CN104693204A - 吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪类衍生物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有式I结构的吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪类衍生物，其互变异构体，立体异构体及其盐，特别是其与无机或有机的酸或碱所形成的药学上可接受的盐，涉及其制备方法，并涉及利用这些化合物的受体酪氨酸激酶抑制特性在制备治疗增生性疾病如癌症的药物中的应用。

Description

吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪类衍生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪类衍生物、其制备方法及含有该衍生物的药物组合物以及其作为治疗剂特别作为蛋白激酶抑制剂的用途，本发明还涉及该类化合物的中间体。

背景技术

蛋白激酶(Protein Kinases)是目前已知的最大蛋白家族，所有激酶都有非常保守的催化核心和多样的调控模式，并且这些催化核心的一级结构都有很高的同源性，但每一类都有其特异性。蛋白激酶的作用是将ATP的γ-磷酸基转移至它们底物上特定的氨基酸残基。依据这些氨基酸残基的特异性，蛋白激酶可以分为4类，其中主要的两类是蛋白酪氨酸激酶(ProteinTyrosine Kinase,PTK)和蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶(STK)。这两类酶的激酶结构域大小约为250～300个氨基酸残基，催化域的氨基酸残基序列大致相近。更重要的是，这些序列表现为一组高度保守的，甚至是完全保守的氨基酸模体，这些模体却嵌埋在氨基酸残基序列保守性很差的区域之内。

酪氨酸激酶家族以跨膜受体或胞质形式广泛地参与细胞信号传导，按其在细胞内的存在位置可大致分为三类：1)受体酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinases，RTKs)，为单次跨膜蛋白；2)胞质酪氨酸激酶，如Src家族、Tec家族、ZAP70家族、JAK家族等；3)核内酪氨酸激酶如Abl和Wee；如按基因的类型则可以分为两类：癌基因产物和生长因子受体。人类基因组中的蛋白激酶由30种酪氨酸激酶家族构成，包含约90种不同的蛋白酪氨酸激酶，其中58种为受体酪氨酸激酶。

酪氨酸激酶在细胞致癌性转化中具有重要作用：基因扩增和PTK的过度表达(例如在许多癌症中都发现EGFR和HER-2的过表达)导致酪氨酸激酶活性增强，进而改变下游细胞信号；基因重排(类似于染色体易位)也会产生具有持续激酶活性的融合蛋白，例如在慢性髓细胞白血病中发现的P210^BCR-ABL融合蛋白；此外，PTK激酶区域或胞外区域功能性变异或缺失将持续激活激酶活性，例如由于缺少胞外区域中的6-273位氨基酸，EGFRvIII突变型处于持续激活状态，且常见于实体瘤。

许多酪氨酸激酶(包括受体型和非受体型)都与肿瘤有密切联系。临床研究显示酪氨酸激酶的过度表达或失调对肿瘤病人的预后以及病症的预测具有重要参考价值，如EGFR(HER-1)过度表达与卵巢癌、头颈癌、食道癌、乳腺癌、胃癌等多种癌症的预后不良有关。HER-2过度表达与乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌和骨癌患者的差治疗效果有关。

酪氨酸激酶抑制剂虽然在癌症治疗中发挥了重要作用，但其原发与获得性耐药问题已经成为限制其疗效进一步提高的瓶颈，因此对其耐药机制的深入研究，寻找克服耐药的治疗方法，已经成为肿瘤研究领域的迫切任务。目前针对酪氨酸激酶抑制剂耐药问题，临床治疗策略主要涉及一些方面：(1)研究发现不可逆的酪氨酸激酶抑制剂可用于对抗有EGFR突变癌症患者的吉非替尼和厄洛替尼的耐药性。与可逆性酪氨酸激酶抑制剂不同的是，不可逆酪氨酸激酶抑制剂与EGFR的酪氨酸激酶区永久性结合；(2)“旁路激活途径”在EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药中发挥重要作用，肿瘤细胞信号传导相互交错，单靶点药物不能阻断肿瘤细胞所有信号转导，因此开发多靶点的靶向治疗药物成为新的研究趋势；(3)某些生物学分子标记物与EGFR酪氨酸激酶抑制剂疗效相关。为使EGFR酪氨酸激酶抑制剂的临床应用更为合理有效，需确定有效的预测靶标及最佳的检测方法，选择适合的患者接受酪氨酸激酶抑制剂治疗，进一步提高癌症的疗效和生存，最大限度地避免无效的治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪类衍生物及其药学上可接受的盐，特别是其与无机或有机的酸或碱所形成的药学上可接受的盐，本发明的目的还包括提供上述喹唑啉类衍生物的制备方法，及利用这些化合物的受体酪氨酸激酶抑制特性在制备治疗增生性疾病如癌症的药物中的应用。

所述的新型的吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪类衍生物为式I所示化合物：

其中，

R₁是苯基或杂芳基，其任选被一个或多个选自下列的基团所取代：卤素、烷基、烯基、炔基、烷氧基、硝基、羟基、环烷基或杂脂环基、氰基、巯基、酰基、硫代酰基、氨基、卤代烷基、卤代烷氧基、酯基、芳基或杂芳基；

R₂是卤素、-NR₃R₄、-OR₅、-SR₆；

R₃和R₄独立地选自氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基，或者R₃和R₄与N原子合起来形成一个含N的杂芳基或杂脂环基；

R₅合R₆独立地选自氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基。

上述化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于R₁是苯基和吡啶基，其任选被一个或多个选自下列的基团所取代：卤素、炔基；优选地，R₁是3-氯-4-氟苯基或3-乙炔基苯基。

上述化合物或其药学上可接受的盐，其中，

优选地，R₂是-NR₃R₄，

R₃和R₄独立地选自氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基，或者R₃和R₄与N原子合起来形成一个含N的杂芳基或杂脂环基；

进一步优选地，R₂是-NR₃R₄，

R₃和R₄独立地选自烷基，或者R₃和R₄与N原子合起来形成一个含N的杂芳基或杂脂环基；

再进一步优选地，R₂是-NR₃R₄，

R₃和R₄独立地选自烷基，或者R₃和R₄与N原子合起来形成一个含N的杂芳基、未取代的或烷基取代杂脂环基；

更优选地，R₂是-NR₃R₄，

R₃和R₄独立地选自烷基，或者R₃和R₄与N原子合起来形成任选取代的如下基团：哌嗪子基、吗啉子基、哌啶子基、吡咯烷子基或咪唑基。

本发明优选的通式I化合物包括，但不限于：

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(哌啶-1-基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(4-甲基哌啶-1-基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(2-甲基哌啶-1-基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(二乙胺基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(吗啉-1-基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(吡咯烷-1-基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(1H-咪唑-1-基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(二甲胺基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(N-甲基哌嗪-1-基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(4-甲基哌啶-1-基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(N-甲基哌嗪-1-基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(二甲胺基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(1H-咪唑-1-基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(2-甲基哌啶-1-基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(二乙胺基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(吗啉-1-基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(吡咯烷-1-基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(哌啶-1-基)丁烯-2-酰胺；

