CN102732557A - 一种低筋小麦种质创制新方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种培育低筋小麦的方法。本发明所提供的培育低筋小麦品种的方法包括如下步骤：将Glu-1E^bx基因转入目的小麦中，获得与所述目的小麦相比面筋强度降低的转基因小麦；所述方法还包括将所述转基因小麦与面筋强度待降低小麦进行杂交，获得面筋强度低于所述面筋强度待降低小麦的杂交小麦的步骤；将所述杂交小麦与所述面筋强度待降低小麦进行回交，获得回交后代的步骤；以及将所述回交后代进行自交的步骤。实验证明，通过转Glu-1E^bx基因可以获得稳定遗传的共抑制HMW-GS表达的小麦材料，将其作为育种遗传材料对其他综合性状表现好的小麦材料进行回交，可获得面筋强度降低的小麦新种质。这将有利于创造适合饼干和糕点加工的优质低筋小麦。

Description

一种低筋小麦种质创制新方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种培育低筋小麦的方法，特别涉及一种通过转Glu-1E^bx基因获得稳定遗传的共抑制HMW-GS表达的低筋小麦品种的方法。

背景技术

小麦是世界上重要的三大粮食农作物（小麦、水稻和玉米）之一。小麦种子储藏蛋白占种子总蛋白的50%左右，它们的结构和特性对面粉加工品质起着重要的作用。小麦面筋蛋白主要由醇溶蛋白和麦谷蛋白组成，分别决定面团的延展性（extensibility）和弹性（elasticity）。麦谷蛋白为多聚体，是多个亚基通过二硫键相互交联而形成的，分子质量高达几百万道尔顿（Da）。经等电聚焦和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，麦谷蛋白明显地分成2种类型，即高分子量麦谷蛋白亚基(high-molecular-weight glutenin subunit，HMW-GS)和低分子量麦谷蛋白亚基(1ow-molecular-weight glutenin subunit，LMW-GS)，分子质量分别约为60～90kDa和34～54kDa。高分子量麦谷蛋白亚基平均占种子总蛋白的12％左右，相当于面粉干重的1.0%～1.7%，其数量和质量对小麦面筋特性及面粉烘烤品质起着重要作用。

优质弱筋小麦适合制作饼干、糕点等食品。随着我国经济高速发展，饼干、糕点的需求量快速增长，与此相适应，优质弱筋小麦的需求量也将持续增加。经过十几年的工作，我国已育成了一批优质弱筋小麦，但在育种、生产中仍存在一定的问题：优异亲本资源缺乏；品质稳定性差；加工品质仍需改良；综合性状有待进一步提高。目前，我国优质低筋小麦缺口很大，仍依靠从美国、澳大利亚、加拿大等国家进口以满足国内食品加工需求。我国低筋小麦主产区集中在淮河以南的长江沿线。我国培育低筋小麦的主要途径是常规杂交育种，利用南方小麦生态区品种的低筋和低蛋白特性开展育种。

发明内容

本发明的目的是提供一种培育低筋小麦的方法。

本发明所提供的培育低筋小麦的方法包括如下步骤：将Glu-1E^bx基因转入目的小麦中，获得与所述目的小麦相比，面筋强度降低的转基因小麦。

在实际应用中，所述培育低筋小麦的方法还包括如下步骤：将所述转基因小麦与面筋强度待降低小麦进行杂交，获得面筋强度低于所述面筋强度待降低小麦的杂交小麦（F1代小麦）。

在实际应用中，所述培育低筋小麦的方法还包括如下步骤：将所述杂交小麦（F1代小麦）与所述面筋强度待降低小麦（受体亲本）进行连续回交，获得回交后代。回交的目的是为了增大受体亲本优良农艺性状基因在回交后代中的比例，其理想状态为回交后代能够保留受体亲本自身的所有优良性状。

在实际应用中，所述方法还包括将所述回交后代进行自交的步骤。自交是为了在具备受体亲本优良性状的基础上，进一步得到低筋纯合小麦，从而保证低筋这一性状在自交后代中能够稳定遗传。

