CN107920488A - 谷蛋白减少的谷粒及其组合物 - Google Patents

Abstract

本文公开了具有谷蛋白减少的谷粒的植物及其组合物。

Description

谷蛋白减少的谷粒及其组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求享有于2016年4月26日提交的美国临时专利申请第62/327,822号，以及于2015年12月7日提交的美国临时专利申请第62/263,912号，以及于2015年5月29日提交的美国临时专利申请第62/168,536号的优先权；上面引用的申请各以其整体通过引用并入。

关于联邦资助的研究或开发的声明

本发明是在美国国立卫生研究院授予的基金号为1R42DK097976-01和4R42DK097976-02的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。

技术领域

在一个实施方式中，本公开涉及谷蛋白减少的谷粒。

背景技术

小麦是世界上大多数人口的第一重要及战略谷类作物，也是约20亿人口(占世界人口的36％)的最重要的主食。在世界范围内，小麦提供接近55％的碳水化合物和20％的全球消耗的食物卡路里(Breiman和Graur，1995)。小麦种植面积和产量均超过每一种其他谷类作物(包括水稻、玉米等)，并在广泛的气候条件下种植。利用分子标记了解小麦遗传学和基因组组织对于遗传和植物育种目的具有重要意义。

蛋白质是决定小麦谷粒最终使用价值的小麦谷粒中最重要的组成部分。已知谷粒贮藏蛋白(GSP)组成决定面团粘结性和粘弹性。小麦中最丰富的GSP是形成谷蛋白的麦醇溶蛋白和麦谷蛋白，它们占谷粒蛋白总量的60％-80％。

乳糜泻是谷蛋白(一种由在小麦、黑麦和大麦谷物以及密切相关的物种的淀粉质胚乳中发现的不同贮藏蛋白质的混合物)破坏小肠衬里的病症。谷蛋白基质由麦醇溶蛋白和麦谷蛋白蛋白质大致相等的混合物组成。乳糜泻主要由麦醇溶蛋白引起。具体而言，在这种疾病中，小肠的绒毛被破坏，衬里变平，严重损害营养吸收。典型症状是体重减轻、恶臭腹泻、呕吐、腹痛和腿部肿胀。目前唯一可行的治疗方法是终生无谷蛋白饮食，严格避免所有含有小麦、黑麦和大麦的食物和药物组合物。除了乳糜泻之外，许多人患有对谷蛋白的一般不耐受。虽然没有如乳糜泻的明确的临床症状，但这种不耐受的范围差别很大。

因此，临床上需要减少谷蛋白的消耗及开发谷蛋白减少的小麦和其他谷物的相应的需要。尽管该需求长期存在，除了其他可能的原因，由于目前商品化的小麦栽培变种的遗传多样性有限，而且小麦基因组复杂，所以对于减少谷蛋白的小麦基因突变的识别进展缓慢。面包小麦是一种六倍体，在每个细胞的核中有三个完整的基因组，称为A、B和D。这些基因组中的每一个几乎是人类基因组大小的两倍，并且由大约55亿个核苷酸组成。另一方面，硬粒小麦，也被称为通心粉小麦或面食小麦(pasta wheat)(硬粒小麦(Triticum durum)或圆锥小麦硬粒亚种(Triticum turgidum subsp.durum))，是目前广泛栽培的具有商业重要性的小麦的主要四倍体品种。硬粒小麦有两个完整的基因组，A和B，广泛用于制作意大利面。

本发明人已经识别了一种基因，其中该基因的突变和修饰产生谷蛋白减少的谷粒。

发明内容

在一个实施方式中，本公开涉及具有导致谷蛋白减少的谷粒的在基因中的一个或多个非转基因突变的植物，包括但不限于来自大麦和小麦植株的谷粒。在又一个实施方式中，本公开涉及具有一个或多个转基因的植物，所述一个或多个转基因改变基因的表达和/或蛋白质的活性，这导致谷蛋白减少的谷粒。在另一个实施方式中，本公开涉及具有谷蛋白减少的谷粒的转基因植物。在又一个实施方式中，本公开涉及具有修饰的基因的植物，其中所述基因通过基因组编辑而被修饰，并且与来自野生型植株的谷粒相比，使谷粒具有减少的谷蛋白。

在一个实施方式中，本文讨论的谷粒包括小麦、大麦和黑麦。

在一个实施方式中，本公开涉及在一种或多种小麦醇溶谷蛋白盒结合因子(WPBF)基因或同源基因中具有非转基因突变的植物，所述非转基因突变导致谷蛋白减少的谷粒。在一个实施方式中，本公开涉及WPBF基因中的非转基因突变，其中所述突变导致谷蛋白减少的谷粒。

在一个实施方式中，一个或多个突变在A基因组的WPBF基因中。在另一个实施方式中，一个或多个突变在B基因组的WPBF基因中。在另一个实施方式中，一个或多个突变在D基因组的WPBF基因中。

在一个实施方式中，本发明涉及WPBF基因中的多个非转基因突变，包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和大于10个突变。

在另一个实施方式中，本发明涉及A基因组的WPBF基因中的多个非转基因突变(包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和大于10个突变)，以及B基因组的WPBF基因中的多个突变(包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和大于10个突变)。

在另一个实施方式中，本发明涉及A基因组的WPBF基因中的多个非转基因突变(包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和大于10个突变)，以及D基因组的WPBF基因中的多个突变(包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和大于10个突变)。

在另一个实施方式中，本发明涉及B基因组的WPBF基因中的多个非转基因突变(包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和大于10个突变)，以及D基因组的WPBF基因中的多个突变(包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和大于10个突变)。

在另一个实施方式中，本发明涉及A基因组的WPBF基因中的多个非转基因突变(包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和大于10个突变)，以及B基因组的WPBF基因中的多个突变(包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和大于10个突变)，以及D基因组的WPBF基因中的多个突变(包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和大于10个突变)。

在另一个实施方式中，本公开涉及与野生型小麦植株、小麦种子、小麦植物部分及其后代相比具有谷蛋白减少的谷粒的小麦植株、小麦种子、小麦植物部分及其后代。

在另一个实施方式中，本公开涉及与野生型小麦植株、小麦种子、小麦植物部分及其后代相比具有增加的高分子量麦谷蛋白的小麦植株、小麦种子、小麦植物部分及其后代。

在另一个实施方式中，本公开涉及与野生型小麦植株、小麦种子、小麦植物部分及其后代相比具有降低的低分子量麦谷蛋白的小麦植株、小麦种子、小麦植物部分及其后代。

在另一个实施方式中，本公开涉及与野生型小麦植株、小麦种子、小麦植物部分及其后代相比具有降低的麦醇溶蛋白的小麦植株、小麦种子、小麦植物部分及其后代。

在另一个实施方式中，本发明涉及与野生型小麦植株相比具有谷蛋白减少的谷粒的小麦植株、小麦种子、小麦植物部分及其后代，其中所述谷蛋白的减少是由人类诱导的在一种或多种小麦植株的WPBF基因中的非转基因突变引起。在另一个实施方式中，所述WPBF蛋白具有降低的活性。

在另一个实施方式中，本公开涉及含有一个或多个突变的WPBF基因的小麦植株，以及该植株的种子、花粉、植物部分和后代。

在另一个实施方式中，本公开涉及掺入小麦种子和小麦粉的食物和食品，所述小麦种子和小麦粉具有由人类诱导的一种或多种WPBF基因中的非转基因突变引起的降低的WPBF蛋白活性。

在另一个实施方式中，本公开涉及与野生型小麦植株相比具有活性降低的一种或多种WPBF蛋白的小麦植株，其通过以下步骤产生：从亲本小麦植株获得植物材料，通过用诱变剂处理该植物材料以在该植物材料的WPBF基因的至少一个拷贝中诱导至少一种突变而产生诱变的植物材料(例如种子或花粉)，分析后代小麦植株以检测WPBF基因的至少一个拷贝中的至少一种突变，选择在WPBF基因的至少一个拷贝中具有至少一种突变的后代小麦植株，将在WPBF基因的至少一个拷贝中具有至少一种突变的后代小麦植株与在WPBF基因的不同拷贝中具有至少一种突变的其他后代小麦植株杂交，并且重复进行识别具有突变的后代小麦植株并将该具有突变的后代小麦植株与具有突变的其他后代小麦植株杂交的循环以产生具有降低的WPBF活性的后代小麦植株。在另一个实施方式中，所述方法包括培育或使用该诱变的植物材料来产生后代小麦植株。

在一个实施方式中，本公开涉及具有改变的蛋白质储存图谱的小麦植株的种子。

在一个实施方式中，本公开涉及包含小麦种子和谷蛋白酶的组合物，该小麦种子具有由一种或多种WPBF基因中的突变引起的降低的WPBF蛋白活性。

在又一个实施方式中，本公开涉及包含小麦粉和谷蛋白酶的组合物，该小麦粉具有由一种或多种WPBF基因中的突变引起的降低的WPBF蛋白活性。

在一个实施方式中，本公开涉及包含掺入小麦种子和小麦粉的食物和/或食品和谷蛋白酶的组合物，所述小麦种子和小麦粉具有由人类诱导的一种或多种WPBF基因中的非转基因突变引起的降低的WPBF蛋白活性。

在一个实施方式中，本公开涉及包含掺入大麦种子和/或大麦粉的食物和/或食品和谷蛋白酶的组合物，所述大麦种子和/或大麦粉具有降低的大麦Dof转录因子活性。

在又一个实施方式中，本公开涉及包含掺入超低谷蛋白大麦的食物和/或食品和谷蛋白酶的组合物。

在一个实施方式中，所述谷蛋白酶选自Glutenase ALV003、GlutenEase、Glutenase Plus、Digest Gluten Plus、Gluten Cutter。

在另一个实施方式中，所述谷蛋白酶可以与一种或多种另外的酶(包括但不限于淀粉酶、葡糖淀粉酶和DPP4(二肽基肽酶-4))一起使用。

序列表简要说明

SEQ ID NO.1示出A基因组的小麦醇溶谷蛋白盒结合因子(WPBF)的基因序列(2,024个碱基对)。

SEQ ID NO.2示出SEQ ID NO.1的WPBF-A编码序列(990个碱基对)。

SEQ ID NO.3示出SEQ ID NO.2的WPBF-A蛋白序列(330个氨基酸)。

SEQ ID NO.4示出B基因组的小麦醇溶谷蛋白盒结合因子(WPBF)基因的基因(2,027个碱基对)。

SEQ ID NO.5示出SEQ ID NO.4的WPBF-B编码序列(984个碱基对)。

SEQ ID NO.6示出SEQ ID NO.5的WPBF-B蛋白序列(328个氨基酸)。

SEQ ID NO.7示出D基因组的小麦醇溶谷蛋白盒结合因子(WPBF)基因的基因序列(2,081个碱基对)。

SEQ ID NO.8示出SEQ ID NO.7的WPBF-D编码序列(990个碱基对)。

SEQ ID NO.9示出SEQ ID NO.8的WPBF-D蛋白序列(330个氨基酸)。

SEQ ID NO.10示出WPBF基因的Dof区的核酸序列。

SEQ ID NO.11示出WPBF蛋白的Dof区的氨基酸序列。

SEQ ID NO.12示出大麦(Hordeum vulgare；Hv)DOF编码序列(1,011个碱基对)。

SEQ ID NO.13示出SEQ ID NO.12的蛋白序列(337个氨基酸)。

附图说明

图1A和1B是显示存在于野生型大麦和突变体低谷蛋白大麦中的B、C和D大麦醇溶蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶照片。与图1A中相同的泳道相比，图1B中对于突变体低谷蛋白大麦泳道的蛋白上样量增加5倍。

图2是野生型大麦和突变体低谷蛋白大麦种子的照片。

图3A、3B、3C和3D描绘考马斯亮蓝染色的SDS聚丙烯酰胺凝胶的数字扫描。每个孔表示来自单个小麦种子切下的胚乳的醇溶性谷粒贮藏蛋白。用箭头指示含有改变的种子贮藏蛋白图谱的胚乳半种子，其中几个蛋白质条带消失，其它蛋白量减少。

具体实施方式

定义

本公开中的数字范围为约数，并且因此除非另外指明，可以包括除了该范围之外的值。数值范围以一个单位为增量包括上限值和下限值之间的所有值并包括下限值和上限值，条件是在任何较低值和较高值之间存在至少两个单位的分隔。作为一个例子，如果组成、物理或其他性质，例如，如分子量、粘度等，是从100到1,000，则意图清楚地列举所有个别值，如100、101、102等，以及子范围，如100至144，155至170，197至200等。对于包含小于1的值或包含大于1的分数(例如，1.1、1.5等)的范围，视情况而定，一个单位被认为是0.0001、0.001、0.01或0.1。对于包含小于10的单个数字的范围(例如，1至5)，一个单位通常被认为是0.1。这些只是具体意图的例子，并且在所列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能的组合被认为是在本公开中明确表述。除了其他方面以外，在本公开中提供数值范围用于混合物中组分的相对量，以及方法中提到的各种温度和其他参数范围。

如本文所用，术语“等位基因”是基因的一种或多种替代形式中的任一种，所有这些形式涉及一种性状或特征。在二倍体细胞或生物体中，给定基因的两个等位基因在一对同源染色体上占据相应的位点。在四倍体或六倍体细胞或生物体(如小麦)中，一个基因组上的给定基因的两个等位基因在一对同源染色体上占据相应的位点，并且在另一基因组(如四倍体的A或B基因组，或六倍体小麦的A、B或D基因组)上占了相同位点的同一基因的两个等位基因被称为与第一基因组的基因同源，并存在于同源染色体上。

如本文所用，术语“改变”、“增加”、“增加的”、“减少”、“减少的”、“抑制的”等被认为是相对术语，即，与野生型或未改变状态相比。“蛋白水平”是指特定蛋白质(例如WPBF)的量，其可以通过本领域已知的任何方法测量，例如，譬如，蛋白质印迹分析或其他免疫学方法。如本文所用，“转录因子(“TF”)活性”是指TF激活其靶基因转录的程度。

如本文所用，“WPBF活性”可以通过以下特征中的一种或多种来测量：(1)WPBF激活转录的程度；(2)WPBF结合DNA的程度；(3)WPBF与共激活剂和/或其他转录调节复合物结合的程度；以及(4)WPBF与DNA结合的稳定性。可以理解的是，在突变体中，WPBF活性水平或转录因子活性水平可能发生改变，但蛋白本身的表达水平(量)不变。相反，如果产生更多或更少的活性蛋白质，蛋白质的量可能会改变，但是活性保持不变。也可能数量和活性均降低，例如，譬如，当编码酶的基因失活时。在某些实施方式中，与未修饰的小麦胚乳中的蛋白质水平或活性相比，蛋白质水平或活性降低至少10％，或至少20％，或至少30％，或至少40％，或至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％，或至少85％，或至少90％或至少95％。蛋白质或基因表达水平或WPBF活性水平或转录因子活性水平的降低可能发生在谷物发育的任何阶段，特别是在谷物灌浆期，或谷物发育到成熟的所有阶段。

如本文所用，氨基酸或核苷酸序列“同一性”和“相似性”由被比较的两个序列之间的最佳全局比对确定。例如，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443-453)实现最佳全局比对。还可以使用本领域已知的算法比对序列，包括但不限于CLUSTAL V算法或Blastn或BLAST 2序列程序。

如本文所用，术语“大麦”是指大麦属(Genus Hordeum)的任何物种，包括其祖先，以及通过与其他物种杂交产生的它的后代。大麦的优选形式是Hordeum vulgare物种。

如本文所用，大麦Dof转录因子是指大麦转录物MLOC_12852.2，Dof转录因子。

如本文所用，“修饰的大麦Dof转录因子基因”包括通过非转基因突变或转基因或基因组编辑或其组合对大麦Dof转录因子基因进行修饰。

“同一性”意指第一多肽或多核苷酸中特定位置处的氨基酸或核苷酸和处于与所述第一多肽或多核苷酸最佳全局比对的第二多肽或多核苷酸中相应的氨基酸或核苷酸相同。与同一性相反，“相似性”包含保守替换的氨基酸。“保守”替换是在Blosum62替换矩阵中具有正分数的任何替换(Hentikoff和Hentikoff，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919)。

“序列A与序列B具有n％的相似性”的说法，是指序列A和B之间的最佳全局比对中n％的位置由相同的残基或核苷酸和保守替换组成。“序列A与序列B具有n％的同一性”的说法，是指序列A和B之间的最佳全局比对中n％的位置由相同的残基或核苷酸组成。

如本文所用，术语“基因”或“基因序列”是指基因、其互补序列及其5'或3'非翻译区的部分或完整编码序列。基因也是遗传的功能单位，并且在物理术语上是沿着参与产生多肽链的DNA(或RNA，在RNA病毒的情况下)分子的特定片段或核苷酸序列。后者可以进行后续处理，如化学修饰或折叠以获得功能蛋白或多肽。基因可以在生物体基因组内分离、部分分离、或发现。举例来说，转录因子基因编码转录因子多肽，其可以是功能性的或需要加工以作为转录的引发剂。

