CN104688790A - 阿魏极性分离部位在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开阿魏极性分离部位在制备抗肿瘤药物中的应用，阿魏的极性分离部位为用极性溶剂提取阿魏所得到的部位。阿魏的极性分离部位具有良好的抗肝癌、胃癌和/或结肠腺癌作用，特别是其中的乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

Description

阿魏极性分离部位在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于植物药物领域，具体涉及阿魏极性分离部位在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

阿魏，别名：臭阿魏、细叶阿魏，伞形科、阿魏属植物，是新疆一种独特的药材。高50-100厘米，全株披白色绒毛，根肥大，圆柱形或纺锤形，有时分杈，表皮紫黑色，有臭气，开黄色小花。圆茎阿魏与它相比，植株要高一倍，茎直立。功能主治：消积，杀虫，治癥瘕痞块，虫积，肉积，心腹冷痛，疟疾，痢疾。

发明内容

本发明的目的利用阿魏通过极性分离得到的有效部位进行抗肿瘤药物的研制。

阿魏极性分离部位在制备抗肿瘤药物中的应用，所述极性分离部位为用极性溶剂分离提取阿魏所得到的部位。

进一步，所述极性溶剂为乙醇或石油醚。

乙醇提取得的部位进一步用乙酸乙酯、正丁醇或甲醇极性溶剂分离。

进一步，所述极性分离部位为先用乙醇提取阿魏，得到的提取液再用乙酸乙酯、正丁醇或甲醇萃取得到的部位。

进一步，所述极性分离部位为先用乙醇提取阿魏，得到的提取液再用乙酸乙酯或正丁醇萃取得到的部位。

进一步，所述极性分离部位为先用乙醇提取阿魏，得到的提取液再用乙酸乙酯萃取得到的部位。

进一步，所述肿瘤为肝癌、胃癌和/或结肠腺癌。

阿魏极性分离部位，通过阿魏用极性溶剂提取，提取液干燥，得到所述阿魏极性分离部位，所述极性溶剂为乙醇或石油醚。

进一步，用乙醇提取得到提取液先用乙酸乙酯、正丁醇或甲醇萃取，所得萃取液再经干燥得到所述阿魏极性分离部位。

进一步，提取液与硅藻土拌和后，再用乙酸乙酯、正丁醇或甲醇萃取。

阿魏极性分离部位的制备方法，阿魏先用乙醇提取，所得提取液与硅藻土拌和均匀后，再用乙酸乙酯、正丁醇或甲醇萃取，所得萃取液干燥，即得阿魏极性分离部位。

附图说明

图1为新疆阿魏不同极性分离部位对结肠癌Caco-2的凋亡作用流式图，其中，A：正常对照组，B～E分别为石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、甲醇部位；

图2为新疆阿魏不同极性部位对胃癌MFC的凋亡作用流式图，其中，A：正常对照组，B～E分别为石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、甲醇部位；

图3为新疆阿魏不同极性分离部位对肝癌HepG2的凋亡作用流式图，其中，A：正常对照组，B～E分别为石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、甲醇部位；

图4为阿魏乙酸乙酯部位对HCT116荷瘤裸鼠的生长曲线图。

具体实施例方式

以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。

一、新疆阿魏极性分离部位的制备

药材：新疆阿魏药材

试剂：正丁醇(分析级，西安化学试剂厂，批号20081008)，乙醇(分析级，95％，天津市富宇精细化工有限公司，批号20121009)，乙酸乙酯(天津市致远化学试剂有限公司)，石油醚(馏程：30-60℃，天津市富宇精细化工有限公司，20120103)，无水甲醇(天津市富宇精细化工有限公司，20111227)，硅藻土(青岛海洋，20081118)。

新疆阿魏(400g)，用2000mL石油醚超声提取40min，控温在40℃以下，过滤，提取液浓缩，60℃干燥至无气泡产生，即得石油醚部位。

将新疆阿魏经石油醚提取过滤后的残渣用乙醇超声提取40min(料液比为1：5，g/ml)，控温在40℃以下，过滤，提取液减压浓缩，浓缩液用硅藻土拌和均匀后(以硅藻土将浓缩液吸干，成粗粉状即可)，依次用乙酸乙酯、正丁醇、无水甲醇超声萃取5min，滤过，滤液浓缩干燥，分别得乙酸乙酯部位、正丁醇部位、甲醇部位。

