CN104710433B

CN104710433B - 苯丁酸氮芥衍生物、制备方法及应用

Info

Publication number: CN104710433B
Application number: CN201410031134.XA
Authority: CN
Inventors: 张跃华
Original assignee: Nanjing Youyi Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Youyi Medical Technology Co., Ltd.
Priority date: 2014-01-23
Filing date: 2014-01-23
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2034-01-23
Also published as: WO2015110040A1; CN104710433A

Abstract

本发明公开了具有下式Ⅰ或Ⅱ或Ⅲ结构的苯丁酸氮芥衍生物及其药学上可接受的盐。本发明还涉及上述化合物制备方法、制剂及应用。

Description

苯丁酸氮芥衍生物、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一类苯丁酸氮芥衍生物及其药学上可接受的盐、制备方法、制剂及作为抗肿瘤药物的应用。

背景技术

目前，靶向治疗已成为癌症治疗的重要方向，多采用一药一靶点的治疗模式，如用于治疗晚期大肠癌作用于DNA拓扑异构酶Ⅰ的依立替康(Irinotecan，CPT-11）和用于治疗卵巢癌和乳腺癌作用于细胞内微管的紫杉醇(Taxol)等。但是，肿瘤异于一般疾病，它的生长和存活不仅依赖于一种受体或一种信号通路的传导，这就使得单纯作用于一个靶点的策略并不能彻底杀死肿瘤细胞，并容易产生抗药性。于是，多种药物联合用药成为癌症临床治疗的主要手段，虽然在一定程度上能达到预期的治疗效果，但由于多种药物彼此间容易发生相互作用，如对药物的吸收和代谢产生影响，即使没有相互作用，这些药物通常也不能以它们单独应用时的剂量联用，为此，药物研究者借鉴多种药物联合用药的原理，采用药效团拼合的方法，将两种或两种以上的药效团拼合成一个分子，使这个分子本身或其代谢产物作用于两个或更多的靶点，从而产生协同作用以提高疗效。因此，设计与合成作用于两个或多个靶点的抗癌药物，不仅可以提高治疗效果，而且有可能避免多种药物联合用药而导致的药物相互作用等副作用，从而降低毒副作用。

喜树碱（20(s)-camptothecin，式1-1）及其衍生物具有很好的抗肿瘤活性，是一类重要的DNA拓扑异构酶I(Top I)抑制剂，它们能够与Top I-DNA可裂解复合物结合，形成CPT-Top I-DNA三元络合物，从而稳定可裂解复合物，导致细胞死亡。但因其在水和其他生物相容性溶剂中的溶解性差和毒性大的问题，最终未能进入临床。为了提高药物的水溶性并保留母体化合物的抗肿瘤特性，已合成了许多喜树碱衍生物。然而，只有衍生物拓扑替康（Topotecan，式1-4）和伊立替康（Irinotrcan，式1-5）被美国食品与药物管理局（FDA）批准进入临床已经上市，分别用于治疗卵巢癌、肺癌和直肠癌。但是，拓扑替康和伊立替康具有明显的缺点，包括在体内半衰期短、毒副作用大和治疗效果有限等。目前，有多个喜树碱衍生物处于临床研究阶段。

1.20(S)-camptothecin,R=R₁=R₂=H

2.10-hydroxycamptothecin,R=OH,R₁=H

3.7-ethyl-10-hydroxycamptothecin,R=OH,R₁=H,R₂=CH₃H₂-

4.topotecan,R=OH,R₁=(CH₃)₂NCH₂-,R₂=H

5.irinotecan,R₁=H,R₂=Et,

式1.喜树碱及其衍生物、拓扑替康(topotecan)和伊立替康(irinotecan)的化学结构。

氮芥类化合物（包括氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥）是用于临床并取得突出疗效的抗肿瘤药物。为双氯乙胺类烷化剂，是一高度活泼的化合物。氮芥类化合物进入体内后，通过分子内成环作用，形成高度活泼的乙烯亚胺离子，在中性或弱碱条件下迅速与多种有机物质的亲核基团（如蛋白质的羧基、氨基、巯基、核酸的氨基和羟基、磷酸根）结合，进行烷基化作用。氮芥类化合物最重要的反应是与鸟嘌呤第7位氮共价结合，产生DNA的双链内的交叉联结或DNA的同链内不同碱基的交叉联结。

发明内容

本发明的目的在于提供一类苯丁酸氮芥衍生物，具有式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的化学结构，是4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸与喜树碱或喜树碱衍生物分子通过酯键结合的新的化合物：

其中：R是H或C1-C6直链或支链的饱和或不饱和烃基，优选H、CH₃、CH₂CH₃、CH₂CH₂CH₃或CH(CH₃)₂，更优选H或CH₂CH₃。

本发明的另一目的在于提供所述苯丁酸氮芥衍生物化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的合成方法。

上述化合物Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ可将4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸与喜树碱或喜树碱衍生物通过酯化反应生成。优选两种制备方法，

方法一：包括以下步骤：

1）4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸与酰氯化试剂（如二氯亚砜、（SOCl₂）、草酰氯（(COCl)₂）、三氯氧磷（POCl₃）反应生成4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酰氯；

2）4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酰氯再分别与7-R-10-羟基喜树碱（7-R-10-hydroxycamptothecin）或10-羟基喜树碱（10-hydroxycamptothecin）或喜树碱（Camptothecin）反应，在碱（如三乙胺、吡啶、4-二甲氨基吡啶、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯等）的作用下生成具有通式Ⅰ或Ⅱ结构的化合物，其中7-R-10-羟基喜树碱中的R是C1-C6直链或支链的饱和或不饱和烃基,优选R是CH₃、CH₂CH₃、CH₂CH₂CH₃或CH(CH₃)₂。

反应路线示意图如下图所示：

或者，方法二：

优选以4-二甲氨基吡啶（DMAP）和2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物（CMPI）或N,N′-二环己基碳化二亚胺（DCC）和4-二甲氨基吡啶（DMAP）或其它酯化试剂为偶联剂，4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸直接与7-R-10-羟基喜树碱或10-羟基喜树碱或喜树碱反应，生成具有通式Ⅰ或Ⅱ或Ⅲ结构的化合物，所述7-R-10-羟基喜树碱的R是C1-C6直链或支链的饱和或不饱和烃基,优选R是CH₃、CH₂CH₃、CH₂CH₂CH₃或CH(CH₃)₂。

反应路线示意图如下图所示：

本发明的另一目的在于提供所述苯丁酸氮芥衍生物：化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ在制备抗癌药物中的应用。所述癌症包括但不限于①血液系统的癌症，如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤；②非血液癌症，如实体瘤癌（如乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、胃癌、肝癌等）、肉瘤、皮肤癌和胶质瘤等。

上述应用中，所述的药物包括有效治疗量的式Ⅰ或Ⅱ或Ⅲ化合物以及药学上可接受的药物载体。可以为注射剂、口服制剂或外用制剂。优选乳剂、微乳剂、胶束剂、脂质体、片剂或胶囊剂、膏剂。

