CN111699188A

CN111699188A - [1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮衍生物

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Publication number: CN111699188A
Application number: CN201980011334.XA
Authority: CN
Inventors: N·P·坎普; C·汉道奇; J·P·林内斯瓦拉; J·R·墨菲; 施清
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2018-02-06
Filing date: 2019-01-30
Publication date: 2020-09-22
Anticipated expiration: 2039-01-30
Also published as: WO2019156861A1; CN111699188B; JP2022137065A; US11453673B2; JP7488768B2; US20200399277A1; EP3749671A1; ES2942442T3; JP2021512154A; EP3749671B1

Abstract

本发明提供用作PDE1抑制剂的式I的化合物或其可药用盐：

其中R¹是甲基、乙基或环丙基；R²是氢、甲基或乙基；R³是甲基或AA

；且R⁴是C2‑C4烷基、BB

Description

[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮衍生物

本发明涉及某些人PDE1抑制剂，涉及包含所述化合物的药物组合物，涉及使用所述化合物治疗生理性病症的方法并涉及可用于合成所述化合物的中间体和方法。

磷酸二酯酶（PDE）是通过控制cAMP和cGMP的水解速率而调节这些环核苷酸的细胞水平的酶。PDE1是钙和钙调蛋白依赖性PDE，是至少11种已知PDE家族之一。PDE1在许多组织中表达，包括大脑、心脏、肺、肾和平滑肌。PDE1由三种已知同种型PDE1A、PDE1B和PDE1C组成。

患有糖尿病的患者经常发生一定形式的慢性肾脏疾病，被称为糖尿病肾脏疾病（或糖尿病肾病）。已经估计，糖尿病肾脏疾病可能影响多达40%的糖尿病患者。糖尿病肾脏疾病的治疗选择有限并包括使用降低血压的药物、管理血糖水平、膳食和体重以及定期进行体育活动。因此，患有慢性肾脏疾病，特别是糖尿病肾脏疾病的患者需要另外的治疗选择。

美国专利申请公开No. 2017/0233396 A1公开了某种[1,2,4]三唑并[4,3-a]喹喔啉-4-酮及其在治疗某些疾病，如慢性肾脏疾病和糖尿病肾脏疾病中的用途。WO 2016/055618 A1公开了某些三唑并吡嗪酮作为PDE1抑制剂和它们用于治疗神经退行性病症和精神病症的用途。

本发明提供作为人PDE1的抑制剂的某些新型化合物。本发明提供相对于其它人PDE（如PDE3A、PDE4D和PDE6AB）作为人PDE1A、PDE1B和PDE1C的选择性抑制剂的某些新型化合物。

相应地，本发明提供式I的化合物或其可药用盐：

式I

其中R¹是甲基、乙基或环丙基；

R²是氢、甲基或乙基；

R³是甲基或

；且

R⁴是C2-C4烷基，

或

。

本发明还提供一种治疗患者的慢性肾脏疾病的方法，其包括给予需要这种治疗的患者有效量的式I的化合物。本发明还提供一种治疗患者的糖尿病肾脏疾病的方法，其包括给予需要这种治疗的患者有效量的式I的化合物。本发明还提供一种治疗患者的高血压的方法，其包括给予需要这种治疗的患者有效量的式I的化合物。本发明还提供一种治疗患者的心力衰竭的方法，其包括给予需要这种治疗的患者有效量的式I的化合物。

此外，本发明提供用于治疗的式I的化合物。本发明还提供用于治疗慢性肾脏疾病的式I的化合物。此外，本发明提供用于治疗糖尿病肾脏疾病的式I的化合物。此外，本发明提供用于治疗高血压的式I的化合物。本发明还提供用于治疗心力衰竭的式I的化合物。本发明还提供式I的化合物用于制备用于治疗慢性肾脏疾病的药物的用途。本发明还提供式I的化合物用于制备用于治疗糖尿病肾脏疾病的药物的用途。本发明还提供式I的化合物用于制备用于治疗高血压的药物的用途。本发明还提供式I的化合物用于制备用于治疗心力衰竭的药物的用途。

本发明进一步提供包含式I的化合物以及一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。本发明进一步提供一种制备药物组合物的方法，其包括混合式I的化合物与一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂。本发明还包含用于合成式I的化合物的新型中间体和方法。

本文所用的术语“治疗”包括抑制、遏制、减慢、停止或逆转已有症状或病症的进展或严重程度。

本文所用的术语“患者”是指哺乳动物，如犬或人类，人类是优选的。

本文所用的术语“有效量”是指在单剂或多剂给药于患者时在被诊断或治疗的患者中提供所需作用的本发明化合物或其可药用盐的量或剂量。

本文所用的术语“C2-C4烷基”是指选自乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基和环丁基的直链、支链和环状烷基，其中乙基、正丙基、环丙基、正丁基和环丁基是优选的。

本领域技术人员通过使用已知技术和通过观察在类似情况下获得的结果容易确定有效量。在确定对患者的有效量时，本领域技术人员考虑许多因素，包括但不限于：患者的体型、年龄和一般健康状况；涉及的特定疾病或病症；疾病或病症的涉入程度或严重程度；个体患者的响应；给予的特定化合物；给药模式；给予的制剂的生物利用度特征；所选给药方案；伴随用药；和其它相关情况。

本发明的化合物在落在大约0.01至大约20 mg/kg体重范围内的每日剂量下有效。在一些情况下，在上述范围的下限以下的剂量水平可能绰绰有余，而在另一些情况下，可以在可接受的副作用下使用甚至更大剂量，因此上述剂量范围无意以任何方式限制本发明的范围。