上述乙醇提取液浓缩后，如采用传统的水相-有机相进行萃取，乙醇提取物与水接触后会产生乳白色油状物，为避免该问题以及保证成分的稳定，本发明优先将浓缩液与硅藻土进行干粉拌样。

二、新疆阿魏极性分离部位对肿瘤细胞的抑制作用

在初期的抗肿瘤药物筛选和研究中，药物体外肿瘤细胞抑制研究扮演着非常重要的角色。在体外肿瘤细胞抑制方法筛选抗肿瘤药物时，检测的有效指标常针对细胞的生存能力和生存状态两个方面，前者的是指对肿瘤细胞的直接增殖抑制作用的测定，常用的检测方法的有MTT法与SRB法。而后者是指对肿瘤细胞促使凋亡的作用的测定，常用的有流式细胞术、ELISA法等。本研究将通过SRB与流式细胞术的检测分析新疆阿魏极性分离部位干预下，人肝癌细胞HepG2、小鼠胃癌细胞MFC、人结肠腺癌细胞Caco-2的增殖抑制和凋亡作用情况。

2.1 实验仪器与材料

2.1.1 实验仪器

超净工作台(中国上海智诚ZHJH-C1112B)，酶标仪(美国Thermo公司)，二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)，流式细胞仪(美国MILLPORE公司，GUAVAEASYCYTE 8HT)，10mL移液管，5mL移液管，100mm细胞培养皿，6孔板，96孔细胞培养板(美国COSTAR公司)，移液器(德国eppendorf公司)。

2.1.2 实验材料

药材：上述阿魏各极性分离部位。

细胞株：人肝癌细胞HepG2、小鼠胃癌细胞MFC、人结肠腺癌细胞Caco-2(购自上海中科院细胞研究所，试验使用在5-10代之间)。

试剂：DMEM高糖、RPMI1640培养液(美国Gibco公司，批号1346370、1237839)，胎牛血清(美国Hyclone公司批号F120121)，青链霉素混合液(美国Hyclone公司，批号J120051)，0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液(北京Solarbio公司,批号120913)，DMSO(美国Sigma公司，批号67685TT)，PBS(美国Hyclone公司，批号NYCO830)，SRB(美国Sigma公司，批号20223FAV)，三氯乙酸(分析级，天津市百世化工有限公司，批号20100102)，冰乙酸(分析级，天津市百世化工有限公司，批号20121103)。

2.2 实验方法

2.2.1 SRB法测定新疆阿魏不同极性分离部位对结3种肿瘤细胞的增殖抑制作用

2.2.1.1 分组与给药

取处于对数生长期的HepG2细胞、MFC细胞、Caco-2细胞制成细胞悬液，计数调整其浓度为1×10⁵cells·mL^-1。于96孔板上每孔加入上述细胞悬液100μL，四周边缘孔用无菌PBS填充，培养24h后加药处理。以正常培养基加相应浓度的助溶剂DMSO(浓度小于0.2％)为正常对照组，上述新疆阿魏的极性分离得到的石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和甲醇部位4组为药物组，分别用DMSO助溶后用培养基分别稀释成250mg·L^-1、125mg·L^-1、62.5mg·L^-1、31.2mg·L^-1、15.6mg·L^-1。将孔中原有培养基弃去加入含药物的培养基200μL。每组设3个复孔，后再将96孔板继续放入培养箱中培养24h。并设无细胞加培养基的孔为调零孔。

2.2.1.2 细胞固定

带阿魏各极性部位干预处理终止后，每个处理孔加入50μL预冷过三氯乙酸溶液(50％)固定细胞，完成后移入4℃冰箱中固定2h，取出再用去离子水冲洗5遍，在室温下晾干。

2.2.1.3 染色

待上述处理完成的96孔板室温下晾干后，每孔加入0.4％SRB染液100μL，染色30min后用吸去染料，再用1％乙酸漂洗4次，除去未结合的染料，室温晾干。

2.2.1.4 检测

用150μL Tris-base碱液(10mmol·L^-1，pH10.5)溶解与细胞蛋白结合的染料，脱色摇床上反复振荡10min，上酶标仪采用515nm处测定吸光度值(A)。

2.2.1.5 计算

肿瘤细胞增殖的抑制率＝(A_对照孔－A_给药孔)/(A_对照孔－A_调零孔)×100％

根据各浓度抑制率，IC₅₀采用Graphpad Prism 5软件提供IC₅₀计算模型计算。以上实验重复3次，求出3次实验的各浓度的抑制率与IC₅₀以平均值作为最终结果。