操作上，可以通过顺式-反式测试(一种确定两个突变是否发生在相同的基因中并且可以用于确定基因活性单元的限制的基因测试)来定义基因。基因通常包括编码区之前(“前导序列”；上游)和之后(“非转录尾区”；下游)的区域。基因还可以包括位于各个编码段(称为“外显子”)之间插入的非编码序列(称为“内含子”)。大多数基因具有相关的启动子区域，转录起始密码子的5'调控序列(有一些基因没有可识别的启动子)。也可以由增强子、操纵基因和其他调控元件来调节基因的功能。

如本文所用，术语“修饰的植物”包括具有非转基因突变的植物，或含有转基因的植物，或已经经历基因组编辑的植物，或其组合。

如本文所用，术语“植株”包括未成熟或成熟的完整植株的含义，包括已经除去了种子或谷粒或花药的植物。将产生所述植株的种子或胚也被认为是所述植株。

如本文所用，术语“植物部分”包括植物原生质体、可以再生小麦植株的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和在植株或植物部分(如胚、花粉、胚珠、果皮、种子、花、小花、头、穗、叶、根、根尖、花药等)中完整的植物细胞。

如本文所用，术语“多肽”是指包含通过肽键或修饰的肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。“多肽”是指短链(通常称为肽、寡肽和寡聚物)和较长链(通常称为蛋白质)。多肽可以含有20种基因编码的氨基酸以外的氨基酸。“多肽”包括通过自然过程(例如加工)和其他翻译后修饰修饰的那些，也包括通过化学修饰技术修饰的那些多肽。这些修饰在教材和更详细的专著以及大量的研究文献中已被很好地描述，并且为本领域技术人员所熟知。应该理解的是，相同类型的修饰可以以相同或不同的程度存在于给定多肽的几个位点。

如本文所用，术语“多核苷酸”通常是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。该定义包括但不限于单链和双链DNA，为单链和双链区或单链、双链和三链区的混合物的DNA，cDNA，单链和双链RNA，和为单链和双链区的混合物的RNA，包含可以是单链、或更典型地双链、或三链区、或者单链和双链区的混合物的DNA和RNA的杂合分子。术语“多核苷酸”还包括通常被称为“寡核苷酸”的短核苷酸或片段，其由于诱变并不是100％相同，但仍然编码相同的氨基酸序列。

如本文所用，“降低的或无功能片段”是指与全核酸序列的蛋白编码序列相比，编码具有降低的生物活性的WPBF蛋白的核酸序列。换句话说，它是指基本上保留了编码本发明的WPBF多肽能力但所编码的WPBF多肽具有降低的活性的核酸或其片段。

如本文所用，术语“片段”是指多核苷酸序列(例如，PCR片段)，其是人工构建(例如通过化学合成)或通过使用限制性核酸内切酶或机械剪切将天然产物裂解成多个片段的目标核酸的分离部分，或通过PCR、DNA聚合酶或本领域公知的任何其他聚合技术合成的，或通过本领域的技术人员所熟知的重组核酸技术在宿主细胞中表达的核酸的部分。

关于本公开的多核苷酸，有时使用术语“分离的多核苷酸”。当应用于DNA时，这个术语是指在衍生该多核苷酸的生物体的天然存在的基因组中从与它紧邻(在5'和3'方向上)的序列分离的DNA分子。例如，所述“分离的多核苷酸”可以包括PCR片段。在另一个实施方式中，所述“分离的多核苷酸”可以包括插入载体(例如质粒或病毒载体)或整合到原核生物或真核生物的基因组DNA中的DNA分子。“分离的多核苷酸分子”也可以包括cDNA分子。

如本文所使用，单核苷酸多态性(SNP)是根据核苷酸替换(或转换(C/T或G/A)或颠换(C/G、A/T、C/A或T/G))两个DNA之间单个核苷酸碱基的差异。单碱基变异被认为是基因组中单碱基插入和缺失(in/dels)的SNP。

如本文所用，是一种脯氨酸特异性消化酶，表现出有效地帮助消化谷蛋白。适用于低卡路里和高卡路里的食物。

如本文所用，“转录因子(“TF”)活性”是指TF激活其靶基因转录的程度。

如本文所用，“转基因植物”是指含有在同一物种、品种或栽培变种的野生型植株中未发现的基因构建体(“转基因”)的植物。本文提及的“转基因”具有生物技术领域中通常的含义并且包括已经通过DNA或RNA重组技术产生或改变并且已经被引入到植物细胞中的基因序列。所述转基因可以包括来源于植物细胞的基因序列。通常，通过人类操作，例如，如，通过转化(但可以使用本领域技术人员所了解的任何方法)将所述转基因引入植物中。

如本文所用，“修饰的WPBF基因”包括通过非转基因突变或转基因或基因组编辑或其组合来修饰WPBF基因。

如本文所用，“WPBF衍生物”是指与全WPBF蛋白/肽/多肽序列的生物活性相比具有显著降低的生物活性的WPBF蛋白/肽/多肽序列。换句话说，其是指具有降低的WPBF活性的修饰的WPBF蛋白的多肽。术语“WPBF衍生物”包含修饰的WPBF蛋白/肽的“片段”或“化学衍生物”。

本文中将小麦植株定义为小麦属(Triticum)物种的任何植物，该物种被商业栽培，包括例如普通小麦(Triticum aestivum L.ssp.aestivum)(普通小麦或面包小麦)、普通小麦(Triticum aestivum)的其他亚种、硬粒小麦(Triticumturgidum L.ssp.durum)(硬粒小麦，也称为通心粉或面食小麦)、一粒小麦(Triticum monococcum L.ssp.monococcum)(栽培的单粒小麦或小斯卑尔脱(small spelt))、提莫菲拉维小麦(Triticum timopheevissp.timopheevi)、二粒小麦(Triticum turgidum L.ssp.dicoccon)(栽培的二粒小麦)，及圆锥小麦(Triticum turgidum)的其他亚种(Feldman)。小麦可以是具有AABBDD型基因组的六倍体小麦或具有AABB型基因组的四倍体小麦。由于小麦的遗传变异通过杂交转移到某些相关物种(包括黑麦和大麦)，因此本公开还包括由此形成的杂交物种，包括为面包小麦和黑麦的杂种的小黑麦。在一个实施方式中，所述小麦植株属于普通小麦(Triticumaestivum)种，优选属于小麦亚种。或者，由于突变或转基因可容易地从普通小麦(Triticumaestivum)转移到硬粒小麦，所以所述小麦优选为硬粒小麦(Triticum turgidumL.ssp.durum)。

在另一个实施方式中，本公开描述了与野生型小麦植株相比呈现出谷蛋白减少的谷粒的小麦植株，而所述小麦植株基因组中不包含外源核酸。在一个实施方式中，本公开涉及一种或多种WPBF基因中的非转基因突变。

在又一个实施方式中，本公开涉及在一种或多种WPBF基因中的一系列独立的人类诱导的非转基因突变；在其至少一种WPBF基因中具有一个或多个这些突变的小麦植株；以及在小麦的至少一种WPBF基因中创建和识别相似和/或另外的突变的方法。

在又一个实施方式中，本公开涉及具有降低WPBF基因表达和/或WPBF蛋白活性的转基因的转基因小麦植株，其中与来自野生型植株的谷粒相比，所述转基因使谷粒具有减少的谷蛋白。

在另一个实施方式中，本公开涉及具有修饰的WPBF基因的小麦植株，其中所述WPBF基因通过基因组编辑修饰，并且进一步，其中所述修饰使谷粒与野生型植株的谷粒相比具有减少的谷蛋白。

I.小麦醇溶谷蛋白盒结合因子

小麦醇溶谷蛋白盒结合因子(WPBF)，即DoF(DNA binding with one finger)转录因子，在种子发育过程中起着醇溶谷蛋白基因表达激活剂的作用；WPBF是存储蛋白基因的激活剂。在中胚乳发育期间，通过需要与特定DNA基序(包括胚乳盒(EB)和ACAA基序)结合的转录因子的通路而时间上和空间上调控编码贮藏蛋白基因的转录。EB由两个不同的蛋白结合位点组成：GCN4样基序和醇溶谷蛋白盒。

Dof蛋白是具有高度保守的DNA结合域的植物转录因子。由大约50-60个氨基酸残基组成的Dof结构域与GATA1和类固醇激素受体的Cys2/Cys2锌指DNA结合域相似，但与锌指结构域相比具有更长的推定环(putative loop)。

在一个实施方式中，本公开涉及降低WPBF基因的表达和/或降低WPBF蛋白的活性。在一个实施方式中，本公开涉及WPBF基因的表达降低和/或WPBF蛋白的活性降低的植物。在一个实施方式中，降低WPBF基因的表达或降低WPBF蛋白的活性可以通过非转基因突变、转基因或基因组编辑来完成。

在一个实施方式中，本公开涉及通过非转基因突变、或转基因或基因组编辑来修饰WPBF基因。

A.麦谷蛋白

小麦谷蛋白是麦醇溶蛋白和麦谷蛋白的二元混合物。包括高分子量(HMW)麦谷蛋白亚基和低分子量(LMW)麦谷蛋白亚基的麦谷蛋白包括经济上重要的一类小麦种子贮藏蛋白。单个HMW麦谷蛋白多肽或亚基的表观分子量范围为90kDa至200kDa。这些亚基通过它们之间的二硫键交联并与LMW麦谷蛋白多肽交联形成分子量超过1,000,000Da的聚合物。HMW麦谷蛋白占总胚乳蛋白的8-10％，而LMW麦谷蛋白占总胚乳蛋白的15-20％。HMW和LMW麦谷蛋白蛋白质在决定小麦粉的最终用途中均起着重要的功能性作用。

在小麦中，HMW麦谷蛋白在第1组染色体的长臂上的Glu-1基因座上编码。每个基因座由两个独立的基因组成，分别编码x型和y型亚基。特定HMW麦谷蛋白等位基因的数量和特性都会造成不同栽培变种面包制作质量的差异。例如，麦谷蛋白基因的缺失导致HMW麦谷蛋白总体水平降低，这导致了面包制作质量下降。

一方面，本公开涉及与野生型植株相比具有增加量的高分子量麦谷蛋白的修饰的植物。在一个实施方式中，本公开涉及用于增加谷粒中高分子量麦谷蛋白的量的组合物和方法。在另一个实施方式中，本公开涉及修饰小麦醇溶谷蛋白盒结合因子基因以增加谷粒中高分子量麦谷蛋白的量。在又一个实施方式中，本公开涉及WPBF基因中的一个或多个突变或WPBF基因的修饰以增加谷粒中高分子量麦谷蛋白的量。

在一个实施方式中，本公开涉及在WPBF基因中具有一个或多个突变或WPBF基因经修饰的植物，包括大麦、黑麦和小麦，其与野生型植株中的谷粒相比，具有高约5％，或10％，或15％，或20％，或25％，或30％，或40％，或50％，或60％，或70％，或80％，或85％，或90％，或95％或更多的高分子量麦谷蛋白。

在一个实施方式中，本公开涉及在WPBF基因中具有一个或多个突变或WPBF基因经修饰的植物，包括大麦、黑麦和小麦，其与野生型植株中的谷粒相比，具有高约5％至约20％，或约20％至约40％，或约40％至约60％，或约60％至约80％，或80％至约95％的高分子量麦谷蛋白。

一方面，本公开涉及与野生型植株相比具有降低量的低分子量麦谷蛋白的修饰的植物。在一个实施方式中，本公开涉及用于减少谷粒中低分子量麦谷蛋白的量的组合物和方法。在另一个实施方式中，本公开涉及修饰小麦醇溶谷蛋白盒结合因子基因以与野生型谷粒相比降低谷粒中低分子量麦谷蛋白的量。在又一个实施方式中，本公开涉及WPBF基因中的一个或多个突变或WPBF基因的修饰以与野生型谷粒相比降低谷粒中低分子量麦谷蛋白的量。

在一个实施方式中，本公开涉及在WPBF基因中具有一个或多个突变或WPBF基因经修饰的植物，包括大麦、黑麦和小麦，其具有在野生型谷粒中发现的低分子量麦谷蛋白的量的约少于5％，或少于10％，或少于15％，或少于20％，或少于25％，或少于30％，或少于40％，或少于50％，或少于60％，或少于70％，或少于80％，或少于85％，或少于90％，或少于95％的量的低分子量麦谷蛋白。

在一个实施方式中，本公开涉及在WPBF基因中具有一个或多个突变或WPBF基因经修饰的植物，包括大麦、黑麦和小麦，其与野生型植株中的谷粒相比，具有少约5％至约20％，或约20％至约40％，或约40％至约60％，或约60％至约80％，或者80％至约95％的低分子量麦谷蛋白。

B.麦醇溶蛋白

麦醇溶蛋白是小麦谷蛋白的醇溶性蛋白部分。麦醇溶蛋白通常富含谷氨酰胺和脯氨酸，特别是在N-末端部分。例如，α-麦醇溶蛋白和γ-麦醇溶蛋白的前100个氨基酸分别含有约35％和约20％的谷氨酰胺和脯氨酸残基。

本公开的一方面，提供了一种修饰的植物，其由于与野生型植株相比具有减少量的麦醇溶蛋白而不同于其天然存在的对应物。在一个实施方式中，本公开涉及用于减少谷粒中麦醇溶蛋白的量的组合物和方法。在另一个实施方式中，本公开涉及修饰WPBF基因以与野生型谷粒相比降低谷粒中麦醇溶蛋白的量。在又一个实施方式中，本公开涉及WPBF基因中的一个或多个突变，以与野生型谷粒相比降低谷粒中麦醇溶蛋白的量。

在一个实施方式中，本公开涉及在WPBF基因中具有一个或多个突变或WPBF基因经修饰的植物，包括大麦、黑麦和小麦，其具有在野生型谷粒中的麦醇溶蛋白的量约少于5％，或少于10％，或少于15％，或少于20％，或少于25％，或少于30％，或少于40％，或少于50％，或少于60％，或少于70％，或少于80％，或少于85％，或少于90％，或少于95％的量的麦醇溶蛋白。

在一个实施方式中，本公开涉及在WPBF基因中具有一个或多个突变或WPBF基因经修饰的植物，包括大麦、黑麦和小麦，其与野生型植株中的谷粒相比，具有少约5％至约20％，或约20％至约40％，或约40％至约60％，或约60％至约80％，或者80％至约95％的麦醇溶蛋白。

II WPBF基因的突变

A.WPBF基因

在一个实施方式中，本公开涉及WPBF基因中的一个或多个非转基因突变。在另一个实施方式中，本公开涉及WPBF基因中的一个或多个突变。在一个实施方式中，本公开涉及WPBF基因中的多个非转基因突变，包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和大于10个突变。

在另一个实施方式中，WPBF基因可以含有表1-3中提到的一个或多个非转基因突变和同源染色体中的对应突变及其组合。

在另一个实施方式中，本公开涉及在对应的同源染色体中的WPBF基因中与本文所公开的所述一个或多个非转基因突变对应的突变。举例来说，A基因组的WPBF基因中识别的突变可以是B和/或D基因组的WPBF基因中的有益突变。本领域的普通技术人员将理解同源染色体中的突变可以不在完全相同的位置。

本领域的普通技术人员理解，不同小麦品种中WPBF基因的基因序列中可能存在自然变异。

本发明人已经确定为了实现减少植物谷粒中的谷蛋白，希望降低WPBF基因功能的突变。优选的突变包括错义和无义变化，包括过早截短信使RNA翻译一种或多种WPBF蛋白的突变，例如在WPBF信使RNA的编码区内创建终止密码子的那些突变。这样的突变包括插入、重复序列、剪接点突变(slice junction mutation)、修饰的开放阅读框(ORF)和点突变。

在又一个实施方式中，一个或多个突变在A基因组的WPBF基因中。在另一个实施方式中，一个或多个突变在B基因组的WPBF基因中。在又一个实施方式中，一个或多个突变在D基因组的WPBF基因中。在又一个实施方式中，一个或多个突变在A和B基因组的WPBF基因中。在又一个实施方式中，一个或多个突变在A和D基因组的WPBF基因中。在另一个实施方式中，一个或多个突变在B和D基因组的WPBF基因中。在再一个实施方式中，一个或多个突变在A、B和D基因组的WPBF基因中。

1.A基因组

在一个实施方式中，本公开涉及A基因组的WPBF基因中的多个非转基因突变，包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和大于10个突变。在一个实施方式中，一个或多个非转基因突变在A基因组中的WPBF基因的两个等位基因中。在另一个实施方式中，所述非转基因突变在A基因组的WPBF基因的两个等位基因中是相同的。在一个实施方式中，所述突变是纯合的。