或其药学上可接受的盐。

本发明中，所述“药学上可接受的盐”表示保留母体化合物的生物有效性和性质的那些盐。这类盐包括但不限于：

(1)与酸成盐，通过母体化合物的游离碱与无机酸或有机酸的反应而得，无机酸例如(但不限于)盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、偏磷酸、硫酸、亚硫酸和高氯酸等，有机酸例如(但不限于)乙酸、丙酸、丙烯酸、草酸、(D)或(L)苹果酸、富马酸、马来酸、羟基苯甲酸、γ-羟基丁酸、甲氧基苯甲酸、邻苯二甲酸、甲磺酸、乙磺酸、萘-1-磺酸、萘-2-磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、扁桃酸、琥珀酸或丙二酸等，优选盐酸或对甲苯磺酸。

(2)存在于母体化合物中的酸性质子被金属离子代替或者与有机碱配位化合所生成的盐，金属离子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子，有机碱例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等。

本发明的另一方面是提供一种制备通式I化合物或其药学上可接受的盐的方法。

本发明首先提供了一种式II化合物作为制备通式I化合物的关键中间体：

其中R₁的定义如前述式I化合物中所述。

式II化合物可以直接制备式Ia化合物，Ia化合物可以进一步制备得到其他式I化合物，从而完成通式I化合物的制备。

所述式II化合物与卤代巴豆酰氯进行酰化，得到式Ia化合物，

其中Z选自卤素，R₁的定义如前述式I化合物1中所述。

所述式Ia化合物与取代胺进行亲核取代反应，进一步得到通式I化合物，

其中Z选自卤素，R₁和R₂的定义如前述式I化合物中所述，R₂不包括卤素，并

并进一步地，如有需要，再裂解去除上述反应中所用的任何保护基；及/或

如有需要，将制得的通式I化合物解析成为其立体异构体；及/或

如有需要，将制得的通式I化合物转化成为其盐，特别是转化成供医药用的其药学上可接受的盐。

本发明的另一个方面在于提供一种药物组合物，其特征在于所述药物组合物包含上述的通式I化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的稀释剂或载体。

本发明的化合物可以以前药的形式给药。前药是指经过生物体内转化后成为具有药理作用的上述通式I化合物。可使用前药可以改变本发明化合物的物理化学性质或药物动力学方面性质。当本发明的化合物含有可连接改变性质基团的适当基团或取代基团时，可形成前药。

本发明的另一方面是提供通式I化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗与蛋白激酶有关的疾病的药物中的用途。所述蛋白激酶选自EGFR受体酪氨酸激酶和HER-2受体酪氨酸激酶。

本发明的另一方面是提供含有通式I化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物在制备治疗与蛋白激酶有关的疾病的药物中的用途。所述蛋白激酶选自EGFR受体酪氨酸激酶和HER-2受体酪氨酸激酶。

除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。

“烷基”表示1-20个碳原子的饱和的脂烃基，包括直链和支链基团(本申请书中提到的数字范围，例如“1-20”，是指该基团，此时为烷基，可以含1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，直至包括20个碳原子)。含1-4个碳原子的烷基称为低级烷基。当低级烷基没有取代基时，称其为未取代的低级烷基。更优选的是，烷基是有1-10个碳原子的烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基等。最好是，烷基为有1-4个碳原子的低级烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基或叔丁基等。烷基可以是取代的或未取代的。当是取代烷基时，该取代基优选是一或多个，更优选1-3个，最优选1或2个取代基，它们独立地优选自以下的基团：卤素、羟基、低级烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳环、杂脂环基和酯基。

“环烷基”表示全部为碳的单环或稠合的环(“稠合”环意味着系统中的每个环与系统中的其他环共享毗邻的一对碳原子)基团，含有4－9个碳原子，优选5、6或7个碳原子，更优选5或6个碳原子，其中一个或多个环不具有完全连接的π电子系统，任选包含一个或多个双键和/或三键形式的不饱和状态。环烷基的可为取代的和未取代的。未取代环烷基实例(不局限于)为环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷、金刚烷、环己二烯、环庚烷和环庚三烯。当被取代时，取代基优选为一个或多个各自选自以下的基团，包括：烷基、芳基、杂芳基、杂脂环基、羟基、烷氧基、芳氧基、巯基、烷巯基、氰基、卤素、羰基、硫代羰基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基和氨基。

“芳基”表示6至18个碳原子、优选6－12个碳原子、更优选6－10个碳原子的全碳单环或稠合多环基团，具有完全共轭的π电子系统。芳基可以是取代的或未取代的。未取代的芳基的非限制性实例有苯基、萘基、蒽基和菲基。当被取代时，取代基优先选为一个或多个，更优选为一个、两个或三个，进而更优选为一个或两个，独立地选自卤素、烷基、烯基、炔基、烷氧基、硝基、羟基、环烷基或杂脂环基、氰基、巯基、酰基、硫代酰基、氨基、硝基、卤代烷基、卤代烷氧基、酯基、芳基或杂芳基等基团。优选的，芳基任选地被一个或两个取代基取代，取代基独立地选自卤素、低级烷基、三卤烷基、烯基、炔基、氰基、酯基或硝基。

“杂芳基”表示5-18个环原子的单环或稠合环基团，优选含有5－12个环原子，更优选含有6－10个环原子，其含有一个、两个、三个或四个选自N、O或S的环杂原子，其余环原子是C，另外具有完全共轭的π电子系统。未取代的杂芳基非限制性实例有吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、嘧啶、喹啉、异喹啉、嘌呤、四唑、三嗪、咔唑、吡啶、异噁唑、异噻唑、呋咱、哒嗪、噻二唑、吲哚、异吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并咪唑、苯并噻唑、苯并呋咱、喹唑啉、萘啶、吡唑并嘧啶。杂芳环可以是取代的或未取代的。当被取代时，取代基优选为一个或多个，更为优选为一个、两个或三个，进而更为优选一个或两个，独立地选自以下基团，包括卤素、烷基、烯基、炔基、烷氧基、硝基、羟基、环烷基或杂脂环基、氰基、巯基、酰基、硫代酰基、氨基、硝基、卤代烷基、卤代烷氧基、酯基、芳基或杂芳基等基团。优选的杂芳基任选地被一个或两个取代基取代，取代基独立地选自卤素、低级烷基、三卤烷基、烯基、炔基、氰基、酯基或硝基。