2.2.2 新疆阿魏不同极性分离部位对肿瘤细胞的凋亡作用

2.2.2.1 分组与给药

取处于对数生长期的HepG2细胞、MFC细胞、Caco-2细胞制成细胞悬液，计数调整其浓度为2×10⁵cells·mL^-1于6孔板上，每孔加1mL细胞悬液，放入培养箱培养24h。设正常对照组与上述新疆阿魏分离的石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、甲醇部位4个给药组，按照上述配药方法配置成62.5mg·L^-1，弃去原来培养基，每孔加入2mL含药培养基，再放入培养箱培养24h。

2.2.2.2 细胞收集

从6孔板中收集经药物处理后24h的细胞，PBS打散成细胞混悬液，细胞计数细胞数目控制在1～5×10⁶cell·mL^-1范围内。用PBS，4℃，500r·min^-1，5min离心，重复清洗2次，完毕后收集细胞用试剂盒自带的染色缓冲液400μL调成细胞混悬液。

2.2.2.3 细胞荧光染色

上述细胞混悬液加入染料Annexin V-FITC 5μL溶液用混匀器混匀，4℃下染色20min，再加入PI染料10μL溶液混匀器混匀，4℃下染色5min。

2.2.2.4 细胞流式检测

清洗流式仪系统后，调试流式仪工作站软件，在进样的96孔板中，加入200μL上述荧光染色处理的待测细胞悬液，进行检测。实验完毕后图示四个象限所代表为左下象限：无凋亡的细胞；右下象限：处于早期凋亡的细胞；右上象限：处于晚期凋亡细胞；左上象限：细胞碎片，并计算总凋亡率(早期凋亡率+晚期凋亡率)。重复实验三次。

2.2.3 统计学方法

数据用表示，用SAS.JMP 9.0软件，先进行单因素方差分析，与对照组比较采用Dunnett法，多组两两比较采用TUKEY-HSD法分析，以(P＜0.05)为差异有统计学意义。

2.3 实验结果

2.3.1 新疆阿魏各极性分离部位对Caco-2细胞、HepG2细胞、MFC细胞的增殖抑制结果如下

表1 新疆阿魏各极性部位对Caco-2细胞抑制增殖结果

注:对照组相比*P＜0.05

表2 新疆阿魏各极性部位对HepG2细胞抑制结果

注:对照组相比*P＜0.05

表3 新疆阿魏各极性部位对MFC细胞抑制情况

注:对照组相比*P＜0.05

结果表明，上述新疆阿魏各极性部位对Caco-2细胞、HepG2细胞、MFC细胞的增殖均有一定增殖抑制作用，其中，新疆阿魏的乙酸乙酯部位、正丁醇部位对Caco-2细胞、HepG2细胞、MFC细胞的抑制效果比较明显，甲醇部位抑制作用相对较弱，石油醚部位抑制作用相对最弱。

2.3.2 新疆阿魏各极性分离部位对Caco-2细胞、HepG2细胞、MFC细胞的促凋亡作用结果

表4 新疆阿魏各极性部位促肿瘤细胞凋亡作用

注：同种细胞下与正常对照相比*P＜0.05,同种细胞下各组与石油醚组相比#P＜0.05，

同种细胞各组下与乙酸乙酯组相比^P＜0.05，同种细胞各组下与正丁醇组相比&P＜0.05

结果表明，新疆阿魏极性分离的各部位均有促进结肠腺癌Caco-2细胞凋亡作用(见图1)。石油部位总凋亡率为(43.3±1.1)％，乙酸乙酯部位总凋亡率为(56.2±0.9)％；正丁醇部为(46.4±4.9)％，甲醇部为(48.0±5.5)％，且与对照组(1.2±0.8)％相比差异有统计学意义，其中乙酸乙酯部促凋亡效果最好与其他三组相比差异有统计学意义。

新疆阿魏极性分离的各部位均有促进结胃癌MFC细胞凋亡作用(见图2)。石油醚部位总凋亡率为(12.3±3.4)％，乙酸乙酯部位为(64.0±3.2)％，正丁醇部位为(80.0±11.5)％，甲醇部位为(76.3±12.1)％，且与对照组(1.8±0.9)％相比差异有统计学意义，其中，正丁醇部、甲醇部效果最为突出且在统计学上无差异。