将本发明的化合物配制成通过使该化合物生物可利用的任何途径，包括口服和肠胃外途径给药的药物组合物。此类组合物最优选用于口服给药。此类药物组合物及其制备方法是本领域中公知的（参见例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy,L.V. Allen编辑，第22版，Pharmaceutical Press, 2012）。

式I的化合物特别可用于本发明的治疗方法，但某些基团、取代基和化合物是优选的。以下段落描述这些优选基团、取代基和化合物。要理解的是，这些优选既适用于本发明的治疗方法，又适用于本发明的新型化合物。

优选的是，R¹是环丙基。

优选的是，R²是甲基。

优选的是，R³是甲基。

进一步优选的是，当R¹是环丙基时，R²是甲基。

进一步优选的是，当R²是甲基时，R³是甲基。

更优选的是，当R¹是环丙基时，R²和R³是甲基。

下列化合物及其可药用盐尤其优选：

和

各化合物的相应游离碱最尤其优选。

本发明化合物的可药用盐可以例如通过本发明化合物的适当游离碱和适当的可药用酸在合适的溶剂中在本领域公知的标准条件下反应形成。参见例如Gould, P.L.,“Salt selection for basic drugs,” International Journal of Pharmaceutics, 33:201-217 (1986)；Bastin, R.J.等人, “Salt Selection and Optimization Proceduresfor Pharmaceutical New Chemical Entities,” Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000)；和Berge, S.M.等人, “Pharmaceutical Salts,”Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977)。

本领域普通技术人员可以在本发明化合物的合成中的任何方便的点通过如选择性结晶技术或手性色谱法之类的方法分离或拆分单个的异构体、对映异构体和非对映异构体（参见例如J. Jacques等人, "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", JohnWiley and Sons, Inc., 1981和E.L. Eliel和S.H. Wilen, “Stereochemistry of Organic Compounds”, Wiley-Interscience, 1994）。名称“异构体1”和“异构体2”分别是指在指定条件下首先和其次由手性色谱洗脱的化合物。

某些缩写如下定义：“ACN”是指乙腈；“BSA”是指牛血清白蛋白；“cAMP”是指环腺苷-3',5'-单磷酸；“CDI”是指1,1'-羰基二咪唑；“cGMP”是指环单磷酸鸟苷；“DCC”是指1,3-二环己基碳二亚胺；“DCM”是指二氯甲烷或亚甲基氯；“DIC”是指1,3-二异丙基碳二亚胺；“DIPEA”是指N,N-二异丙基乙基胺；“DMF”是指N,N-二甲基甲酰胺；“DMAP”是指二甲基氨基吡啶；“DMSO”是指二甲亚砜；“EDCI”是指1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；“EDTA”是指乙二胺四乙酸；“ES/MS”是指电喷雾质谱法；“EtOAc”是指乙酸乙酯；“Et₂O”是指乙醚；“EtOH”是指乙醇或乙基醇；“HATU”是指1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐；“HBTU”是指(1H-苯并三唑-1-基氧基)(二甲基氨基)-N,N-二甲基甲亚铵(methaniminium)六氟磷酸盐；“HIS”是指组氨酸；“HOAt”是指1-羟基-7-偶氮苯并三唑；“HOBt”是指1-羟基苯并三唑水合物；“IC₅₀”是指产生试剂可能的最大抑制响应的50%的该试剂浓度；“MeOH”是指甲醇或甲基醇；“MTBE”是指甲基-叔丁基醚；“NiNTA”是指具有用次氮基三乙酸作为螯合剂官能化的琼脂糖固定相的色谱法；“PDE”是指磷酸二酯酶；“PyBOP”是指(苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐)；“PyBrOP”是指溴(三吡咯烷基)鏻六氟磷酸盐；“t_(R)”是指保留时间；“SFC”是指超临界流体色谱法；“SPA”是指闪烁迫近分析法；“TEA”是指三乙胺；“THF”是指四氢呋喃；“Tris”是指2-氨基-2-羟基甲基-丙-1,3-二醇；“U/ml”是指每毫升单位数；“XPhos Pd G2”是指氯(2-二环己基膦基-2′,4′,6′-三异丙基-1,1′-联苯基)[2-(2′-氨基-1,1′-联苯基)]钯(II)；且“ee”是指对映体过量。

本发明的化合物可通过本领域普通技术人员已知的各种程序制备，其中一些例示在下列方案、制备和实施例中。本领域普通技术人员会认识到，所述各路线的具体合成步骤可以以不同方式组合，或与来自不同方案的步骤结合，以制备本发明的化合物。以下各步骤的产物可通过本领域中公知的常规方法回收，包括萃取、蒸发、沉淀、色谱法、过滤、研制和结晶。在下列方案中，除非另行指明，所有取代基如上定义。试剂和原材料是本领域普通技术人员易得的。提供下列方案、制备和实施例以进一步例示本发明而不限制本发明的范围。