“杂脂环基”表示单环或稠合环基团，在环中具有5－18个、优选6－12个，更优选6-9个环原子，其中一个或两个环原子选自N、O或S(O)_m(其中m是0至2的整数)的杂原子，其余环原子是C。这些环可以具有一条或多条双键，但这些环不具有完全共轭的π电子系统。未取代的杂脂环基的非限制性实例有吡咯烷基、哌啶子基、吗啉子基、哌嗪子基、硫代吗啉子基、高哌嗪子基等。杂脂环基可以是取代的或未取代的。当被取代时，取代基优选为一个或多个、更优选为一个、两个或三个，进而更优选为一个或两个，独立地选自以下基团，包括：低级烷基、三卤烷基、卤素、羟基、低级烷氧基、巯基、(低级烷基)硫基、氰基、羰基、硫代羰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、硝基、N-磺酰氨基、S-磺酰氨基。优选的杂芳基任选地被一个或两个取代基取代，取代基独立地选自卤素、低级烷基、三卤烷基、氰基、酯基或硝基。

“羟基”表示-OH基团。

“烯基”表示具有2～6个碳原子和1～3根双键的直链或支链基团。

“炔基”表示具有2～6个碳原子和1～3根三键的直链或支链基团。

“烷氧基”表示-O-(烷基)和-O-(环烷基)，其中烷基和环烷基定义如上。代表性实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基等。

“芳氧基”表示-O-芳基和-O-杂芳基，其中芳基和杂芳基定义如上。代表性实例包括但不限于苯氧基、吡啶氧基、呋喃氧基、噻吩氧基、嘧啶氧基、吡嗪氧基等及其衍生物、

“巯基”表示-SH基团

“酰基”表示-C(O)-R’基团，其中R’是选自以下基团：氢，未取代的烷基、三卤甲基、未取代的环烷基、任选地被一或多个、优选被1、2或3个选自未取代的烷基、三卤甲基、未取代的烷氧基和卤素取代的芳基，上述烷基、环烷基、烷氧基和芳基定义如上。

“硫代酰基”表示-C(S)-R’，其中R’定义同上。

“酯基”表示-C(O)O-R’基团，其中R’定义同上，但是R’不能是氢。

“卤素”表示氟、氯、溴或碘，优选氟、氯或溴。

“氰基”表示-CN基团。

“氨基”表示-NH₂基团。

“硝基”表示-NO₂基团。

“卤代烷基”表示烷基被一个或多个相同或不同的卤原子取代，优选如上所定义的低级烷基被一个或多个相同或不同的卤原子取代，其中烷基定义如上，例如-CH₂Cl、-CF₃、-CH₂CF₃、-CH₂CCl₃等。

“卤代烷氧基”表示烷氧基被一个或多个相同或不同的卤原子取代，其中烷氧基定义如上，例如-OCH₂Cl、-OCF₃、-OCH₂CF₃、-OCH₂CCl₃等。

“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生和不发生的场合。例如，“杂芳基任选地被一个或两个取代基取代”意味着杂芳基的取代基可以但不必是一个，该说明包括杂芳基被一个取代基取代的情形和杂芳基被两个取代基取代的情形。

“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/药学上可接受的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/药学上可接受的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进生物体的给药，利用活性成分的吸收进而发挥生物活性。

具体实施方式

以下结合实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制本发明的范围。

制备例1

4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-6-{[4-溴-1-氧-2-丁烯-1-基]氨基}-吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪

步骤1

将1a（20.0g，0.09mol），三氯氧磷（41.4g，0.27mol），4-二甲氨基吡啶(DMAP)（32.0g，0.27mol）和150ml甲苯置入250ml反应瓶中，氮气保护下加热至110℃反应6h。TLC监测反应结束后冷却至室温，减压浓缩蒸除溶剂，加入200ml冰水，搅拌，析出大量固体。过滤，滤饼用冰水洗涤，真空干燥过夜，得淡黄色固体(化合物1b)19.1g，收率88.8%。

步骤2

将1b（19.0g，79.5mmol），3-氯-4-氟苯胺（11.6g，79.5mmol）和300ml异丙醇置入500ml反应瓶中，80℃反应2h，TLC监测反应结束后，冷却至室温，过滤，固体用异丙醇洗涤，真空干燥过夜。得黄色固体(化合物1c)28.5g，收率92.8%。ESI-MS m/z：349[M+H]⁺。

步骤3

将1c（28.0g，0.08mol），氢氧化钠（9.60g，0.24mol），150ml甲醇和150ml水置入500ml反应瓶中，60℃反应2h，TLC监测反应结束后，冷却至室温，用乙酸调至pH约为7，大量固体析出。过滤，固体用水洗涤，真空干燥过夜。得淡黄色固体（化合物1d）24.6g，收率96.1%。ESI-MS m/z：321[M+H]⁺。

步骤4

将1d（24.0g，75.0mmol），叠氮磷酸二苯酯DPPA（24.8g，0.09mol），三乙胺（9.09g，0.09mol），300ml甲苯置入500ml反应瓶中，氮气保护下加热至85℃反应4h。然后加入叔丁醇（11.1g，0.15mol），85℃过夜。冷却至室温，浓缩后柱层析纯化[洗脱剂：乙酸乙酯：石油醚=1:4]。得黄色固体（化合物1e）7.35g，收率25.1%。ESI-MS m/z：392[M+H]⁺。

步骤5

将1e（7.00g，17.9mmol），三氟乙酸14ml，二氯甲烷150ml置入250ml反应瓶中，室温反应4h。TLC监测反应结束，浓缩除去溶剂得油状物，柱层析提纯[洗脱剂：乙酸乙酯：石油醚=1:1]。得黄色固体（化合物1f）3.53g，收率67.8%。ESI-MS m/z：292[M+H]⁺。

步骤6

将1f（3.50g，12.0mmol），4-溴巴豆酸（1.96g，12.0mmol），2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯HATU（5.47g，14.4mmol），三乙胺（2.42g，24.0mmol）和DMF50ml置入250ml反应瓶中，室温反应1h。TLC监测反应结束，加入200ml水，用二氯甲烷100ml×3萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩得油状物，柱层析提纯[洗脱剂：乙酸乙酯：石油醚=3:1]。得黄色固体（化合物1g）2.45g，收率46.7%。ESI-MS m/z：438[M+H]⁺。¹H-NMR(DMSO-d₆,500MHz)δ(ppm)：9.74(br s,1H,CONH),8.58(s,1H,NH),8.04(s,1H,Ar-H),7.98(dd,J=2.5,6.5Hz,1H,Ar-H),7.91(s,1H,Ar-H),7.67-7.70(m,1H,Ar-H),7.42(t,J=9.0Hz,1H,Ar-H),6.59(td,J=6.0,9.0Hz,1H,CH=CH),6.51(d,J=13.5Hz,1H,CH=CH),3.40(s,2H,CH₂),2.54(s,3H,CH₃).