结果表明，新疆阿魏极性分离的各部位均有促进肝癌HepG2凋亡作用(见图3)。石油醚部位总凋亡率为(9.1±3.7)％，乙酸乙酯部位为(80.8±11.6)％，正丁醇部位为(73.4±4.6)％，甲醇部位为(58.4±4.1)％，且与对照组(2.1±0.7)％相比差异具有统计学意义。其中，乙酸乙酯部位、正丁醇部位效果最为突出且在统计学上无差异。

三、新疆阿魏的急性毒性实验

本研究根据国家食品药品监督管理局制定的《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》来进行。

3.1 实验仪器与材料

3.1.1 实验仪器

AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，研钵(10mL)，电热恒温水浴锅(北京市医疗设备厂)，超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)，WS70-1红外快速干燥箱(2000401，巩义市英峪予华仪器厂)，EYELA旋转蒸发仪(SB-2000上海爱朗仪器有限公司)

3.1.2 实验材料

3.1.2.1 实验动物

昆明种小鼠，雌雄各半，体重18～22g，由新疆自治区疾病预防控制中心动物繁殖中心提供，动物合格证号：SCXK2005-006号。室温18～22℃，相对湿度35％～45％，小鼠自由摄食和饮水。

3.1.2.2 试剂

95％乙醇(分析级，天津市富宇精细化工有限公司，批号20121009)，正丁醇(分析级，西安化学试剂厂，批号20081008)，95％乙醇(天津市富宇精细化工有限公司，批号20091227)，乙酸乙酯(天津市致远化学试剂有限公司，批号20110912)30-60℃石油醚(天津市富宇精细化工有限公司，批号20120103)，无水甲醇(天津市富宇精细化工有限公司，批号20111227)，无水乙醇(天津市富宇精细化工有限公司，批号20120420)，硅藻土(青岛海洋，批号20081118)

3.2 实验方法与结果

3.2.1 受试药物的配制

精密称量石油醚部位，用金龙鱼牌食用油溶解，配成所需灌胃浓度。

精密称取乙酸乙酯部位，用无水乙醇助溶，加金龙鱼牌食用油配成所需灌胃浓度，其中无水乙醇最终体积分数为10％。

精密称取甲醇部位、正丁醇部位，用无水乙醇助溶，加水配成所需灌胃浓度，其中无水乙醇最终体积分数为10％。

3.2.2 小鼠随机分组

小鼠按体重与性别随机分为给药组与对照组，其中给药组为4组，分别灌胃新疆阿魏石油醚部位、乙酸乙酯部位、甲醇部位、正丁醇部位，对照组为3组，均为溶媒对照组，对照组1灌胃等容量的金龙鱼牌食用油，对照组2灌胃等容量无水乙醇最终体积分数为10％的金龙鱼牌食用油溶液。对照组3为等容量的10％乙醇溶液。每组10只，雌雄各半，实验前禁食不禁水12h。

3.2.3 给药量

在正式试验前，先进行各供试品的急性毒性预试。确定新疆阿魏石油醚部位给药量分别为0.3g/kg、0.4g/kg、0.5g/kg、0.6g/kg、0.7g/kg、0.8g/kg。

新疆阿魏的乙酸乙酯部位给药量分别为0.5g/kg、1.0g/kg、1.5g/kg、2g/kg、2.5g/kg。

新疆阿魏的正丁醇部位给药量分别为0.5g/kg、1.0g/kg、1.5g/kg、2g/kg、2.5g/kg。

新疆阿魏的甲醇部位给药量分别为0.5g/kg、1.0g/kg、1.5g/kg、2g/kg、2.5g/kg。3.2.4观察方法与检测指标

(1)观察方法

给药后详细观察24h内小鼠活动和毒性反应情况，记录死亡动物数。然后每日上、下午各观察2次，连续观察14d。每3d称一次存活小鼠的体重。死亡小鼠即刻解剖观察，存活小鼠于14d处死，解剖观察。

(2)观察指标

①一般症状观察

实验中观察指标有小鼠一般形态外观，包括皮肤和毛、口、眼、鼻以及泌尿生殖系统有无异常、分泌物以及不良反应；行为活动，包括叫声、行动、呼吸；饮食饮水的情况；粪便形态等。记录小鼠毒性反应。观测时间为给药当天即刻、2、4、6小时，给药后第2～14天的上午、下午。