方案1

方案1描绘了如步骤1中所示用取代腈将胺(1)烷基化以产生化合物(2)。可在溶剂如1,2-二甲氧基乙烷中与醛一起使用三甲基氰硅烷作为腈源并加热到大约70℃以实现烷基化。产物可用酸如HCl处理以作为酸盐分离化合物(2)。或者，可使用羟基腈源完成烷基化并在溶剂如THF中在室温下搅拌和用酸如HCl处理以产生化合物(2)。在步骤2中，化合物(2)可在大约0℃下用酰基氯，如草酰氯逐滴处理，接着将该反应加热到50-100℃以将腈环化成1,6-取代的-3,5-二氯-吡嗪-2-酮，化合物(3)。在步骤3中，随后可在溶剂如THF中在室温下或在EtOH中在加热到大约100℃的同时用一水合肼将化合物(3)转化成酰肼，以产生相应的化合物(4)。在步骤4中，可用适当的羧酸、在溶剂如DMF或DCM中的有机碱如DIPEA和偶联剂如N-[(5-氯-3-氧负离子基(oxido)-1H-苯并三唑-1-基)-4-吗啉基亚甲基]-N-甲基甲铵六氟磷酸盐在化合物(4)上实现酰胺偶联，以产生化合物(5)。本领域技术人员会认识到，有许多方法和试剂用于由羧酸和胺的反应形成酰胺。例如，在存在或不存在有机碱如DIPEA或TEA的情况下，胺化合物与适当的羧酸在偶联试剂存在下的反应可提供步骤4的化合物。偶联试剂包括碳二亚胺，如DCC、DIC、EDCI或羰基二咪唑，如CDI。也可使用酰胺偶联添加剂如HOBt和HOAt以增强该反应。另外，可使用非亲核阴离子的脲鎓或鏻盐，如HBTU、HATU、PyBOP和PyBrOP代替更传统的偶联试剂。可使用添加剂如DMAP以增强反应。或者，化合物(4)可在碱如TEA或吡啶存在下使用适当的酰基氯酰化以产生化合物(5)。在步骤5中，化合物(5)可在碱性或酸性条件下环化成三唑(6)。例如，在封闭系统中在溶剂如1,4-二氧杂环己烷中用碱如TEA和亚硫酰氯处理化合物(5)和加热到大约80℃可提供三唑(6)。或者，可使用六甲基二硅氮烷作为碱并可将反应加热到大约120℃。在冷却到室温后，可加入MeOH以促进环化。或者，化合物(5)可在使用酸如乙酸的酸性条件下在大约130℃的温度下在微波条件下环化成三唑以产生三唑(6)。在步骤6中，可实现两个反应。可置换化合物(6)的5-氯取代基以产生氢的R²取代基，并可在Suzuki钯交叉偶联条件下用碱如碳酸钾、合适的硼试剂（boronicreagent）和钯催化剂如双(二-叔丁基膦基)二茂铁二氯化钯将R³进一步官能化。该反应可在溶剂如DMF中在大约120℃的温度下加热以产生式I的化合物。技术人员会认识到，存在各种条件可用于促进这样的交叉偶联反应。合适的钯试剂包括XPhos Pd Gen 2、双(三苯基膦)氯化钯(II)、含三环己基膦的三(二亚苄基丙酮)二钯(0)、(1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁)氯化钯(II)、四三苯基膦钯或乙酸钯(II)。合适的碱包括碳酸铯、碳酸钠、碳酸钾、叔丁醇锂或一水合磷酸三钾。

方案2

在方案2，步骤1中，可在大约0℃下在溶剂如MeOH中使用甲醇钠将如方案1中制备的化合物(3)的3-氯取代基置换成甲氧基，以产生化合物(7)。在步骤2中，可随后在溶剂如己烷中和在加热到大约80℃的同时在Negishi钯交叉偶联反应中用催化剂如[1,3-双(二苯基膦基)丙烷]二氯镍(II)和适当的有机锌试剂将化合物(7)的5-氯取代基官能化成R²的取代基以产生化合物(8)。本领域技术人员熟悉涉及过渡金属催化的交叉偶联的Negishi偶联。该反应将有机卤化物或三氟甲磺酸酯与有机锌化合物偶联以形成碳-碳键。常使用钯(0)物类作为金属催化剂，但也可如上所述使用镍催化剂。在步骤3中，可使用强路易斯酸如三溴化硼将羟基脱保护，以产生化合物(9)的2,3-二酮。在步骤4中，可在催化量的DMF中使用氯源如亚硫酰氯和草酰氯将2位的酮选择性氯化以产生化合物(10)。在步骤5中，可随后在溶剂如THF中在加热到大约100℃的同时用适当的碳酰肼置换化合物(10)上的氯取代基以产生化合物(11)。在步骤6中，化合物(11)可随后如方案1，步骤5中所述环化以产生式I的化合物。

方案3

在方案3，步骤1中，以类似于方案1，步骤3的方式将取代2,3-二氯吡嗪(12)的2-氯取代基转化成化合物(13)。在方案3，步骤2中，以类似于方案1，步骤4的方式通过在溶剂如DCM中使用碱如DIPEA借助偶联剂如HATU的酰胺偶联将化合物(13)转化成化合物(14)。在方案3，步骤3中，化合物(14)可以类似于方案1，步骤5的方式环化以产生化合物(15)。在方案3，步骤4中，使用在溶剂如DMF中的强非亲核碱如双(三甲基甲硅烷基)氨基锂和充当亲核催化剂的碘化钾用R⁴-卤化物将吡嗪酰胺化合物(15)的氮烷基化以产生式I的化合物。或者，可用其它碱，如碳酸铯或氢化钠替代双(三甲基甲硅烷基)氨基锂并且混合物可在室温下搅拌或在大约60-80℃下加热。DMSO可充当另一种溶剂并且亲核催化剂可能不是成功反应所必需的。

制备1

2-(环丙基甲基氨基)丙腈盐酸盐

方案1，步骤1：在0℃下将乙醛（7.89 g, 179.1 mmol）缓慢添加到环丙烷甲基胺（10.00g, 137.7 mmol）在1,2-二甲氧基乙烷（78.40 mL, 756.4 mmol）中的溶液中并在室温下搅拌30分钟，接着逐滴加入三甲基氰硅烷（20.29 mL, 151.5 mmol）。所得反应混合物在70℃下加热4小时，并在室温下冷却。将反应冷却到0℃并在N₂气氛下逐滴加入HCl（37.893 mL,151.570 mmol）。过滤所得沉淀物并用乙醚（200 mL）洗涤以产生标题化合物（22.31g,97%）。