实施例1

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(哌啶-1-基)丁烯-2-酰胺

将化合物1g(200mg)溶解于丙酮(5ml)中，加入哌啶(39mg)和碳酸钾(95mg)。室温反应2小时，点板基本反应完全，过滤，减压蒸除溶剂，粗品用柱层析(二氯甲烷/甲醇=10:1)纯化，得到白色固体(化合物1)82mg，收率40.6%。ESI-MS m/z：443[M+H]⁺；¹H-NMR(DMSO-d₆,300MHz)δ(ppm)：9.69(s,1H,CONH),8.59(s,1H,NH),8.14(s,1H,Ar-H),7.97-7.99(m,1H,Ar-H),7.91(s,1H,Ar-H),7.68-7.70(m,1H,Ar-H),7.42(t,J=9.1Hz,1H,Ar-H),6.75(td,J=5.8,9.6Hz,1H,CH=CH),6.47(d,J=15.5Hz,1H,CH=CH),3.11(s,2H,CH₂),2.56(s,3H,CH₃),2.39(s,4H,2×CH₂),1.54(s,4H,2×CH₂),1.40(s.2H,CH₂).

实施例2

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(4-甲基哌啶-1-基)丁烯-2-酰胺

具体实验操作同实施例2，投入化合物1g(100mg)、4-甲基哌啶(25mg)和碳酸钾48mg，得白色固体(化合物2)40mg，收率38.4%。ESI-MS m/z：457[M+H]⁺；1H-NMR(DMSO-d₆,500MHz)δ(ppm)：9.74(br s,1H,CONH),8.62(s,1H,NH),8.16(s,1H,Ar-H),7.99(dd,J=2.5,6.5Hz,1H,Ar-H),7.71(s,1H,Ar-H),7.68-7.71(m,1H,Ar-H),7.44(t,J=9.0Hz,1H,Ar-H),6.76(td,J=6.0,9.0Hz,1H,CH=CH),6.50(d,J=13.5Hz,1H,CH=CH),3.13(s,2H,CH₂),2.84(s,2H,CH₂),2.57(s,3H,CH₃),1.95(s,2H,CH₂),1.62(s,2H,CH₂),1.37(s,1H,CH),1.21(s,2H,CH₂),0.91(d,J=6.0Hz,3H,CH₃).

实施例3

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(2-甲基哌啶-1-基)丁烯-2-酰胺

具体实验操作同实施例2，投入化合物1g(100mg)、2-甲基哌啶(25mg)和碳酸钾48mg，得白色固体(化合物3)30mg，收率28.8%。ESI-MS m/z：457[M+H]⁺；¹H-NMR(DMSO-d₆,300MHz)δ(ppm)：9.69(br s,1H,CONH),8.59(s,1H,NH),8.15(s,1H,Ar-H),7.98(dd,J=2.3,6.7Hz,1H,Ar-H),7.91(s,1H,Ar-H),7.67-7.70(m,1H,Ar-H),7.42(t,J=9.1Hz,1H,Ar-H),6.74(td,J=5.8,15.4Hz,1H,CH=CH),6.46(d,J=15.3Hz,1H,CH=CH),3.10(d,J=5.4Hz,2H,CH₂),2.81(d,J=11.0Hz,2H,CH₂),2.56(s,3H,CH₃),1.93(t,J=10.8Hz,2H,CH₂),1.59(d,J=15.3Hz,2H,CH₂),1.33(s,1H,CH),1.15-1.22(m,2H,CH₂),0.90(d,J=6.3Hz,3H,CH₃).

实施例4

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(二乙胺基)丁烯-2-酰胺

具体实验操作同实施例2，投入化合物1g(100mg)、二乙胺(17mg)和碳酸钾48mg，得白色固体(化合物4)30mg，收率30.3%。ESI-MS m/z：431[M+H]⁺；¹H-NMR(DMSO-d₆,500MHz)δ(ppm)：9.76(br s,1H,CONH),8.62(s,1H,NH),8.16(s,1H,Ar-H),7.99(dd,J=2.5,7.0Hz,1H,Ar-H),7.92(s,1H,Ar-H),7.69-7.71(m,1H,Ar-H),7.44(t,J=9.0Hz,1H,Ar-H),6.79(td,J=6.0,15.5Hz,1H,CH=CH),6.56(d,J=15.5Hz,1H,CH=CH),2.58(s,5H,CH₂,CH₃),2.51(s,4H,2×CH₂),1.05(s,6H,2×CH₃).

实施例5

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(吗啉-1-基)丁烯-2-酰胺

具体实验操作同实施例2，投入化合物1g(200mg)、吗啉(42mg)和碳酸钾127mg，得白色固体(化合物5)87mg，收率43.3%。ESI-MS m/z：445[M+H]⁺；¹H-NMR(DMSO-d₆,500MHz)δ(ppm)：9.74(br s,1H,CONH),8.63(s,1H,NH),8.16(s,1H,Ar-H),7.97(dd,J=2.5,9.5Hz,1H,Ar-H),7.92(s,1H,Ar-H),7.68-7.70(m,1H,Ar-H),7.44(t,J=9.5Hz,1H,Ar-H),6.74(td,J=5.5,15.0Hz,1H,CH=CH),6.50(d,J=15.0Hz,1H,CH=CH),3.62(s,4H,2×CH₂),3.14(d,J=4.5Hz,2H,CH₂),2.64(s,3H,CH₃),2.41(s,4H,2×CH₂).

实施例6

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(吡咯烷-1-基)丁烯-2-酰胺

具体实验操作同实施例2，投入化合物1g(150mg)、吡咯烷(25mg)和碳酸钾94mg，得白色固体(化合物6)64mg，收率42.8%。ESI-MS m/z：429[M+H]⁺；¹H-NMR(DMSO-d₆,500MHz)δ(ppm)：9.67(br s,1H,CONH),8.58(s,1H,NH),8.15(s,1H,Ar-H),7.98(dd,J=2.3,6.8Hz,1H,Ar-H),7.90(s,1H,Ar-H),7.68-7.70(m,1H,Ar-H),7.42(t,J=9.1Hz,1H,Ar-H),6.79(td,J=5.6,15.4Hz,1H,CH=CH),6.49(d,J=15.6Hz,1H,CH=CH),3.25(d,J=5.5Hz,2H,CH₂),2.56(s,3H,CH₃),2.50(s,4H,2×CH₂),1.72(s,4H,2×CH₂).