②体重

观察期间每隔3d测定体重，如果明显观察到小鼠有消瘦的临床表现，根据情况增加称重次数。

③病理

每天观察动物，解剖死亡动物和濒死动物，观察脏器病变情况，肉眼观察有病变的脏器进行病理制片，观察期结束，颈椎脱臼处死，系统解剖。

3.2.5 新疆阿魏不同部位的急性毒性的结果

(1)一般症状观察结果

小鼠灌胃新疆阿魏不同极性部位后，剂量较高时出现毒性反应，表现为小鼠静伏不动、呼吸微弱、精神萎靡、走路蹒跚等。瞳孔表现正常，口、眼、鼻未见分泌物，粪便和尿液颜色正常。剂量较高组有动物死亡，多发生在48h之内。48h后至给药后2周期间，存活动物的一般状况、活动等未见异常。

对死亡小鼠解剖可见胸腔有少量出血；胃内存有大量内容物，胃壁变薄胃粘膜脱落，胃肌处无血色；小肠内水充盈；肾脏充血。

(2)动物死亡情况结果

在较高剂量组有不同数量的动物死亡，随着剂量增高，动物死亡数增多，各剂量组动物死亡率，结果见表5。由实验结果可知，新疆阿魏石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、甲醇部位对小鼠的最大耐受量分别为0.6g/kg(4.7g生药/kg)、1.5g/kg(39.9g生药/kg)、2.0g/kg(79.2g生药/kg)、2.0g/kg(56.6g生药/kg)，分别相当于临床人用剂量的187倍、1595倍、3168倍、2263倍。表明新疆阿魏石油醚部位毒性大，毒性成分可能为脂溶性成分。

表5 新疆阿魏极性分离部位对小鼠的急性毒性实验结果

(3)体重观察结果

每隔3d给存活动物称重，记录数据。采用SPSS17.0统计软件进行重复测量资料的方差分析。结果见表6。

表6 新疆阿魏不同极性部位对小鼠体重的影响

注：与对照组相比，P＞0.05.

四、新疆阿魏极性分离部位的体内抗肿瘤实验

本实验以S180荷瘤小鼠为模型，以抑瘤率为指标考察阿魏极性分离部位(选取其中的乙酸乙酯部位为考察对象)的抑瘤效果；建立小鼠H22肝癌腹水瘤模型，考察阿魏乙酸乙酯部位对H22荷瘤小鼠生命延长率的影响。

4.1 实验仪器与材料

4.1.1 实验仪器

超净工作台(中国上海智诚ZHJH-C1112B)，酶标仪(美国Thermo公司)，二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)，10mL移液管，5mL移液管，100mm细胞培养皿，移液器(德国eppendorf公司)。

4.1.2 实验材料

实验动物

昆明种小鼠，雌雄各半，体重18～22g，由新疆自治区疾病预防控制中心动物繁殖中心提供，动物合格证号：SCXK2005-006号。室温18～22℃，相对湿度35％～45％，小鼠自由摄食和饮水。

药材：上述阿魏乙酸乙酯部位；环磷酰胺(CTX)(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号13060321)，临用时以生理盐水配成2mg/mL的溶液。

细胞株：S180小鼠肉瘤细胞株，H22小鼠肝癌细胞株(购自上海中科院细胞研究所，试验使用在5-10代之间)。

试剂：RPMI1640培养液(美国Gibco公司，批号1237839)，胎牛血清(美国Hyclone公司批号F120121)，青链霉素混合液(美国Hyclone公司，批号J120051)，0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液(北京Solarbio公司，批号120913)，DMSO(美国Sigma公司，批号67685TT)，PBS(美国Hyclone公司，批号NYCO830)，台盼蓝(华美生物工程公司)。

4.2 实验方法

4.2.1 受试药物的配制

精密称取阿魏乙酸乙酯部位，用吐温-80助溶，加0.1％CMC-Na配成所需灌胃浓度，其中吐温-80最终体积分数为10％。

4.2.2 模型的建立、分组及给药

4.2.2.1 动物模型建立

将接种后7d的S180小鼠和H22小鼠，腹部皮肤消毒后，用注射器抽取腹水，取少量腹水用台盼蓝染色计数，其中癌细胞数为95％以上方可使用，以无菌生理盐水稀释腹水后，调整细胞浓度为2×10⁷个/mL，放入无菌容器内，置冰块中暂时保存，在小鼠右肢腋部皮下按0.2mL/只接种S180细胞，按0.2mL/只小鼠腹腔接种H22细胞。