在本发明中，所述面筋强度具体体现在湿面筋含量、稳定时间和谷蛋白大聚合体（GMP）积累速率上。

本发明的另一个目的是提供一种培育谷蛋白大聚合体（GMP）积累速率降低的小麦的方法。

该方法包括如下步骤：将Glu-1E^bx基因转入目的小麦中，获得与所述目的小麦相比，谷蛋白大聚合体积累速率降低的转基因小麦。

在实际应用中，所述培育谷蛋白大聚合体（GMP）积累速率降低的小麦的方法，还包括如下步骤：将所述转基因小麦与谷蛋白聚合体积累速率待降低小麦杂交，获得谷蛋白聚合体积累速率低于所述谷蛋白聚合体积累速率待降低小麦的杂交小麦（F1代小麦）。在上述杂交的基础上，所述方法中还包括将所述杂交小麦（F1代小麦）与所述谷蛋白聚合体积累速率待降低小麦进行连续回交，获得回交后代的步骤。在上述回交的基础上，所述方法中还包括将所述回交后代进行自交的步骤。

在本发明中，所有所述的谷蛋白大聚合体（GMP）均指：小麦胚乳中的谷蛋白并不是以单个分子存在，而是高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）和低分子量谷蛋白亚基（LMW-GS）通过二硫键形成大小不同的聚合体。其中，不溶于SDS的谷蛋白聚合体分子量较大，称为谷蛋白大聚合体（glutenin macro-polymer，GMP）。

上述所有的Glu-1E^bx基因均可编码序列表中序列2所示的多肽。序列2由604个氨基酸组成。

所述Glu-1E^bx基因的编码序列是序列表中序列1（GenBank：AY525782的第955-2772位）或序列1的第1-1815位。序列1含有两个终止密码子，共由1818个核苷酸组成。

上述所有所述将Glu-1E^bx基因转入目的小麦，具体可为将所述Glu-1E^bx基因以重组表达载体的方式导入所述目的小麦。所述重组表达载体中启动所述Glu-1E^bx基因转录的启动子为CaMV35S启动子，更为具体的，所述重组表达载体为在pCAMBIA3301载体的多克隆位点出插入所述Glu-1E^bx基因，得到的重组质粒；所述多克隆位点具体为Xba I和Sac I酶切位点。

上述所有的目的小麦均具体为小麦品种藁城8901；所述面筋强度待降低小麦和所述谷蛋白聚合体积累速率待降低小麦均具体为小麦品种小偃54、金麦1号、丰优1号和藁城8901中的任一种。

实验证明，通过转Glu-1E^bx基因可以获得稳定遗传的共抑制HMW-GS表达的小麦材料，将其作为育种遗传材料对其他综合性状表现好的小麦材料进行杂交或回交，可获得面筋强度降低的小麦新种质。这将有利于创造适合饼干和糕点加工的优质低筋小麦。

附图说明

图1为T₀代Glu-1E^bx转基因小麦Lg-1的种子的SDS-PAGE分析结果。其中，泳道1和泳道10为野生型小麦品种藁城8901的种子；泳道2-9为T₀代Glu-1E^bx转基因小麦Lg-1的8粒种子。

图2为T₁代Glu-1E^bx转基因小麦Lg-1-1的种子的SDS-PAGE分析结果。其中，泳道B为野生型小麦品种藁城8901的种子；泳道1-5为随机选取的T₁代Glu-1E^bx转基因小麦Lg-1-1的5粒种子。

图3为T₃代转Glu-1E^bx基因小麦Lg-1-1-3种子的HMW-GS的RP-HPLC分析结果。其中，A为野生型小麦品种藁城8901的种子；B为T₃代Glu-1E^bx转基因小麦Lg-1-1-3的种子。

图4为T₁代Glu-1E^bx转基因小麦Lg-1-1的种子的Western杂交分析结果。其中，泳道1和泳道7为野生型小麦品种藁城8901的种子；泳道2-6为图2中随机选取的T₁代Glu-1E^bx转基因小麦Lg-1-1的5粒种子；泳道8为小麦品种中国春的种子。

