CN104655464B - 一种小麦种子高分子量谷蛋白亚基检测样品的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种小麦种子高分子量谷蛋白亚基检测所需样品的制备方法，属于生物化学领域。在小麦种子无胚端切取其体积的1/4~1/5，置于单孔容积为200 uL的96孔PCR扩增用微孔板中，并在每个微孔中放入1粒直径2 mm的钢珠。随后在微孔板中加入40 uL浸泡缓冲液静置过夜，再加入120 uL提取缓冲液，经高通量研磨器研磨后，在60℃的烘箱静置30 min，期间分2次，分别漩涡震荡1 min。微孔板经离心后所得上清液为小麦高分子量谷蛋白亚基检测所需样本。该提取方法通量高，适用于大规模的小麦种子高分子量谷蛋白亚基检测中的样品制备。
Description
技术领域
本发明涉及一种小麦种子高分子量谷蛋白亚基检测样品的制备方法，属于谷物化学领域，专用于小麦谷蛋白的化学提取。
背景技术
高分子量麦谷蛋白亚基(High molecular weight glutenin subunit，HMW-GS)对小麦面筋质量具有决定性作用(Gianibelli等，2001)，由Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1三个位点上的6个基因编码，但多数品种具有3～5个HMW-GS。发掘和聚合优质HMW-GS是国内外小麦品质育种最重要的途径，因此如何快速进行HMW-GS的提取和鉴定，直接影响小麦面筋品质分子育种的成效。
由于HMW-GS对面筋强度的影响存在加性效应和互作效应，因此在涉及2-3个HMW-GS杂交转育的育种方案中必须同时跟踪多个亚基。单个基因的聚合酶链式反应(PCR)或多个基因的多重PCR检测可在小麦育种世代的苗期检测，但存在两个问题，一是苗期检测无法观察到小麦单株的农艺性状，对那些农艺性状较差的单株在苗期大规模检测势必浪费人力物力；多重PCR同时还存在本身反应体系不稳定，加之显性标记稳定性差等因素，在一般小麦育种单位的实用性仍不足。另外，HMW-GS的PCR检测一般根据每个位点x型和y型亚基两个编码基因紧密连锁的特征，仅对其中的一个亚基基因进行标记检测，对部分HMW-GS缺失突变系无法检测。亦有利用芯片的方法对HMW-GS进行鉴定(Jondiko等，2012)，但设备和日常耗材昂贵。HMW-GS为显性表达，传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)可同时检测所有的HMW-GS在当代小麦胚乳中的表达及组成，且可在灌浆期或成熟期进行，不仅避开了小麦生长的农忙期，而且已对目标单株进行了优选，仍是当前最有效实用的方法。但是该方法检测效率较低，主要原因是样品提取繁琐，在分子育种实际工作中实用性较差。因此，建立一套高效低耗的样品制备方法显得尤为重要。
目前用于SDS-PAGE检测的小麦种子HMW-GS提取主要过程为粉碎、化学还原和烷基化三步。育种早代样品可通过小型磨磨制全麦粉(刘丽等，2004)、也可取单粒或半粒种子经锤击或碾压粉碎，这两种方法都需要保证无样品间相互污染，样品准备过程仍较为繁琐。化学还原剂通常选用二硫苏糖醇、β-巯基乙醇，浓度范围为1％-2％；烷基化通常选用4-乙烯吡啶，浓度在1％左右。化学还原剂和烷基化试剂的溶剂和缓冲液通常有50％正丙醇、或含有正丙醇和SDS的Tris-HCl溶液(晏月明等，1998；Jondiko等，2012；刘丽等，2004)。已有的这些提取方法都是在1.5mL或2.0mL离心管中，利用50mg左右样品在100uL-300uL提取系统中完成，需要针对每个样品单独提取，在种子碾碎、离心管准备、加液、离心和取上清液过程中花费大量的时间，较为繁琐。每人每日正常仅可对100个左右的样品进行提取，工作效率低，工作强度大，难以满足品质育种中的大规模检测。
本发明利用容积为200uL的普通96孔PCR扩增用微孔板和高通量组织研磨器，并将样品提取试剂进行复配，1组可完成2板192个样品的提取，每人每日可完成3组6板576个样品的提取，操作简单，工作强度低。相关的方法仍未见报道。参考文献：
1、刘丽,周阳,何中虎,阎俊,张艳,Pena R J.Glu-1和Glu-3等位变异对小麦加工品质的影响.作物学报,2004,30(10):959-968
2、晏月明,刘广田,Prodanovic S.小麦谷蛋白亚基的凝胶电泳分离及其品种鉴定.中国粮油学报,1998,13(6):1-5
3、Jondiko T O,Alviola N J,Hays D B,Ibrahim A,Tilley M,Awika JM.Effect of high-molecular-weight glutenin subunit allelic composition onwheat flour tortilla quality.Cereal Chem,2012,89:155–161
4、Gianibelli M C,Larroque O R,MacRitchie F.Biochemical,genetic,molecular characterization ofwheat glutenin and its component subunits.CerealChem,2001,78:635–646.
