒸发仪中使其挥发，真空度控制在0.07-0.1 MPa，蒸发温度控制在35-40℃，70-90 r/min，持续40-60min，即可在容器内壁形成均匀的脂质膜。
3）将所需的单体氨基酸加入浓度为500-540mM的 NaCl溶液中溶解，使其最终溶液中该氨基酸的浓度达到180-350mM，备用。
4）取步骤3）中配好的氨基酸溶液加入步骤2）完成的含有脂质膜的圆底容器中，氨基酸溶液与含有脂质膜液体的体积比为1：1~2，在35-40℃条件下缓慢摇动30-40min，形成脂质体初悬液，然后将脂质体初悬液通过薄膜脂质体挤出器，滤膜粒径0.4 -1.2μm，最终形成氨基酸强化脂质体。
5）将上述的氨基酸强化脂质体投喂轮虫或卤虫，对轮虫或卤虫强化孵育培养，即可完成限制性氨基酸的强化。
所述对轮虫或卤虫强化孵育培养时间为16-19h。
强化后的轮虫、卤虫具有较接近仔稚鱼鱼体的氨基酸模式，可以直接投喂给仔稚鱼。
本发明有益效果：生物饵料在仔稚鱼的生长发育中扮演重要的角色，但是其氨基酸组成对于有些鱼类来说并不均衡，存在潜在的限制性氨基酸，这些氨基酸的不足导致摄入的大量其它氨基酸利用率较低。本发明基于轮虫、卤虫与不同发育阶段的仔稚鱼体氨基酸进行比对，对潜在的限制性氨基酸进行强化，从而提高该种氨基酸在轮虫卤虫体内的含量，使其氨基酸组成接近仔稚鱼，达到生物饵料氨基酸的最大化利用，促进仔稚鱼的快速生长发育，减少畸形率和死亡率，使仔稚鱼在进入幼鱼期时获得最大的体积体重。另外，脂质体技术的使用，模拟了生物膜的结构，减少了单体氨基酸的使用量，提高其保留率，使强化过程变得可控。
经过临床试验表明，所培育的鲆鲽类苗种体格健壮，提高了进入幼鱼期的苗种的尺寸，降低了畸形率和死亡率，且此方法培育的幼鱼转饵适应性强，生长迅速，抗病能力强。
具体实施方式
以下给出本发明的具体实施方式，用来对本发明进行进一步说明。
实施例1
本实施例中基于仔稚鱼体氨基酸平衡的轮虫卤虫氨基酸强化法，选用星斑川鲽仔稚鱼做为培育对象，依据轮虫和卤虫体内氨基酸组成和星斑川鲽仔稚鱼体氨基酸组成比较，轮虫蛋氨酸A/E值为3.01，苏氨酸A/E值为7.86，仔稚鱼蛋氨酸A/E值为7.36, 苏氨酸A/E值为10.05，估测蛋氨酸和苏氨基酸缺乏各为53.60%和27.02%。判定蛋氨酸为第一限制性氨基酸，苏氨酸为潜在的另一限制性氨基酸。
采用直接强化法：在20L培养轮虫、卤虫的过滤海水加入蛋氨酸1.2g和苏氨酸0.8g，搅拌均匀，使最后溶液中的蛋氨酸和苏氨酸浓度分别达到为8.0mM和6.0mM，将温度提高为25-30℃，加入轮虫约为6×106个或卤虫4×106个，并缓慢搅拌使其均匀分布，在孵育培养的过程中充入空气并注意缓慢搅拌，孵育过程持续16h。将强化后的轮虫（或卤虫）直接投到仔稚鱼的培育池中喂养仔稚鱼。
实施例2