图5为杂交F₁代小麦种子的SDS-PAGE分析结果。其中，泳道1为野生型小麦品种藁城8901；泳道2为Lg-1-1×野生型小麦品种藁城8901；泳道3为野生型小麦品种藁城8901×Lg-1-1；泳道4为小偃54×Lg-1-1；泳道5为金麦1号×Lg-1-1；泳道6为金麦1号；泳道7为小偃54。泳道2-5中，×表示杂交，×前的小麦品种作为母本；×后的小麦品种作为父本。

图6为杂交F₁代小麦种子的Western杂交分析结果。其中，泳道1为小麦品种中国春；泳道2为野生型小麦品种藁城8901；泳道3为Lg-1-1×野生型小麦品种藁城8901；泳道4为野生型小麦品种藁城8901×Lg-1-1；泳道5为小偃54×Lg-1-1；泳道6为金麦1号×Lg-1-1；泳道7为金麦1号；泳道8为小偃54。泳道3-6中，×表示杂交，×前的小麦品种作为母本；×后的小麦品种作为父本。

图7为回交一代小麦种子的SDS-PAGE分析结果。其中，A为金麦1号×（金麦1号×Lg-1-1）子代的检测结果；B为丰优1号×（丰优1号×Lg-1-1）子代的检测结果。A中，泳道1为作为对照的小麦品种藁城8901；泳道2-9为金麦1号×（金麦1号×Lg-1-1）子代的全部8粒种子；泳道10为小麦品种金麦1号。B中，泳道1为作为对照的小麦品种藁城8901；泳道2-9为丰优1号×（丰优1号×Lg-1-1）子代的全部8粒种子；泳道10为小麦品种丰优1号。

图8为HMW-GS全部缺失的T₃代转基因材料和T₄代转基因材料与未突变材料藁城8901的小麦花后GMP积累特性分析结果。其中，野生型对照指小麦品种藁城8901。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pAHC25载体：Rita Abranches,Ana P.Santos,Eva Wegel,Sarah Williams,AlexandraCastilho,Paul Christou,Peter Shaw,Eva Stoger.Widely separated multiple transgeneintegration sites in wheat chromosomes are brought together at interphase.The PlantJournal(2000)24(6),713-723.

pCAMBIA3301载体购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司（目录号：MCV039）。

小麦品种藁城8901：刘霞，王振林.藁城8901和山农1391淀粉合成酶活性和淀粉组分积累特征的比较.中国农业科学,2005,38(05):897-903.

小麦品种中国春：刘登才，郑有良，兰秀锦.小麦中国春遗传背景的育种改良.中国农业科学，2003，36（11）：1383-1389.

小麦品种小偃54：张晓霞,焦浈,董振营,李世明,王燃,凌宏清,秦广雍,王道文.普通小麦品种小偃54中α/β-醇溶蛋白编码基因的克隆与序列分析.作物学报，2011，37（8）：1497-1502.

小麦品种金麦1号：张国丛，班进福，刘彦军.河北省小麦面粉及加工制品色泽研究.麦类作物学报，2011，31（3）：462-468.

小麦品种丰优1号：石明，姜紫勤，李言益.丰产抗病小麦新品种“丰优1，2号”特征特性与产量表现.耕作与栽培，2003，4：21.

实施例1、转Glu-1E^bx基因小麦的获得及其HMW-GS的鉴定

一、重组表达载体pCAMBIA3301-Glu-1E^bx的构建

以来源于百萨偃麦草（Thinopyrum bessarabicum）的Glu-1E^bx基因（GenBank：AY525782，序列1）为模板，以上游引物和下游引物作为兼并性引物，扩增得到两端分别带有酶切位点Xba I和Sac I的Glu-1E^bx基因片段。

上游引物：5′-GACTCTAGAATGGCTAAGCGGC/TTA/GG-3′（下划线部分为XbaI的识别位点，其后的序列为序列1的第1-第25位）

下游引物：5′-CGGAGCTCGCTATCACTGGCTG/AGCC-3′（下划线部分为Sac I的识别位点，第10-27位为序列1的第1794-1818位的反向互补序列）