制备2

2-(丁基氨基)丙腈；盐酸盐

方案1，步骤1：丁基胺（6.77 mL, 68.4 mmol）和2-羟基丙腈（7.39 mL, 103 mmol）在THF（68.4 mL）中的溶液在室温下搅拌整夜。将反应混合物减压浓缩，用Et₂O稀释并逐滴加入HCl（68 mL, 1.0 mol/L在Et₂O中）。通过过滤收集形成的固体以产生标题化合物（9.67g, 86.9%）。

制备3

1-环丙基环丙烷碳酰肼盐酸盐

向1-环丙基环丙烷甲酸（9.63 g, 76.3 mmol）和HATU（32.3 g, 83.2 mmol）在DMF（300mL）中的搅拌溶液中加入肼基甲酸叔丁酯（5.00 g, 37.8 mmol），接着加入DIPEA（14.5 mL,83.1 mmol），并将反应在室温下搅拌5天。反应混合物用EtOAc稀释，用1.0 N HCl、饱和NaHCO₃和水洗涤。分离有机层，经硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩。将1,4-二氧杂环己烷（50mL）添加到残留物中，经20分钟加入在1,4-二氧杂环己烷中的HCl（4 mol/L）（100 mL, 400mmol）并将反应在室温下搅拌1小时。过滤溶液，滤饼用MTBE洗涤并在减压下干燥以产生标题化合物（8.01 g, 58.7%）。MS (m/z) 141 (M+H)。

制备4

甲磺酸(1-甲基环丙基)甲酯

将(1-甲基环丙基)甲醇（500 mg, 5.805 mmol）和TEA（0.89 mL, 6.39 mmol）在DCM（30mL）中的搅拌溶液在冰/水浴中冷却到0℃。经注射器逐滴加入甲磺酰氯（0.5 mL, 6.46mmol）。使反应混合物升温到室温；然后搅拌1小时。该反应用饱和NaHCO₃稀释并用DCM萃取。有机物经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩以产生标题化合物（1.00 g, 94%）。

制备5

3,5-二氯-1-(环丙基甲基)-6-甲基-吡嗪-2-酮

方案1，步骤2：将2-(环丙基甲基氨基)丙腈；盐酸盐（22.31 g, 134.71 mmol）在1,2-二甲氧基乙烷（216.41 mL；2.09摩尔）中的溶液冷却到0℃并在N₂气氛下逐滴加入草酰氯（23.37 mL, 269.42 mmol）。然后使反应混合物达到室温，并在100℃下加热6小时。将反应冷却到室温并搅拌整夜。在减压下除去过量草酰氯。混合物用饱和碳酸氢盐溶液（100 mL）中和并用EtOAc（3 x 350 ml）萃取。合并有机萃取物并用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩以产生粗制物质。残留物通过用EtOAc:己烷洗脱的硅胶快速色谱法提纯以产生标题化合物（21.33g, 67.93%）。MS (m/z) 235 (M+H)。

制备6

1-丁基-3,5-二氯-6-甲基-吡嗪-2-酮

方案1，步骤2：将2-(丁基氨基)丙腈盐酸盐（9.67 g, 59.4 mmol）在甲苯（300 mL）中的搅拌悬浮液在冰/水浴中冷却到0℃。逐滴加入草酰氯（26.0 mL, 299.7 mmol）。反应在55℃下搅拌16小时，冷却到室温并减压浓缩。残留物通过在二氧化硅上的快速色谱法提纯，用0-20% EtOAc/己烷洗脱以产生标题化合物（14.93 g, >99%）。MS (m/z) 235 (M+H)。

制备7

1-丁基-5-氯-3-甲氧基-6-甲基-吡嗪-2-酮

方案2，步骤1：将1-丁基-3,5-二氯-6-甲基-吡嗪-2-酮（12.61 g, 50.42 mmol）在MeOH（15 mL）中的搅拌溶液在冰/水浴中冷却到0℃。加入甲醇钠（15 mL, 67 mmol, 25质量%，在MeOH中）并将混合物搅拌20分钟。反应用水稀释，通过过滤收集固体，并在减压下干燥以产生标题化合物（9.39 g, 80.8%）。MS (m/z) 231 (M+H)。

制备8

1-丁基-5-乙基-3-甲氧基-6-甲基-吡嗪-2-酮

方案2，步骤2：在小瓶中合并1-丁基-5-氯-3-甲氧基-6-甲基-吡嗪-2-酮（500 mg,2.16 mmol）和[1,3-双(二苯基膦基)丙烷]二氯镍(II)（120 mg, 0.221 mmol）。在N₂下密封小瓶，加入THF（5.5 mL）和二乙基锌溶液（6.5 mL, 6.5 mmol, 1 mol/L，在己烷中），并将反应在80℃下搅拌整夜。将反应冷却到室温，与基本通过相同方法制备的物质（50 mg规模反应）合并，并经硅藻土过滤。硅藻土用MTBE和水洗涤，并收集滤液。水性物质用MTBE萃取(2×)，合并的有机物用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残留物通过在二氧化硅上的快速色谱法提纯，用0-70% EtOAc/己烷洗脱以产生标题化合物（343.1 mg, 64%, 总收率）。MS (m/z) 225 (M+H)。