本实施例中基于星斑川鲽仔稚鱼体氨基酸平衡的轮虫、卤虫氨基酸强化法，与实施例1不同的是轮虫采用脂质体包被氨基酸强化法：将2g蛋黄卵磷脂和0.8g胆固醇混合后溶于氯仿-甲醇（2:1v/v）溶液28ml中, 然后放入旋转蒸发仪在35-40℃下使溶液挥发，真空度控制在0.09 MPa，转速为70 r/min，持续干燥30-50min。用20ml浓度为520mM的NaCl溶液溶解蛋氨酸0.95g和苏氨酸0.68g使其成为含有两种氨基酸的溶液，而后灌入250ml圆底烧瓶内，在35℃下缓慢摇晃30min，然后将脂质体悬液通过薄膜脂质体挤出器，滤膜粒径0.4μm。将最终形成的氨基酸脂质体，饲喂轮虫2×105个或卤虫1.2×105个左右。
实施例3
本实施例中基于仔稚鱼体氨基酸平衡的轮虫卤虫氨基酸强化法，选用大菱鲆仔稚鱼做为培育对象，依据轮虫卤虫体内氨基酸组成和大菱鲆仔稚鱼体氨基酸组成比较，轮虫精氨酸A/E值为11.02，卤虫亮氨酸A/E值为17.14；大菱鲆仔鱼精氨酸A/E值为14.89，亮氨酸A/E值为21.93，估测精氨酸和亮氨酸缺乏35.12%和29.95%，判定精氨酸为轮虫的第一限制性氨基酸，亮氨酸为卤虫的第一限制性氨基酸。
采用脂质体包被氨基酸强化法：将2g蛋黄卵磷脂和0.6g胆固醇配好后溶于氯仿-甲醇（1.8:1）31.2ml溶液中, 然后放入真空旋转蒸发仪使圆底瓶内的溶剂在37℃下挥发，真空度控制在0.10 MPa，转速为80r/min，持续50min。用20ml浓度为520mM的 NaCl溶液溶解精氨酸1.05g或亮氨酸0.83g使其成为氨基酸溶液，然后将其灌入250ml圆底烧瓶内，在37℃下缓慢摇晃40min，然后将脂质体悬液通过薄膜脂质体挤出器，滤膜粒径选择0.4μm和0.6μm。将最终形成的氨基酸脂质体，饲喂轮虫2×105个或卤虫1.2×105个左右。
实施例4
本实施例中基于仔稚鱼体氨基酸平衡的卤虫氨基酸强化法，选用孵化后5天的塞内加尔鳎（欧鳎）仔鱼做为培育对象，依据卤虫体内氨基酸组成和欧鳎仔稚鱼体氨基酸组成比较，卤虫体缬氨酸A/E值为11.86，孵化后5天欧鳎仔稚鱼体缬氨酸A/E值为14.72，估测缬氨酸缺乏为24.12%，判定缬氨酸为卤虫的第一限制性氨基酸。
采用脂质体包被氨基酸强化法：将2g大豆卵磷脂和0.5g胆固醇配好后溶于氯仿-甲醇（2:1）溶液20ml中, 利用真空旋转干燥机使圆底瓶内的溶剂在35℃下挥发，真空度控制在0.10 MPa，转速为90 r/min，持续35min。用20ml浓度为500mM 的NaCl溶液溶解0.75g缬氨酸，灌入圆底烧瓶内，在37℃下缓慢摇晃40min，然后将脂质体悬液通过薄膜脂质体挤出器，滤膜粒径选择0.6μm。将最终形成的氨基酸脂质体，投喂给约1.2×105个卤虫。
2012年4月26日，山东省海洋水产研究所某养殖基地，在几个72平米的育苗池内，分别投放星斑川鲽卵360克/池，通过体氨基酸比较分析认定蛋氨酸为潜在的第一限制性氨基酸，对轮虫卤虫分别采用直接强化法和脂质体强化技术，直接法强化浓度为7.0mM，脂质体氨基酸包被强化法浓度为300mM。孵化后第3天开始投入强化后的轮虫，第8天开始投喂卤虫无节幼体，第12天开始加入卤虫后期无节幼体，另外两个池子投喂普通小球藻强化的轮虫和DHA强化的卤虫作为对照。5月18日测量直接强化组和脂质体强化组的仔稚鱼进入幼鱼后体长分别为12.1±1.7mm和13.4±2.2mm，而对照组的仔稚鱼体长为10.5±2.6mm。说明采用这种技术大大促进了星斑川鲽仔稚鱼变态前后的生长。