喜树碱及其衍生物具有很好的抗肿瘤活性，是一类重要的DNA拓扑异构酶I(Top I)抑制剂，它们能够与Top I-DNA可裂解复合物结合，形成CPT-Top I-DNA三元络合物，从而稳定可裂解复合物，导致癌细胞死亡。

4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸（苯丁酸氮芥）是氮芥衍生物，为双氯乙胺类烷化剂，可与DNA的鸟嘌呤第7位氮共价结合，产生双链内的交叉联结或同链内不同碱基的交叉联结，致癌细胞死亡。与环磷酰胺相似，对多种肿瘤有抑制作用，临床用于慢性淋巴细胞白血病、淋巴肉瘤、何金杰氏病、卵巢癌、乳腺癌、绒毛上皮瘤、多发性骨髓瘤等。

本发明的化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分子中同时含有可使DNA碱基交叉联结的双氯乙胺烷化基团和可抑制DNA拓扑异构酶I(Top I)的喜树碱结构，预期分子本身或其代谢产物以两种机制作用于癌细胞，从而产生协同作用效果抑制并杀死癌细胞，以提高疗效和降低毒副作用。

本发明还涉及所述的新的苯丁酸氮芥衍生物的制剂配方，包括乳剂或微乳液剂、胶束剂、脂质体剂、片剂、胶囊剂和膏剂配方。乳剂包括本发明所述苯丁酸氮芥衍生物、一种或多种表面活性剂、油相（亲脂性介质）和水相。乳剂可以是水包油型或油包水型。胶束剂包括本发明所述苯丁酸氮芥衍生物、助溶剂和一种或多种表面活性剂和水相。脂质体剂包括本发明所述苯丁酸氮芥衍生物、磷脂（最具有代表性的是卵磷脂、磷脂酰胆碱）、胆固醇和水相。片剂包括本发明所述苯丁酸氮芥衍生物和辅料。胶囊剂包括本发明所述苯丁酸氮芥衍生物和辅料。膏剂配方包括本发明所述苯丁酸氮芥衍生物和基质。

采用的技术方案为，一种本发明所述苯丁酸氮芥衍生物的乳剂或微乳剂，其成分包括：

1）油相，包括：

a)具有式Ⅰ或Ⅱ或Ⅲ结构的化合物；

b)生物相容的亲脂性介质；

2)表面活性剂和助溶剂；

3)水相。

或者，一种本发明所述苯丁酸氮芥衍生物胶束剂，其成分包括：

1）具有式Ⅰ或Ⅱ或Ⅲ结构的化合物；

2）表面活性剂；

3）助溶剂；

4）水相。

或者，一种本发明所述苯丁酸氮芥衍生物脂质体制剂，其成分包括：

1）具有式Ⅰ或Ⅱ或Ⅲ结构的化合物；

2）磷脂；

3）胆固醇；

4）水相。

或者，一种本发明所述苯丁酸氮芥衍生物的片剂，其成分包括：

1）具有式Ⅰ或Ⅱ或Ⅲ结构的化合物；

2）辅料。

常用的辅料包括：①稀释剂（Diluents），如淀粉、糖粉、糊精、乳糖、预胶化淀粉（Pregelatinized starch）、微晶纤维素（Microcrystalline cellulose，MCC）、无机钙盐，如硫酸钙、磷酸氢钙及药用碳酸钙、甘露醇；②粘合剂（Adhesives），如蒸馏水、乙醇、淀粉浆、羧甲基纤维素钠（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）、羟丙基纤维素（hydroxypropylcellulose，HPC）、甲基纤维素和乙基纤维素（Methylcellulose，MC；Ethylcellulose，EC）、羟丙甲纤维素（Hydroxypropylmethyl cellulose，HPMC）、其它粘合剂（5%～20%的明胶溶液，50%～70%的蔗糖溶液，3%～5%的聚乙烯毗咯烷酮（PVP）的水溶液或醇溶液）；③崩解剂（Disintegrants），如干淀粉、羧甲基淀粉钠（Carboxymethyl starchsodium，CMS-Na）、低取代羟丙基纤维素（L-HPC）、交联聚乙烯比咯烷酮（Cross-linkedpolyvinyl pyrrolidone，亦称交联PVP）、交联羧甲基纤维素钠（Croscarmellose sodium，CCNa是交联化的纤维素羧甲基醚（大约有70%的羧基为钠盐型）；④润滑剂（Lubricants），如硬脂酸镁、氢化植物油、聚乙二醇、月挂醇硫酸镁、微粉硅胶（Aerosil）、滑石粉；⑤着色剂；⑥矫味剂等。无论加入何种辅料，都应符合药用的要求，都不能与主药发生反应，也不应妨碍主药的溶出和吸收。

片剂可采用湿法制粒压片、干法制粒压片和直接压片制备。

或者，一种本发明所述苯丁酸氮芥衍生物的胶囊剂，包括硬胶囊和软胶囊。其成分包括：

1）具有式Ⅰ或Ⅱ或Ⅲ结构的化合物；

2）辅料。

硬胶囊剂的常用辅料包括但不限于：①稀释剂：用于改善内容物的物理特性和增加体积，往往具有一定的可压性。常用的稀释剂有甘露醇、微晶纤维素、乳糖、预胶化淀粉1500、玉米淀粉等。②润滑剂：以防止粉末与金属材料的黏附。常用有硬脂酸镁、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、滑石粉等。③助流剂：改善内容物的流动性。常用有微粉硅胶和滑石粉等。④崩解剂：保证内容物的崩解。常见有交联纤维素、玉米淀粉、交联聚维酮、预胶化淀粉1500、甘氨酰基淀粉钠、海藻酸等。⑤润湿剂：增加药物与溶出介质的润湿性，保证制剂的效能。常见有吐温80、十二烷基硫酸钠等。

软胶囊剂内容物中的辅料包括但不限于油性分散或PEG分散，内容物可以是溶液、混悬液、乳剂、半固体等。油性分散（亲脂性）内容物辅料包括：①油性载体：大豆油、蓖麻油、中链脂肪酸等；②用于调节粘度的半固体包括氢化蓖麻油、蜂蜡等；③表面活性剂如磷脂可以改善混悬液的混悬稳定性。也可添加其它稳定剂如抗氧剂BHT等。PEG分散（亲水性）内容物辅料通常为PEG400和600，半固体的可以同时使用低分子量的PEG200、300和高分子的PEG4000-10000。

硬胶囊壳与软胶囊壳相似，主要含明胶、阿拉伯胶、水、增塑剂(如甘油，也可以加入适量丙二醇和聚乙二醇200，甘露醇或山梨醇可以替代甘油作为胶皮的增塑剂)、防腐剂（如山梨酸钾、尼泊金等）、遮光剂和色素等，其中水的作用是溶剂。