在另一个实施方式中，一个或多个突变在A基因组的WPBF基因中的DoF区中。在又一个实施方式中，一个或多个突变在WPBF基因中的DoF区中，其改变WPBF蛋白的DNA结合。在又一个实施方式中，一个或多个突变在WPBF基因中的DoF区中，其不改变DNA结合，但以另一种方式改变WPBF功能。

表1-3中识别的以下突变是根据本文公开的各种实施方式创建和识别的突变的范例。它们是以说明而不是限制的方式提供。应该理解，下面的突变仅仅是示例性的，并且也考虑了类似的突变。

表1提供了A基因组中WPBF基因中的代表性突变列表。一个示例性的突变是G41A，导致根据其在SEQ ID NO：2序列中位置识别的第41位核苷酸处由鸟嘌呤到腺嘌呤的改变。该突变导致根据其在表达的蛋白(SEQ ID NO:3)中位置识别的第14位氨基酸处由甘氨酸到天冬氨酸的改变。本领域技术人员将理解，对于某些等位基因，由于上游非翻译区，核苷酸位置可能略有变化。在表1-3中提及的导致氨基酸改变的所有核酸改变均包含在本文中。

表1：A基因组中WPBF基因中的代表性突变

在一个实施方式中，本公开涉及A基因组中的WPBF基因的多核苷酸，其具有表1中列出的一个或多个非转基因突变并且对应于SEQ ID NO:2。在另一个实施方式中，具有表1中列出的一个或多个非转基因突变的多核苷酸与SEQ ID NO:2具有85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或大于99％的同一性。

在又一个实施方式中，具有表1中列出的一个或多个非转基因突变的多核苷酸编码WPBF蛋白，其中所述WPBF蛋白包含一个或多个非转基因突变，并与SEQ ID NO:3具有85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或大于99％的同一性。

SEQ ID NO.1：小麦醇溶谷蛋白盒结合因子(WPBF)A基因组(在不同小麦栽培变种-不同等位基因中核苷酸序列差别可极其微小)：CTGGCTTGCTCATTTTGCGGTAGTGTTTAAACATCGGCTAGCCTTACGGGTATAAAAAGGTGGGCAACTTCACCCTATCCCATAGCACTAGACCAAAGAACACCTATACTCCATACTACCCTTCGTTCACCTGGTGAGCTTCTTCTTCCTTTGATCTATATCACTTACTATTTCTCCCTTGTCCAGCTTCTTCTTCTTCCTCGTGCATGCGACTTTTTCTAGATAATATCCCGCACTATCGCTCGCCGCAAGATGTGCTAGCTAGCGATCTTCACTTTAATACCTGTTGTAGATCTAACCACGGGCTATTCCAAAAAATATTTGTCTTGTTTGCGTGTTCCTGTGTACATGCACGTATCTAGATCTTGATTTTGAAGAATTCATAATTAATTCATGACCTACCTTGTTTGGTTTGTGTAATTTTGATGTTGTCGTATCAATTTTAGCAAACCACTCGTAGCTAGAACAATAGAGGGGGCGATCGTATGTTTCTGTTTTGAAAAGGGGATATTTCCAGGCTCTGCATCGGTTCATGCACACAGCCGTTACCACATTCAATAGGCACTGATCCATGGATGCATGCCAGATTTACTAGTTTTGTATACAAAGTTTTACTTTTTTGCTTTGATTTATGAAAAGTTGGATCAGATTTTGCAGTTCTCTTTTATCCATGTTGGATTCACTACTTTGTACCCAAGATTTTATTTATTTTGTCTTGGTTTCTTACCTGCCTGGTTAGTAACTAGGAGATCCTGGGATTAGACTTTCAAGGAATCCTAATACTAGTGAGTATAGGGAAAGGAAGCTTATTTTTAAGCTGCCCAAAAGAATGGGCGCTTAGAGTTGTAGTTGATTAATTGAATCTGTTCTGTGGATTTGAGAATTTCAGACCTGATTCTACATGACATTTTGAGTTAACCAATGATTCTACATGTCTCACTCCTTGGGATTAACAATTTAACTTTATTTAATTCGATATGTGTGTACACATGTGTTGCAGATGGAGGAAGTGTTTCCGTCAAACTCCAAGAGCAAGGCCGGTCAGATGGCGGGGGAGGCGACAGCGGCGGCGGAGAAGAAGCCTCGGCCGAAGCCAGAGCAGAAGGTGGAATGCCCTCGGTGCAAGTCTGGCAACACCAAGTTCTGCTACTACAACAACTATAGTATGTCTCAGCCCCGCTACTTCTGCAAGGCCTGCCGCCGCTACTGGACCCATGGTGGCTCCCTCCGCAACGTCCCCATCGGTGGCGGCTGCCGCAAGCCCAAGCGCCCGGGGACCTCCGACGCCCACAAGCTCGGCGTGGCCTCCTCGTCAGAACCCACGGTTGTCATGCCGCCCTCGACCTGCACAGGGATGAACTTTGCCAACGTCCTCCCAACATTTATGTCTGCTGGTTTTGAGATTCCAAGCAGCCTTTCCCTGACTGCCTTTGGGTCATCGTCATCGTCCAACACGGCGGCAGTGATGTCCCCTGGTGGGACGACGTCATTTCTAGACGTGTTGAGAGGGGGCGCAGGAGGGCTTCTTGATGGCAGCCTCAGTCAGAACAATGGCTACTACTATGGTGGGCCTGCCACTGGATCAGGCATTGGGATGCTGATGACGCCGCCAGTGGCGTCATTTGGCATTCCAGGTCCGATGCAGCAACATGGTGATCTCGTGGTTGGTGGAAATGGAATAGGTGCTGCAACTGCTTCAATATTTCAGGGGGGCACTGGCGAGGAAGGAGATGATGGTACGGGGGGCGTGATGGGGCTCCAATGGCAGCCACAGGTTGGCAATGGTGGAGGTGCTGGTGTTGTATCAGGAGGCGTGCATCACCTTGGGACTGGGAACAATGTGACGATGGGCAACAACAATATACACAACAACAACAATAACAACAGTGGGGGTGATGACAACAATGGTGCGTCATCGAGGGATTGCTACTGGATCAACAATGGAGGATCGAACCCATGGCAGAGCCTCCTCAACAACAGCTCCCTGATGTAAGTGCAATAAGAAAATGGGAAATGGAGGTCAT

SEQ ID NO.2小麦醇溶谷蛋白盒结合因子(WPBF)A编码区域：ATGGAGGAAGTGTTTCCGTCAAACTCCAAGAGCAAGGCCGGTCAGATGGCGGGGGAGGCGACAGCGGCGGCGGAGAAGAAGCCTCGGCCGAAGCCAGAGCAGAAGGTGGAATGCCCTCGGTGCAAGTCTGGCAACACCAAGTTCTGCTACTACAACAACTATAGTATGTCTCAGCCCCGCTACTTCTGCAAGGCCTGCCGCCGCTACTGGACCCATGGTGGCTCCCTCCGCAACGTCCCCATCGGTGGCGGCTGCCGCAAGCCCAAGCGCCCGGGGACCTCCGACGCCCACAAGCTCGGCGTGGCCTCCTCGTCAGAACCCACGGTTGTCATGCCGCCCTCGACCTGCACAGGGATGAACTTTGCCAACGTCCTCCCAACATTTATGTCTGCTGGTTTTGAGATTCCAAGCAGCCTTTCCCTGACTGCCTTTGGGTCATCGTCATCGTCCAACACGGCGGCAGTGATGTCCCCTGGTGGGACGACGTCATTTCTAGACGTGTTGAGAGGGGGCGCAGGAGGGCTTCTTGATGGCAGCCTCAGTCAGAACAATGGCTACTACTATGGTGGGCCTGCCACTGGATCAGGCATTGGGATGCTGATGACGCCGCCAGTGGCGTCATTTGGCATTCCAGGTCCGATGCAGCAACATGGTGATCTCGTGGTTGGTGGAAATGGAATAGGTGCTGCAACTGCTTCAATATTTCAGGGGGGCACTGGCGAGGAAGGAGATGATGGTACGGGGGGCGTGATGGGGCTCCAATGGCAGCCACAGGTTGGCAATGGTGGAGGTGCTGGTGTTGTATCAGGAGGCGTGCATCACCTTGGGACTGGGAACAATGTGACGATGGGCAACAACAATATACACAACAACAACAATAACAACAGTGGGGGTGATGACAACAATGGTGCGTCATCGAGGGATTGCTACTGGATCAACAATGGAGGATCGAACCCATGGCAGAGCCTCCTCAACAACAGCTCCCTGATG

SEQ ID NO.3:WPBF-A氨基酸序列：

MEEVFPSNSKSKAGQMAGEATAAAEKKPRPKPEQKVECPRCKSGNTKFCYYNNYSMSQPRYFCKACRRYWTHGGSLRNVPIGGGCRKPKRPGTSDAHKLGVASSSEPTVVMPPSTCTGMNFANVLPTFMSAGFEIPSSLSLTAFGSSSSSNTAAVMSPGGTTSFLDVLRGGAGGLLDGSLSQNNGYYYGGPATGSGIGMLMTPPVASFGIPGPMQQHGDLVVGGNGIGAATASIFQGGTGEEGDDGTGGVMGLQWQPQVGNGGGAGVVSGGVHHLGTGNNVTMGNNNIHNNNNNNSGGDDNNGASSRDCYWINNGGSNPWQSLLNNSSLM

2.B基因组

在一个实施方式中，本公开涉及B基因组的WPBF基因中的多个非转基因突变，包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和大于10个突变。在一个实施方式中，一个或多个非转基因突变在B基因组中的WPBF基因的两个等位基因中。在另一个实施方式中，所述非转基因突变在B基因组的WPBF基因的两个等位基因中是相同的。在又一个实施方式中，所述突变是纯合的。

在又一个实施方式中，一个或多个突变在B基因组的WPBF基因中的DoF区中。在又一个实施方式中，一个或多个突变在WPBF基因中的DoF区中，其改变WPBF蛋白的DNA结合。在又一个实施方式中，一个或多个突变在WPBF基因中的DoF区中，其不改变DNA结合但以另一种方式改变WPBF的功能。

表2提供了小麦植株Kronos和Express的B基因组的WPBF基因中突变的代表性列表。核苷酸和氨基酸改变根据它们在SEQ ID NO:5和6中的位置分别被识别。“*”表示终止密码子。

表2.B基因组的WPBF基因中的代表性突变

在一个实施方式中，本公开涉及B基因组中的WPBF基因的多核苷酸，其具有表2中列出的一个或多个非转基因突变并且对应于SEQ ID NO:5。在另一个实施方式中，具有表2中列出的一个或多个非转基因突变的多核苷酸与SEQ ID NO:5具有85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或大于99％的同一性。

在又一个实施方式中，具有表2中列出的一个或多个非转基因突变的多核苷酸编码WPBF蛋白，其中所述WPBF蛋白包含一个或多个非转基因突变并且与SEQ ID NO:6具有85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或大于99％的同一性。

SEQ ID NO.4WPBF-B基因组：

CTGGCTTGCTCATTTTGCGGTAGTGTTTAAACATTGGCTGGAATTACGGGTATAAAAAGGAGGGCAACTTCACCCTATCCCATAGCACTAGACCAAACAACTCCTATACTCCATACTACCCTTCATTCACCTGGTGAGCTTCTTCTTTCTTTGATTTCTATCACTTACTCTTTCTCCCTCGTCCAGCTTCTTCTTCTTCCTCGTGCATGTGACTTTTGCTAGATAATCTCCCACATTATCGCTCAATGCAAGCCGTGCTAGCTAGCTAGCGATCTAGCTAGCGATCTTCACTTTAATACCCGTTGTAGATCTAACCATGGGCTATTCCAAAACATATTTCTCTTGTTTGCGTGTTCGTGTGTACATGCATGCATCTAGATCTTGATTTTGAGGAATTCATAAGTAATTCCTGACCTACCTTGTTTGGTTTGTTTAATTTTGATGTTGTTGTCTCAATTTTAGCAAATTGCTCGTAGCTAGAACAATAGAGGGGGCGGCCGTATGTTTCCGTTTTGAAAAGGGGATATTTCCAGGCTCTGCATCGGTTGATGCACACAGCCGTTACCACATTCAATAGGCACTGATCCATGGATGCATGCTATATTTACAAGTTTTCTATAGAAATTTTTTTTATTTATGAAAAATTGGATCGGTATAGTTCTTCTTTATCCATGTCGGATTCACTACTTTGTACCCAAGATTTTATTTATTTTGTCTCGGTTTCTTACATGTCTAGTTAGGTAACTAGGAGAGCCTGGGATTAGGCTTTCAAGGAATCCTAATACTAGAGACTATGGGGAGAGACAGCTTATTCTTTAAGCTGCGCAAAAGAATGGGCGCTTAGAGTTGTAGTTGATAAATTGAATCTGTTGTATGGATTTGAGAATTTGAGACCTGATTATGCACTTATCATGAAATTTTGAGTTAACCAATGATTCTACATGTCTCACTCCTTAGGATTAACAATTTAACTTAATTTAATTCGATATGTGTGTACACATGTGTTGAAGATGGAGGAAGTGTTTCCGTCAAACTCCAAGAGCAAGGCTGGTCAGATGGCGGGGGAGGCGACAGCGGCGGCGGAGAAGAAGCCTCGGCCGAAGCCAGAGCAGAAGGTGGAATGCCCTCGGTGCAAGTCTGGCAACACCAAGTTCTGCTACTACAACAACTATAGTATGTCTCAGCCCCGCTACTTCTGCAAGGCCTGCCGCCGCTACTGGACCCATGGTGGGTCCCTCCGTAACGTCCCCATCGGTGGTGGCTGCCGCAAGCCCAAGCGCTCGGGGACCTCCGACGCCCACAAGCTCGGCGTGGCCTCCTCGTCGGAACACACGGCTGTCATGCCCCCCTCGACCTGCACAGGGATAAACTTTGCCAATGTCCTCCCGACGTTTATGTCTGCTGGTTTTGAGATTCCAAGAAGCCTTTCCCTGACCACCTTTGGGTCATCGtcGTCGTCCAACACGACGGCTGTCATGTCCCCTGGTGGGACGACGTCATTTCTAGACGTGCTGAGAGGGGGAACAGGAGGGCTTCTTGATGGCAACCTCGGTCAGAACAATGGCTACTACTATGGTGGGTCTAGATCAGGCATTGGGATGCTGATGACGCCGCCAGCGGCGTCATTTGGCATTCCAGGTCCAATGCAGCAGCATGGCGATCTCATGGTTGGTGGAAATGGAATAGGTGCCGCAACTGCTTCAATATTTCAGGGGGGCACTGGTGAGGAAGGAGATGACGGCAAAGGGGCCATGATGGGGCTCCAATGGCAGCCACATGTTGGTAATGGTGGAGGTGGTGGTGTTGTATCAGGAGGCGTGCATCACCTTGGGACTGGGAACAATGTGACGATGGGCAACAACAACATAAACAACAATAACAATAATGGCAGCCACAGTGATGACAACACTGGTGGGTCATCGAGGGATTGCTACTGGATCAATAATGGAGGATCGAACCCATGGCAAAGCCTCCTCAATAGCAGCTCCCTGATGTAAGTGCAAGAAGAAAATGCGAAATGGAGATCAT

SEQ ID NO.5:WPBF-B编码序列：

ATGGAGGAAGTGTTTCCGTCAAACTCCAAGAGCAAGGCTGGTCAGATGGCGGGGGAGGCGACAGCGGCGGCGGAGAAGAAGCCTCGGCCGAAGCCAGAGCAGAAGGTGGAATGCCCTCGGTGCAAGTCTGGCAACACCAAGTTCTGCTACTACAACAACTATAGTATGTCTCAGCCCCGCTACTTCTGCAAGGCCTGCCGCCGCTACTGGACCCATGGTGGGTCCCTCCGTAACGTCCCCATCGGTGGTGGCTGCCGCAAGCCCAAGCGCTCGGGGACCTCCGACGCCCACAAGCTCGGCGTGGCCTCCTCGTCGGAACACACGGCTGTCATGCCCCCCTCGACCTGCACAGGGATAAACTTTGCCAATGTCCTCCCGACGTTTATGTCTGCTGGTTTTGAGATTCCAAGAAGCCTTTCCCTGACCACCTTTGGGTCATCGtcGTCGTCCAACACGACGGCTGTCATGTCCCCTGGTGGGACGACGTCATTTCTAGACGTGCTGAGAGGGGGAACAGGAGGGCTTCTTGATGGCAACCTCGGTCAGAACAATGGCTACTACTATGGTGGGTCTAGATCAGGCATTGGGATGCTGATGACGCCGCCAGCGGCGTCATTTGGCATTCCAGGTCCAATGCAGCAGCATGGCGATCTCATGGTTGGTGGAAATGGAATAGGTGCCGCAACTGCTTCAATATTTCAGGGGGGCACTGGTGAGGAAGGAGATGACGGCAAAGGGGCCATGATGGGGCTCCAATGGCAGCCACATGTTGGTAATGGTGGAGGTGGTGGTGTTGTATCAGGAGGCGTGCATCACCTTGGGACTGGGAACAATGTGACGATGGGCAACAACAACATAAACAACAATAACAATAATGGCAGCCACAGTGATGACAACACTGGTGGGTCATCGAGGGATTGCTACTGGATCAATAATGGAGGATCGAACCCATGGCAAAGCCTCCTCAATAGCAGCTCCCTGATG