制备9

4-丁基-6-乙基-5-甲基-1H-吡嗪-2,3-二酮

方案2，步骤3：将1-丁基-5-乙基-3-甲氧基-6-甲基-吡嗪-2-酮（343.1 mg, 1.53mmol）在DCM（10 mL）中的搅拌溶液在冰/水浴中冷却到0℃。加入三溴化硼（3 mL, 3 mmol,1 mol/L，在DCM中），将反应搅拌2小时，然后将其升温到室温并搅拌45分钟。反应用饱和NaHCO₃淬灭，水相用DCM萃取(3×)。合并的有机萃取物用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩以产生标题化合物（320.3 mg, 89%）。MS (m/z) 211 (M+H)。

制备10

1-丁基-3-氯-5-乙基-6-甲基-吡嗪-2-酮

方案2，步骤4：4-丁基-6-乙基-5-甲基-1H-吡嗪-2,3-二酮（301.3 mg, 1.29 mmol）、亚硫酰氯（1.0 mL, 13.73 mmol）和催化性的DMF（3滴）在DCM（6 mL）中的溶液在室温下搅拌45分钟。加入另外的亚硫酰氯（1.0 mL, 13.73 mmol）并将反应搅拌另外45分钟。该反应在减压下浓缩。将残留物悬浮在甲苯中并减压浓缩(2×)以产生标题化合物（475.9 mg, 96.8%,60质量%）。MS (m/z) 229 (M+H)。

制备11

5-氯-1-(环丙基甲基)-3-肼基-6-甲基-吡嗪-2-酮

方案1，步骤3：将一水合肼（15.3 mL,201.3 mmol）逐滴添加到3,5-二氯-1-(环丙基甲基)-6-甲基-吡嗪-2-酮（21.33 g, 91.51 mmol）在THF（106.7 mL, 1311 mmol）中的溶液中，冷却到0℃，搅拌15分钟，然后在室温下16小时。加入水（100 mL）并用DCM（300 mL）萃取混合物。将有机萃取物减压浓缩以产生黄色固体，其在Et₂O（100 mL）中研制，然后过滤以产生标题化合物（0.26 g, 82%）。MS (m/z) 229 (M+H)。

制备12

N'-[6-氯-4-(环丙基甲基)-5-甲基-3-氧代-哌嗪-2-基]-1-环丙基-环丙烷碳酰肼

方案1，步骤4：在N₂气氛下在室温下将1-环丙基环丙烷甲酸（10.13 g, 80.28 mmol）添加到5-氯-1-(环丙基甲基)-3-肼基-6-甲基-吡嗪-2-酮（16.69 g, 72.98 mmol）和DIPEA（42.00 mL, 240.8 mmol）在无水DMF（417.3 mL）中的搅拌溶液中，接着加入N-[(5-氯-3-氧负离子基-1H-苯并三唑-1-基)-4-吗啉基亚甲基]-N-甲基甲铵六氟磷酸盐（36.59 g,80.28 mmol）。将反应混合物在室温下搅拌2小时。将水（1.4 L）添加到反应混合物中并形成沉淀物。将反应混合物过滤，分离的固体用Et₂O（1 L）洗涤以产生标题化合物（16.06 g,65%）。MS (m/z) 339 (M+H)。

制备13

N'-(4-丁基-6-乙基-5-甲基-3-氧代-哌嗪-2-基)-1-环丙基-环丙烷碳酰肼

方案2，步骤5：在N₂下在密封的微波小瓶中合并1-丁基-3-氯-5-乙基-6-甲基-吡嗪-2-酮（475.9 mg, 1.25 mmol, 60质量%）、1-环丙基环丙烷碳酰肼盐酸盐（221 mg, 1.25mmol）和THF（4 mL）并在微波条件下在100℃下搅拌2小时。反应用水稀释并用DCM萃取(3×)。合并的有机萃取物用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩以产生标题化合物（320.3 mg, 89%, 70质量%）。MS (m/z) 333 (M+H)。

制备14

(3-氯-5,6-二甲基-吡嗪-2-基)肼

方案3，步骤1：2,3-二氯-5,6-二甲基-吡嗪（2.0 g, 11.298 mmol）和肼（0.943 mL,28.2 mmol, 95质量%）在EtOH（15 mL）中的搅拌溶液在100℃下加热整夜。将反应混合物减压浓缩以产生标题化合物（1.94 g, 84.6%）。MS (m/z) 173 (M+H)。

制备15

N'-(3-氯-5,6-二甲基-吡嗪-2-基)-1-环丙基-环丙烷碳酰肼

方案3，步骤2：将(3-氯-5,6-二甲基-吡嗪-2-基)肼（4.08 g, 23.6 mmol）、1-环丙基环丙烷甲酸（4.77 g, 37.8 mmol）、HATU（14.7 g, 37.9 mmol）和DIPEA（14.4 mL, 82.6mmol）溶解在DCM（120 ml）中并在室温下搅拌45分钟。反应混合物用水洗涤，经硫酸钠干燥并减压浓缩。残留物通过在二氧化硅上的快速色谱法提纯，用0-100% EtOAc/己烷洗脱以产生标题化合物（4.37 g, 65.8%）。MS (m/z) 280 (M+H)。

以基本类似于制备15的方法的方式制备下列化合物。

表1

制备编号	化学名称	结构	MS (m/z) (M+H)
				16	N'-(3-氯-5,6-二甲基-吡嗪-2-基)-1-乙基-环丙烷碳酰肼	269
17	N'-(3-氯-5,6-二甲基-吡嗪-2-基)-1-甲基-环丙烷碳酰肼		255

制备18

5-氯-3-(1-环丙基环丙基)-7-(环丙基甲基)-6-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮

方案1，步骤5：将N'-[6-氯-4-(环丙基甲基)-5-甲基-3-氧代-哌嗪-2-基]-1-环丙基-环丙烷碳酰肼（18.44 g , 54.75毫摩尔）添加到1,4-二氧杂环己烷（547.5 mL, 6413mmol）中，接着加入TEA（30.52 mL, 219.0 mmol）和亚硫酰氯（7.98 mL, 109.5毫摩尔）。关闭反应器并在室温下搅拌30分钟，然后在80℃下加热2小时。将反应冷却到室温并加入水(1L)。混合物用DCM萃取（2 x 750 ml）。合并有机萃取物并经硫酸钠干燥；过滤并减压浓缩以产生残留物。残留物通过用EtOAc: 己烷洗脱的硅胶快速色谱法提纯，以产生标题化合物（9.2g, 52%）。MS (m/z) 321 (M+H)。

制备19

3-(1-环丙基环丙基)-5,6-二甲基-7H-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮

方案3，步骤3：将N'-(3-氯-5,6-二甲基-吡嗪-2-基)-1-环丙基-环丙烷碳酰肼（3.74g, 7.99 mmol, 60质量%）溶解在乙酸（15 mL）中，并在微波辐照下在130℃下加热3小时。将反应冷却到室温，通过过滤收集固体并用己烷洗涤以产生标题化合物（1.98 g, 100%）。MS(m/z) 245 (M+H)。

以基本类似于制备19的方法的方式制备下列化合物。

表2

制备编号	化学名称	结构	MS (m/z) (M+H)
				20	5,6-二甲基-3-(1-甲基环丙基)-7H-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮	219
21	3-(1-乙基环丙基)-5,6-二甲基-7H-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮		233

实施例1

3-(1-环丙基环丙基)-7-(环丙基甲基)-6-[(1-甲基吡唑-4-基)甲基]-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮

方案1，步骤6：将碳酸钾（0.127 g, 0.922 mmol）添加到5-氯-3-(1-环丙基环丙基)-7-(环丙基甲基)-6-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮（0.098 g, 0.307 mmol）和1-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊-2-基)吡唑（0.0476 g, 0.229 mmol）在DMF（4.0 mL）中的溶液中。将反应脱气并用N₂吹扫10分钟。将1,1'-双(二-叔丁基膦基)二茂铁二氯化钯（0.015 g, 0.022 mmol）添加到反应中并将混合物在120℃下加热16小时。反应在EtOAc和冷饱和NaHCO₃溶液之间分配，并分离。有机层用5%氯化锂（水性）、接着盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残留物通过用0-100%丙酮/己烷洗脱的硅胶快速色谱法提纯以产生标题化合物（0.015 mg, 13%）。MS (m/z) 365 (M+H)。

实施例2

3-(1-环丙基环丙基)-7-(环丙基甲基)-5,6-二甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮

方案3，步骤4：将双(三甲基甲硅烷基)氨基锂（2.5 mL, 2.5 mmol, 1 mol/L，在MTBE中）添加到在DMF（8 mL）中的3-(1-环丙基环丙基)-5,6-二甲基-7H-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮（202 mg, 0.827 mmol）中并将反应在室温下搅拌1小时。加入(溴甲基)环丙烷（400 μL, 4 mmol）和碘化钾（15 mg, 0.0909 mmol）并将反应在室温下搅拌整夜。加入另外的(溴甲基)环丙烷（80 μL, 0.8 mmol）和碘化钾（15 mg, 0.0909 mmol），反应在室温下搅拌4小时，然后在35℃下搅拌整夜。反应在EtOAc和水之间分配，并分离。水性物质用EtOAc萃取。有机层用5%氯化锂（水性）、接着盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。将残留物与以替代性实施例2中所述基本相同的方式制备的先前物质合并并通过用0-10% MeOH/DCM洗脱的硅胶快速色谱法提纯。将分离的物质与以基本相同的方式制备的先前物质（51mg规模反应）合并并从EtOAc中重结晶和在真空炉中干燥以产生标题化合物（140.3 mg,16%总收率）。MS (m/z) 299 (M+H)。

以基本类似于实施例2的方法的方式制备下列化合物。

表3

实施例编号	化学名称	结构	MS (m/z) (M+H)
				3	3-(1-环丙基环丙基)-5,6-二甲基-7-戊基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮	315
4	7-(环丁基甲基)-3-(1-环丙基环丙基)-5,6-二甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮		313

替代性实施例2

方案3，步骤4：在DMF（1 mL）中合并5,6-二甲基-3-(1-甲基环丙基)-7H-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮（25 mg, 0.07 mmol）、碳酸铯（100 mg, 0.31 mmol）、碘化钾（3 mg,0.02 mmol）和溴甲基环丙烷（25 μL, 0.26 mmol）。混合物在N₂下在80℃下搅拌整夜。将反应冷却到室温并用EtOAc稀释和用水洗涤(2×)。有机层用5%氯化锂（水性）洗涤，经无水硫酸钠干燥，分离并减压浓缩。残留物通过用0-15% MeOH/DCM洗脱的硅胶快速色谱法提纯以产生标题化合物（8 mg, 3.7%）。MS (m/z) 299 (M+H)。

实施例5

7-丁基-3-(1-环丙基环丙基)-5,6-二甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮

方案3，步骤4：在0℃下将氢化钠（950mg, 23.75 mmol, 60质量%，在矿物油中）添加到在DMF（50 mL）中的3-(1-环丙基环丙基)-5,6-二甲基-7H-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮（1.95 g, 7.98 mmol）中。加入1-溴丁烷（2.15 mL, 19.9 mmol）并将反应在室温下搅拌整夜。然后将反应在60℃下搅拌2小时。将反应冷却到室温并用EtOAc稀释。有机层用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残留物通过在二氧化硅上的快速色谱法提纯，用0-50% EtOAc/己烷、然后0-10% MeOH/DCM洗脱。合并含产物的色谱级分，在减压下浓缩。不纯的残留物通过在二氧化硅上的快速色谱法提纯，在0-100% EtOAc/DCM中洗脱。合并含产物的色谱级分，减压浓缩并冻干以产生标题化合物（100 mg, 4.7%）。MS (m/z) 301 (M+H)。