或者，一种本发明所述苯丁酸氮芥衍生物的膏剂，其成分包括：

1）具有式Ⅰ或Ⅱ或Ⅲ结构的化合物；

2）基质。

常用的基质包括：烃类（如凡士林、固体石蜡、液体石蜡、硅酮）、类脂类（如羊毛脂、蜂蜡与鲸蜡、二甲硅油）、油脂类（如动植物高级脂肪酸甘油脂及其混合物）。

本发明所述苯丁酸氮芥衍生物可溶于亲脂性介质中。亲脂性介质（或载体）可以是任何一种的生物相容的亲脂性介质，具有代表性的生物相容的亲脂性介质包括：

1）可作为亲脂性介质的油脂，包括不同链长的脂肪酸及酯，它们大多是直链的，但也可以是支链的，例如癸酸、辛酸、己酸、月桂酸、肉豆蔻、硬脂酸、油酸、亚油酸、以及其它饱和或不饱和脂肪酸及酯类。

2）脂溶性的维生素E及衍生物。维生素E是指以天然或人工合成的维生素E系列，它们通常称为生育酚和生育三烯酚（tocopherols和tocotrienols），生育酚包括α-生育酚（D型、DL型、L型）、β-生育酚（D型、DL型、L型）、γ-生育酚（D型、DL型、L型）和δ-生育酚（D型、DL型、L型）。生育三烯酚在结构上与生育酚相似，但生育三烯酚在碳-2的侧链植基（phytyl）上有三个双键。生育三烯酚包括α-生育三烯酚（D型、DL型、L型）、β-生育三烯酚（D型、DL型、L型）、γ-生育三烯酚（D型、DL型、L型）和δ-生育三烯酚（D型、DL型、L型）。维生素E衍生物包括所有生育酚和生育三烯酚的衍生物，如维生素E琥珀酸酯，维生素E醋酸酯等。

3）脂肪酸与甘油酯化反应所形成的甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯，无论它们是合成的还是天然的，都可作为亲脂性介质，例如，甘油酯，如豆油，棉籽油，菜籽油，鱼油，乙酰化单甘酯，甘油单油酸酯，三醋酸甘油酯，和双乙酰酒石酸酯，单甘酯，蓖麻油等。

4）脂肪醇，如苄醇、硬脂醇、月桂醇等，或是它们的酯或醚，如苯甲酸苄酯。

具有代表性的表面活性剂包括：

1）聚乙二醇表面活性剂，如聚氧乙烯蓖麻油EL(Cremophor EL)、吐温系列表面活性剂等。

2）磷脂表面活性剂（phospholipids），如卵磷脂(lecithin）、聚乙二醇磷脂（pegylatedphospholipids）。

3）聚乙二醇维生素E衍生物，如维生素E琥珀酸酯聚乙二醇（d-α-tocopherolpolyethylene glycol1000succinate,TPGS）。

4）聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物：POLOXAMERS或PLURONICS的嵌段共聚物（H(OCH2CH2)a(OCH2CH2CH2)b(OCH2CH2)aOH）。

具有代表性的有机助溶剂包括：

乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甘油、N-甲基吡咯烷酮等。聚乙二醇（PEG）是亲水性的，重复单元的化学结构组成为-CH₂CH₂O-，通式为H-(CH₂CH₂)_n-OH，分子量范围一般从200至10000。例如，聚乙二醇200、PEG-300、聚乙二醇400等。

本发明的乳剂、微乳剂、胶束剂和脂质体剂、片剂、胶囊剂和膏剂。配方中都包含本发明所述苯丁酸氮芥衍生物。

此处使用的“乳剂”是指在表面活性剂的作用下，一相液体以液滴状态分散于另一相液体中形成的非均相液体分散体系，如油和水所形成的液滴，其直径一般在0.1至3.0微米。

所述的乳剂可以形成稳定的微乳剂。“微乳”一词是指两个不混溶的液体形成一个热力学稳定的各向同性、透明或半透明的分散体系，如油和水的微乳分散体系是被表面活性剂分子形成的界面膜所稳定。微乳平均液滴直径小于200nm，一般10至50纳米。

乳剂或微乳剂中包括油相和水相。乳剂或微乳剂可以是水包油型乳化或油包水型。

在没有水的情况下，由油相、非离子型表面活性剂和助乳化剂混合所形成的均一透明并包含药物的溶液被称为自乳化释药系统（self-emulsifying drug delivery system：SEDDS），自发乳化形成粒径在100nm至500nm的乳剂，可用于提高亲脂性药物溶解度和口服吸收度。

所述的乳剂或微乳剂中，本发明所述苯丁酸氮芥衍生物在制剂配方中所占的重量百分比为0.005%至5.0%；优选在制剂配方中所占的重量百分比为0.01%至2.5%；更优选的方案中，本发明所述苯丁酸氮芥衍生物在制剂配方中所占的重量百分比为0.1%至1.5%。

所述的乳剂或微乳剂中，亲脂性介质在制剂配方中所占的重量百分比为2%至20%；优选亲脂性介质在制剂配方中所占的重量百分比为4%至12%；更优选的方案中，亲脂性介质在制剂配方中所占的重量百分比为6%至10%。

在一个乳剂或微乳剂的实施方案中，亲脂性介质包括豆油，水相介质是水。在另一个乳剂和微乳剂的实施方案中，亲脂性介质包括油溶性维生素E。在另一个乳剂或微乳剂的实施方案中，亲脂性介质包括油溶性维生素E衍生物。

除了本发明所述苯丁酸氮芥衍生物，乳剂或微乳剂配方中还可以包括药物乳剂和微乳剂中常用的其他的成分，这些成分包括表面活性剂和助溶剂。具有代表性的表面活性剂包括非离子表面活性剂，如聚氧乙烯蓖麻油EL(Cremophor EL)、吐温80（Tween80）、聚乙二醇维生素E衍生物表面活性剂及其它表面活性剂聚合物。

合适的聚乙二醇维生素E衍生物表面活性包括维生素E琥珀酸聚乙二醇衍生物（例如维生素E聚乙二醇琥珀酸酯），在维生素E衍生物分子中，聚乙二醇是由琥珀酸与维生素E的羟基连接而成，这些维生素E的聚乙二醇衍生物中的聚乙二醇包括具有各种分子量（例如，200、300、400、600、1000等）的聚乙二醇。此处的“维生素E聚乙二醇琥珀酸酯”包括维生素E聚乙二醇琥珀酸酯（如D-α生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯，TPGS，一种非离子型表面活性剂（HLB=16-18））和维生素E聚乙二醇的各种酯和醚衍生物。

所述的乳剂或微乳剂中，表面活性剂在配方中的重量百分含量约为1至10%，优选2-6%，更优选4-5%。

所述的乳剂或微乳剂中，助溶剂约占配方重量的0%至20%。

在另一个方面，本发明还提供了一种本发明所述苯丁酸氮芥衍生物的胶束制剂包括本发明所述苯丁酸氮芥衍生物、一种或多种表面活性剂、一种或多种助溶剂和水相。

在本发明所述苯丁酸氮芥衍生物的胶束剂中，药物化合物在配方中重量百分含量约为0.005%至3.0%，优选药物化合物在配方中重量百分含量约为0.01%至2.5%；更优选，药物化合物在配方中重量百分含量约为0.1%至1.0%。