4.2.2.2 分组

小鼠接种S180肿瘤细胞24h后称重，将其随机分为5组，分别为阿魏乙酸乙酯部位3个剂量组、阴性对照组及CTX阳性对照组，每组12只。

小鼠接种H22肿瘤细胞24h后称重，将其随机分为5组，分别为阿魏乙酸乙酯部位3个剂量组、阴性对照组及CTX阳性对照组，每组12只。

4.2.2.3 给药

小鼠分组后，开始灌胃给药，连续给药14d，阿魏乙酸乙酯部位3个剂量组每天的给药量分别为0.50，1.0，2.0g/kg，阴性对照组给予相同体积的生理盐水，阳性对照组给20mg/kg的环磷酰胺。

4.2.3 阿魏乙酸乙酯部位对S180荷瘤小鼠抑瘤率的影响

停药次日称量小鼠体重后，颈椎脱臼法处死小鼠，剥瘤称重，体内抑瘤试验中实体瘤的疗效以抑瘤率表示，中草药抑瘤率大于30％，合成药大于40％，且有统计学意义，重复3次，疗效稳定，则评定有一定疗效。本实验结果判定参考合成药标准。计算抑瘤率公式如下。

瘤重抑制率％＝(阴性对照组瘤重-给药组瘤重)/阴性对照组瘤重×100％

4.2.4 阿魏乙酸乙酯部位对H22小鼠生命延长率的影响

停药后，分别记录对照组和治疗组平均生存时间，治疗组观察时间为30d(超过此时限者，按此时限最长日期计算)，腹水型肿瘤疗效以生命延长率表示，若腹腔给药生命延长率大于75％，且有统计学意义，重复3次，疗效稳定，则评定有一定疗效。按下列公式计算生命延长率。

生命延长率％＝(给药组存活天数-阴性对照组存活天数)/阴性对照组存活天数×100％

4.2.5 实验数据处理

应用SPSS15.0 for Windows软件对数据进行统计学处理，结果以表示，组间比较采用方差检验。

4.3 结果

4.3.1 阿魏乙酸乙酯部位对S180荷瘤小鼠抑瘤率的影响

实验结果如下表所示，各组小鼠开始体重差异无统计学意义(P>0.05)；阳性对照组结束体重与阴性对照组比较有显著差异(P<0.01)。

CTX对照组可显著抑制S180荷瘤小鼠的瘤块质量，与阴性对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01)，符合阳性药的作用特点。阿魏乙酸乙酯部位各剂量组及阳性对照组荷瘤小鼠瘤重均显著低于阴性对照组(P<0.05，P<0.01)；尤其是中剂量组抑瘤率为43.60％；说明阿魏乙酸乙酯部位对S180实体肿瘤生长具有良好的抑制作用。

表7 阿魏乙酸乙酯部位对S180荷瘤小鼠抑瘤率的影响

注:与阴性对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01

4.3.2 阿魏乙酸乙酯部位对H22小鼠生命延长率的影响

实验结果如下表所示，CTX对照组可显著延长H22荷瘤小鼠的生存时间，与阴性对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01)，符合阳性药的作用特点。阿魏乙酸乙酯部位各剂量组可显著延长H22荷瘤小鼠的生存时间，与阴性对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)，阿魏乙酸乙酯部位中剂量组生命延长率达到82.12％，低剂量时生命延长率随着剂量的增加而升高，当高剂量时生命延长率却略有下降。

表8 阿魏乙酸乙酯部位对H22腹水瘤小鼠生存时间的影响

注:与阴性对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01

以上实验结果说明阿魏乙酸乙酯部位在体内有明确的抗肿瘤作用。

在考察其对S180肉瘤、H22腹水瘤的抑制作用后，本实验拟通过建立人结肠癌移植瘤裸鼠模型，进一步考察新疆阿魏乙酸乙酯部位对结直肠癌的作用。

5.1 实验仪器与材料

5.1.1 实验仪器

超净工作台(中国上海智诚ZHJH-C1112B)，酶标仪(美国Thermo公司)，二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)，10mL移液管，5mL移液管，100mm细胞培养皿，移液器(德国eppendorf公司)，游标卡尺(东莞长安铭钦电子工具)。