发明内容
技术问题
鉴于小麦种子HMW-GS鉴定样品提取效率低、工作强度大的特点，本发明旨在通过使用体积容量为200uL的普通96孔PCR扩增用微孔板，通过样品浸泡、复配提取试剂中的高通量研磨，提供一种高效样品制备方法，提高小麦种子的HMW-GS鉴定效率。
技术方案
本发明的目的是这样实现的：
一种小麦种子高分子量谷蛋白亚基检测样品的制备方法，其特征在于：在96孔微孔板中一步提取。
所述96孔微孔板为实验室通用的容积为200uL的PCR扩增用微孔板，该微孔板配有塑料联排孔盖和每孔1粒直径2mm的钢珠。
其步骤包括：在小麦种子无胚端切取其体积的1/4～1/5，置于200uL的96孔PCR微孔板中，并在每个微孔中放入1粒直径2mm的钢珠；随后在微孔板中加入40uL浸泡缓冲液静置过夜，再加入120uL提取缓冲液，经高通量研磨器研磨后，在60℃的烘箱静置，期间每静置14min，漩涡震荡一次1min，两次共30min，微孔板经离心后所得上清液为小麦高分子量谷蛋白亚基检测所需样本。
浸泡缓冲液：25％正丙醇+0.04M Tris-HCl PH8.0；
提取缓冲液：25％正丙醇+0.04M Tris-HCl PH8.0+3.0％SDS+1.3％DTT+2.0％4-VP。
碾磨使用高通量组织碾磨仪，碾磨频率为30次/s，碾磨时间为2min；微孔板离心条件为4000rpm×15min。
有益效果
现有技术中需要针对每个样品单独提取，在种子碾碎、离心管准备、加液、震荡、离心和上清液移取过程中花费大量的时间，操作繁琐，工作强度大。每人每日正常仅可对100个左右的样品进行提取，工作效率低，难以满足品质育种中的大规模检测。
本发明克服了小麦种子HMW-GS鉴定所需样品制备方法中对每个样品的单独粉碎或碾压、离心管准备、加液、离心和上清液移取等的时间和人力消耗，利用体积容量为200uL的普通96孔PCR扩增用微孔板和高通量组织研磨器，通过缓冲液浸泡样品，并通过复配试剂进行提取，1组可完成2板192个样品的提取。这一方法适于小麦面筋品质育种中HMW-GS的鉴定。本发明与常规方法相比的效率优势如下：
本发明：每人每日可完成3组6板576个样品的提取。
常规方法：每人每日仅可完成约100个样品的提取。
本发明所述方法和常规方法的效率估算(表1)。其中样品数量按576个单粒估算，所用设备中的漩涡震荡器、离心机(1.5mL×24孔角转子、微孔板×2吊篮)、移液器(单道200uL、8道100uL)、96孔微孔板(200uL)、震荡器(30孔适配头和细胞培养板适配头)等均为实验室的通用标准。表1可以看出，本发明操作简单，人力消耗较低，效率显著高于常规方法。在实际操作中，常规方法在当日仅可完成约100个样品的全部提取过程。
表1 常规方法和本发明所述方法效率比较
具体实施方式
实施例1：试剂配制
(一)样品提取相关试剂配制
浸泡试剂A：25％正丙醇(v/v)+0.04M Tris-HCl(PH8.0)
提取试剂B：25％正丙醇(v/v)+0.04M Tris-HCl(PH8.0)+3.0％SDS(w/v，十二烷基硫酸钠)+1.3％DTT(v/w，二硫苏糖醇)+2.0％4-VP(v/v，4-乙烯吡啶)。其中SDS、DTT和4-VP在样品提取前按比例现配加入并摇匀。
(二)聚丙烯凝胶电泳相关试剂配制
凝胶制备相关溶液：1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.8)；1M Tris-HCl缓冲液(pH6.8)；Acr:Bis水溶液(394.8gAcr+5.2g Bis，定容至1000mL)；10％SDS(w/v)水溶液；1.5％过硫酸铵水溶液(w/v)。
5×电极缓冲液：1.5％Tris(w/v)+7.2％g甘氨酸(w/v)+0.5％(w/v)SDS，蒸馏水定容。
固定液：12％三氯乙酸(w/v)水溶液。
染色液：40％甲醇(v/v)+7％冰乙酸(v/v)+0.1％(w/v)R-250，蒸馏水定容。
上样缓冲液母液：6.25％1M Tris-HCl(pH 6.8)(v/v)+2％SDS(w/v)+22.5％甘油(v/v)+0.05％(w/v)溴酚蓝，蒸馏水定容。
实施例3：单粒种子的无胚端样品切取