实施例7

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(1H-咪唑-1-基)丁烯-2-酰胺

具体实验操作同实施例2，投入化合物1g(150mg)、咪唑(23mg)和碳酸钾94mg，得白色固体(化合物7)60mg，收率40.4%。ESI-MS m/z：426[M+H]⁺；¹H-NMR(DMSO-d₆,500MHz)δ(ppm)：9.77(br s,1H,CONH),8.59(s,1H,NH),8.13(s,1H,Ar-H),7.95(dd,J=2.3,6.8Hz,1H,Ar-H),7.90(s,1H,Ar-H),7.67-7.69(m,2H,Ar-H),7.42(t,J=9.1Hz,1H,Ar-H),7.20(s,1H,Ar-H),6.98(s,1H,Ar-H),6.93(td,J=4.810.9Hz,1H,CH=CH),6.12(d,J=15.4Hz,1H,CH=CH),4.89(d,J=3.8Hz,2H,CH₂),2.53(s,3H,CH₃).

实施例8

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(二甲胺基)丁烯-2-酰胺

具体实验操作同实施例2，投入化合物1g(200mg)、二甲胺盐酸盐(45mg)和碳酸钾190mg，得白色固体(化合物8)100mg，收率54.2%。ESI-MS m/z：403[M+H]⁺；¹H-NMR(DMSO-d₆,500MHz)δ(ppm)：9.74(br s,1H,CONH),8.61(s,1H,NH),8.15(s,1H,Ar-H),7.99(dd,J=2.2,6.6Hz,1H,Ar-H),7.91(s,1H,Ar-H),7.68-7.70(m,1H,Ar-H),7.42(t,J=9.1Hz,1H,Ar-H),6.75(td,J=5.9,15.4Hz,1H,CH=CH),6.51(d,J=15.5Hz,1H,CH=CH),3.14(s,2H,CH₂),2.57(s,3H,CH₃),2.24(s,6H,2×CH₃).

实施例9

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(N-甲基哌嗪-1-基)丁烯-2-酰胺

具体实验操作同实施例2，投入化合物1g(150mg)、N-甲基哌嗪(34mg)和碳酸钾94mg，得白色固体(化合物9)45mg，收率29.0%。ESI-MS m/z：458[M+H]⁺；¹H-NMR(DMSO-d₆,500MHz)δ(ppm)：9.66(br s,1H,CONH),8.61(s,1H,NH),8.09(s,1H,Ar-H),7.93(s,2H,Ar-H),7.85(s,1H,Ar-H),7.39(t,J=9.1Hz,1H,Ar-H),6.72(td,J=6.0,15.4Hz,1H,CH=CH),6.46(d,J=15.5Hz,1H,CH=CH),3.01(s,2H,CH₂),2.36-2.41(m,8H,2×CH₂),2.16(s,3H,CH₃).

制备例2

4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-6-{[4-溴-1-氧-2-丁烯-1-基]氨基}-吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪

步骤1

将1b（19.0g，79.5mmol），3-乙炔苯胺（9.22g，79.5mmol）和300ml异丙醇置入500ml反应瓶中，80℃反应2h，TLC监测反应结束后，冷却至室温，过滤，固体用异丙醇洗涤，真空干燥过夜。得黄色固体（化合物1h）23.8g，收率93.7%。ESI-MS m/z：321[M+H]⁺。

步骤2

将1h（23.0g，71.8mmol），氢氧化钠（8.62g，0.22mol），150ml甲醇和150ml水置入500ml反应瓶中，60℃反应2h，TLC监测反应结束后，冷却至室温，用乙酸调至pH约为7，析出大量固体。过滤，固体水洗涤，真空干燥过夜。得淡黄色固体（化合物1i）20.3g，收率97.0%。ESI-MS m/z：293[M+H]⁺。

步骤3

将1i（20.0g，68.5mmol），叠氮磷酸二苯酯DPPA（22.0g，0.08mol），三乙胺（8.08g，0.08mol），,300ml甲苯置入500ml反应瓶中，氮气保护下加热至85℃反应4h。然后加入叔丁醇（10.2g，0.14mol），85℃过夜。冷却至室温，浓缩后柱层析纯化[洗脱剂：乙酸乙酯：石油醚=1:4]。得黄色固体（化合物1j）6.74g，收率27.1%。ESI-MS m/z：364[M+H]⁺。

步骤4

将1j（6.50g，17.9mmol），三氟乙酸14ml，二氯甲烷150ml置入250ml反应瓶中，室温反应4h。TLC监测反应结束，浓缩除去溶剂得油状物，柱层析提纯[洗脱剂：乙酸乙酯：石油醚=1:1]。得黄色固体（化合物1k）3.07g，收率65.4%。ESI-MS m/z：264[M+H]⁺。

步骤5

将1k（3.00g，11.5mmol），4-溴巴豆酸（1.87g，11.5mmol），HATU（6.56g，17.3mmol），三乙胺（1.77g，17.3mmol）DMF50ml置入250ml反应瓶中，室温反应1h。TLC监测反应结束，加入200ml水，用二氯甲烷100ml×3萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩后油状物，柱层析提纯[洗脱剂：乙酸乙酯：石油醚=3:1]。得黄色固体（化合物1L）1.92g，收率48.2%。ESI-MS m/z：410[M+H]⁺。

实施例10

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(4-甲基哌啶-1-基)丁烯-2-酰胺

具体实验操作同实施例2，投入化合物1L(150mg)、4-甲基哌啶47mg和碳酸钾89mg，得白色固体(化合物10)30mg，收率19.2%。ESI-MS m/z：429[M+H]⁺；¹H-NMR(DMSO-d₆,300MHz)δ(ppm)：9.77(br s,1H,CONH),8.55(s,1H,NH),8.15(s,1H,Ar-H),7.92(s,1H,Ar-H),7.87(s,1H,Ar-H),7.76(d,J=8.2Hz,1H,Ar-H),7.38(t,J=7.8Hz,1H,Ar-H),7.23(d,J=7.7Hz,1H,Ar-H),6.76(td,J=5.9,15.5Hz,1H,CH=CH),6.51(d,J=14.9Hz,1H,CH=CH),4.21(s,1H,ethynyl-H),2.89(s,2H,CH₂),2.57(s,3H,CH₃),1.99(s,2H,CH₂),1.64(s,2H,CH₂),1.40(s,1H,CH),1.23(s,2H,CH₂),0.91(d,J=6.3Hz,3H,CH₃).