5.1.2 实验材料

受试动物

SPF级BALB/c裸鼠，购自上海斯莱克实验动物有限公司，裸鼠体重18±2克，雌雄不限。严格饲养在恒温(20℃～26℃)、恒湿(50％～56％)、无特定病原体的空气洁净层流架内；裸鼠盒、空气过滤罩、垫料、饲料和饮水等均经高压蒸汽灭菌，并在无菌条件下适时更换。

药材：阿魏乙酸乙酯部位；氟尿嘧啶(5-Fu)注射液(上海旭东海普药业有限公司)。

细胞株：人结肠癌细胞株HCT116(购自上海中科院细胞研究所，试验使用在5-10代之间)。

试剂：RPMI1640培养液(美国Gibco公司，批号1237839)，胎牛血清(美国Hyclone公司批号F120121)，青链霉素混合液(美国Hyclone公司，批号J120051)，0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液(北京Solarbio公司,批号120913)，DMSO(美国Sigma公司，批号67685TT)，PBS(美国Hyclone公司，批号NYCO830)。

5.2 实验方法

5.2.1 受试药物的配制

精密称取新疆阿魏乙酸乙酯部位，用吐温-80助溶，加0.1％CMC-Na配成所需灌胃浓度，其中吐温-80最终体积分数为10％。

5.2.2 模型的建立、分组及给药

5.2.2.1 人结肠癌移植瘤裸鼠模型的制作

裸鼠皮下接种生长状态良好的HCT116培养细胞，用D-Hanks液洗3次，0.25％胰酶消化，1000rpm离心5分钟，收集细胞，无血清培养液洗涤细胞两次，重悬细胞，细胞的浓度调整为2×10⁷个/mL。裸鼠左侧或右侧腋下皮下接种，每只裸鼠接种每个部位约2×10⁶/个细胞。注射时可见局部出现皮丘，用游标卡尺测量并计算肿瘤体积：V＝L×W²/2(V＝肿瘤体积；L＝长径；W＝短径)。待肿瘤体积增至约100mm³时，移植瘤模型建立。

5.2.2.2 分组及给药

荷瘤裸鼠按肿瘤体积随机分为5组，每组6只，即阴性对照组、阳性药物组、阿魏乙酸乙酯部位3个剂量组。小鼠分组后，开始灌胃给药，新疆阿魏乙酸乙酯部位3个剂量组每天的给药量分别为0.50，1.0，2.0g/kg，阴性对照组给予相同体积的生理盐水，阳性对照组给20mg/kg的氟尿嘧啶。给药6d后间隔1d，连续给药3周。给药期间密切观察裸鼠的一般状况，包括精神状态、活动、饮食及大小便，并每日测量裸鼠体重，调整用药剂量，每周使用游标卡尺测量肿瘤结节的长径和短径，计算肿瘤体积。

5.2.2.3 取材及测量

每天观察裸鼠的生存状况，每隔3d用游标卡尺测量肿瘤的长径(L)及其短径(D)，计算肿瘤体积，根据各组平均瘤体积绘制肿瘤生长曲线。根据肿瘤体积计算相对肿瘤体积(RTV)，计算公式为:RTV＝V_t/V₀(V₀为分笼给药时肿瘤体积，V_t为每次测量时的肿瘤体积)。抗肿瘤活性评价指标采用相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式为T/C＝T_RTV/C_RTV×100％(T_RTV为治疗组RTV，C_RTV为对照组RTV)。

疗效评价标准：T/C％>60％为无效；T/C％≤60％，并经统计学处理P<0.05为有效。

5.2.2.4 肿瘤抑制率计算

采用颈推脱臼法处死全部小鼠，剥取肿瘤，称质量，计算肿瘤抑制率。平均肿瘤抑制率按下式计算:平均肿瘤抑制率(％)＝(对照组瘤平均瘤质量-给药组平均瘤质量)/对照组瘤平均瘤质量×100％。