利用Xba I和Sac I双酶切PCR产物后，将其连接到经过同样酶切的pCAMBIA3301的骨架片段上，形成重组质粒。对重组质粒进行测序，将经过测序表明含有序列表中序列1所示Glu-1E^bx基因的重组质粒命名为pCAMBIA3301-Glu-1E^bx。pCAMBIA3301-Glu-1E^bx中，启动所述Glu-1E^bx基因转录的启动子为CaMV35S启动子。

二、转Glu-1E^bx基因小麦的获得

1、以重组表达载体pCAMBIA3301-Glu-1E^bx转化小麦

将步骤一1中构建的重组表达载体pCAMBIA3301-Glu-1E^bx和pAHC25载体用基因枪轰击的方法共转化小麦品种藁城8901的幼胚。同时设置转入pCAMBIA3301空载体为对照。由于pAHC25载体上含有bar基因，可以作为抗除草剂双丙氨磷（PPT）的筛选标记。

将转化后的小麦幼胚置于含有双丙氨磷（PPT）的筛选培养基（1/2MS培养基中加入PPT，使PPT终浓度为4mg/L）上进行筛选，获得T₀代抗PPT的转基因阳性植株。

对上述获得的抗双丙氨磷的转基因阳性植株进行PCR分子鉴定，以上述获得的抗除草剂的转基因植株的基因组DNA为模板，以上述步骤一所述上游引物和所述下游引物所组成的引物对进行PCR扩增。将其中一个经过PCR扩增得到大小为1800bp左右的目的条带的转Glu-1E^bx基因植株命名为Lg-1。

三、转基因小麦种子中HMW-GS表达情况的鉴定

1、SDS-PAGE检测T₀代Glu-1E^bx转基因小麦Lg-1的种子中HMW-GS表达情况

收获步骤二获得的T₀代转基因小麦Lg-1的所有种子，提取麦谷蛋白进行SDS-PAGE电泳分析Glu-1E^bx转基因小麦Lg-1的种子中高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）的表达情况。同时以野生型小麦品种藁城8901的种子作为内源HMW-GS正常表达的对照。实验重复三次。其中，麦谷蛋白的提取操作如下：（1）取单粒种子的胚乳端半粒，将其研磨成细粉末（大约20mg）。（2）用1ml溶液A（50%正丙醇V/V）在65℃提取醇溶蛋白30分钟，其间震荡2次以上，12000rpm离心1分钟，弃上清。（3）重复步骤（2）两次。（4）用0.5ml上述溶液A洗涤沉淀，12000rpm离心5分钟，弃上清。（5）用0.1ml含有新加入1%（W/V）二硫苏糖醇（DTT）的溶液B（50%V/V正丙醇，0.08M Tris-HCl，pH 8.0），65℃孵育1h，对蛋白进行还原。（6）12000rpm离心5分钟后，加入0.1ml混匀的含有新加入1.4%（V/V）4-乙烯吡啶（4-vinylpyridine）的上述溶液Ｂ，孵化15分钟进行蛋白质烷基化。（7）12000rpm离心2分钟，取上清液即为麦谷蛋白样品。

SDS-PAGE电泳结果如图1所示，T₀代Glu-1E_bx转基因小麦的种子中所有的高分子量麦谷蛋白亚基都不表达，这不仅包括受体野生型小麦品种藁城8901内源的1Ax2*、1Bx7、1By9、1Dx5和1Dy10五个亚基，而且转化的Glu-E^bx基因也未表达。

2、反向高效液相色谱检测转基因小麦中HMW-GS表达情况

将步骤二获得的T₀代转基因小麦Lg-1进行两次自交繁殖，获得T₃代转基因小麦Lg-1-1-3-5。对T₃代Glu-E^bx转基因小麦Lg-1-1-3-5的种子（HMW-GS缺失的种子）进行反向高效液相色谱（RP-HPLC）进一步检测T₃代转基因小麦的种子中HMW-GS的表达情况，同时以野生型小麦品种藁城8901的种子作为内源HMW-GS正常表达的对照。实验中对于每个样品采用从该种小麦多粒种子混合提取的HMW-GS样品进行实验。具体操作如下：