SEQ ID NO.6WPBF B氨基酸序列：

MEEVFPSNSKSKAGQMAGEATAAAEKKPRPKPEQKVECPRCKSGNTKFCYYNNYSMSQPRYFCKACRRYWTHGGSLRNVPIGGGCRKPKRSGTSDAHKLGVASSSEHTAVMPPSTCTGINFANVLPTFMSAGFEIPRSLSLTTFGSSSSSNTTAVMSPGGTTSFLDVLRGGTGGLLDGNLGQNNGYYYGGSRSGIGMLMTPPAASFGIPGPMQQHGDLMVGGNGIGAATASIFQGGTGEEGDDGKGAMMGLQWQPHVGNGGGGGVVSGGVHHLGTGNNVTMGNNNINNNNNNGSHSDDNTGGSSRDCYWINNGGSNPWQSLLNSSSLM

3.D基因组

在一个实施方式中，本公开涉及D基因组的WPBF基因中的多个非转基因突变，包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和大于10个突变。在一个实施方式中，一个或多个非转基因突变在D基因组中的WPBF基因的两个等位基因中。在另一个实施方式中，所述非转基因突变在D基因组的WPBF基因的两个等位基因中是相同的。

表3提供了小麦植株Express的D基因组中的WPBF基因中创建和识别突变的代表性实例。核苷酸和氨基酸改变根据它们在SEQ ID NO:8和9中的位置分别被识别。

表3.D基因组的WPBF基因中的突变的代表性列表

在一个实施方式中，本公开涉及D基因组中的WPBF基因的多核苷酸，其具有表3中列出的一个或多个非转基因突变并且对应于SEQ ID NO:8。在另一个实施方式中，具有有表3中列出的一个或多个非转基因突变的多核苷酸与SEQ ID NO:8具有85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或大于99％的同一性。

在又一个实施方式中，具有表3中列出的一个或多个非转基因突变的多核苷酸编码WPBF蛋白，其中所述WPBF蛋白包含一个或多个非转基因突变，并与SEQ ID NO:9具有85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或大于99％的同一性。

SEQ ID NO.7:WPBF-D基因组：

CTGGCTTGCTCATTCTGCGGTAGTGTTTAAACATCAGCTAGCCTTACGGGTATAAAAAGGTGGGCAACTTCACCCTATCCCATAGCACTAGACCAAACAACACCTATACTCCATACTACCCTTCATTCACCTGGTGAGATTCTTCTTCCTTTGATCTCTATCACTTACTCTTTCTCCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCCTCGTGCATGCTACTTTTGCTACATAATCTCCTGCAGTATCGCTCGCCGCAAGCTGTGCTAGCTAGCTAGCGATCTTCACTTTAAGACCCGTTGTAGATCTAGCCACGGGCTATTCCAAAAAATATTTCTCTTGTTTGCGTGTTCCTGTGTACATGCATGTATTTAGATCTTGATCTTGAAGAATTCATACTGAATTCATGACCTACCTTGTTTGGTTTGTGTAATTTTGATGTTGTTGTATCAATTTTAGCAAACCGCTCGTAGCTAGAACAATAGAGGGGGCGGCCGTATGTTTCCATTTCGAAAAGGGGATATTTCCAGGCTCTGCATCGGTTCATGCACACAGCCGTTACCACATTCAATAGGCACTAATCCATGGATGCATGCCAGATTTACTAGTTTTGTTTACAAAGTTTTATTTTTTTTTGCTTTGATTTACGAAAAATTGGATCGGATTTTGCAGTTCTTTTTTATCCATGTTGGATTCACTACTTTGAACCCAAGATTTTATTTATTTTGTCTCGGTTTCTTACACGCCTGGTTAGGTAACTAGGAGATCCTGGGATTAGGCTTTCAAGGAATCCTAATACTAGAGAGTATGGGGAGAGGCACCTTATTTTTTAAGTTGCCCAAAAGAATGGGCGCTTAGAGTTGTAGCTAATTAATTGAATCTGTTGTATGGATCTGAGAATTTGAGACCTGATTATGCACTTATCATGACATTTTGAGTCAACCAATGATTCTACATGTCTCACTCCTTAGGATTAACAATTTAACTTAATTTAATTCGATATGTGTGTACACATGTGTTGTAGATGGAGGAAGTGTTTCCGTCAAACTCCAAGAGCAAGGCAGGTCAGATGGCGGGGGAGGCGATAGCGGGGGCGGAGAAGAAGCCTCGGCCAAAGCCAGAGCAGAAGGTGGAATGCCCTCGGTGCAAGTCTGGCAACACCAAGTTCTGCTACTACAACAACTATAGTATGTCTCAGCCCCGCTACTTCTGCAAGGCCTGCCGCCGCTACTGGACCCATGGTGGCTCCCTCCGCAACGTCCCCATCGGTGGTGGCTGCCGCAAGCCCAAGCGCTCGGGGACCTCCGACGCCCACAAGCTCGGCGTGGCCTCCTCACCGGAACCCACGACTGTCGTGCCCCCCTCGACCTGCACAGGGATGAACTTTGCGAACGTCCTCCCGACGTTTATGTCTGTTGGTTTTGAGATTCCAAGCAGCCTTTCCCTAACCGCCTTTGGGTCATCAtcGTCGTCCAACACGGCGGCGATGATGTCCCCTGGTGGGACGACGTCATTTCTAGACGTGCTAAGAGGGGGTGCAGGAGGGCTTCTTGATGGCAGCCTCAGTCAGAACAATGGCTACTACTATGGTGGGCCAGCCATTGGATCAGGCAATGGGATGCTGATGACGCCGCCAGCGGTGTCATTTGGCATTCCAGTTCCGATGCAGCAGCATGGTGATCTCGTGGTTGGTGGAAATGGAATAGGTGCCGCAACTGCTTCAATATTTCAAGGGGCCACTAGCGAGGAAGGAGATGACGGCATGGGGGGCGTGATGGGGCTCCAATGGCAACCACAGGTTGGCAATGGTGGAGGTGGTGGTGGTGTATCAGGAGGCGTGCATCACCTTGGGACTGGGAACAATGTGACGATGGGCAACAGCAACATACACAACAACAACAATAACGACAGCGGCGGTGATGACAACAATGGTGGGTCATCGAGGGATTGCTACTGGATCAACAATGGAGGATCAAACCCATGGCAGAGCCTCCTCAACAGCAGCTCCCTGATGTAAGTGCAAGAAGAAAATGGGAAATGGAGGTCAT

SEQ ID NO.8:WPBF-D编码序列：

ATGGAGGAAGTGTTTCCGTCAAACTCCAAGAGCAAGGCAGGTCAGATGGCGGGGGAGGCGATAGCGGGGGCGGAGAAGAAGCCTCGGCCAAAGCCAGAGCAGAAGGTGGAATGCCCTCGGTGCAAGTCTGGCAACACCAAGTTCTGCTACTACAACAACTATAGTATGTCTCAGCCCCGCTACTTCTGCAAGGCCTGCCGCCGCTACTGGACCCATGGTGGCTCCCTCCGCAACGTCCCCATCGGTGGTGGCTGCCGCAAGCCCAAGCGCTCGGGGACCTCCGACGCCCACAAGCTCGGCGTGGCCTCCTCACCGGAACCCACGACTGTCGTGCCCCCCTCGACCTGCACAGGGATGAACTTTGCGAACGTCCTCCCGACGTTTATGTCTGTTGGTTTTGAGATTCCAAGCAGCCTTTCCCTAACCGCCTTTGGGTCATCAtcGTCGTCCAACACGGCGGCGATGATGTCCCCTGGTGGGACGACGTCATTTCTAGACGTGCTAAGAGGGGGTGCAGGAGGGCTTCTTGATGGCAGCCTCAGTCAGAACAATGGCTACTACTATGGTGGGCCAGCCATTGGATCAGGCAATGGGATGCTGATGACGCCGCCAGCGGTGTCATTTGGCATTCCAGTTCCGATGCAGCAGCATGGTGATCTCGTGGTTGGTGGAAATGGAATAGGTGCCGCAACTGCTTCAATATTTCAAGGGGCCACTAGCGAGGAAGGAGATGACGGCATGGGGGGCGTGATGGGGCTCCAATGGCAACCACAGGTTGGCAATGGTGGAGGTGGTGGTGGTGTATCAGGAGGCGTGCATCACCTTGGGACTGGGAACAATGTGACGATGGGCAACAGCAACATACACAACAACAACAATAACGACAGCGGCGGTGATGACAACAATGGTGGGTCATCGAGGGATTGCTACTGGATCAACAATGGAGGATCAAACCCATGGCAGAGCCTCCTCAACAGCAGCTCCCTGATG

SEQ ID NO.9:WPBF-D氨基酸序列：

MEEVFPSNSKSKAGQMAGEAIAGAEKKPRPKPEQKVECPRCKSGNTKFCYYNNYSMSQPRYFCKACRRYWTHGGSLRNVPIGGGCRKPKRSGTSDAHKLGVASSPEPTTVVPPSTCTGMNFANVLPTFMSVGFEIPSSLSLTAFGSSSSSNTAAMMSPGGTTSFLDVLRGGAGGLLDGSLSQNNGYYYGGPAIGSGNGMLMTPPAVSFGIPVPMQQHGDLVVGGNGIGAATASIFQGATSEEGDDGMGGVMGLQWQPQVGNGGGGGGVSGGVHHLGTGNNVTMGNSNIHNNNNNDSGGDDNNGGSSRDCYWINNGGSNPWQSLLNSSSLM

4.Dof区

在一个实施方式中，本公开涉及A、B或D基因组的WPBF基因的Dof区中的多个非转基因突变。在一个实施方式中，本公开涉及A和B基因组的WPBF基因的Dof区中的多个非转基因突变。在一个实施方式中，本公开涉及A和D基因组的WPBF基因的Dof区中的多个非转基因突变。在一个实施方式中，本公开涉及B和D基因组的WPBF基因的Dof区中的多个非转基因突变。

在又一个实施方式中，本公开涉及如WPBF基因的SEQ ID NO.10所示的Dof区中的一个或多个非转基因突变。

在又一个实施方式中，本公开涉及如WPBF蛋白的SEQ ID NO.11所示的Dof区中的一个或多个非转基因突变。SEQ ID NO.11中示出的63个氨基酸中的一个或多个可以突变。这些突变可以是严重的或保守的。

在一个实施方式中，SEQ ID NO.11的第28位处Q发生突变。在一个实施方式中，SEQID NO.11的第28位处谷氨酰胺(Q)可以突变成亮氨酸(L)。

SEQ ID NO.10:WPBF基因的Dof区

AAGCCAGAGCAGAAGGTGGAATGCCCTCGGTGCAAGTCTGGCAACACCAAGTTCTGCTACTACAACAACTATAGTATGTCTCAGCCCCGCTACTTCTGCAAGGCCTGCCGCCGCTACTGGACCCATGGTGGCTCCCTCCGCAACGTCCCCATCGGTGGTGGCTGCCGCAAGCCCAAGCGCTCGGGGACC

SEQ ID NO.11:WPBF蛋白的Dof区

KPEQKVECPRCKSGNTKFCYYNNYSMSQPRYFCKACRRYWTHGGSLRNVPIGGGCRKPKRSGT

B.WPBF蛋白

在又一个实施方式中，本公开涉及WPBF基因中的一个或多个非转基因突变(如上文标题为WPBF突变的部分中所述)，与野生型WPBF蛋白相比，其产生具有一个或多个突变的WPBF蛋白。在一个实施方式中，所述非转基因突变包括但不限于表1-3中提及的突变、同源染色体中对应的突变，及其组合。

在另一个实施方式中，本公开涉及WPBF基因中的一个或多个非转基因突变，其抑制WPBF蛋白产生。在一些实施方式中，WPBF基因中的突变降低WPBF蛋白的表达。在其他实施方式中，WPBF基因中的突变产生不稳定的或功能降低的WPBF蛋白。

1.WPBF蛋白的表达水平

在另一个实施方式中，具有本文公开的一个或多个突变的WPBF蛋白的表达水平与野生型WPBF蛋白的表达水平相比降低0-2％，2-5％，5-7％，7-10％，10-15％，15-20％20-25％，25-30％，30-35％，35-40％，40-45％，45-50％，50-60％，60-70％，70-80％，80-90％，90-95％以及95-99％。

在又一个实施方式中，与野生型WPBF蛋白的表达水平相比，具有本文公开的一个或多个突变的WPBF蛋白的表达水平降低10-20％，或20-30％，或30-40％，或40-50％，或50-60％，或60-70％，或70-80％，或80-90％，或90-99％。

2.WPBF蛋白的活性

在另一个实施方式中，具有本文公开的一个或多个突变的WPBF蛋白的活性降低至野生型WPBF蛋白的活性水平的0-1，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99％及降低超过99％。在另一个实施方式中，与野生型WPBF蛋白相比，具有本文公开的一个或多个突变的WPBF蛋白没有活性或活性为零。

在另一个实施方式中，具有本文公开的一个或多个突变的WPBF蛋白的活性为野生型WPBF蛋白的活性水平的1-10％，或10-30％，或30-50％，或50-70％，或70-80％，或80-90％，或90-95％。

III.转基因

在一个实施方式中，本公开涉及包含编码多核苷酸的转基因的转基因植物，所述多核苷酸下调WPBF基因的表达和/或WPBF蛋白的活性。该多核苷酸的实例包括但不限于反义多核苷酸、有义多核苷酸、催化性多核苷酸、人工微小RNA或双螺旋RNA分子。

在一个实施方式中，本公开涉及包含降低WPBF基因表达和/或WPBF蛋白活性的转基因的小麦植株，其中所述小麦植株与野生型植株的谷粒相比具有谷蛋白减少的谷粒。

A.反义多核苷酸

术语“反义多核苷酸”应被理解为指DNA或RNA分子或其组合，该分子与编码WPBF的特定mRNA分子的至少一部分互补并且能够干扰转录后事件，如mRNA翻译。

植物中的反义多核苷酸在生理条件下将与靶多核苷酸杂交。如本文所用，术语“在生理条件下杂交的反义多核苷酸”是指所述多核苷酸(其是完全或部分单链的)至少能够与编码蛋白质的mRNA形成双链多核苷酸。

反义分子可包括对应于结构基因的序列或对基因表达或剪接事件实施控制的序列。例如，反义序列可以对应于WPBF的靶向编码区或5'-非翻译区(UTR)或3'-UTR或这些区域的组合。它可能部分地与可能在转录过程中或转录后被剪切掉的内含子序列互补，优选仅与靶基因的外显子序列互补。鉴于UTR通常差异更大，靶向这些区域提供了更大的基因抑制特异性。

反义序列的长度应至少为19个连续核苷酸，优选至少50个核苷酸，更优选至少100个，200个，500个或1000个核苷酸。可以使用与整个基因转录物互补的全长序列。该长度最优选为100-2000个核苷酸。所述反义序列与靶向转录物的同一性程度应至少为90％，更优选为95-100％。反义RNA分子当然可以包含无关序列，其可以起到稳定分子的作用。

B.催化性多核苷酸

术语催化性多核苷酸/核酸指的是特异性识别不同的底物并催化该底物的化学修饰的DNA分子或含DNA的分子(在本领域中也称为“脱氧核酶”)或RNA或含RNA的分子(也称为“核酶”)。催化性核酸中的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T(以及U，对于RNA)。

通常，所述催化性核酸含有用于特异性识别靶核酸的反义序列和裂解酶活性的核酸(在本文中也称为“催化域”)。

本文公开的植物中的核酶和编码该核酶的DNA可以使用本领域公知的方法化学合成。所述核酶还可以由与RNA聚合酶启动子(例如T7RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶的启动子)可操作连接的DNA分子(在转录时产生RNA分子)制备。当载体还含有与DNA分子可操作连接的RNA聚合酶启动子时，在与RNA聚合酶和核苷酸一起孵育时可在体外产生所述核酶。在一个单独的实施方式中，可以将DNA插入到表达盒或转录盒中。合成后，可通过与具有稳定所述核酶的能力的DNA分子连接来修饰RNA分子，并使其对核糖核酸酶具有抗性。