2013年7月至8月，蓬莱某养殖场采用脂质体包被氨基酸强化法，利用精氨酸强化的轮虫，亮氨酸强化的卤虫，以轮虫卤虫培养大菱鲆仔稚鱼，对照组采用小球藻强化轮虫和DHA强化卤虫，25天时脂质体强化饵料组的大菱鲆仔稚鱼比对照组生长率提高15-22%。接受相同的微粒子配合饲料40天后，脂质体强化组比对照组增重率提高20-25%。
Claims (1)
1.基于仔稚鱼体氨基酸平衡的轮虫或卤虫氨基酸强化法，其特征在于基于比较鲆鲽仔稚鱼体与活饵料的必需氨基酸组成的基础上，以所判定潜在的限制性氨基酸为原料，采用直接强化法或脂质体包被氨基酸强化法，使限制性氨基酸在轮虫、卤虫体内积累，从而改变轮虫、卤虫氨基酸平衡状态，使其接近仔稚鱼体氨基酸组成，仔稚鱼摄食轮虫、卤虫后最大程度的保留利用摄入的轮虫、卤虫整体氨基酸；
所述限制性氨基酸定义为：(饵料中某必需氨基酸A/E值-鱼体内某必需氨基酸A/E值)/(鱼体某必需氨基酸A/E值)×100,按其绝对值大小分别为潜在性第一限制性氨基酸、第二限制性氨基酸……；
所述必需氨基酸A/E值计算公式为:该必需氨基酸含量/总必需氨基酸量×100；
所述脂质体包被氨基酸强化法的操作步骤为：
1)将卵磷脂和胆固醇按质量比5:1～2w/w配好后，溶于体积比为1.8～2.2:1v/v的氯仿-甲醇溶液中，溶质与溶剂比例为1:8～15g/ml，将配好的溶液放入圆底容器中；
2)将容器接入旋转蒸发仪中使其挥发，真空度控制在0.07-0.1MPa，蒸发温度控制在35-40℃，70-90r/min，持续40-60min，即可在容器内壁形成均匀的脂质膜；
3)将所需的单体氨基酸加入浓度为500-540mM的NaCl溶液中溶解，使其最终溶液中该氨基酸的浓度达到180-350mM，备用；
4)取步骤3)中配好的氨基酸溶液加入步骤2)完成的含有脂质膜的圆底容器中，氨基酸溶液与含有脂质膜液体的体积比为1：1～2，在35-40℃条件下缓慢摇动30-40min，形成脂质体初悬液，然后将脂质体初悬液通过薄膜脂质体挤出器，滤膜粒径0.4-1.2μm，最终形成氨基酸强化脂质体；
5)将上述的氨基酸强化脂质体投喂轮虫或卤虫，对轮虫或卤虫强化孵育培养，即可完成限制性氨基酸的强化；
所述脂质体包被氨基酸强化法步骤5)中对轮虫或卤虫氨基酸孵育培养时间为16-19h；
所述直接强化法操作步骤为：
在过滤海水中加入所需的单体氨基酸，搅拌均匀，要求溶液中该氨基酸的浓度达到5.0-30.0mM，温度要求为25-30℃，然后加入轮虫或卤虫，并缓慢搅拌使其均匀分布，轮虫密度要求为300-400个/ml，卤虫密度要求为卤虫无节幼体100-200个/ml，孵育培养，在孵育培养的过程中充入空气并注意缓慢搅拌，经过孵育培养后，将强化后的轮虫或卤虫直接投到仔稚鱼的培育池中，供仔稚鱼食用；
所述直接强化法中对轮虫或卤虫氨基酸孵育培养时间为16-19h。
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