小麦HMW-GS的提取：称取全麦粉0.1g于2mL离心管中，加入1.0mL提取液A（NaCl的终浓度为0.4mol·L^-1，NaKHPO₄的终浓度为0.067mol·L^-1，pH=7.6），漩涡振荡2min后，在20℃下用恒温混合器（Eppendorf Thermomixer comfort）振荡10min后，7000r/min离心15min，连续提取2次，弃上清液。沉淀物中加入1mL提取液B（60%（v/v）乙醇溶液），漩涡振荡2min，在20℃下用恒温混合器振荡10min后，7000r/min离心20min，连续提取2次，弃去上清液。沉淀物中加入1.0mL提取液C（50%（v/v）正丙醇，尿素的终浓度为2mol·L^-1，Tris-HCl的终浓度为0.05mol·L-1，1%（w/v）DTT，pH7.5），漩涡振荡2min后，在60℃下用恒温混合器振荡20min，悬浮液在20℃恒温下7000r/min离心20min，连续提取2次，收集上清液。

样品测定前过0.45μm滤膜，在上样前后分别注入0.5mL 0.1%（v/v）三氟乙酸溶液，进样体积为100μL。

色谱系统为美国Waters公司生产1525Binary HPLC pump+996 photodiode arraydetector，样品环体积为2mL，工作站软件为Empower，色谱柱为Nucleosil 300-5 C8柱（250mm×4.6mm）。洗脱系统：A液（三氟乙酸+H₂O（0.1%，v/v）），B液（乙腈+三氟乙酸（99.9/0.1，v/v））。洗脱梯度：0min 24%B液，50min 56%B液，柱温为53℃，流速为1mL·min^-1，吸收波长为210nm。每个样品进行完毕，用90%B液洗脱5min，用初始B液平衡10min。实验重复三次。

结果如图3所示，与作为内源HMW-GS正常表达的野生型小麦品种藁城8901对照的种子相比，T₃代Glu-E^bx转基因小麦的种子没有明显的峰检出，HMW-GS含量接近于0。

四、转基因小麦后代遗传规律分析

将步骤二获得的T₀代Glu-1E^bx转基因小麦进行自交繁殖，获得T₁代转Glu-1E^bx基因小麦，将其中一个转基因株系命名为Lg-1-1。对T₁代转基因株系Lg-1-1所结种子的麦谷蛋白进行SDS-PAGE分析。同时以野生型小麦品种藁城8901的种子作为内源HMW-GS正常表达的对照。实验重复三次。其中麦谷蛋白的提取方法同步骤三1中所述。

结果显示，T₁代转基因株系Lg-1-1的全部种子，1Ax2*、1Bx7、1By9、1Dx5和1Dy10五个亚基的编码基因以及转化的Glu-E^bx基因均沉默（图2），SDS-PAGE电泳没有检测到编码蛋白。

进一步利用HMW-GS多克隆抗体（HMW-GS多克隆抗体由中科院遗传与发育生物学研究所王道文老师惠赠，其制备过程参见Wan Y，Liu K,Wang D,Shewry PR.High-molecular-weight glutenin subunits in the Cylindropyrum and Vertebrata section ofthe Aegilops genus and identification of subunits related to those encoded by the Dx allelesof common wheat.Theor Appl Genet,101:879-884.），对T₁代Lg-1-1的种子麦谷蛋白进行Western杂交，以小麦品种中国春和藁城8901的种子作为对照，实验重复三次。其中麦谷蛋白的提取方法同步骤三1中所述。

结果如图4所示，用HMW-GS多克隆抗体，对T₁代转基因株系Lg-1-1种子蛋白进行Western杂交，非转基因小麦种子麦谷蛋白与HMW-GS多克隆抗体表现出很强的杂交信号（1Dx2、1Bx7、1By8和1Dy12亚基），而转基因小麦种子麦谷蛋白与该多抗无反应信号，获得了与SDS-PAGE相同的结果。