与本文所述的反义多核苷酸一样，所述催化性多核苷酸也应该能够在“生理条件”下，即在植物细胞内的那些条件下，与靶核酸分子(例如编码WPBF的mRNA)杂交。

C.RNA干扰

RNA干扰(RNAi)对于特异性地抑制特定蛋白的产生特别有用。该技术依赖于含有与目的基因或其部分的mRNA基本相同的序列的dsRNA分子的存在。方便地，dsRNA可以由单个启动子在重组载体或宿主细胞中产生，其中有义和反义序列侧翼为能够使有义和反义序列杂交以形成dsRNA分子的无关序列，无关序列形成环结构。本发明合适的dsRNA分子的设计和生产完全在本领域技术人员的能力范围内，特别考虑，WO 99/32619、WO99/53050、WO99/49029和WO 01/34815。

在一个实例中，引入DNA，其指导与待灭活的靶基因具有同源性的至少部分双链(双螺旋)RNA产物的合成。因此，DNA包含有义和反义序列，在转录成RNA时，有义和反义序列可以杂交以形成双链RNA区域。在一个优选的实施方式中，有义和反义序列被包含内含子(在转录成RNA时所述内含子被剪切掉)的间隔区分开。已经表明这种安排导致更高效的基因沉默。双链区域可以包含从一个DNA区域或两个DNA区域转录的一个或两个RNA分子。据认为双链分子的存在引起内源植物系统的反应，该反应破坏双链RNA以及来自靶植物基因的同源RNA转录物，有效地降低或消除靶基因的活性。

杂交的有义和反义序列的长度应分别为至少19个连续的核苷酸，优选至少30个或50个核苷酸，更优选至少100个，200个，500个或1000个核苷酸。可以使用对应于整个基因转录物的全长序列。该长度最优选为100-2000个核苷酸。有义和反义序列与靶向转录物的同一性程度应为至少85％，优选至少90％，更优选95-100％。RNA分子当然可以包含可能起稳定分子作用的无关序列。RNA分子可以在RNA聚合酶II或RNA聚合酶III启动子的控制下表达。后者的实例包括tRNA或snRNA启动子。

在一个实施方式中，小干扰RNA(“siRNA”)分子包含与靶mRNA的约19-21个连续核苷酸相同的核苷酸序列。优选地，所述靶mRNA序列以二核苷酸AA开始，包含约30-70％(优选30-60％，更优选40-60％，更优选约45％-55％)的GC含量，并且与除了其将要被引入其中的大麦植株的基因组中的靶标以外的任何核苷酸序列不具有高百分比同一性(例如，如通过标准BLAST搜索所确定的)。

D.微小RNA

微小RNA调控是朝向基因调节发展的RNA沉默途径中的一个清楚的专门分支，与传统的RNAi/转录后基因沉默(PTGS)不同。微小RNA是一类特殊的小RNA，在以特征性反向重复序列组织的基因样元件中编码。当转录时，微小RNA基因产生茎-环前体RNA，从该茎-环前体RNA顺序加工微小RNA。微小RNA的长度通常为约21个核苷酸。释放的miRNA被并入到RISC样复合物中，该复合物含有发挥序列特异性基因抑制作用的阿格蛋白(Argonaute protein)的特定亚单位。

E.共抑制

可以使用的另一种分子生物学方法是共抑制。共抑制的机制尚不清楚，但据认为涉及转录后基因沉默(PTGS)，在这方面可能与反义抑制的许多例子非常相似。它涉及将基因或其片段的额外拷贝以相对于用于其表达的启动子的有义方向引入植物中。有义片段的大小、其与靶基因区域的对应性以及与靶基因的序列同一性程度与上述反义序列相同。在一些情况下，基因序列的额外拷贝干扰靶植物基因的表达。实施共抑制方法的方法参考WO97/20936和EP 0465572。

IV.基因组编辑

在一个实施方式中，本公开涉及WPBF基因表达降低和/或WPBF蛋白活性降低的植物，其中WPBF基因表达降低和/或WPBF蛋白活性降低通过基因组编辑实现。

在一个实施方式中，本公开涉及具有基因组编辑的WPBF基因的小麦植株，其中所述小麦植株与野生型植株相比具有减少的谷蛋白谷粒。

基因组编辑，或使用工程核酸酶的基因组编辑(GEEN)，是一种使用人工改造的核酸酶或“分子剪刀”在基因组中插入、替换或去除DNA的基因工程。所述核酸酶在基因组中的期望的位置产生特定的双链断裂(DSB)，并利用细胞内源性机制通过同源重组(HR)和非同源末端接合(NHEJ)的自然过程来修复诱导的断裂。目前使用的有四种主要的工程核酸酶家族：锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统以及具有重新改造的归巢核酸内切酶的工程大范围核酸酶。

A.锌指核酸酶(ZFN)

锌指核酸酶(ZFN)是通过将锌指DNA结合域与DNA切割域融合而产生的人工限制 酶。锌指结构域可以被改造成靶向特定的期望的DNA序列，并且这使得锌指核酸酶能够靶向复杂基因组内的独特序列。通过利用内源性DNA修复机制，这些试剂可以用来精确地改变高等生物的基因组。

ZFN由与FokI限制性核酸内切酶的切割域融合的工程锌指DNA结构域组成。ZFN可用于诱导特定DNA序列中的双链断裂(DSB)，从而促进与外源模板的位点特异性同源重组。该外源模板含有待引入基因组的序列。

改造锌指结构域的公知可用的方法包括：(1)背景依赖的组装(Context-dependent Assembly)(CoDA)，(2)寡聚文库构建(Oligomerized Pool Engineering)(OPEN)和(3)模块化组装(Modular Assembly)。

在一个实施方式中，本公开涉及使用ZFN降低WPBF基因的表达和/或降低WPBF蛋白的活性。

B.转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)

TALEN是由转录激活因子样效应物(TALE)和FokI核酸内切酶组成的序列特异性核酸内切酶。TALE是一种DNA结合蛋白，其具有含有34个氨基酸的串联重复单元的高度保守中心区域。每个重复单元的碱基偏好由称为重复可变二元残基(RVD)的两个氨基酸残基确定，其识别靶DNA中的一个特定核苷酸。可以定制DNA结合重复单元阵列以靶向特定的DNA序列。与ZFN一样，两个TALEN在基因组中靶向的特定序列上的二聚化导致DSB的FokI依赖性引入，刺激同源定向修复(HDR)和非同源的末端接合(NHEJ)修复机制。

在一个实施方式中，本公开涉及使用TALEN降低WPBF基因的表达和/或降低WPBF蛋白的活性。

C.CRISPR/Cas系统

规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)II型系统是用于基因组工程的RNA指导的核酸内切酶技术。该系统有两个不同的组成部分：(1)向导RNA和(2)核酸内切酶，在这种情况下是CRISPR相关(Cas)核酸酶，Cas9。

向导RNA是内源性细菌crRNA和tracrRNA组合成单个嵌合向导RNA(gRNA)转录物。gRNA将crRNA的靶向特异性与tracrRNA的支架性质组合到单一转录物中。当gRNA和Cas9在细胞中表达时，基因组靶序列可被修饰或被永久破坏。

gRNA/Cas9复合物通过gRNA序列与基因组DNA中的靶序列的互补性之间的碱基配对被募集至靶序列。为了成功结合Cas9，基因组靶序列还必须包含紧接在所述靶序列之后的正确的前间区序列邻近基序(Protospacer Adjacent Motif，PAM)序列。gRNA/Cas9复合物的结合将Cas9定位于基因组靶序列，使得野生型Cas9可以切割两条DNA链，导致双链断裂(DSB)。Cas9将切割在PAM序列的上游的3-4个核苷酸。DSB可以通过两种常规修复途径之一而被修复：(1)NHEJ DNA修复途径或(2)HDR途径。所述NHEJ修复途径通常导致在DSB位点插入/缺失(InDel)，这可能导致移码和/或提前终止密码子，有效地破坏靶基因的开放阅读框(ORF)。

所述HDR途径需要用于固定DSB的修复模板的存在。HDR忠实地将修复模板的序列复制到切割的靶序列。通过使用具有修复模板的HDR，可将特定的核苷酸改变引入到靶基因中。

在一个实施方式中，本公开涉及使用所述CRISPR/cas9系统降低WPBF基因的表达和/或降低WPBF蛋白的活性。

D.具有重新改造的归巢核酸酶的大范围核酸酶

大范围核酸酶是以大识别位点(12至40个碱基对的双链DNA序列)为特征的内脱氧核糖核酸酶；因此这个位点在任何给定的基因组中通常只出现一次。例如，由I-SceI大范围核酸酶识别的18个碱基对序列平均需要人类基因组二十倍大小的基因组才被偶然发现一次(尽管具有单个错配的序列每个人类大小的基因组发生约三次)。因此，大范围核酸酶被认为是最特异的天然存在的限制酶。

在大范围核酸酶中，归巢核酸内切酶的LAGLIDADG家族已经成为过去15年来基因组和基因组工程研究的宝贵工具。通过蛋白质工程改变它们的识别序列，可以改变靶序列。

在一个实施方式中，本公开涉及使用具有重新改造的归巢核酸酶的大范围核酸酶降低WPBF基因的表达和/或降低WPBF蛋白的活性。

V.小麦栽培变种

在一个实施方式中，可以使用为二倍体、多倍体、四倍体和六倍体的具有至少一种WPBF基因的小麦栽培变种。

在另一个实施方式中，所述小麦是普通小麦(Triticum aestivum)。

在一个实施方式中，小麦的任何栽培变种均可用于在WPBF基因中创建突变。在一个实施方式中，小麦的任何栽培变种均可用于在A基因组的WPBF基因中创建突变。在另一个实施方式中，小麦的任何栽培变种均可用于在B基因组的WPBF基因中创建突变。在另一个实施方式中，小麦的任何栽培变种均可用于在D基因组的WPBF基因中创建突变。

在一个实施方式中，小麦的任何栽培变种均可用于将WPBF突变杂交到不同的栽培变种中的品系。在另一个实施方式中，可以使用具有至少一种WPBF基因的小麦的任何栽培变种，包括但不限于硬红春麦、硬白小麦、硬粒小麦、软白春麦、软白冬麦、硬红冬麦、普通小麦、棍状小麦、斯卑尔脱小麦、二粒小麦、面食小麦和圆锥小麦。

在一个实施方式中，硬红春麦包括但不限于Bullseye、Cabernet、Cal Rojo、Hank、Joaquin、Kelse、Lariat、Lassik、Malbec、Mika、PR 1404、Redwing、Summit 515、SY 314、Triple IV、Ultra、WB-Patron、WB-Rockland、Yecora Rojo、Accord、Aim、Anza、Baker、BethHashita、Bonus、Borah、Brim、Brooks、Buck Pronto、Butte 86、Cavalier、Challenger、Chief、Ciano T79、Colusa、Companion、Copper、Cuyama、Dash 12、Eldon、Enano、Express、Expresso、Jefferson、Genero F81、Grandin、Helena 554、Hollis、Imuris T79、Inia 66R、Jerome、Kern、Len、Marshall、McKay、Nomad、Northwest 10、Oslo、Pavon F76、Pegasus、Pitic 62、Poco Red、Powell、Probrand 711、Probrand 751、Probrand 771、Probrand 775、Probred、Prointa Queguay、Prointa Quintal、Rich、RSI 5、Sagittario、Scarlet、Serra、Shasta、Solano、Spillman、Sprite、Stander、Stellar、Stoa、Success、Summit、Sunstar 2、Sunstar King、Tadinia、Tammy、Tanori 71、Tara 2000、Tempo、Tesia T79、Topic、UIWinchester、Vance、Vandal、W444、Wampum、Wared、WB-Fuzion、Westbred 906R、Westbred911、Westbred 926、Westbred 936、Westbred Discovery、Westbred Rambo、Yolo和Zeke。

在另一个实施方式中，硬白小麦包括但不限于Blanca Fuerte、Blanca Grande515、Blanca Royale、Clear White、Patwin、Patwin 515、WB-Cristallo、WB-Paloma、WB-Perla、Alta Blanca、Blanca Grande、Delano、Golden Spike、ID377S、Klasic、Lochsa、Lolo、Macon、Otis、Phoenix、Pima 77、Plata、Pristine、Ramona 50、Siete Cerros 66、Vaiolet和Winsome。

在又一个实施方式中，硬粒小麦包括但不限于Crown、Desert King、Desert KingHP、Duraking、Fortissimo、Havasu、Kronos、Maestrale、Normanno、Orita、Platinum、Q-Max、RSI 59、Saragolla、Tango、Tipai、Topper、Utopia、Volante、WB-Mead、Westmore、Aldente、Aldura、Altar 84、Aruba、Bittern、Bravadur、Candura、Cortez、Deluxe、Desert Titan、Durex、Durfort、Eddie、Germains 5003D、Imperial、Kofa、Levante、Matt、Mead、Mexicali75、Minos、Modoc、Mohawk、Nudura、Ocotillo、Produra、Reva、Ria、Septre、Sky、Tacna、Titan、Trump、Ward、Westbred 803、Westbred 881、Westbred 883、Westbred 1000D、Westbred Laker、Westbred Turbo和Yavaros 79。

在另一个实施方式中，软白春麦包括但不限于Alpowa、Alturas、Babe、Diva、JD、New Dirkwin、Nick、Twin,Whit、Blanca、Bliss、Calorwa、Centennial、Challis、Dirkwin、Eden、Edwall、Fielder、Fieldwin、Jubilee、Louise、Owens、Penawawa、Pomerelle、Sterling、Sunstar Promise、Super Dirkwin、Treasure、UI Cataldo、UI Pettit、Urquie、Vanna、Waduel、Waduel 94、Wakanz、Walladay、Wawawai、Whitebird和Zak。

在再一个实施方式中，软白冬麦包括但不限于AP Badger、AP Legacy、Brundage96、Bruneau、Cara、Goetze、Legion、Mary、Skiles、Stephens、SY Ovation、Tubbs、WB-Junction、WB-528、Xerpha、Yamhill、Barbee、Basin、Bitterroot、Bruehl、Castan、Chukar、Coda、Daws、Edwin、Eltan、Faro、Finch、Foote、Gene、Hill 81、Hiller、Hubbard、Hyak、Hyslop、Idaho 587、Kmor、Lambert、Lewjain、MacVicar、Madsen、Malcolm、Masami、McDermid、Moro、Nugaines、ORCF-101、ORCF-102、ORCF-103、Rod、Rohde、Rulo、Simon、Salute、Temple、Tres、Tubbs 06、UICF-Brundage、WB-523和Weatherford。

在另一个实施方式中，硬红冬麦包括但不限于Andrews、Archer、Batum、Blizzard、Bonneville、Boundary、Declo、Deloris、Finley、Garland、Hatton、Hoff、Longhorn、Manning、Meridian、Promontory、Vona、Wanser、Winridge。

在另一个实施方式中，普通小麦(六倍体，免脱粒)，Triticum aestivum sspaestivum包括但不限于Sonora、Wit Wolkoring、Chiddam Blanc De Mars、India-Jammu、Foisy。

在又一个实施方式中，斯卑尔脱小麦(六倍体，非免脱粒)，Triticum aestivumssp spelta包括但不限于西班牙斯卑尔脱小麦、瑞士斯卑尔脱小麦。

在又一个实施方式中，二粒小麦(四倍体)，Triticum turgidum ssp.dicoccum包括但不限于Ethiopian Blue Tinge。

在另一个实施方式中，面食小麦(四倍体，免脱粒)，Triticum turgidum sspdurum包括但不限于Blue Beard、Durum-Iraq。

在再一个实施方式中，圆锥小麦(四倍体，免脱粒)，Triticum turgidum sspturgidum包括但不限于Akmolinka、Maparcha。

在一个实施方式中，具有至少一种与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8具有相当大的百分比同一性的WPBF基因的小麦栽培变种可以与本文公开的方法和组合物一起使用。

如本文所用，关于所述小麦栽培变种，“相当大的百分比同一性”是指该基因的DNA序列在核苷酸水平与SEQ ID NO:1、2、4、5、7和8充分相似以编码大体上相似的蛋白质，允许栽培变种间的等位基因差异(或交替的mRNA剪接)。根据本发明的一个实施方式，当WPBF基因与SEQ ID NO:1、2、4、5、7和8之间编码区中的百分比同一性低至约85％时，可能存在“相当大的百分比同一性”，条件是该基因的保守区域的百分比同一性较高(例如至少约90％)。优选地，编码区的百分比同一性是85-90％，更优选90-95％，并且最佳地，是95％以上。因此，在不偏离本发明的范围和意图的情况下，本领域技术人员可能更愿意使用具有商业普及性的小麦栽培变种或者具有其中创建WPBF突变的小麦植株的特定期望特征的小麦栽培变种。或者，本领域技术人员可能愿意利用具有少数多态性的小麦栽培变种，如自交栽培变种，以便于筛选根据本发明的在一种或多种WPBF基因内的突变。