合适的表面活性剂在本发明的胶束剂配方中的重量百分含量约为1至10%，优选2-6%，更优选4-5%。

胶束剂配方还包括其它的成份，如上面提到的助溶剂。在一个实施例中，胶束剂配方中包含聚乙二醇和较低的烷基醇（如乙醇）。所述的胶束剂中，助溶剂约占配方重量的1%至20%。

在另一个方面，本发明还提供了一种本发明所述苯丁酸氮芥衍生物的脂质体剂包括本发明所述苯丁酸氮芥衍生物、一种或多种磷脂（包括PEG化磷脂）、一种或多种亲脂性介质（如胆固醇）和水相。

在本发明所述苯丁酸氮芥衍生物的脂质体剂中，药物化合物在配方中重量百分含量约为0.005%至5.0%，优选药物化合物在配方中的重量百分含量约为0.01%至2.5%；更优选，药物化合物在配方中重量百分含量约为0.1%至1.5%。

合适的磷脂在本发明的脂质体剂配方中的重量百分含量约为1至10%，优选2-6%，更优选4-5%。

脂质体剂配方还包括其它的成份，如上面提到的亲脂性介质（如胆固醇）。在一个实施例中，脂质体剂配方中包含胆固醇或维生素E。所述的脂质体剂中，胆固醇或维生素E约占配方重量的0.1%至20%。

乳剂、微乳剂、胶束剂和脂质体剂配方中包含水相。在一个实施例中，水相包括去离子水。在另一个实施例中，水相包括生理盐水。在另一个实施例中，水相中含一种酸的如琥珀酸、柠檬酸、磷酸）缓冲液。

在另一个方面，本发明还提供了一种本发明所述苯丁酸氮芥衍生物的片剂包括本发明所述苯丁酸氮芥衍生物和辅料。本发明所述苯丁酸氮芥衍生物的在每片中的含量可为1毫克至1000毫克，优选的方案中本发明所述苯丁酸氮芥衍生物在每片中的含量为10毫克至500毫克；更优选的方案中，本发明所述苯丁酸氮芥衍生物在每片中的含量为20毫克至250毫克。

在另一个方面，本发明还提供了一种本发明所述苯丁酸氮芥衍生物的胶囊剂包括本发明所述苯丁酸氮芥衍生物和辅料。本发明所述苯丁酸氮芥衍生物的在每颗胶囊中的含量可为1毫克至1000毫克，优选的方案中本发明所述苯丁酸氮芥衍生物在每颗胶囊中的含量为10毫克至500毫克；更优选的方案中，本发明所述苯丁酸氮芥衍生物在每颗中的含量为20毫克至250毫克。

在另一个方面，本发明还提供了一种本发明所述苯丁酸氮芥衍生物的膏剂包括本发明所述苯丁酸氮芥衍生物、一种或多种基质。

在本发明所述苯丁酸氮芥衍生物在膏剂中的重量百分含量约为0.01%至30%，优选药物化合物在配方中的重量百分含量约为0.05%至20%；更优选，药物化合物在配方中重量百分含量约为0.1%至10%。

本发明还提供了新发明的药物化合物的应用，即本发明所述苯丁酸氮芥衍生物在制备抗癌药物中的应用。

例如，本发明的药物化合物用于制备治疗癌症的药物。本发明的药物化合物可用于治疗包括血液系统的癌症，如白血病，淋巴瘤，骨髓瘤；和非血液癌症，如实体瘤癌（如乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、胃癌、肝癌等），肉瘤、皮肤癌和胶质瘤等。

本发明的药物化合物的疗效和毒性用体外细胞或体内动物实验来确定，例如，ED50(50%effective dose，半数有效量：50%实验对象出现阳性反应时的药量）、LD50(50%lethaldose，半数致死量，杀死一半试验对象的剂量)和GI50（concentration of the anti-cancer drug thatinhibits the growth of cancer cells by50%，抑制50%的实验对象生长的药物浓度）。通常将半数致死量（LD50）／半数有效量（ED50）的比值称为治疗指数，用以表示药物的安全性。治疗指数大的药物相对治疗指数小的药物更安全。

新发明的抗癌药物化合物旨在提高治疗指数和药物的安全性，同时也提高治疗效果。从体外细胞实验和体内动物实验获得的药物剂量可以用来制定用于人体的剂量范围。这种化合物的剂量最好在很少或根本没有毒性的ED50范围内。剂量变化通常取决于采用的剂型、病人的敏感性和给药途径等。通常可用相同或类似药物，如伊立替康和拓扑替康的常规剂量做参考。例如拓扑替康的常规剂量为0.2-1.5mg/m²、伊立替康的常规剂量为100mg-350mg/m²。

本发明的药物化合物可以单独使用，也可与一个或多个其它的治疗药物一起使用。例如，在癌症的治疗时，这些药物化合物可与以下治疗药物一起使用，包括但不限于：雄激素抑制剂，如氟他胺（flutamide）和鲁珀若利得（luprolide）；抗雌激素，如他莫昔芬（tomoxifen）；抗代谢药物和细胞毒性药物，如道诺红菌素（daunorubicin）、五氟脲嘧啶（fluorouracil）、氟尿苷（floxuridine）、α-干扰素（interferon alpha）、甲氨蝶呤（methotrexate）、光神霉素（plicamycin）、硫基嘌呤（mecaptopurine）、硫鸟嘌呤（thioguanine）、阿霉素（adriamycin）、卡莫司汀（carmustine）、洛莫司汀（lomustine）、阿糖胞苷（cytarabine）、环磷酰胺（cyclophosphamide）、阿霉素（doxorubicin）、雌莫司汀（estramustine）、六甲蜜胺（altretamine）、羟基脲（hydroxyurea）、异环磷酰胺(ifosfamide)、甲基苄肼(procarbazine)、突变霉素（mutamycin）、白消安（busulfan）、米托蒽醌（mitoxantrone）、卡铂carboplatin）、顺铂（cisplatin）、链脲佐菌素（streptozocin）、博莱霉素（bleomycin）、放线菌素（dactinomycin）、和依达比星(idamycin)；激素，如甲孕酮（medroxyprogesterone）、炔雌二醇（ethinyl estradiol）、雌二醇（estradiol）、亮丙瑞林（leuprolide）、甲地孕酮（megestrol）、奥曲肽(octreotide)、己烯雌酚（diethylstilbestrol）、氯烯雌醚（chlorotrianisene）、足叶乙甙（etoposide）、鬼臼毒素（podophyllotoxin)和戈舍瑞林（goserelin）；氮芥衍生物，如苯丙酸氮芥（melphalan）、苯丁酸氮芥（chlorambucil）和塞替派（thiotepa）；类固醇，如倍他米松(betamethasone）；和其他抗肿瘤药物，如活牛分枝杆菌(live Mycobacterium bovis)、达卡巴嗪（dicarbazine）、天冬酰胺酶（asparaginase）、甲酰四氢叶酸（leucovorin）、米托坦（mitotane）、长春新碱（vincristine）、长春碱（vinblastine）和多西紫杉醇（taxotere）等。