以上SDS-PAGE和Western杂交的结果均表明对于通过转化Glu-E^bx基因来沉默高分子量麦谷蛋白不同亚基的编码基因的基因沉默可以稳定遗传。

实施例2、通过杂交获得低筋小麦品种

一、杂交小麦和回交后代的获得及其HMW-GS表达情况的鉴定

1、HMW-GS完全缺失小麦新种质的获得及其HMW-GS表达情况的鉴定

以实施例1获得的T₁代Lg-1-1为父本，分别用受体野生型小麦品种藁城8901、小麦品种小偃54和金麦1号为母本进行杂交；以及用T₁代Lg-1-1为母本，以野生型小麦品种藁城8901为父本进行反交。对上述四个组合杂交后代的种子一方面进行SDS-PAGE电泳，另一方面进行Western杂交，从而分析HMW-GS的表达情况。实验操作方法参见实施例1相关内容。实验重复三次。

SDS-PAGE结果如图5所示，四个杂交后代（F1代）种子的HMW-GS基因（1Ax2*、1Bx7、1By9、1Dx5和1Dy10五个亚基的编码基因以及转化的Glu-E^bx基因）全部沉默。Western杂交结果（图6）进一步证实了SDS-PAGE的结果。

再将上述四个杂交后代（F1）各自进行自交，获得F2代。采用同样的SDS-PAGE和Western杂交对F2代的种子进行HMW-GS表达情况的分析，结果显示，F2代种子呈3:1分离（沉默:不沉默）。这一结果表明该基因沉默呈现显性效应。

2、回交后代的获得及其HMW-GS表达情况的鉴定

以实施例1获得的T₁代Lg-1-1为供体亲本，分别用金麦1号和丰优1号为受体亲本进行杂交；再将杂交后代与各自的受体亲本进行回交，获得回交一代。对上述回交一代的种子进行SDS-PAGE电泳，从而分析HMW-GS的表达情况。同时设置内源HMW-GS正常表达的野生型小麦品种藁城8901作为对照。实验操作方法参见实施例1相关内容。实验重复三次。

SDS-PAGE结果如图7所示，回交一代的种子呈现1：1的分离比，即有一半种子HMW-GS基因（1Ax2*、1Bx7、1By9、1Dx5和1Dy10五个亚基的编码基因以及转化的Glu-E^bx基因）全部沉默，一半种子恢复正常表达HMW-GS。

二、杂交小麦和回交后代的面筋品质鉴定

1、对谷蛋白大聚合体GMP的积累随发育进程做发育动态分析

谷蛋白大聚合体（GMP）对面筋的弹性起着重要作用，其数量与面团强度成正相关。以实施例1获得的T₁代Lg-1-1进行连续自交后，获得的T₃代和T₄代HMW-GS完全缺失株系为实验材料，对谷蛋白大聚合体GMP的积累随发育进程做发育动态分析。同时以野生型小麦品种藁城8901作为对照。具体操作如下：

分别在开花后5、10、15、20、25、30和35天取同一穗位籽粒，烘干后磨粉，称0.1g的面粉，加入0.8ml 50%（v/v）正丙醇，在室温下提取30min，并间隔振荡；5000r/min离心3min，去上清，去除清蛋白、球蛋白，重复提取2次。将50PI（50%（v/v）正丙醇不溶性蛋白）沉淀用含1%（v/v）DTT的50%（v/v）正丙醇0.8ml于60℃水浴振荡提取1h，16000r/min离心10min，重复提取2次，合并上清液为50PDS（含1%（v/v）DTT的50%（v/v）正丙醇可溶性蛋白）。取0.1ml样品上清液（50PDS）加5ml考马斯亮蓝G-250试剂，在紫外分光光度计（美国Agilent，8453型）上于595nm波长进行考马斯亮蓝比色，测定吸收值。计算GMP的质量百分含量。实验重复三次，结果取平均值。