选用23个生产推广品种或对照品种，如下表2。在每个单粒种子的无胚端切取种子体积的1/4～1/5，并依次放入96孔微孔板中，并在与96孔微孔板微孔位置一致的矩阵登记表内记录样品名，随后在每个孔中放入1粒2mm的钢珠。
表2 23份种子材料的HMW-GS鉴定结果
实施例4：高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)提取
1、使用Eppendorf 100uL八道移液器在已放置切取的种子和钢珠的96孔微孔板中加入40uL试剂A，盖上12孔联排塑料微孔盖，并静置过夜。
2、打开联排所料微孔盖，使用八道移液器在96孔微孔板中加入120uL试剂B，盖上12孔联排塑料微孔盖。
3、将微孔板放入高通量组织碾磨仪(Retsch TissueLyser)，碾磨频率为30次/s，碾磨时间为2min，随后将微孔板放入60℃的干热鼓风烘箱静置，期间每静置14min，漩涡震荡一次1min，两次共30min。
4、将经温育的微孔板放入Eppendorf5810R台式离心机离心，离心条件为4000rpm×15min。
5、使用八道移液器吸取上清20uL于另一干净的96孔微孔板中，获得HMW-GS检测样品。
实施例5：聚丙烯酰胺凝胶电泳参数及亚基检测
上样缓冲液准备：在上样缓冲液母液中加入β-巯基乙醇，使β-巯基乙醇终浓度达到5％。
电泳样品准备：在实施例4中所获得的HMW-GS检测样品中，使用八道移液器加入20uL上样缓冲液。盖紧12孔联排塑料微孔盖，放入90℃的干热鼓风烘箱中静置8分钟，冷却至室温后即为凝胶电泳所需样品。
凝胶制备：
13％分离胶按下表制备：
3％浓胶按下表制备：
电泳设备：北京六一DYY-6C电泳仪，伯乐PROTEAN II xi电泳槽。
电泳参数：加样量7uL，每板胶电流为15mA，室温电泳过夜(12-16hr)。
(四)染色和脱色：
室温下染色液连续摇染24h，蒸馏水连续摇脱24h。
实施例6：HMW-GS带型鉴定
结果如前表2，本发明及常规方法所提取样品的HMW-GS鉴定结果一致。
实施例7：本发明所述方法在小麦育种实践中的应用
为了快速鉴定江苏主要品种(系)的HMW-GS组成，为优质育种中的亲本选配提供资料。本实施例利用本发明所述方法，对江苏省96份(1个微孔板的样品容量)育成品种或高代品系进行了样品提取和HMW-GS鉴定。该实施例中96份样品从种子切割到提取完成，仅用时113min，其中切割种子和提取两个步骤分别用时60min和53min。
本实施例的样品中共检测到HMW-GS等位变异12个，其中Glu-A1位点有3个，分别为0、1和2*；Glu-B1位点有5个，分别为7+8、7+9、14+15、17+18和6+8；Glu-D1位点有4个，分别为2+12、3+12、4+12和5+10。主要亚基类型及分布频率分别为0(47.8％)、1(48.6％)、7+8(62.3％)、2+12(64.1％)和5+10(28.6％)。
Claims (1)
1.一种小麦种子高分子量谷蛋白亚基检测样品的制备方法，其特征在于：在96孔微孔板中一步提取，96孔微孔板为实验室通用的容积为200uL的PCR扩增用微孔板，该微孔板配有塑料联排孔盖和每孔1粒直径2mm的钢珠，其步骤包括：在小麦种子无胚端切取其体积的1/4～1/5，置于200uL的96孔PCR扩增用微孔板中，并在每个微孔中放入1粒直径2mm的钢珠；随后在微孔板中加入40uL浸泡缓冲液静置过夜，再加入120uL提取缓冲液，经高通量研磨器研磨后，在60℃的烘箱静置，期间每静置14min，漩涡震荡一次1min，两次共30min，微孔板经离心后所得上清液为小麦高分子量谷蛋白亚基检测所需样本；
其中
浸泡缓冲液：25％正丙醇+0.04M Tris-HCl PH8.0；
提取缓冲液：25％正丙醇+0.04M Tris-HCl PH8.0+3.0％SDS+1.3％DTT+2.0％4-VP；
碾磨使用高通量组织碾磨仪，碾磨频率为30次/s，碾磨时间为2min；微孔板离心条件为4000rpm×15min。
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