附图说明

图1.为本发明所述苯丁酸氮芥衍生物XBB-001核磁共振氢谱图。

图2.为本发明所述苯丁酸氮芥衍生物XBB-001质谱图。

图3.为本发明所述苯丁酸氮芥衍生物XBB-001的液相色谱。

图4.为本发明所述苯丁酸氮芥衍生物XBB-002核磁共振氢谱图。

图5.为本发明所述苯丁酸氮芥衍生物XBB-002质谱图。

图6.为本发明所述苯丁酸氮芥衍生物XBB-002的液相色谱。

图7.为本发明所述苯丁酸氮芥衍生物XBB-003核磁共振氢谱图。

图8.为本发明所述苯丁酸氮芥衍生物XBB-003质谱图。

图9.为本发明所述苯丁酸氮芥衍生物XBB-003的液相色谱。

图10.为本发明所述苯丁酸氮芥衍生物XBB-004核磁共振氢谱图。

图11.为本发明所述苯丁酸氮芥衍生物XBB-004质谱图。

图12.为本发明所述苯丁酸氮芥衍生物XBB-004的液相色谱。

具体实施方式

下面以实施例说明本发明所述苯丁酸氮芥衍生物的合成、制剂和体外细胞实验等。

所述的实施例有助于对本发明的理解和实施，并不构成对于本发明的限制，保护范围由权利要求加以界定。

实施例1.4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸喜树碱酯（XBB-001，式Ⅱ化合物,R=H）的合成

反应式如下式所示：

实验步骤：

向100mL圆底烧瓶中，加入0.348g(1mmol)喜树碱和40mL无水DMF，加热使其溶解。

向溶液中加入0.334g(1.1mmol)4-[对双(2-氯乙基)胺基]苯丁酸，然后加入0.501g(2mmol)2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物，0.489g(4mmol)4-二甲氨基吡啶，室温搅拌，反应过夜至反应完成。向反应液中加入200mL乙酸乙酯，搅拌15分钟，转移至分液漏斗中，混合液分别用100mL食盐水洗三次，有机相用20g无水硫酸镁干燥50分钟，过滤除去硫酸镁，旋转蒸发除去溶剂乙酸乙酯。柱层分离，用100-200目硅胶为固定相，二氯甲烷和乙酸乙酯混合液为淋洗液，得淡黄色固体0.436g，产率68.8%。XBB-001核磁共振氢谱图如图1所示，质谱图如图2所示。

MS(Positive Ion mode ESI):m/z=634.2(M+H)⁺,MS(Negtive Ion Mode ESI):m/z=632.2(M-H)^-。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δppm:8.4132(s,1H),8.2582-8.2296(d,J=8.58Hz，1H),7.9683-7.9411(d,,J=8.16Hz,1H),7.8813-7.8295(t，J=7.77Hz,1H),7.7100-7.6603(t,J=7.455Hz，1H),7.2789(s,1H),7.0978-7.0707(d,J=8.13Hz,2H),6.6334-6.6073(d,J=7.83,2H),5.7199-5.1624(d,J=17.25Hz,1H),5.4473-5.3893(d,J=17.4Hz,1H),5.2961(s,2H),3.6773-3.6576(m,4H),3.6217-3.6016(m,4H),2.6152-2.5912(t,J=7.5Hz,2H),2.5329-2.4670(q,J=6.2Hz,2H),2.3347-2.2651(m,1H),2.1936-2.1218(m,1H),1.9870-1.8902(m,2H),1.0085-0.9592(t,J=7.4Hz,3H)。

XBB-001的液相色谱图如图3所示，纯度：99.07%；色谱条件：色谱柱：C18柱（5μm,150mm×5mm）；流动相：CH₃CN：IPA:HAc（95:5:0.1）；检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；进样量：5μL；柱温：40℃。

实施例2.4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸7-乙基-10-羟基喜树碱酯（XBB-002，式Ⅰ化合物，R为乙基）的合成

反应式如下式所示：

实验步骤：

向100mL圆底烧瓶中加入0.456g(1.5mmol)4-[对双(2-氯乙基)胺基]苯丁酸、30mL无水甲苯、600μL亚硫酰氯和2滴无水DMF，氮气保护，室温搅拌6小时，减压旋转蒸发掉过量的亚硫酰氯和无水甲苯，然后加入10mL三氯甲烷溶解剩余物，得溶液A。

称取0.392g(1mmol)7-乙基-10-羟基喜树碱，加入到另一个100mL的圆底烧瓶中，加入20mL无水DMF，加热搅拌使其溶解，加入250μL无水三乙胺。向上述溶液经滴液漏斗慢慢滴加溶液A，60分钟滴加完毕，室温搅拌，反应过夜至反应完成。旋转蒸发掉部分溶剂，向反应液中加入200mL乙酸乙酯，搅拌15分钟，转移至分液漏斗中，混合液分别用100mL食盐水洗三次，有机相用20g无水硫酸镁干燥50分钟，过滤除去硫酸镁，旋转蒸发除去溶剂乙酸乙酯。柱层分离，用100-200目硅胶为固定相，二氯甲烷和乙酸乙酯混合液为淋洗剂，产物真空干燥，得淡黄色固体0.460g，产率67.8%。

XBB-002的核磁共振氢谱图如图4所示，质谱图如图5所示。

MS(Positive Ion mode ESI):m/z=678.2(M+H)⁺,700.2(M+Na)⁺,MS(Negtive Ion ModeESI):m/z=676.3(M-H)^-。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δppm:8.2788-8.2484(d,J=9.12Hz,1H),7.8243-7.8165(d,J=2.34Hz，1H),7.6913(s,1H),7.5533-7.5149(dd，J=2.31和9.15Hz,1H),7.1614-7.1330(d,J=8.52Hz，2H),6.7171-6.6885(d,J=8.58Hz,2H),5.7798-5.7252(d,J=16.38,1H),5.3353-5.2804(d,J=16.47Hz,1H),5.2654(s,2H),3.7442-3.7020(m,4H),3.6598-3.6096(m,4H),3.1981-3.1229(q,J=7.52Hz,2H),2.738-2.6549(q,J=7.79Hz,4H),2.1576-2.0578(m,2H),1.9476-1.8278(m,2H),1.4273-1.3766(t,J=7.60Hz,3H),1.0656-1.0166(t,J=7.35Hz,3H)。

XBB-002的液相色谱图如图6所示，纯度：98.8%；色谱条件：色谱柱：C18柱（5μm,150mm×5mm）；流动相：乙腈:水（70:30）；检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；进样量：5μL；柱温：40℃。

实施例3.4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸10-羟基喜树碱酯（XBB-003，式Ⅰ化合物，R=H）的合成