结果如图8所示，HMW-GS全部缺失的T₃代和T₄代转基因材料相比对照材料来说，GMP的含量大大降低。在开花后第5-10天内，HMW-GS全部缺失材料与对照材料的GMP含量基本一致，从开花10天后，对照材料GMP的积累速率明显高于HMW-GS全部缺失材料，对照材料从开花后10-25天和30-35天分别有两个快速积累的阶段，而HMW-GS全部缺失材料的GMP积累速率变化不明显。对照材料开花后35天，GMP含量达到9.2%，而HMW-GS全部缺失材料的GMP含量只有4.1%。这说明高分子量麦谷蛋白（HMW-GS）缺失极大的影响小麦籽粒中GMP的积累水平，从而对小麦的蛋白含量和加工特性产生较大的影响。

2、小麦加工品质特性的检测

将实施例1获得的T₁代Lg-1-1进行连续自交后，获得的T₃代的转基因材料。将其中一个转基因株系Lg-1-1-3-5，及其与藁城8901回交获得回交后代，通过SDS-PAGE和Western blot技术（实验方法同实施例1）检测发现所述Lg-1-1-3-5和所述回交后代为HMW-GS缺失材料。以所述T₃转基因后代Lg-1-1-3-5以及所述回交后代为实验材料，研究HMW-GS缺失对小麦加工品质特性的影响。同时以野生型小麦品种藁城8901作为对照。具体操作如下：

测定各品质指标，用Brabender senior实验磨制粉；按国标GB5511-85半微量凯氏定氮法测定籽粒粗蛋白含量；用瑞典Falling Number公司2100型洗面筋仪测定籽粒面粉湿面筋含量；沉降值测定采用3.2g面粉按照AA-CC标准56-61A机械震荡法；按AA-CC方法54-21，用德国Brabender公司粉质仪测定包括面团吸水率、形成时间、稳定时间、评价值等指标。实验重复三次，结果取平均值。

结果如表1所示，与对照材料相比，所述Lg-1-1-3-5的湿面筋含量、沉降值、形成时间、稳定时间等指标有大幅度的降低，湿面筋含量由31.0%下降到3%，沉降值由28.8%下降到7%左右，形成时间由6分钟下降到0.3分钟，稳定时间由7分钟下降到0.6分钟。所述回交后代（藁城8901×Lg-1-1-3-5）的情况基本相同，其面筋含量、稳定时间急剧下降，有利于创造适合饼干和糕点加工的优质低筋小麦。

表1  HMW-GS缺失材料面团流变学特性

以上结果表明通过转Glu-1E^bx基因可以获得稳定遗传的共抑制HMW-GS表达的小麦材料，将其作为育种遗传材料对其他综合性状表现好的小麦材料进行回交，可获得不同面筋品质改良（低筋）的小麦新种质。

Claims (10)

1.一种培育低筋小麦的方法，包括如下步骤：将Glu-1E^bx基因转入目的小麦中，获得与所述目的小麦相比，面筋强度降低的转基因小麦。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：将所述转基因小麦与面筋强度待降低小麦进行杂交，获得面筋强度低于所述面筋强度待降低小麦的杂交小麦。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：将所述杂交小麦与所述面筋强度待降低小麦进行回交，获得回交后代。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将所述回交后代进行自交的步骤。

5.一种培育谷蛋白大聚合体积累速率降低的小麦的方法，包括如下步骤：将Glu-1E^bx基因转入目的小麦中，获得与所述目的小麦相比，谷蛋白大聚合体积累速率降低的转基因小麦。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：将所述转基因小麦与谷蛋白聚合体积累速率待降低小麦杂交，获得谷蛋白聚合体积累速率低于所述谷蛋白聚合体积累速率待降低小麦的杂交小麦。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：将所述杂交小麦与所述谷蛋白聚合体积累速率待降低小麦进行回交，获得回交后代。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括将所述回交后代进行自交的步骤。

9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：所述Glu-1E^bx基因的编码序列为序列表中序列1，或序列1的第1-1815位。

10.根据权利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于：将所述Glu-1E^bx基因转入目的小麦中为通过重组表达载体将所述Glu-1E^bx基因导入所述目的小麦中，所述重组表达载体中启动所述Glu-1E^bx基因转录的启动子为CaMV35S启动子。 

Images