实施例11

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(N-甲基哌嗪-1-基)丁烯-2-酰胺

具体实验操作同实施例2，投入化合物1L(150mg)、N-甲基哌嗪47mg和碳酸钾89mg，得白色固体(化合物11)40mg，收率25.4%。ESI-MS m/z：430[M+H]⁺；¹H-NMR(DMSO-d₆,500MHz)δ(ppm)：9.70(br s,1H,CONH),8.53(s,1H,NH),8.14(s,1H,Ar-H),7.92(s,1H,Ar-H),7.87(s,1H,Ar-H),7.76(d,J=8.2Hz,1H,Ar-H),7.38(t,J=7.9Hz,1H,Ar-H),7.22(d,J=7.6Hz,1H,Ar-H),6.73(td,J=6.0,15.4Hz,1H,CH=CH),6.48(d,J=15.4Hz,1H,CH=CH),4.18(s,1H,ethynyl-H),3.16(d,J=5.5Hz,2H,CH₂),2.57(s,3H,CH₃),2.50(s,8H,4×CH₂),2.32(s,3H,CH₃).

实施例12

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(二甲胺基)丁烯-2-酰胺

具体实验操作同实施例2，投入化合物1L(150mg)、二甲胺盐酸盐39mg和碳酸钾148mg，得白色固体(化合物12)50mg，收率37.6%。ESI-MSm/z：375[M+H]⁺；¹H-NMR(DMSO-d₆,500MHz)δ(ppm)：9.69(br s,1H,CONH),8.52(s,1H,NH),8.15(s,1H,Ar-H),7.92(s,1H,Ar-H),7.88(s,1H,Ar-H),7.76(d,J=8.2Hz,1H,Ar-H),7.38(t,J=7.9Hz,1H,Ar-H),7.22(d,J=7.6Hz,1H,Ar-H),6.74(td,J=5.9,15.4Hz,1H,CH=CH),6.48(d,J=15.4Hz,1H,CH=CH),4.18(s,1H,ethynyl-H),3.07(d,J=4.9Hz,2H,CH₂),2.57(s,3H,CH₃),2.20(s,6H,2×CH₃).

实施例13

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(1H-咪唑-1-基)丁烯-2-酰胺

具体实验操作同实施例2，投入化合物1L (150mg)、咪唑30mg和碳酸钾89mg，得白色固体(化合物13)40mg，收率23.2%。ESI-MS m/z：398[M+H]⁺；¹H-NMR(DMSO-d₆,500MHz)δ(ppm)：9.76(brs,1H,CONH),8.51(s,1H,NH),8.12(s,1H,Ar-H),7.91(s,1H,Ar-H),7.86(s,1H,Ar-H),7.75(d,J=8.2Hz,1H,Ar-H),7.69(s,1H,Ar-H),7.37(t,J=7.9Hz,1H,Ar-H),7.22(d,J=7.7Hz,1H,Ar-H),7.20(s,1H,Ar-H),6.98(s,1H,Ar-H),6.93(td,J=4.7,15.4Hz,1H,CH=CH),6.12(d,J=15.4Hz,1H,CH=CH),4.88(d,J=3.1Hz,2H,CH₂),4.18(s,1H,ethynyl-H),2.53(s,3H,CH₃).

实施例14

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(2-甲基哌啶-1-基)丁烯-2-酰胺

具体实验操作同实施例2，投入化合物1L(150mg)、2-甲基哌啶47mg和碳酸钾89mg，得白色固体(化合物14)30mg，收率19.2%。ESI-MS m/z：429[M+H]⁺；¹H-NMR(DMSO-d₆,500MHz)δ(ppm)：9.96(br s,1H,CONH),8.55(s,1H,NH),8.14(s,1H,Ar-H),7.93(s,1H,Ar-H),7.87(s,1H,Ar-H),7.76(d,J=8.2Hz,1H,Ar-H),7.38(t,J=7.9Hz,1H,Ar-H),7.22(d,J=7.6Hz,1H,Ar-H),6.84(td,J=5.9,15.4Hz,1H,CH=CH),6.69(d,J=15.4Hz,1H,CH=CH),4.18(s,1H,ethynyl-H),3.30(s,2H,CH₂),2.59(s,3H,CH₃),2.50(s,2H,CH₂),1.91(s,2H,CH₂),1.68(s,2H,CH₂),1.45(s,1H,CH₂),1.29(s,5H,CH₂,CH₃).

实施例15

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(二乙胺基)丁烯-2-酰胺

具体实验操作同实施例2，投入化合物1L(150mg)、二乙胺24mg和碳酸钾89mg，得白色固体(化合物15)40mg，收率27.4%。ESI-MS m/z：403[M+H]⁺；¹H-NMR(DMSO-d₆,500MHz)δ(ppm)：9.99(br s,1H,CONH),8.55(s,1H,NH),8.15(s,1H,Ar-H),7.93(s,1H,Ar-H),7.88(s,1H,Ar-H),7.76(d,J=8.2Hz,1H,Ar-H),7.38(t,J=7.9Hz,1H,Ar-H),7.22(d,J=7.6Hz,1H,Ar-H),6.80(td,J=5.9,15.4Hz,1H,CH=CH),6.72(d,J=15.4Hz,1H,CH=CH),4.18(s,1H,ethynyl-H),3.96(s,2H,CH₂),3.14(s,4H,2×CH₂),2.59(s,3H,CH₃),1.25(s,6H,2×CH₃).

实施例16

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(吗啉-1-基)丁烯-2-酰胺

具体实验操作同实施例2，投入化合物1L(150mg)、吗啉41mg和碳酸钾89mg，得白色固体(化合物16)50mg，收率33.4%。ESI-MS m/z：417[M+H]⁺；¹H-NMR(DMSO-d₆,500MHz)δ(ppm)：9.69(s,1H,Ar-H),8.52(s,1H,Ar-H),8.14(s,1H,Ar-H),7.92(s,1H,Ar-H),7.88(s,1H,Ar-H),7.76(d,J=8.2Hz,1H,Ar-H),7.38(t,J=7.9Hz,1H,Ar-H),7.22(d,J=7.6Hz,1H,Ar-H),6.74(td,J=6.0,15.4Hz,1H,CH=CH),6.49(d,J=15.5Hz,1H,CH=CH),4.18(s,1H,ethynyl-H),3.48(s,2H,CH₂),2.74(s,4H,2×CH₂),2.58(s,3H,CH₃),1.80(s,4H,2×CH₂).