实施例6

外消旋3-(1-环丙基环丙基)-5,6-二甲基-7-(四氢吡喃-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮

方案3，步骤4：在DMF（66 mL）中合并3-(1-环丙基环丙基)-5,6-二甲基-7H-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮（1.95 g, 7.98 mmol）、碳酸铯（7.75 g, 23.8 mmol）、碘化钾（131mg, 0.789 mmol）和2-(溴甲基)四氢-2H-吡喃（1.80 mL, 17.8 mmol）。混合物在N₂下在80℃下搅拌6小时。将反应冷却到室温并用3:1氯仿/异丙醇稀释。有机物用饱和NaHCO₃、接着盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残留物通过在二氧化硅上的硅胶快速色谱法提纯，用0-100% EtOAc/己烷、然后0-10% MeOH/DCM洗脱以产生标题化合物（275 mg,10%）。MS (m/z) 343 (M+H)。

以基本类似于实施例6的方法的方式制备下列化合物。

表4

实施例编号	化学名称	结构	MS (m/z) (M+H)
				7	外消旋3-(1-乙基环丙基)-5,6-二甲基-7-(四氢吡喃-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮	331
8	外消旋5,6-二甲基-3-(1-甲基环丙基)-7-(四氢吡喃-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮		317

实施例9

3-(1-环丙基环丙基)-5,6-二甲基-7-(四氢吡喃-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮；异构体1

和

实施例10

3-(1-环丙基环丙基)-5,6-二甲基-7-(四氢吡喃-2-基]甲基]-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮；异构体2

外消旋3-(1-环丙基环丙基)-5,6-二甲基-7-(四氢吡喃-2-基]甲基]-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮（250 mg, 0.730 mmol）通过使用下列条件的手性色谱法分离成其组成对映异构体：柱(S,S) Whelk-01 25 cm x 21.2 mm, 10 µ；21 x 250 mm, 流动相35 %MeOH : 65 % CO₂，柱温40℃, 流速5 mL/分钟, UV 225。将第一洗脱物质冻干以产生实施例9的标题化合物（95 mg, 38%）, MS (m/z) 343 (M+H), t_(R)= 1.81分钟, ee >99%。将第二洗脱异构体冻干以产生实施例10的标题化合物（95 mg, 38%）, MS (m/z) 343 (M+H),t_(R) = 2.62分钟, ee >99%。

实施例11

3-(1-乙基环丙基)-5,6-二甲基-7-(四氢吡喃-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮，异构体1

和

实施例12

3-(1-乙基环丙基)-5,6-二甲基-7-(四氢吡喃-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮；异构体2

外消旋3-(1-乙基环丙基)-5,6-二甲基-7-(四氢吡喃-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮（564 mg, 1.71 mmol）通过使用下列条件的手性SFC分离成其组成对映异构体：柱(S,S) Whelk-01 25 cm × 21.2 mm, 10 µ, 流动相40% EtOH 75% CO₂, 流速5 mL/分钟, UV 225 nm，柱温35℃。分离第一洗脱物质作为实施例11的标题化合物（262 mg,46.5%）, MS (m/z) 331 (M+H), t_(R) = 1.99分钟, ee >99%。分离第二洗脱物质作为实施例12的标题化合物（248 mg, 44%）, MS (m/z) 331 (M+H), t_(R) = 3.03分钟, ee >99%。

实施例13

5,6-二甲基-3-(1-甲基环丙基)-7-(四氢吡喃-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮；异构体1

和

实施例14

5,6-二甲基-3-(1-甲基环丙基)-7-(四氢吡喃-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮；异构体2

外消旋5,6-二甲基-3-(1-甲基环丙基)-7-(四氢吡喃-2-基甲基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮（210 mg, 0.664 mmol）通过使用下列条件的手性SFC分离成其组成对映异构体：柱(S,S) Whelk-01 25 cm × 21.2 mm, 10 µ, 流动相35% EtOH/CO₂, 流速5 mL/分钟，UV 225 nm，柱温40℃。分离第一洗脱物质以产生实施例13的标题化合物（60 mg,28.6%）, MS (m/z) 317 (M+H), t_(R) = 1.84分钟, ee >99%。分离第二洗脱物质以产生实施例14的标题化合物（55 mg, 26.2%）, MS (m/z) 317 (M+H), t_(R) = 2.65分钟, ee >99%。

实施例15

3-(1-环丙基环丙基)-5,6-二甲基-7-[(1-甲基环丙基)甲基]-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮

方案3，步骤4：在DMSO（7 mL）中合并3-(1-环丙基环丙基)-5,6-二甲基-7H-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮（350 mg, 1.43 mmol）、碳酸铯（1.40 g, 4.3 mmol）和甲磺酸(1-甲基环丙基)甲酯（250 mg, 1.52 mmol）。该混合物在N₂下在室温下搅拌整夜。该反应用EtOAc稀释并用盐水洗涤。水层用EtOAc萃取，合并的有机物经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。残留物通过在C18上用10-60% ACN/H₂O洗脱的反相快速色谱法提纯，并冻干以产生标题化合物（2 mg, 0.45%）。MS (m/z) 313 (M+H)。

实施例16

7-丁基-3-(1-环丙基环丙基)-5-乙基-6-甲基-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-8-酮