反应式如下式所示：

实验步骤：

向100mL圆底烧瓶中加0.456g(1.5mmol)4-[对双(2-氯乙基)胺基]苯丁酸、30mL无水甲苯、600μL亚硫酰氯和2滴无水DMF，氮气保护，室温搅拌6小时，减压旋转蒸发掉过量的亚硫酰氯和无水甲苯，然后加入10mL三氯甲烷溶解剩余物，得溶液A。

称取0.364g(1mmol)10-羟基喜树碱，加入到另一个100mL的圆底烧瓶中，加入20mL无水DMF，加热搅拌使其溶解，加入250μL无水三乙胺。向上述溶液经滴液漏斗慢慢滴加溶液A，60分钟滴加完毕，室温搅拌，反应过夜至反应完成。旋转蒸发掉部分溶剂，向剩余的反应液中加入200mL乙酸乙酯，搅拌15分钟，混合液转移至分液漏斗中，分别用100mL食盐水洗三次，有机相用20g无水硫酸镁干燥50分钟，过滤除去硫酸镁，旋转蒸发除去掉溶剂乙酸乙酯。柱层分离，用100-200目硅胶为固定相，二氯甲烷和乙酸乙酯混合液为淋洗液，得淡黄色固体0.462g，产率71.1%。

XBB-003核磁共振氢谱图如图7所示，质谱图如图8所示。

XBB-003的液相色谱图如图9所示，纯度：94.55%；色谱条件：色谱柱：C18柱（5μm,150mm×5mm）；流动相：乙腈:水（80:20）；检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；进样量：5μL；柱温：40℃。

MS(Positive Ion mode ESI):m/z=650.2(M+H)⁺,MS(Negtive Ion Mode ESI):m/z=648.2(M-H)^-。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δppm:8.3330(s,1H),8.2554-8.2246(d,J=9.24Hz,1H),7.6727(s,1H),7.6601(s,1H),7.5611-7.5225(dd，J=2.49和9.15Hz,1H),7.1623-7.1338(d,J=8.55Hz，2H),6.7314-6.7029(d,J=8.55Hz,2H),5.7770-5.7224(d,J=16.38,1H),5.3342-5.2799(d,J=16.29Hz,1H),5.2949(s,2H),3.7428-3.7009(m,4H),3.6599-3.6167(m,4H),2.7304-2.6438(m,4H),2.1502-2.0502(m,2H),1.9731-1.8315(m,2H),1.0707-1.0216(t,J=7.36Hz,3H)。

实施例4.7-乙基-10-羟基喜树碱二{4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸}酯（XBB-004）的合成

反应式如下式所示：

实验步骤：

向100mL圆底烧瓶中，加入0.392g(1mmol)7-乙基-10-羟基喜树碱和40mL无水DMF，加热使其溶解。向溶液中加入0.639g(2.1mmol)4-[对双(2-氯乙基)胺基]苯丁酸，然后加入1.002g(4mmol)2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物，0.978g(8mmol)4-二甲氨基吡啶，室温搅拌，反应过夜至反应完成。向反应液中加入200mL乙酸乙酯，搅拌15分钟，转移至分液漏斗中，混合液分别用100mL食盐水洗三次，有机相用20g无水硫酸镁干燥50分钟，过滤除去硫酸镁，旋转蒸发除去溶剂乙酸乙酯。柱层分离，用100-200目硅胶为固定相，二氯甲烷和乙酸乙酯混合液为淋洗液，得淡黄色固体0.690g，产率71.5%。

XBB-004核磁共振氢谱图如图10所示，质谱图如图11所示。

XBB-004的液相色谱图如图12所示，纯度：96.82%；色谱条件：色谱柱：C18柱（5μm,150mm×5mm）；流动相：乙腈:水（85:15）；检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；进样量：5μL；柱温：40℃。

MS(Positive Ion mode ESI):m/z=963.30(M+H)⁺,。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δppm:8.2322-8.2139(d,J=15.2Hz,1H),7.8266-7.8224(d,J=2.1Hz,1H),7.5618-7.5395(dd，J=2.1和9.15Hz,1H),7.2198(s,1H),7.1442-7.1273(d,J=8.45Hz，2H),7.0801-7.0632(d,J=8.45Hz,2H),6.6851-6.6681(d,J=8.50Hz,2H),6.6112-6.5943(d,J=8.45Hz,2H),5.7015-5.6671(d,J=17.2,1H),5.4330-5.3987(d,J=17.15Hz,1H),5.2508-5.2454(d,J=2.7Hz,2H),3.7335-3.5823(m,16H),3.1594-3.1440(m,2H),2.7176-2.6611(m,4H),2.5951-2.5656(m,2H),2.4968-2.4743(m,2H),2.3400-2.110(m,1H),2.1573-2.0910(m,3H),1.9465-1.9169(m,2H),1.4058-1.3752(t,J=7.65Hz,3H),0.9916-0.9619(t,J=7.43Hz,3H)。

实施例5.本发明所述苯丁酸氮芥衍生物的制剂，包括乳剂、胶束剂、脂质体剂、片剂、胶囊剂和膏剂配方

本实施例中，包括本发明所述苯丁酸氮芥衍生物的乳剂、胶束剂、脂质体剂、片剂、胶囊剂和膏剂配方。乳剂、胶束剂、脂质体剂、片剂、胶囊剂和膏剂配方中含有本发明所述苯丁酸氮芥衍生物，可任选式Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ化合物中的一种或几种。

1）4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸7-乙基-10-羟基喜树碱酯乳剂

4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸7-乙基-10-羟基喜树碱酯（XBB-002）溶解于豆油、吐温80和聚乙二醇PEG（200）的混合物中，再加入去离子水（DI water），然后搅拌和超声乳化或用均质机乳化，所生产的乳剂的组成如下：

制成的乳剂药品通过一个孔径0.2微米的过滤器过滤，再装入无菌的玻璃瓶。

2）4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸7-乙基-10-羟基喜树碱酯乳剂

4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸7-乙基-10-羟基喜树碱酯（XBB-002）溶解于D-α-生育酚乙酸酯、D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯（TPGS）和聚乙二醇PEG（200）的混合物中，再加入去离子水（DI water），然后搅拌和超声乳化或用均质机乳化，所生产的乳剂的组成如下：

制成的乳液药品通过一个孔径0.2微米的过滤器过滤，再装入无菌的玻璃瓶。

3）4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸喜树碱酯乳剂

4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸喜树碱酯（XBB-001）溶解于豆油、吐温80和聚乙二醇PEG（200）的混合物中，再加入去离子水（DI water），然后搅拌和超声乳化或用均质机乳化，所生产的乳剂的组成如下：

4）4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸10-羟基喜树碱酯乳剂

4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁10-羟基酸喜树碱酯（XBB-003）溶解于豆油、吐温80和聚乙二醇PEG（200）的混合物中，再加入去离子水（DI water），然后搅拌和超声乳化或用均质机乳化，所生产的乳剂的组成如下：

5）7-乙基-10-羟基喜树碱二{4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸}酯乳剂

7-乙基-10-羟基喜树碱二{4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸}酯（XBB-004）溶解于豆油、吐温80和聚乙二醇PEG（200）的混合物中，再加入去离子水（DI water），然后搅拌和超声乳化或用均质机乳化，所生产的乳剂的组成如下：