实施例17

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(吡咯烷-1-基)丁烯-2-酰胺

具体实验操作同实施例2，投入化合物1L(150mg)、吡咯烷34mg和碳酸钾89mg，得白色固体(化合物17)30mg，收率21.2%。ESI-MS m/z：401[M+H]⁺；¹H-NMR(DMSO-d₆,500MHz)δ(ppm)：9.79(s,1H,Ar-H),8.54(s,1H,Ar-H),8.15(s,1H,Ar-H),7.92(s,1H,Ar-H),7.88(s,1H,Ar-H),7.76(d,J=8.2Hz,1H,Ar-H),7.38(t,J=7.9Hz,1H,Ar-H),7.22(d,J=7.6Hz,1H,Ar-H),6.80(td,J=6.0,15.4Hz,1H,CH=CH),6.56(d,J=15.1Hz,1H,CH=CH),4.18(s,1H,ethynyl-H),3.49(s,2H,CH₂),2.74(s,4H,2×CH₂),2.58(s,3H,CH₃),1.80(s,4H,2×CH₂).

实施例18

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(哌啶-1-基)丁烯-2-酰胺

具体实验操作同实施例2，投入化合物1L(150mg)、哌啶41mg和碳酸钾89mg，得白色固体(化合物18)30mg，收率19.4%。ESI-MS m/z：415[M+H]⁺；¹H-NMR(DMSO-d₆,500MHz)δ(ppm)：9.69(s,1H,Ar-H),8.52(s,1H,Ar-H),8.14(s,1H,Ar-H),7.92(s,1H,Ar-H),7.87(s,1H,Ar-H),7.76(d,J=8.2Hz,1H,Ar-H),7.38(t,J=7.9Hz,1H,Ar-H),7.22(d,J=7.7Hz,1H,Ar-H),6.75(td,J=6.0,15.4Hz,1H,CH=CH),6.48(d,J=15.1Hz,1H,CH=CH),4.18(s,1H,ethynyl-H),3.11(s,2H,CH₂),2.57(s,3H,CH₃),2.36(s,4H,2×CH₂),1.55(s,4H,2×CH₂),1.41(s,2H,CH₂).

生物学实施例

1.细胞水平EGFR激酶活性测定

测定EGFR抑制剂在细胞水平的活性。利用ELSA法，检测EGFR抑制剂对EGF诱导的细胞水平EGFR磷酸化抑制的IC₅₀值。

用EGFR的抗体包被在固相载体上，来抓取细胞裂解液中的EGFR蛋白。然后用抗磷酸化酪氨酸的抗体检测细胞中磷酸化的EGFR蛋白：由于磷酸化的EGFR蛋白能被抗磷酸化酪氨酸的抗体识别，用HRP二抗、TMB显示后读数。不同的磷酸化程度有不同的读数值；磷酸化程度越大，读数值越高。

1.1实验材料与仪器

人口腔表皮样癌KB细胞株(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)；

DMEM培养基(Gibco,C12430)；

FBS(Gibco,12657-029)；

胰酶-EDTA(Gibco，25200)

双抗(碧云天生物技术研究所，C0222)

100mm细胞培养皿(Corning,430167)

96孔细胞培养板(Costar，3599)；

96孔V底板(Costar，3896)

96孔酶标板(Costar，2592)；

Recombinant Human EGF(Peprotech,AF-100-15)；

裂解液(生兴生物,SN338)；

Anti-human EGF R/ErbB1 Antibody(R&D,AF231)；

Anti-phosphotyrosine clone4G10(Millipore,05-231)；

Goat Anti-Mouse IgG HRP Conjugate(Novagen,71045-3)；

TMB(Pierce,34028)

离心机(Eppendorf，centrifuge5810R)

二氧化碳培养箱(Thermo，FORMA SERIES Ⅱ)

超净工作台(Thermo，1300SERIES A2)

恒温振荡仪(Eppendorf，Thermomixer comfort)

酶标仪(TECAN，Infinite M200pro)

1.2实验方法

1.2.1化合物配置

将化合物用DMSO配制成1mM的母液，-20℃保存备用。

1.2.2试验步骤

(1)将Anti-human EGF R/ErbB1Antibody稀释到0.2μg/mL，每孔100μL，加入到酶标板中，4℃包被过夜。

(2)取包被过夜的酶标板，吸去上清，PBST(PBS/0.05%Tween20，pH7.4)洗涤3遍，每孔加入200μL封闭液(5%BSA/PBS)，37℃封闭2小时，PBST洗涤三遍，4℃保存备用。

(3)将80-90%融合度的KB细胞接种到96孔细胞培养板中，贴壁后更换无血清培基饥饿过夜。

(4)吸去96孔板中上清，每孔加入90μL新鲜无血清培基，再加入10μL无血清培基稀释后的化合物(浓度从0-10μM)，37摄氏度孵育1.5小时。

(5)每孔加入5μL稀释后的EGF(10μg/mL)，快速混匀，37℃刺激8分钟。

(6)快速吸去96孔板中上清，每孔加入100μL裂解液，4℃裂解1小时。

(7)取90μL细胞裂解液加入到酶标板中，37℃孵育1.5小时。

(8)取出酶标板，吸去上清，PBST洗涤3遍，每孔加入100μLAnti-phosphotyrosine(1:2000稀释)，37℃孵育1小时。

(9)取出酶标板，吸去上清，PBST洗涤3遍，每孔加入100μLGoat Anti-Mouse IgG HRPConjugate(1:4000稀释)，37℃孵育1小时。

(10)取出酶标板，吸去上清，PBST洗涤6遍，每孔加入100μL TMB，室温避光反应至适当颜色后，每孔加入50μL2M的硫酸终止反应

(11)在OD450下检测吸光度值。

2.3数据处理

以化合物浓度为横坐标，相对吸收值为纵坐标绘图，数据拟合用lg(IC₅₀)公式经Prism软件(GraphPad Software, Inc)处理，求出IC₅₀。

抑制率采用以下公式计算：

本发明化合物的活性：

本发明化合物的细胞水平EGFR激酶活性通过以上的试验进行测定，测得的IC₅₀值见下表。

2.抑制细胞增殖测试

下面的体外测试是用来测定本发明化合物对于人类肿瘤细胞NCI-N87(HER-2高表达)细胞株抑制增殖活性。

测定按常规采用溴化四氮唑蓝(MTT)法。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性溴化四氮唑蓝还原为难溶的蓝紫色结晶物(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在570nm波长处检测其光吸收值，可间接反映活细胞数量。因而，采用MTT法可测定目标化合物抑制细胞的增殖能力，同时利用本领域熟知的方法，可以对任意癌细胞使用相似的测定方法。