方案2，步骤6：N'-(4-丁基-6-乙基-5-甲基-3-氧代-哌嗪-2-基)-1-环丙基-环丙烷碳酰肼（576.1 mg, 1.213 mmol, 70质量%）在六甲基二硅氮烷（4 mL）中在120℃下搅拌整夜。将反应混合物冷却到室温，倒入MeOH中。在添加到MeOH中后，反应混合物剧烈喷发。所得残留物通过用0-10% MeOH/DCM洗脱的硅胶快速色谱法提纯。将所得残留物溶解在六甲基二硅氮烷（4 mL）中并在120℃下搅拌整夜。将反应混合物冷却到室温，加入MeOH，反应在50℃下搅拌30分钟并减压浓缩。残留物通过用0-10% MeOH/DCM洗脱的硅胶快速色谱法提纯。该物质通过在C18上的反相快速色谱法进一步提纯，在10-100% ACN/H₂O（0.1%碳酸氢铵）中洗脱以产生标题化合物（101.7 mg, 27%）。MS (m/z) 315 (M+H)。

PDE蛋白质的生成

将编码全长人PDE1A (NP_001003683.1)和PDE1C (NP_005011.1)的核苷酸序列插入具有N末端HIS标签的pFastBac1 (Invitrogen)载体中。将编码全长人PDE4D (NP_006194.2)和PDE3A (NP_000912.3)的催化结构域（残基641-1141）的核苷酸序列插入具有C末端HIS标签的pFastBac1 (Invitrogen)载体中。将编码全长人PDE6A (NP_000431.2)和PDE6B(AAH00249.1)的核苷酸序列插入分别具有N末端HIS标签和N末端Flag标签的pFastBacDual(Invitrogen)载体中以生成PDE6A/6B二聚体。根据Bac-to-Bac Baculovirus Expressionsystem (Invitrogen)的方案进行Sf9细胞中的杆状病毒生成和蛋白质表达。将编码全长人PDE1B (NP_000915.1)的核苷酸序列插入具有C末端HIS标签的pIEX4 (Novagen)中，并且在Sf9细胞中的这两种蛋白质生成都根据供应商的方案（Novagen）进行。使用Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)、接着在SUPERDEX^® 200柱（GE Healthcare）上的尺寸排阻色谱法在储存缓冲液（20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 10%甘油）中提纯His标记的PDE蛋白质。在通过NiNTA柱色谱法提纯后使用抗-Flag M2-琼脂糖(Sigma)提纯包括PDE6A/6B的Flag标记PDE蛋白质，并在储存缓冲液（50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 10%甘油, 0.1 mg/mlFlag肽）中洗脱。所有纯化蛋白质以小等分试样储存在-80℃下。

磷酸二酯酶酶检测

用基于SPA检测系统的放射酶检测法测量所有3',5'环核苷酸PDE酶活性。受试化合物在纯DMSO中使用十点浓度响应曲线稀释。反应混合物中的最大化合物浓度为10或100 µM。化合物在适当浓度下用任一PDE酶预孵育30分钟，然后通过加入底物启动反应。使反应在室温下进行60分钟。接着，通过添加SPA珠停止反应。在12小时后在MICROBETA^TM TRILUX^®计数器中读取样品。通过绘制归一化数据 vs. log [化合物]和使用四参数逻辑斯蒂方程拟合数据来计算IC₅₀值。

Ca²⁺- 钙调蛋白依赖性PDE酶检测

PDE1B、PDE1A和PDE1C根据标准蛋白质生成程序克隆和纯化。制备检测缓冲液以得到在pH 7.5下在水中50 mM Tris-HCl、50 mM MgCl₂、4 mM CaCl₂、0.1% BSA和6 U/ml钙调蛋白的在检测中的最终浓度。对于PDE1A、PDE1B和PDE1C，最终酶浓度分别为0.25、0.074和0.0012nM。通过添加底物[³H]cAMP启动反应，以产生47 nM的最终浓度。

实施例化合物对人PDE1A、PDE1B和PDE1C的体外效力

表5中的数据证实实施例1-16的化合物体外抑制人PDE1A、PDE1B和PDE1C酶活性。

使用[³H]cAMP作为底物的PDE酶检测

使用[³H]cAMP作为反应底物测量下列PDE活性：人PDE3A（催化结构域）和人PDE4D。这两种酶都根据标准程序克隆和纯化。制备检测缓冲液以得到在pH 7.5下50 mM Tris-HCl、8.3mM MgCl₂、1.7 mM EDTA和0.1% BSA的在检测中的最终浓度。对于PDE3A和PDE4D，最终酶浓度分别为0.008和0.021 nM。通过添加底物[³H]cAMP启动反应，以产生47 nM的最终浓度。

实施例化合物对人PDE3A（催化结构域）和PDE4D的体外效力

使用[³H]cGMP作为底物的PDE酶检测

使用[³H]cGMP作为反应底物测量下列磷酸二酯酶活性：人PDE6A/6B。人PDE6的催化活性形式是由α（人PDE6A）和β亚基（人PDE6B）组成的二聚体。通过共表达和纯化策略（使用两个纯化步骤，即NiNTA和抗-FLAG Sepharose色谱法）产生人PDE6A/6B的二聚体。制备检测缓冲液以得到在pH 7.5下50 mM Tris-HCl、8.3 mM MgCl₂、1.7 mM EDTA和0.1% BSA的在检测中的最终浓度。最终酶浓度为5 nM。通过添加底物[³H]cGMP启动反应，以产生80 nM的最终浓度。

实施例化合物对PDE6AB的体外效力

表5、6和7中的数据证实实施例1-16的化合物在体外相对于人PDE3A、PDE4D和PDE6AB是人PDE1A、PDE1B和PDE1C的选择性抑制剂。