疗效评价标准：肿瘤生长抑制率<40％为无效；肿瘤生长抑制率≥40％，并经统计学处理P<0.05为有效。

5.2.2.5 组织形态学观察

取部分肿瘤组织及肝、脾、肾等用10％中性甲醛溶液固定，逐级乙醇脱水、浸蜡，石蜡包埋后切片，常规HE染色后光镜观察。

5.2.3 实验数据处理

应用SPSS15.0 for Windows软件对数据进行统计学处理，结果以表示，组间比较采用方差分析。

5.3 结果

5.3.1 阿魏乙酸乙酯部位对荷瘤裸鼠肿瘤生长的影响

实验期间每3d测量1次移植瘤体积参数并计算瘤体积，计算各组平均瘤体积并按瘤体积绘制移植瘤生长曲线见图4。实验结束时，对照组、阿魏低中高剂量组HCT116裸鼠移植瘤的平均体积分别是分组给药时瘤体积的8.4倍、5.3倍、3.7倍和3.9倍。表明用药后肿瘤生长速度较阴性对照组减慢，其中阿魏中、高浓度抑制效果较好。

5.3.2 阿魏乙酸乙酯部位对荷瘤裸鼠相对瘤体积及相对肿瘤增殖率的影响

根据每次测量的移植瘤体积计算相对瘤体积(RTV)，并进一步计算相应的相对肿瘤增殖率(T/C)，给药结束后比较阿魏各剂量组治疗组与阴性对照组的RTV及T/C值，可见阿魏乙酸乙酯部位能抑制HCT116细胞在裸鼠体内的增殖，抑制作用与时间和剂量呈依赖关系。治疗第21天，阿魏乙酸乙酯部位中高剂量组T/C值均小于60％，且与阴性对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。结果见表7。

5.3.3 阿魏乙酸乙酯部位对荷瘤裸鼠肿瘤质量影响和平均抑瘤率

裸鼠移植瘤边界清楚，有包膜，肿瘤表面凹凸不平，未见转移病灶。阿魏乙酸乙酯部位低中高剂量组的平均瘤质量为(1.08±0.29)g、(0.79±0.20)g和(0.89±0.27)g，与对照组(1.59±0.26)g比较，治疗组移植瘤平均质量显著轻于对照组(P<0.05，P<0.01)，阿魏乙酸乙酯部位中高剂量组的平均抑瘤率分别为50.31％和44.03％，均大于40％。结果见表9。

表9 阿魏乙酸乙酯部位对HCT116荷瘤裸鼠的影响

注:与阴性对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01

5.3.4 阿魏乙酸乙酯部位对裸鼠移植瘤及主要脏器组织形态的影响

移植瘤组织切片HE染色显示：对照组肿瘤组织中肿瘤细胞生长旺盛，细胞致密，染色较深，肿瘤组织中可见明显的血管生成，中心区可见坏死区域；治疗组组织视野中肿瘤细胞不同程度减少，可见坏死区域，瘤组织不同程度为纤维组织包裹；部分细胞体积缩小，胞质致密、有嗜酸性染色增强现象。HE染色光镜下观察各组裸鼠心、肝、脾和肾组织均无明显肿瘤转移及病理学改变。

结果显示，阿魏乙酸乙酯部位对人结肠癌HCT116细胞裸鼠移植瘤有明显的抑制作用，具有体内抗结肠癌活性，无明显毒副作用。

Claims (10)

1.阿魏极性分离部位在制备抗肿瘤药物中的应用，所述极性分离部位为用极性溶剂分离提取阿魏所得到的部位。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述极性溶剂为乙醇或石油醚。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述极性分离部位为先用乙醇提取阿魏，得到的提取液再用乙酸乙酯、正丁醇或甲醇萃取得到的部位。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述极性分离部位为先用乙醇提取阿魏，得到的提取液再用乙酸乙酯或正丁醇萃取得到的部位。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述极性分离部位为先用乙醇提取阿魏，得到的提取液再用乙酸乙酯萃取得到的部位。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌、胃癌和/或结肠腺癌。

7.阿魏极性分离部位，通过阿魏用极性溶剂提取，提取液干燥，得到所述阿魏极性分离部位，所述极性溶剂为乙醇或石油醚。

8.根据权利要求7所述的阿魏极性分离部位，其特征在于，用乙醇提取得到的提取液先用乙酸乙酯、正丁醇或甲醇萃取，所得萃取液再经干燥得到所述阿魏极性分离部位。

9.根据权利要求7所述的阿魏极性分离部位，其特征在于，提取液与硅藻土拌和后，再用乙酸乙酯、正丁醇或甲醇萃取。

10.阿魏极性分离部位的制备方法，阿魏先用乙醇提取，所得提取液与硅藻土拌和均匀后，再用乙酸乙酯、正丁醇或甲醇萃取，所得萃取液干燥，即得阿魏极性分离部位。