2.1实验材料与仪器

人胃癌NCI-N87细胞株(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)

100mm细胞培养皿(Corning，430167)

96孔细胞培养板(Costar，3599)

96孔V底板(Costar，3896)

一次性移液管(Costar，货号：4488)

RMPI-1640培养基(Gibco，C22400)

FBS(Gibco，12657)

胰酶-EDTA(Gibco，25200)

双抗(碧云天生物技术研究所，C0222)

MTT(SIGMA，M2128)

离心机(Eppendorf，centrifuge5810R)

二氧化碳培养箱(Thermo，FORMA SERIES Ⅱ)

超净工作台(Thermo，1300SERIES A2)

恒温振荡仪(Eppendorf，Thermomixer comfort)

酶标仪(TECAN，Infinite M200pro)

2.2试验方法

取融合度大于80%的NCI-N87细胞，胰酶消化后离心计数，按15000个/孔接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，置于37℃，5%CO₂培养箱中过夜。次日，吸去培基，每孔加入180μL新鲜培基，再加入20μL含待测化合物(浓度从10μM至1nM)的培基，空白组加入20μL培基，每个浓度设3个平行孔。置于37℃，5%CO₂培养箱中继续培养72h后，每孔加入20μL含5mg/mL MTT的PBS。在培养箱中继续培养4h后吸去培基，每孔加入100μLDMSO。室温下避光振荡10min。用多功能读数仪，在参考波长690nm，吸收波长550nm条件下测定吸光度值(OD值)。相对吸收值为550nm减去690nm。以化合物浓度为横坐标，相对吸收值为纵坐标绘图，数据拟合用lg(IC₅₀)公式经Prism软件(GraphPad Software,Inc)处理。图形曲线拟合公式如下：相对OD值=最低OD值+(最高OD值-最低OD值)/(1+10^(浓度-LogIC₅₀))。其中，最低OD值是阳性化物100%抑制时的吸光度值，最高OD值是空白对照组的吸光度值。计算出的IC₅₀值是指特定化合物的细胞毒性作用。

本发明化合物的活性：

本发明化合物的抑制N87细胞增殖活性通过以上的试验进行测定，测得的IC₅₀值见下表。

结论：本发明实施例中制备的具有式I结构的化合物1～18在细胞水平EGFR激酶活性测定中显示出显著的抑制活性，此外对HER-2高表达的人胃癌细胞NCI-N87也显示出显著的抑制增殖活性。

Claims (10)

1.式I结构的化合物或其药学上可接受的盐：

其中，

R₁是苯基或杂芳基，其任选被一个或多个选自下列的基团所取代：卤素、烷基、烯基、炔基、烷氧基、硝基、羟基、环烷基或杂脂环基、氰基、巯基、酰基、硫代酰基、氨基、卤代烷基、卤代烷氧基、酯基、芳基或杂芳基；

R₂是卤素、-NR₃R₄、-OR₅、-SR₆；

R₃和R₄独立地选自氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基，或者R₃和R₄与N原子合起来形成一个含N的杂芳基或杂脂环基；

R₅合R₆独立地选自氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基。

2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于R₁是苯基，其任选被一个或多个选自下列的基团所取代：卤素、炔基；优选地，R₁是3-氯-4-氟苯基或3-乙炔基苯基。

3.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，

R₂是-NR₃R₄，

R₃和R₄独立地选自氢、烷基、环烷基、芳基或杂芳基，或者R₃和R₄与N原子合起来形成一个含N的杂芳基或杂脂环基；

进一步优选地：

R₂是-NR₃R₄，

R₃和R₄独立地选自烷基，或者R₃和R₄与N原子合起来形成一个含N的杂芳基或杂脂环基；

再进一步优选地：

R₂是-NR₃R₄，

R₃和R₄独立地选自烷基，或者R₃和R₄与N原子合起来形成一个含N的杂芳基、未取代的或烷基取代杂脂环基；

更优选地，R₂是-NR₃R₄，

R₃和R₄独立地选自烷基，或者R₃和R₄与N原子合起来形成任选取代的如下基团：哌嗪子基、吗啉子基、哌啶子基、吡咯烷子基或咪唑基。

4.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，选自：

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(哌啶-1-基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(4-甲基哌啶-1-基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(2-甲基哌啶-1-基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(二乙胺基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(吗啉-1-基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(吡咯烷-1-基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(1H-咪唑-1-基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(二甲胺基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(N-甲基哌嗪-1-基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(4-甲基哌啶-1-基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(N-甲基哌嗪-1-基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(二甲胺基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(1H-咪唑-1-基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(2-甲基哌啶-1-基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(二乙胺基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(吗啉-1-基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(吡咯烷-1-基)丁烯-2-酰胺；

(E)-N-{4-[(3-乙炔基苯基)氨基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基}-4-(哌啶-1-基)丁烯-2-酰胺；

或其盐。

5.根据权利要求1～4中至少一项的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述盐为所述化合物与无机或有机的酸或碱所成的药学上可接受的盐。

6.一种制备式Ia化合物的方法，式II化合物与卤代巴豆酰氯进行酰化，得到式Ia化合物，

其中Z选自卤素，R₁的定义如权利要求1中所述，并

如有需要，再裂解去除上述反应中所用的任何保护基，及/或

如有需要，将制得的通式Ia化合物解析成为其立体异构体，及/或

如有需要，将制得的通式Ia化合物转化成为其盐，特别是转化成供医药用的其生理上可接受的盐。

7.一种制备式I化合物的方法，式Ia化合物与取代胺进行亲核取代反应，得到式I化合物，

其中Z选自卤素，R₁和R₂的定义如权利要求1中所述，R₂不包括卤素，并

如有需要，再裂解去除上述反应中所用的任何保护基，及/或

如有需要，将制得的通式I化合物解析成为其立体异构体，及/或

如有需要，将制得的通式I化合物转化成为其盐，特别是转化成供医药用的其生理上可接受的盐。

8.一种药物组合物，其特征在于所述药物组合物包括权利要求1～5中任意一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的稀释剂或载体。

9.权利要求1～5中任意一项的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗与蛋白激酶有关的疾病的药物中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述蛋白激酶选自EGFR受体酪氨酸激酶或HER-2受体酪氨酸激酶。