VI.用于识别WPBF突变的代表性方法

本领域的普通技术人员将会理解，许多技术和方法可用于产生突变和/或非转基因突变。下面介绍一种代表性的方法。

为了创建和识别本文公开的WPBF突变和小麦植株，使用了称为TILLING的方法。请参见McCallum等人，Nature Biotechnology 18:455-457,2000；McCallum等人，PlantPhysiology，123:439-442,2000；美国公开号20040053236；和美国专利号5,994,075，所有这些文献在此通过引用并入本文。在基本的TILLING方法中，植物材料(如种子)受到化学诱变，这在种子细胞的基因组内产生一系列突变。经诱变的种子长成成熟M1植株并自花授粉。合并得到的M2植株的DNA样品，然后筛选目的基因中的突变。一旦在目的基因中识别到突变，则使携带该突变的M2植株的种子生长成成熟的M3植株，并筛选与目的基因中的该突变相关的表型特征。

在一个实施方式中，使用了四倍体栽培变种Kronos。在其他实施方式中，使用了六倍体栽培变种Express。

在一个实施方式中，诱变来自小麦的种子，然后使其生长成M1植株。然后使M1植株自花授粉，并使M1植株的种子生长成M2植株，然后筛选在其WPBF基因座中的突变。虽然根据本发明的可选实施方式，可对M1植株筛选突变，但是筛选M2植株的一个优点是所有的体细胞突变都对应于种系突变。

本领域技术人员将理解，可以诱变各种小麦植株材料，包括但不限于种子、花粉、植物组织或植物细胞，以便产生本文公开的WPBF突变的小麦植株。然而，当筛选植物DNA的突变时，诱变的植物材料的类型可能有所影响。例如，当在未诱变的植株授粉之前对花粉诱变时，授粉产生的种子生长成M1植株。M1植株的每个细胞都将含有在该花粉中产生的突变，因此然后可以筛选这些M1植株的WPBF突变，而不是等到M2代。

可以使用主要产生点突变和短缺失(约1至约30个核苷酸)、插入、颠换和/或转换的诱变剂(例如化学诱变剂或辐射，如x射线和快中子)来产生突变。符合本发明方法的诱变剂包括但不限于甲磺酸乙酯(EMS)、甲基磺酸甲酯(MMS)、N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)、三乙基三聚氰胺(TEM)、N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)、甲苄肼、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、硫酸二乙酯、丙烯酰胺单体、美法仑、氮芥、长春新碱、二甲基亚硝胺、N-甲基-N'-硝基-亚硝基胍(MNNG)、亚硝基胍、2-氨基嘌呤、7,12-二甲基-苯并[a]蒽(DMBA)、环氧乙烷、六甲基磷酰胺、白消安(bisulfan)、双环氧烷类(二环氧辛烷(DEO)、二环氧丁烷(DEB)等)、2-甲氧基-6-氯-9-[3-(乙基-2-氯-乙基)氨基丙基氨基]吖啶二盐酸盐(ICR-170)、叠氮化钠和甲醛。还可以识别WPBF基因中可能不是直接由所述诱变剂引起的自发突变。

现在已知或以后设计的任何合适的植物DNA制备方法可用于制备用于WPBF突变筛选的小麦植株DNA。例如，请参见Chen&Ronald，Plant Molecular Biology Reporter 17:53-57,1999；Stewart和Via，Bio Techniques 14:748-749,1993。另外，可用的有为此目的设计的几种商用试剂盒，包括来自Qiagen(Valencia，CA)和Qbiogene(Carlsbad，CA)的试剂盒。

在一个实施方式中，合并来自个体小麦植株的制备的DNA以便加快筛选源自诱变的植物组织的全部植株种群的一种或多种WPBF基因中的突变。合并组的大小可能取决于所用筛选方法的灵敏度。优选地，合并两个或更多个个体小麦植株的组。

在另一个实施方式中，在合并DNA样品之后，将合并物进行WPBF序列特异性扩增技术处理，例如聚合酶链式反应(PCR)。关于PCR的概述，请参见PCR实验方案：方法和应用指南(PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications)(Innis、Gelfand、Sninsky和White编著)，Academic Press，San Diego，1990。

对于WPBF位点或紧邻这些位点之一的序列特异的任何引物都可用于扩增合并的DNA样品中的WPBF序列。优选地，所述引物被设计成扩增最有可能出现有用突变的WPBF位点的区域。最优选地，所述引物被设计成检测一种或多种WPBF基因的外显子区域。此外，优选使所述引物靶向已知多态性位点以设计基因组特异性引物，以便容易地筛选在特定基因组中的点突变。为了便于在凝胶上检测PCR产物，可以使用任何常规或以后设计的标记方法来标记PCR引物。

在一个实施方式中，基于WPBF基因(SEQ ID NO:1、2、4、5、7和8)来设计引物。在另一个实施方式中，引物可以设计为WPBF基因的5'或3'端。

在另一个实施方式中，可以使用识别野生型和突变体序列之间的核苷酸差异的任何方法筛选PCR扩增产物的WPBF突变。这些方法可以包括，但不限于，例如测序、变性高压液相色谱(dHPLC)、恒定变性剂毛细管电泳(CDCE)、温度梯度毛细管电泳(TGCE)(请参见Li等人，Electrophoresis 23(10):1499-1511，2002)，或通过使用如在由Colbert等人，PlantPhysiology 126:480-484，2001描述的高通量方法中所使用的酶促裂解的片段化。优选地，用优先切割野生型和突变序列之间的杂交双链中的错配的核酸内切酶孵育所述PCR扩增产物。

在另一个实施方式中，使用自动测序凝胶设备对裂解产物进行电泳，并借助于标准商业图像处理程序分析凝胶图像。

在又一个实施方式中，一旦识别出具有突变的WPBF基因序列的M2植株，就分析这些突变以确定它们对WPBF酶的表达、翻译和/或活性的影响。在一个实施方式中，使用标准测序技术对含有该突变的PCR片段进行测序，以确定该突变相对于整个WPBF序列的确切位置。使用生物信息学工具(例如SIFT(Sorting Intolerant from Tolerant；Ng和Henikoff，Nucleic Acids Research 31:3812-3814)、PSSM(Position-Specific Scoring Matrix；Henikoff 和Henikoff，Computer Applications in the Biosciences 12:135-143,1996)和PARSESNP(Taylor和Greene，Nucleic Acids Research 31:3808-3811,2003))来评估每个突变以预测其对蛋白质功能的影响(即从完全耐受到导致功能丧失)。例如，小于0.05的SIFT得分和PSSM得分的大的变化(例如，大约10以上)表示可能对蛋白质功能具有有害作用的突变。已知这些程序是预测性的，本领域技术人员可以理解预测的结果并不总是准确的。

在另一个实施方式中，如果M2植株中的突变的初步评估表明其具有有用性质并且在WPBF基因内的有用位置上，则可以对含有该突变的小麦植株进行进一步进行表型分析。在六倍体小麦中，在A、B和D基因组的每一个中的突变通常必须结合，然后才能检测到表型。在四倍体小麦中，A和B基因组突变相结合。另外，为了消除背景突变，含有所述突变的植物可以在任何一代回交或异型杂交两次或更多次。然后，回交或异型杂交的植物可以自花授粉或杂交，以产生WPBF突变的纯合植株。

评价这些纯合WPBF突变体植物的若干物理特性，以确定该突变是否导致小麦植株中有用的表型变化，而不会导致不期望的负面影响，例如显著降低的种子产量。

VII.生产小麦植株的方法

在另一个实施方式中，本公开涉及生产具有谷蛋白减少的谷粒的小麦植株的方法。在另一个实施方式中，本公开涉及生产高分子量麦谷蛋白增加的小麦植株的方法。在另一个实施方式中，本公开涉及生产低分子量麦谷蛋白减少的植株的方法。在另一个实施方式中，本公开涉及生产麦醇溶蛋白减少的植株的方法。在又一个实施方式中，本公开涉及生产相对于野生型植株低分子量麦谷蛋白减少及高分子麦谷蛋白水平与野生型植株相当的植株的方法。

在另一个实施方式中，本公开涉及使WPBF基因突变与野生型植株异型杂交的方法。

在又一个实施方式中，本公开涉及生产与野生型小麦植株相比具有活性降低的一种或多种WPBF蛋白的植株的方法。

在一个实施方式中，所述方法包括在来自亲本植株的植物材料或植物部分中的WPBF基因的至少一个拷贝中诱导至少一种非转基因突变；使诱变的植物材料生长或使用诱变的植物材料来产生后代植株；分析诱变的植物材料和/或后代植株以检测WPBF基因的至少一个拷贝中的至少一种突变；以及选择在WPBF基因的至少一个拷贝中具有至少一种突变的后代植株。

在另一个实施方式中，所述方法进一步包括使在WPBF基因的至少一个拷贝中具有至少一种突变的后代植株与在WPBF基因的不同拷贝中具有至少一种突变的其他后代植株杂交。可以重复进行识别具有突变的后代植株并使所述后代植株与具有突变的其他后代植株杂交的过程，以产生具有降低的WPBF活性的后代小麦植株。

在另一个实施方式中，小麦植株中WPBF蛋白的活性水平降低至野生型植株中WPBF蛋白活性水平的0-2％，2-5％，5-7％，7-10％，10-15％，15-20％，20-25％，25-30％，30-35％，35-40％，40-45％，45-50％，50-60％，60-70％，70-80％，80-90％，90-95％或95-99％。

A.生产在多于一个基因组中WPBF基因中具有一个或多个突变的植株的方法

在又一个实施方式中，本公开涉及生产植株的方法，所述方法包括以下：在来自亲本植株的植物材料中的WPBF基因的至少一个拷贝中诱导至少一种非转基因突变，所述亲本植株在WPBF基因中包含突变；使诱变的植物材料生长或使用诱变的植物材料来产生后代植株；以及选择在WPBF基因的至少两个拷贝中具有至少一种突变的后代小麦植株。例如，所述亲本植株可以在D基因组的WPBF基因中具有突变。所选择的后代植株可以在D基因组的WPBF基因中具有突变并且在B基因组的WPBF基因中具有一个或多个突变。提供这个实例仅仅是为了澄清，而不应该限制本文公开的方法。

在又一个实施方式中，本发明涉及生产植株的方法，所述方法包括：在来自亲本植株的植物材料中的WPBF基因的至少一个拷贝中诱导至少一种非转基因突变，所述亲本植物在两个WPBF基因中包含至少一种突变；使诱变的植物材料生长或使用诱变的植物材料来产生后代植株；以及选择在WPBF基因的三个拷贝中具有至少一种突变的后代植株。在这个实施方式中，在A、B和D基因组的WPBF基因中将存在至少一种突变。

在另一个实施方式中，本公开涉及生产小麦植株的方法，所述方法包括：使在第一WPBF基因中具有至少一种非转基因突变的第一植株与在第二WPBF基因中具有至少一种非转基因突变的第二植株杂交；以及选择在WPBF基因的至少两个拷贝中具有至少一种突变的后代植株。

在另一个实施方式中，本公开涉及生产植株的方法，所述方法包括：使在第一和第二WPBF基因中具有至少一种非转基因突变的第一植株与在第三WPBF基因中具有至少一种非转基因突变的第二植株杂交；以及选择在WPBF基因的全部三个拷贝中具有至少一种突变的后代植株。在这个实施方式中，在A、B和D基因组的WPBF基因中将存在至少一种突变。

VIII.小麦植株、小麦种子及小麦植株的部分

在一个实施方式中，根据本文公开的方法生产具有谷蛋白减少的谷粒的小麦植株。在一个实施方式中，根据本文公开的方法生产低分子量麦谷蛋白减少的小麦植株。在一个实施方式中，根据本文公开的方法生产麦醇溶蛋白减少的小麦植株。在又一个实施方式中，根据本文公开的方法生产高分子量麦谷蛋白增加或未改变的小麦植株。

在另一个实施方式中，所述小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分在WPBF基因或修饰的WPBF基因中具有一个或多个突变。在另一个实施方式中，所述小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分在WPBF基因中具有一个或多个突变。

在另一个实施方式中，本公开涉及在WPBF基因中包含一个或多个非转基因突变的小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分。在另一个实施方式中，本公开涉及在两个基因组的每一个中的WPBF基因中包含至少一种非转基因突变的小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分。在又一个实施方式中，本公开涉及在三个基因组的每一个中的WPBF基因中包含至少一种非转基因突变的小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分。

在一个实施方式中，所述小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分在A基因组中的WPBF基因的两个等位基因中包含一个或多个非转基因突变。在另一个实施方式中，所述非转基因突变在A基因组的WPBF基因的两个等位基因中是相同的。

在一个实施方式中，所述小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分在B基因组中的WPBF基因的两个等位基因中包含一个或多个非转基因突变。在另一个实施方式中，所述非转基因突变在B基因组的WPBF基因的两个等位基因中是相同的。

在一个实施方式中，所述小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分在D基因组中的WPBF基因的两个等位基因中包含一个或多个非转基因突变。在另一个实施方式中，所述非转基因突变在D基因组的WPBF基因的两个等位基因中是相同的。

在另一个实施方式中，所述小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分包含具有表1中列出的一个或多个非转基因突变的多核苷酸，并与SEQ ID NO:2具有85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或大于99％的同一性或相似性。

在又一个实施方式中，所述小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分包含编码WPBF蛋白并具有表1中列出的一个或多个非转基因突变的多核苷酸，其中所述WPBF蛋白包含一个或多个非转基因突变，并与SEQ ID NO:3具有85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或大于99％的同一性或相似性。

在另一个实施方式中，所述小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分包含具有一个或多个非转基因突变的多核苷酸，并与SEQ ID NO:5具有85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或大于99％的同一性或相似性。

在又一个实施方式中，所述小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分包含编码WPBF蛋白并具有一个或多个非转基因突变的多核苷酸，其中所述WPBF蛋白包含一个或多个非转基因突变，并与SEQ ID NO:6具有85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或大于99％的同一性或相似性。

在另一个实施方式中，所述小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分包含具有一个或多个非转基因突变的多核苷酸，并与SEQ ID NO:8具有85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或大于99％的同一性或相似性。

在又一个实施方式中，所述小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分包含编码WPBF蛋白并具有一个或多个非转基因突变的多核苷酸，其中所述WPBF蛋白包含一个或多个非转基因突变，并与SEQ ID NO:9具有85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或大于99％的同一性或相似性。

在另一个实施方式中，所述小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分在WPBF基因中具有一个或多个突变，包括但不限于表1-3中列举的一个或多个突变和同源染色体中的相应突变。可以产生具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、或多于25个的本文公开的突变的小麦植株、小麦种子或小麦植株的部分，包括但不限于表1-3中公开的突变以及相应同源染色体中的突变。

IX.谷粒、面粉和淀粉

在另一个实施方式中，本公开涉及在WPBF基因或修饰的WPBF基因中包含一个或多个非转基因突变的小麦谷粒、面粉或淀粉。在另一个实施方式中，本公开涉及包含胚的小麦谷粒，其中所述胚在WPBF基因或修饰的WPBF基因中包含一个或多个非转基因突变。

在另一个实施方式中，所述小麦谷粒、面粉或淀粉在WPBF基因中包含一个或多个非转基因突变，包括但不限于表1-3中提到的突变以及同系物和同源染色体中的对应突变。

在又一个实施方式中，本公开涉及在一个、两个或三个基因组中的WPBF基因中包含至少一种非转基因突变的小麦谷粒或面粉。

在又一个实施方式中，本公开涉及在A基因组的WPBF基因中包含一个或多个非转基因突变的小麦谷粒、面粉或淀粉。在另一个实施方式中，所述非转基因突变在A基因组的WPBF基因的两个等位基因中是相同的。

在一个实施方式中，所述小麦谷粒、面粉或淀粉在B基因组中的WPBF基因的两个等位基因中包含一个或多个非转基因突变。在另一个实施方式中，所述非转基因突变在B基因组的WPBF基因的两个等位基因中是相同的。

在一个实施方式中，所述小麦谷粒、面粉或淀粉在D基因组中的WPBF基因的两个等位基因中包含一个或多个非转基因突变。在另一个实施方式中，所述非转基因突变在D基因组的WPBF基因的两个等位基因中是相同的。

在一个实施方式中，本公开涉及包含在A基因组中的WPBF基因具有表1中列出的一个或多个非转基因突变并且对应于SEQ ID NO：2的多核苷酸的小麦谷粒、小麦粉或淀粉。在另一个实施方式中，所述小麦谷粒或小麦粉包含具有表1中列出的一个或多个非转基因突变的多核苷酸，并且与SEQ IDNO:2具有85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或大于99％的同一性或相似性。