6）4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸7-乙基-10-羟基喜树碱酯的胶束剂

4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸7-乙基-10-羟基喜树碱酯（XBB-002）溶解于吐温80（Tween80）、乙醇和聚乙二醇PEG（200）的混合物中得到透明的液体，使用前再加入适量的去离子水（DI water），然后搅拌和超声搅拌，得一澄清液体，所生产的胶束剂的组成如下：

制成的胶束剂药品通过一个孔径0.2微米的过滤器过滤，备用。

7）4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸7-乙基-10-羟基喜树碱酯的胶束剂

4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸7-乙基-10-羟基喜树碱酯（XBB-002）溶解于D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯（TPGS）、乙醇和聚乙二醇PEG（200）的混合物中得到一透明的液体，使用前再加入适量的生理盐水，然后搅拌和超声搅拌，得一澄清液体，所生产的胶束剂的组成如下：

8）4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸喜树碱酯胶束剂

4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸喜树碱酯（XBB-001）溶解于聚氧乙烯蓖麻油EL(CremophorEL)、乙醇和聚乙二醇PEG（200）的混合物中得到透明的液体，使用前再加入适量的去离子水（DI water），然后搅拌和超声搅拌，得一澄清液体，所生产的胶束剂的组成如下：

9）4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸10-羟基喜树碱酯胶束剂

4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸10-羟基喜树碱酯（XBB-003）溶解于聚氧乙烯蓖麻油EL(Cremophor EL)、乙醇和聚乙二醇PEG（200）的混合物中得到透明的液体，使用前再加入适量的去离子水（DI water），然后搅拌和超声搅拌，得一澄清液体，所生产的胶束剂的组成如下：

10）7-乙基-10-羟基喜树碱二{4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸}酯胶束剂

7-乙基-10-羟基喜树碱二{4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸}酯(XBB-004）溶解于聚氧乙烯蓖麻油EL(Cremophor EL)、乙醇和聚乙二醇PEG（200）的混合物中得到透明的液体，使用前再加入适量的去离子水（DI water），然后搅拌和超声搅拌，得一澄清液体，所生产的胶束剂的组成如下：

11）4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸7-乙基-10-羟基喜树碱酯脂质体剂

在一个圆底烧瓶中，将0.01mmol7-乙基-10-羟基喜树碱4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸酯（XBB-002）和0.5mmol磷脂（卵磷脂、磷脂酰胆碱）溶解于15mL的氯仿（CHCl₃），慢慢加热至40℃，用旋转蒸发仪减压蒸发溶剂，形成一层薄的脂质膜，真空干燥过夜，进一步除去脂质膜中的氯仿，加入10mL蒸馏水，然后搅拌和超声搅拌，所得脂质体液通过一个孔径0.2微米的过滤器过滤，再装入无菌的玻璃瓶，用干冰和丙酮冷冻，然后冷冻干燥24小时，得7-乙基-10-羟基喜树碱4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸酯的脂质体剂。

用相同的方法制得4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸喜树碱酯（XBB-001）、4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸7-乙基-10-羟基喜树碱酯（XBB-003）、7-乙基-10-羟基喜树碱二{4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸}酯（XBB-004）的脂质体剂。

12）4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸7-乙基-10-羟基喜树碱酯胶囊剂（(湿法制粒)处方量的XBB-002与处方量的羟基乙酸淀粉钠混合后，加入处方量的吐温80水溶液后进行湿法制粒，制得的湿材料在流化床、干燥盘或其它适当干燥器中干燥，将干燥后的颗粒碾磨至合适的粒径分布，再与处方量的其它组分混合，最后将混合物装入两片硬明胶胶囊壳体中。

组分	每颗胶囊的含量（mg）	每组分的百分含量（%）
			XBB-002	100	40
吐温80	5	2
			乳糖	50	20
硬脂酸镁	5	2
			羟基乙酸淀粉钠	90	36
每颗胶囊总重量	250

用相同的方法制得4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸喜树碱酯（XBB-001）、4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸7-乙基-10-羟基喜树碱酯（XBB-003）、7-乙基-10-羟基喜树碱二{4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸}酯（XBB-004）的胶囊剂。

13）4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸7-乙基-10-羟基喜树碱酯片剂(湿法制粒)

处方量的十二烷基硫酸钠水溶液与处方量的XBB-002、淀粉甘醇酸钠和微晶纤维素制粒，制得的湿材料在流化床、干燥盘或其它适当干燥器中干燥，干燥后的颗粒碾磨至所需的粒径分布，然后将混合物压制成片。

组分	每片的含量（mg）	每组分的百分含量（%）
			XBB-002	300	50
十二烷基硫酸钠	12	2
			乳糖	42	7
硬脂酸镁	6	1
			羟基乙酸淀粉钠	120	20
微晶纤维素	120	20
			每颗胶囊总重量	600

用相同的方法制得4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸喜树碱酯（XBB-001）、4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸7-乙基-10-羟基喜树碱酯（XBB-003）、7-乙基-10-羟基喜树碱二{4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸}酯（XBB-004）的片剂(湿法制粒)。

14）4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸7-乙基-10-羟基喜树碱酯片剂(干法制粒)

首先将XBB-002原料粉碎过筛，控制粒径小于80μm，再将处方量的XBB-002与微粉硅胶混匀，加入处方量的淀粉、蔗糖、交联羧甲基纤维素钠，混匀，干法制粒，制粒后，加入处方量的硬脂酸镁，混匀，压片，包薄膜衣。

组分	每片的含量（mg）每组分的百分含量（%）
		XBB-002	10050
淀粉	5226
		蔗糖	157.5
交联羧甲基纤维素钠	157.5
		微粉硅胶	157.5
硬脂酸镁	31.5
		每颗胶囊总重量	200

用相同的方法制得4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸喜树碱酯（XBB-001）、4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸7-乙基-10-羟基喜树碱酯（XBB-003）、7-乙基-10-羟基喜树碱二{4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸}酯（XBB-004）的片剂(干法制粒)。

15）4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸7-乙基-10-羟基喜树碱酯膏剂

取适量4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸7-乙基-10-羟基喜树碱酯（XBB-002）、硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、液体石蜡、聚乙二醇200（PEG200）、吐温-80加热熔化；另取适量甘油、水加热至70-80℃，在搅拌下加入至油相中，继续搅拌至成型，所生产的膏剂的组成如下：

用相同的方法制得4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸喜树碱酯（XBB-001）、4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸7-乙基-10-羟基喜树碱酯（XBB-003）、7-乙基-10-羟基喜树碱二{4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸}酯（XBB-004）的膏剂。