在又一个实施方式中，小麦谷粒、小麦粉或淀粉包含编码WPBF蛋白的具有表1中列出的一个或多个非转基因突变的多核苷酸，其中所述WPBF蛋白包含一个或多个非转基因突变，并且与SEQ ID NO:3具有85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或大于99％的同一性或相似性。

在一个实施方式中，本公开涉及小麦谷粒、小麦粉或淀粉，其包含在B基因组的WPBF基因中具有表2中列出的一个或多个非转基因突变并且对应于SEQ ID NO:5的多核苷酸。在另一个实施方式中，所述小麦谷粒或小麦粉包含具有表2中列出的一个或多个非转基因突变的多核苷酸，并且与SEQ IDNO:5具有85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或大于99％的同一性或相似性。

在又一个实施方式中，小麦谷粒、小麦粉或淀粉包含编码WPBF蛋白的具有表2中列出的一个或多个非转基因突变的多核苷酸，其中所述WPBF蛋白包含一个或多个非转基因突变，并且与SEQ ID NO:6具有85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或大于99％的同一性或相似性。

在一个实施方式中，本公开涉及小麦谷粒、小麦粉或淀粉，其包含在D基因组的WPBF基因中具有表3中列出的一个或多个非转基因突变并且对应于SEQ ID NO:8的多核苷酸。在另一个实施方式中，所述小麦谷粒或小麦粉包含具有表3中列出的一个或多个非转基因突变的多核苷酸，并且与SEQ IDNO:8具有85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或大于99％的同一性或相似性。

在又一个实施方式中，小麦谷粒、小麦粉或淀粉包含编码WPBF蛋白的具有表3中列出的一个或多个非转基因突变的多核苷酸，其中所述WPBF蛋白包含一个或多个非转基因突变，并且与SEQ ID NO:9具有85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或大于99％的同一性或相似性。

在又一个实施方式中，本公开涉及包含胚乳的小麦谷粒或面粉，以及与野生型小麦谷粒或面粉相比，WPBF基因的基因表达水平、活性或表达水平和活性降低。

在又一个实施方式中，本公开涉及在WPBF基因或修饰的WPBF基因中具有一个或多个突变的小麦谷粒或面粉，所述小麦谷粒或面粉与野生型小麦谷粒或面粉相比显示出谷蛋白减少的谷粒。在另一个实施方式中，与野生型谷粒或面粉相比，在WPBF基因或修饰的WPBF基因中具有一个或多个突变的小麦谷粒或面粉显示出1-5％，5-10％，10-15％，15-20％，20-25％，25-30％，30-35％，35-40％，45-50％，50-55％，55-60％，60-65％，65-70％，70-75％，75-80％，80-85％，85-90％，90-95％和大于95％减少的谷蛋白。

在另一个实施方式中，与野生型谷粒相比，在WPBF基因或修饰的WPBF基因中具有一个或多个突变的小麦谷粒或面粉显示出降低水平的谷蛋白，其中与野生型谷粒相比，具有突变或修饰的谷粒具有少约80％，或约70％，或约60％，或约50％，或约40％，或约30％，或约20％，或约10％，或约5％或约3％的谷蛋白。

在另一个实施方式中，与野生型谷粒或面粉相比，所述小麦谷粒或面粉包含少约5％至约15％，或约15％至25％，或约25％至45％，或约45％至约65％，或约65％至约85％，或约85％至97％的谷蛋白。

在另一个实施方式中，与野生型谷粒或面粉相比，所述小麦谷粒或面粉包含约80％以下，约70％以下，约60％以下，约50％以下，约40％以下，约30％以下，约25％以下，约20％以下，约15％以下，约10％以下，约7.5％以下，约5％以下，或约2.5％以下，或约1％以下，或约0.5％以下水平的低分子量麦谷蛋白水平。

在另一个实施方式中，与野生型谷粒或面粉相比，所述小麦谷粒或面粉包含少约5％至约15％，或约15％至25％，或约25％至45％，或约45％至约65％，或约65％至约85％，或约85％至97％的麦醇溶蛋白。

在一个实施方式中，本文公开的谷粒可以包含比野生型谷粒大的胚。在一个实施方式中，本文公开的谷粒可以包含比野生型谷粒的胚大1-5％，或5-10％，或10-15％，或15-20％，或20-25％，或25-50％，或50-75％，或75-95％的胚。

在一个实施方式中，本文公开的谷粒可以包含尺寸比野生型谷粒的胚大至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％以及至少90％的胚。

在又一个实施方式中，与野生型谷粒相比，本文公开的谷粒可含有更多的脂质。在一个实施方式中，本文公开的谷粒可以包含比野生型谷粒多1-5％，或5-10％，或10-15％，或15-20％，或20-25％，或25-50％，或50-75％或75-95％的脂质。

在一个实施方式中，本文公开的谷粒可以包含比野生型谷粒多至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％和至少90％的脂质。

在又一个实施方式中，与野生型谷粒相比，本文公开的谷粒可以包含更多的游离赖氨酸或掺入蛋白质中的赖氨酸。与相应的野生型谷粒相比，这可以导致这些谷粒向包括人在内的单胃动物提供更高水平的必需氨基酸赖氨酸。

在一个实施方式中，本文公开的谷粒可以含有比野生型谷粒多1-5％，或5-10％，或10-15％，或15-20％，或20-25％，或25-50％，或50-75％，或75-95％的游离赖氨酸。

在一个实施方式中，本文公开的谷粒可含有比野生型谷粒多至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％和至少90％的游离赖氨酸。

在又一个实施方式中，与野生型谷粒相比，本文公开的谷粒可以含有更多的掺入蛋白质中的赖氨酸。在一个实施方式中，本文公开的谷粒可以含有比野生型谷粒多1-5％，或5-10％，或10-15％，或15-20％，或20-25％，或25-50％，或50-75％，或75-95％的掺入蛋白质中的赖氨酸。

在一个实施方式中，本文公开的谷粒可含有比野生型谷粒多至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％和至少90％的掺入蛋白质中的赖氨酸。

在一个实施方式中，与野生型谷粒相比，本文公开的谷粒可含有更少的淀粉。在一个实施方式中，本文公开的谷粒可以含有比野生型谷粒少1-5％，5-10％，10-15％，15-20％，20-25％的淀粉。

在一个实施方式中，与野生型谷粒相比，本文公开的谷粒可具有更小的胚乳。在一个实施方式中，所公开的谷粒可以具有比野生型谷粒的胚乳小1-5％，5-10％，10-15％，15-20％，20-25％的胚乳。

在另一个实施方式中，由谷粒产生的小麦或大麦谷粒或面粉的腹腔毒性少于由相应的野生型小麦或大麦植株的谷粒产生的面粉的约50％，小于由相应的野生型小麦或大麦植株的谷粒产生的面粉的约25％，小于由相应的野生型小麦或大麦植株的谷粒产生的面粉的约10％。

X.食品

在一个实施方式中，本公开涉及由上述谷粒或面粉生产的面粉或其他产品。在另一个实施方式中，所述面粉、粗粒部分或纯化淀粉可以是食品的组分。

所述食品包括但不限于百吉饼(bagel)、饼干、面包、小圆面包(bun)、新月形面包(croissant)、饺子(dumpling)、英式松饼、松饼、皮塔面包(pita bread)、速发面包(quickbread)、扁面包、酵母面包、冷藏/冷冻面团产品(refrigerated/frozen doughproducts)、面团(dough)、烘豆(baked beans)、墨西哥玉米煎饼(burrito)、辣酱汤(chili)、玉米面豆卷(taco)、玉米粉蒸肉(tamale)、玉米粉圆饼(tortilla)、菜肉馅饼(potpie)、即食谷物(ready to eat cereal)、快餐食物(ready to eat meal)、馅(stuffing)、微波炉餐(microwaveable meal)、果仁巧克力小方块蛋糕(brownie)、蛋糕、乳酪蛋糕、咖啡蛋糕、曲奇饼、甜点、面粉糕饼(pastry)、小甜面包(sweet roll)、糖果棒(candy bar)、馅饼皮(pie crust)、馅饼馅(pie filling)、婴儿食品、烘焙粉(baking mix)、牛奶鸡蛋面糊(batter)、拌(面)粉(breading)、肉汁混合物(gravy mix)、肉剂(meat extender)、肉替代物(meatsubstitute)、调味粉(seasoning mix)、汤粉(soup mix)、肉汁(gravy)、乳酪面粉糊(roux)、色拉调料(salad dressing)、汤(soup)、酸奶油(sour cream)、面条、意大利面食(pasta)、拉面面条(ramen noodles)、炒面面条(chow mein noodles)、捞面面条(lo meinnoodles)、冰淇淋内含物(ice cream inclusion)、雪糕(ice cream bar)、冰淇淋蛋卷(icecream cone)，夹心冰淇淋(ice cream sandwich)、薄脆饼干(cracker)、油煎(或烤)碎面包片(crouton)、多纳圈(doughnut)、蛋卷(egg roll)、膨化小吃(extruded snack)、水果和谷物棒(fruit and grain bar)、微波炉零食产品(microwaveable snack product)、营养棒(nutritional bar)、薄烤饼(pancake)、半烘焙面包房产品(par-baked bakery product)、咸脆饼干(pretzel)、布丁、基于麦片的产品(granola-based product)、零食片(snackchip)、零食(snack food)、零食混合物(snack mix)、华夫饼干、比萨饼皮(pizza crust)、动物食品或宠物食品。

在一个实施方式中，所述面粉是全谷面粉(例如，超细研磨的全谷面粉，如超细研磨的全麦小麦粉)。在一个实施方式中，所述全谷面粉包括精制面粉成分(例如精制小麦粉或精制面粉)和粗粒部分(例如超细研磨的粗粒部分)。精制小麦粉可以是例如通过研磨和筛选(筛分)洁净小麦制备的面粉。为了包含在精制小麦粉的种类中，美国食品和药物管理局(FDA)要求面粉满足特定的粒度标准。所述精制小麦粉的粒径被描述为面粉，其中，不少于98％通过孔不大于以“212微米(U.S.Wire70)”命名的金属丝编织网的孔的编织物。

在另一个实施方式中，所述粗粒部分包含糠麸和胚芽中的至少一种。例如，所述胚芽是在麦仁中发现的胚体。所述胚芽包括脂质、纤维、维生素、蛋白质、矿物质和植物营养素，例如黄酮类化合物。所述糠麸可以包括几个细胞层，并具有显著量的脂质、纤维、维生素、蛋白质、矿物质和植物营养素，例如黄酮类化合物。

例如，本发明的粗粒部分或全谷面粉或精制面粉可以在焙烤食品、休闲食品和食品中以各种量使用以代替精制或全谷面粉。所述全谷面粉(即超细研磨全谷面粉)也可以直接销售给消费者用于他们的自制烘焙产品中。在一个示例性实施方式中，全谷面粉的颗粒分布是这样的，占全谷面粉重量的98％的颗粒小于212微米。

在另一个实施方式中，所述全谷面粉或粗粒部分或精制面粉可以是一种营养补充剂的成分。所述营养补充剂可以是加入到含有一种或多种成分(通常包括：维生素、矿物质、药草、氨基酸、酶、抗氧化剂、药草、香料、益生菌、提取物、益生元和纤维)的饮食中的产品。

在进一步的实施方式中，所述营养补充剂可以包括任何已知的将有助于个体的整体健康的营养成分，其实例包括但不限于维生素、矿物质、其它纤维成分、脂肪酸、抗氧化剂、氨基酸、肽、蛋白质、叶黄素、核糖、ω-3脂肪酸和/或其它营养成分。因为本发明的胚乳的高营养成分，可以给个体赋予许多益处，包括纤维和其他必需营养素的输送、提高的消化功能和健康状况、体重控制、血糖控制、心脏健康、糖尿病风险的降低、潜在的关节炎风险的降低以及个体的整体健康和保健。

在又一个实施方式中，所述全谷面粉或粗粒部分或精制面粉可以是膳食补充剂的成分。美国联邦法规(The Code of Federal Regulations)将膳食补充剂定义为一种产品，其旨在补充膳食并含有一种或多种膳食成分，包括：维生素、矿物质、药草、植物制剂、氨基酸、和其他物质或其组分；旨在作为药丸、胶囊、片剂或液体通过口服摄取；并且在前面板上用标签标明作为膳食补充剂。

在又一个实施方式中，所述全谷面粉或粗粒部分或精制面粉可以是纤维补充剂或其组分。所述纤维补充剂可以以下列形式递送，但不限于这些形式：速溶饮料混合物(instant beverage mixes)、即饮饮料(ready-to-drink beverages)、营养棒、华夫饼干、曲奇饼、薄脆饼干、凝胶注射剂(gel shots)、胶囊、咀嚼物、可咀嚼片剂和丸剂。一个实施方式以调味奶昔(flavored shake)或麦芽型饮料的形式递送所述纤维补充剂。

在另一个实施方式中，所述全谷面粉或粗粒部分或精制面粉可以以消化补充剂的成分被包括。所述全谷面粉或粗粒部分或精制面粉可以单独作为消化补充剂的成分或与一种或多种益生元化合物和/或益生菌微生物联合作为消化补充剂的成分。益生元化合物是不易消化的食物成分，可以通过选择性地刺激结肠中有限数目的微生物的生长和/或活性而有益地影响宿主。在本发明的范围内，益生元化合物的实例可以包括但不限于：寡糖和菊粉。

益生菌是当在足量提供时赋予宿主健康益处的微生物。益生菌微生物包括但不限于：乳酸杆菌(Lactobacillus)、双歧杆菌(Bifidobacteria)、埃希氏杆菌(Escherichia)、梭状芽胞杆菌(Clostridium)、乳球菌(Lactococcus)、链球菌(Streptococcus)、肠球菌(Enterococcus)和酵母菌(Saccharomyces)。

在又一个实施方式中，所述全谷面粉或粗粒部分或精制面粉可以以功能性食品的成分被包括。美国食品技术专家学会(The Institute of Food Technologists)将功能性食品定义为作为提供超出基本营养之外的健康益处的食品和食品成分。这包括传统食品、强化的、浓缩的或增强的食品和膳食补充剂。所述全谷面粉和粗粒部分或精制面粉包括许多维生素和矿物质，有很高的氧自由基吸收能力，富含纤维，使它们适合用于/作为功能性食品。

在另一个实施方式中，所述全谷面粉或粗粒部分或精制面粉可以在医疗食品中使用。医疗食品被定义为完全在医师的指导下配制以消费或提供的食品，该食品旨在用于疾病或状况的特殊饮食管理，针对所述疾病或状况，根据公认的科学原则，通过医学评估而建立独特的营养需求。所述全谷面粉和粗粒部分或精制面粉的养分含量和抗氧化能力使它们理想地适于在医疗食品中使用。

在又一个实施方式中，所述全谷面粉或粗粒部分或精制面粉也可以在药物中使用。所述全谷面粉和粗粒部分或精制面粉富含纤维且具有很细的颗粒使它们适于在药物中用作载体。

在再一个实施方式中，预期通过所述全谷面粉或粗粒部分是单一成分或许多营养成分的一种这样的输运机制来递送作为营养补充剂、膳食补充剂或消化补充剂的所述全谷面粉或粗粒部分或精制面粉。实例包括但不限于：速溶饮料混合物、即饮型饮料、营养棒、华夫饼干、曲奇饼、薄脆饼干、凝胶注射剂、胶囊和咀嚼物。

在又一个实施方式中，可以使用研磨方法来制造一种多小麦粉(multi-wheatflour)或者多谷粒粗粒部分(multi-grain coarse fraction)。在一个实施方式中，可以研磨来自一类小麦的糠麸和胚芽并与另一种小麦的研碎的胚乳或全谷小麦粉混合。可选择地，可以研磨一种类型的谷粒的糠麸和胚芽并与另一种谷粒的研碎的胚乳或全谷面粉混合。

在另一个实施方式中，来自第一种类型的小麦或谷粒的糠麸和胚芽可以与来自第二种类型的小麦或谷粒的糠麸和胚芽混合以产生多谷粒粗粒部分。可以预期的是，本发明包括混合一种或多种谷粒的糠麸、胚芽、胚乳和全谷面粉的一种或多种的任意组合。这种多谷粒、多麦的方法可以用来制作定制面粉以及充分利用多种类型的谷粒或小麦的品质和营养成分以制作一种面粉。

本发明的全谷面粉可以通过各种研磨方法来生产。一种示例性方法涉及在单一物料流中研磨谷粒而不是将所述谷粒的胚乳、糠麸和胚芽分离成单独的物料流。将清洁和润麦后的谷粒输送到第一通道粉碎机，例如锤磨机、辊磨机、针磨机、冲击式碾磨机、圆盘研磨机，空气碾磨机、凹口碾磨机等等。