实施例6.本发明所述苯丁酸氮芥衍生物的体外细胞毒性实验

1）实验一

本实验对比本发明所述苯丁酸氮芥衍生物和抗癌药伊立替康（irinotican）抑制A549（人非小细胞肺癌）、BGC-823（人胃腺癌细胞）、HepG2细胞（人肝癌细胞）、K562细胞（人慢性髓原白血病细胞）、HT-29细胞（人结肠癌细胞）的GI50值（抑制癌细胞50%生长的药物浓度），评价药物化合物的体外细胞毒性。贴壁细胞采用SRB法，悬浮细胞采用CCK-8法。

IC50值如表1所示，实验结果表明，本发明所述苯丁酸氮芥衍生物对以上5种癌细胞具有明显的增殖抑制作用，抑制活性都高于伊立替康，尤其是XBB-002对癌细胞有很强的抑制活性。伊立替康在48小时的IC50值在10μM左右，而XBB-002的IC50值在0.1μM左右，远低于irinotecan的IC50值，说明XBB-002对癌细胞的抑制活性远高于伊立替康。并且XBB-002在高浓度时的抑制率高达100%，可以杀死癌细胞。

实验步骤：

a.取处于指数生长期状态良好的细胞一瓶，加入0.25％胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，计数制成细胞悬液；

b.5%FBS，置恒温CO₂培养箱中培养24小时；

c.加入药物化合物，10μL/孔；贴壁细胞T0组加用三氯醋酸（TCA）固定；

d.48小时后悬浮细胞加CCK-8，10μL/孔，37℃孵育2小时后读取450nm处吸光度值，计算抑制率；

e.贴壁细胞用三氯醋酸（TCA）固定，每个小孔加预冷的50%TCA液25μL(TCA最终浓度为10%)固定，加TCA时必须轻轻地加在培养液表面，静止5min之后再将平板移至4℃放置1h，这样可使细胞固定在培养孔的底部；

f.倒掉固定液，小孔用去离子水洗5遍，甩干，空气干燥；

g.SRB用1%醋酸配成0.4%溶液，每孔加入100μLSRB液，在室温放置10min。未与蛋白结合的SRB用1%醋酸洗5次，空气干燥；

h.结合的SRB用150μL10mmol/L非缓冲Tris碱液(pH10.5)溶解；

i.读取515nm处吸光度值，计算抑制率。

表1.本发明所述苯丁酸氮芥衍生物与抗癌药伊立替康IC50(μM)的对比（48小时）

药物	A549	BGC-823	HepG2	HT-29	K562
						Irinotecan	9.43	28.25	5.63	17.46	10.81
XBB-002	0.044	0.037	0.024	0.195	0.043

2）实验二

本实验用MTT法考察了XBB-001、XBB-002、XBB-004三种药物对人源结肠癌细胞Caco-2的抑制作用，并与抗癌药伊立替康（irinotican）进行对比，评价药物化合物的体外细胞毒性。

IC50值如表2所示，实验结果表明，本发明所述苯丁酸氮芥衍生物对人源结肠癌细胞Caco-2具有明显的增殖抑制作用，且随着药物浓度的增加，其对细胞的增殖抑制作用增强，并可杀死癌细胞。

表2.本发明所述苯丁酸氮芥衍生物与抗癌药伊立替康IC50(μM)的对比（48小时）

实验步骤：

Caco-2细胞系培养至状态和活力良好后收集对数期细胞，接种于96孔培养板上，铺板使待测细胞密度为8×10³每孔，边缘孔用无菌PBS填充。5%CO₂，37℃细胞培养箱孵育，待细胞贴壁长至60%-70%后即可开始试验。每组均设空白对照组，阴性对照组和给药组。其中空白对照组不含细胞，阴性对照组不加药，给药组浓度（终浓度）梯度设置如3.1所示。

将各化合物溶解配制好后，过滤灭菌，用培养基逐级稀释为相应浓度。每孔加样量150μL（控制终体积中DMSO含量为0.5%），每种给药剂量设6个复孔。5%CO₂，37℃细胞培养箱孵育48h后，将孔内的含药培养基吸出，PBS清洗两遍后，加入200μL经过滤后无菌的MTT溶液（0.5mg/mL），放置细胞培养箱中继续培养4h。终止培养，弃上清。每孔加入150μL DMSO，37℃下置摇床上低速振荡10min，使甲紫结晶物充分溶解，于490nm波长处测定OD值。

每孔加入200μl并设有含0.5%DMSO的空白对照组（n=6）。培养48h后，弃去上层培养基，并用PBS清洗细胞两遍，加入0.5mg/ml的MTT溶液。4h后弃去上清，加入150ul/孔DMSO终止反应。摇床混匀10min后，振荡混匀10min，待结晶完全溶解后，在酶标仪上检测波长为490nm处各孔的吸光度（D）值。按以下公式计算细胞的生长抑制率：抑制率%=（阴性对照组-给药组）/阴性对照组×100%。

Claims

1.具有下式Ⅰ或II或III结构的苯丁酸氮芥衍生物及其药学上可接受的盐：

其中：R是H或C1-C6直链或支链的饱和或不饱和烃基。

2.根据权利要求1所述的苯丁酸氮芥衍生物及其药学上可接受的盐，其特征在于R是H、CH₃、CH₂CH₃、CH₂CH₂CH₃或CH(CH₃)₂。

3.根据权利要求1或2所述的苯丁酸氮芥衍生物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸与酰氯化试剂反应生成4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酰氯；

(2)将步骤(1)得到的4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酰氯与7-R-10-羟基喜树碱或10-羟基喜树碱反应，在碱的作用下生成具有通式Ⅰ或III结构的化合物，或者与喜树碱反应，在碱作用下生成具有通式II结构的化合物，所述7-R-10-羟基喜树碱的R是C1-C6直链或支链的饱和或不饱和烃基。

4.根据权利要求1或2所述的苯丁酸氮芥衍生物的制备方法，其特征在于在偶联剂作用下，将4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸分别与7-R-10-羟基喜树碱或10-羟基喜树碱或喜树碱反应，生成具有通式Ⅰ或II或III结构的化合物，所述7-R-10-羟基喜树碱的R是C1-C6直链或支链的饱和或不饱和烃基。

5.根据权利要求3或4所述的苯丁酸氮芥衍生物的制备方法，其特征在于所述7-R-10-羟基喜树碱的R是CH₃、CH₂CH₃、CH₂CH₂CH₃或CH(CH₃)₂。

6.根据权利要求4所述的苯丁酸氮芥衍生物的制备方法，其特征在于所述偶联剂为4-二甲氨基吡啶和2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物或N,N′-二环己基碳化二亚胺和4-二甲氨基吡啶。

7.权利要求1或2所述的苯丁酸氮芥衍生物在制备抗癌药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述癌症包括血液系统的癌症、实体瘤癌、肉瘤或胶质瘤。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述癌症包括白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、胃癌、肝癌、肉瘤、皮肤癌或胶质瘤。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述药物包括有效治疗量的式Ⅰ或II或III化合物以及药学上可接受的药物载体。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于所述药物为注射剂、口服制剂或外用制剂。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于所述药物为乳剂、微乳剂、胶束剂、脂质体、片剂、胶囊剂、膏剂。