研磨后，排出谷粒，并输送到筛分器。可以使用本领域已知的任何用于筛选研磨颗粒的筛分器。通过筛分器的筛网的材料是本发明的全谷面粉，无需进一步处理。在筛网中保留的材料被称为第二级分。所述第二级分需要额外的颗粒缩减。因此，可以将该第二级分输送到第二通道粉碎机。

研磨后，可以将第二级分输送到第二筛分器。通过第二筛分器的筛网的材料是所述的全谷面粉。在筛网中保留的材料被称为第四级分，需要进一步的处理以减小颗粒尺寸。通过反馈回路将所述第二筛分器的筛网上的第四级分输送回所述第一通道粉碎机或所述第二通道粉碎机进行进一步处理。

可以设想，本发明的所述全谷面粉、粗粒部分、纯化淀粉和/或谷粒产品可以通过本领域已知的多种研磨方法来生产。

XI.谷蛋白酶

在一个实施方式中，本文公开的小麦植株、小麦种子和小麦植株的部分可以与谷蛋白酶混合。

在又一个实施方式中，可以将本文公开的谷粒、面粉和淀粉与谷蛋白酶混合。在另一个实施方式中，本文公开的食品可以与谷蛋白酶混合。

在一个实施方式中，本公开涉及由上述谷粒或面粉和谷蛋白酶组成的面粉或其他产品。在另一个实施方式中，面粉(粗粒部分或纯化淀粉)和谷蛋白酶的组合物可以是食品的组分。

如本文所用，术语“谷蛋白酶”是指能够单独或与内源或外源添加的酶组合将小麦、大麦、燕麦和黑麦的谷蛋白蛋白质的有毒寡肽切割成无毒片段的酶。谷蛋白是谷类面团中的蛋白质部分，其可以被细分为麦谷蛋白和醇溶谷蛋白，该醇溶谷蛋白自小麦、黑麦、大麦和燕麦分别被细分为麦醇溶蛋白、黑麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白和燕麦蛋白。

在一个实施方式中，术语“谷蛋白酶”也可以指蛋白酶或肽酶。术语“蛋白酶”或“肽酶”描述具有裂解肽键能力的蛋白质或其片段，其中易裂解的肽键可以是寡肽或更大蛋白质的末端或内部。脯氨酰基特异性的肽酶是谷蛋白酶。

谷蛋白酶包括蛋白酶和肽酶酶类，其在氨基酸水平上与以下肽酶之一具有至少约20％的序列同一性，更通常至少约40％的序列同一性，优选至少约70％的序列同一性：来自脑膜炎脓杆菌(F.meningoscepticum)的脯氨酰内肽酶(PEP)(Genbank登录号D10980)、来自嗜水气单胞菌(A.hydrophila)的PEP(Genbank登录号D14005)、来自S.capisulata的PEP(Genbank登录号AB010298)、来自兔的DCP I(Genbank登录号X62551)、来自烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)的DPP IV(Genbank登录号U87950)或来自大麦(Hordeumvulgare)的半胱氨酸蛋白酶B(Genbank登录号JQ1110)。

在一个实施方式中，所述谷蛋白酶是PEP。PEP在微生物、植物和动物中产生。PEP属于丝氨酸蛋白酶超家族酶类，并具有由Ser、His和Asp残基组成的保守的催化三联体。这些同系物中的一些已被表征，例如来自脑膜炎脓杆菌、嗜水气单胞菌、点状气单胞菌(Aeromonas punctata)、Novosphingobium capsulatum、强烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)和来自哺乳动物源的酶是生物化学上表征的PEP。其他如念珠藻属(Nostoc)和拟南芥(Arabidopsis)酶可能是PEP，但迄今尚未完全表征。而其他的，如大肠杆菌和黄色粘球菌(M.xanthus)酶，可能不是PEP，而是丝氨酸蛋白酶超家族的同源成员，并且在蛋白质工程中可以是制备PEP的有用的起始材料。相对于脑膜炎脓杆菌酶，该酶家族的成对序列同一性在30-60％范围内。因此，PEP包括与脑膜炎脓杆菌酶具有>30％同一性的酶(如在火球菌属酶中)，或与脑膜炎脓杆菌酶具有>40％同一性的酶(如在Novosphingobium酶中)，或与脑膜炎脓杆菌酶具有>50％同一性的酶(如在气单胞菌属酶中)。

在一个实施方式中，谷蛋白酶包括具有至少2.5U/mg，优选25U/mg，更优选250U/mg的比活性的肽酶或蛋白酶，用于切割包含多个以下基序之一的肽：Gly-Pro-pNA、Z-Gly-Pro-pNA(其中Z为苄氧基羰基)和Hip-His-Leu，其中“Hip”为马尿酸，pNA为对硝基苯胺，1U是每分钟催化1微摩尔底物转化所需的酶的量。

在一个实施方式中，所述谷蛋白酶是Kuma030，其是如Journal of the AmericanChemical Society，137:13106-13113,2015中所述的快速降解免疫原性麦醇溶蛋白肽的麦醇溶蛋白肽酶。在另一个实施方式中，所述谷蛋白酶是KumaMax(Kuma010)。

在又一个实施方式中，可用于本文公开的组合物和方法的谷蛋白酶包括属于任何以下酶分类的酶：EC 3.4.21.26、EC 3.4.14.5或EC 3.4.15.1。

在一个实施方式中，可以以本领域已知的各种方式改变谷蛋白酶(例如天然存在的谷蛋白酶)的氨基酸序列以产生序列的靶向改变以及可用于本文公开的制剂和组合物中的另外的谷蛋白酶酶类。这样的变体通常将是功能上保留的变体，其序列通常与相应的天然或亲本蛋白质不同，但仍保留期望的生物学活性。

变体还包括保留酶活性的谷蛋白酶片段。可以使用本领域已知的各种方法来产生靶向改变，例如，与随机和靶向突变相结合的噬菌体展示，引入扫描突变等。变体可以与天然序列基本相似，即，相差至少一种氨基酸，并且可以相差至少两个但通常不超过约十个氨基酸(差异的数目取决于天然序列的大小)。序列改变可以是替换、插入或缺失。系统地引入丙氨酸或其他残基的扫描突变可用于确定关键氨基酸。保守性氨基酸替换通常包括以下组内的替换：(甘氨酸，丙氨酸)；(缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸)；(天冬氨酸，谷氨酸)；(天冬酰胺，谷氨酰胺)；(丝氨酸，苏氨酸)；(赖氨酸，精氨酸)；和(苯丙氨酸，酪氨酸)。

在另一个实施方式中，谷蛋白酶目标片段包括至少约20个连续氨基酸的片段，更通常至少约50个连续氨基酸的片段，并且可以包含100个以上的氨基酸的片段，直至完整蛋白质，并且可以进一步延伸包含额外的序列。在每种情况下，关键标准是片段是否保留消化带来口炎性腹泻症状的有毒寡肽的能力。

XII.植物育种

在另一个实施方式中，本公开涉及使用在WPBF基因中具有一个或多个非转基因突变的小麦植株和植物部分进行植物育种的方法。

一个这样的实施方式是使在WPBF基因中具有一个或多个非转基因突变的小麦品种与另一种小麦品种杂交而形成第一代群体的F1植株的方法。用这种方法生产的第一代F1植株的群体也是本发明的一个实施方式。这种第一代群体的F1植株将包含在WPBF基因中具有一个或多个非转基因突变的小麦品种的基本上全套的等位基因。本领域的普通技术人员可以利用育种书籍或分子方法来识别使用在WPBF基因中具有一个或多个非转基因突变的小麦品种生产的特定F1植株，并且任何这样的个体植株也包含在本发明中。这些实施方式还包括使用在WPBF基因中具有一个或多个非转基因突变的小麦品种的转基因或回交转换以产生第一代F1植株。

在另一个实施方式中，本公开涉及一种开发后代小麦植株的方法。开发后代小麦植株的方法包括将在WPBF基因中具有一个或多个非转基因突变的小麦品种与第二小麦植株杂交和进行育种方法。用于生产源自在WPBF基因中具有一个或多个非转基因突变的小麦品种的种系的具体方法如下。

本领域的普通技术人员将在WPBF基因中具有一个或多个非转基因突变的小麦品种与另一种小麦品种(例如优良品种)杂交。源自该杂交的F1种子将生长形成同质群体。所述F1种子将包含来自在WPBF基因中具有一个或多个非转基因突变的小麦品种的一组等位基因和来自另一种小麦品种的一组等位基因。

所述F1基因组将由50％的在WPBF基因中具有一个或多个非转基因突变的小麦品种和50％的其他优良品种组成。所述F1种子会生长形成F2种子。可以使F1种子自我培育，或与另一种小麦栽培变种一起培育。

平均而言，所述F2种子将从在WPBF基因中具有一个或多个非转基因突变的小麦品种得到其等位基因的50％并从其他小麦品种得到50％，但是来自该群体的各种个体植株会具有大得多百分比的源自在WPBF基因中具有一个或多个非转基因突变的小麦品种的它们的等位基因(Wang J.和R.Bernardo，2000，Crop Sci.40:659-665，以及Bernardo,R.和A.L.Kahler，2001，Theor.Appl.Genet.102:986-992)。

使所述F2种子生长，并根据性状的目视观察和/或测量和/或标记辅助选择来进行植株的选择。将选择表现出基因衍生的性状的由在WPBF基因中具有一个或多个非转基因突变的小麦品种衍生的后代，并将分别收割每个植株。将来自各个植株的F3种子种植在不同行并让其自交。然后将所选的行或这些行的植株单独收割和脱粒。该选择仍将基于对植株期望性状的目视观察和/或测量，例如由在WPBF基因中具有一个或多个非转基因突变的一种或多种期望的小麦品种衍生的性状。

种植和选择的过程将重复任意次，直到获得由在WPBF基因中具有一个或多个非转基因突变的纯合小麦品种衍生的小麦植株。由在WPBF基因中具有一个或多个非转基因突变的纯合小麦品种衍生的小麦植株将包含由在WPBF基因中具有一个或多个非转基因突变的小麦品种衍生的期望的性状，其中一些性状可能还没有被与在WPBF基因中具有一个或多个非转基因突变的小麦品种杂交的其他原始小麦品种表达过，并且其中一些性状可能已经被两种小麦品种表达了，但现在的表达水平等于或大于在WPBF基因中具有一个或多个非转基因突变的小麦品种中的表达水平。

可以重复杂交、自交和选择的育种过程以产生由在WPBF基因中具有一个或多个非转基因突变的小麦品种衍生的小麦植株的另一群体，其中，平均来说，其基因的25％源于在WPBF基因中具有一个或多个非转基因突变的小麦品种，但是来自该群体的各个个别植株将具有更大百分比的源于在WPBF基因中具有一个或多个非转基因突变的小麦品种的它们的等位基因。本发明的另一个实施方式是由在WPBF基因中具有一个或多个非转基因突变的纯合小麦品种衍生的小麦植株，该小麦植株已经与在WPBF基因中具有一个或多个非转基因突变衍生的性状的另一种小麦植株杂交。

A.作为标记的突变

遗传标记是由基因或遗传基因座的等位基因形式确定的生物学特征，可以从一代传到另一代，因此可以用作实验探针或标签来跟踪个体、植物、组织、细胞、细胞核、染色体或基因。用于遗传学和植物育种的遗传标记可以分为两类：经典标记和DNA标记。经典标记包括形态学标记、细胞学标记和生物化学标记。基于不同的多态性检测技术或方法(DNA印迹-核酸杂交、PCR和DNA测序)，DNA标记已经发展成许多体系，如限制性片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、简单重复序列(SSR)、单核苷酸多态性(SNP)等。

SNP提供了分子标记的最终/最简单形式，因为单个核苷酸碱基是最小的遗传单位，因此它们可以提供最大数量的标记。SNP在动物和植物中非常常见。通常，在植物中SNP频率为每100-300个碱基对一个SNP的范围内。SNP可以在不同染色体区域中以不同频率存在于基因的编码序列、基因的非编码区域或基因之间的基因间区域内。

SNP是共显性标记，通常与基因连锁并以多态性的最简单/最终形式存在，因此它们已经成为遗传学和育种中非常有吸引力和潜在的遗传标记。此外，SNP可以非常容易地自动化并被快速检测，高效地检测多态性。

在一个实施方式中，本公开涉及WPBF基因中的突变，其为单核苷酸多态性，可以用作植物育种中的标记。WPBF基因中的突变是起因性的，并且可以使用例如KASP探针来追踪它们的分离。

在另一个实施方式中，本公开的第II部分中识别的突变可以用作植物育种中的标记。在又一个实施方式中，表1-3中的一个或多个突变可以用作植物育种中的标记。

在一个实施方式中，可以使用包括但不限于SNP限制性片段长度多态性(RFLP)；CAPS；Axiom SNP阵列；iSelect阵列；TaqMan探针和KASP探针的技术追踪突变。在另一个实施方式中，可以使用下一代测序技术，包括但不限于454Life Sciences(Roche AppliedScience，Indianapolis，IN)；HiSeq(Illumina，San Diego，CA)；SOLiD和Ion Torrent(LifeTechnologies公司，Carlsbad，CA)。

基于PCR的KASP^TM基因分型检测是一种基于同源荧光(FRET)的检测方法，能够对已知SNP和InDel进行精确的双等位基因区分。基于PCR的KASP技术的一个关键特征是使用通用的FRET盒式报告系统，不需要昂贵的双标记探针。等位基因特异性正向引物各自具有专有的尾部序列，其对应于两个FRET盒中的一个：一个标记具有FAM染料而另一个具有HEX染料。通过两个等位基因特异性正向引物的竞争性结合实现双等位基因的区分。

XIII.大麦转录物MLOC_12852.2，Dof转录因子

大麦是在较冷的气候中广泛种植的用于食物、饮料和动物饲料生产的二倍体谷类。大麦种子蛋白根据其在水、盐溶液、含水酒精和碱性或酸性溶液中的溶解性分别分为白蛋白、球蛋白、醇溶谷蛋白(大麦醇溶蛋白)和谷蛋白(glutelin)。大麦中约有一半的种子贮藏蛋白在醇溶谷蛋白部分中发现。这些醇溶谷蛋白主要为储备的蛋白质，用作碳源、氮源或硫源，用于发芽后的生长和发育。大麦醇溶蛋白约占种子蛋白质的40％，尽管这取决于植物在生长期间的氮供应。

编码大麦醇溶谷蛋白的位点已被表征，主要是因为它们在啤酒生产中有助于大麦发芽质量和泡沫形成及雾度。大麦中有四类醇溶谷蛋白，分别由1H染色体上Hor2、Hor1、Hor3和Hor5基因座编码的B、C、D和γ-大麦醇溶蛋白。这些基因座编码从单一的醇溶谷蛋白(例如D大麦醇溶蛋白)到含有20-30个成员(例如B和C大麦醇溶蛋白)的蛋白质家族变化的蛋白质。B和C大麦醇溶蛋白相对更丰富，分别占总大麦醇溶蛋白的约70％和24％。D和γ-大麦醇溶蛋白代表次要组分，各占约2-4％。大麦醇溶蛋白的分子量从约35kDa到100kDa不等。没有大麦醇溶谷蛋白，它们与小麦α-麦醇溶蛋白有着接近的同源性，然而人们普遍认为大麦醇溶蛋白对腹腔有毒性。

B大麦醇溶蛋白是主要的蛋白质组分，其硫含量与C大麦醇溶蛋白不同。B大麦醇溶蛋白占总量的70-80％，C大麦醇溶蛋白占10-20％。A大麦醇溶蛋白通常不被认为是贮存组分，而D大麦醇溶蛋白与高分子量麦谷蛋白同源。与其他贮藏蛋白(如napin)不同，大麦醇溶蛋白与其他相关的谷类醇溶谷蛋白一起在合子胚本身中不表达；据认为它们在种子发育的中后期在淀粉质胚乳中专有地表达。

在美国，FDA对于“无谷蛋白”的定义要求产品仅由无谷蛋白原料制成，即，不含小麦、大麦或黑麦。食品法典允许在含有不超过20ppm谷蛋白(每千克或每升0.02g)的食品上的“无谷蛋白”标签，这也是“无谷蛋白”的欧洲标准。大多数的乳糜泻患者(coeliacs)可以耐受每天大约10毫克的谷蛋白而没有重大影响(Thompson，2001年)。

野生型大麦植株的例子包括但不限于Bomi、Sloop、Carlsberg II、K8或L1。

在另一个实施方式中，本公开涉及在大麦转录物MLOC_12852.2，Dof转录因子(下文的“大麦Dof转录因子”)中具有一个或多个非转基因突变的大麦植株。在另一个实施方式中，本公开涉及在大麦Dof转录因子基因中具有一个或多个非转基因突变的大麦植株，其中所述突变导致谷蛋白减少的谷粒。

在一个实施方式中，本公开涉及大麦Dof转录因子基因表达降低或大麦DoF转录因子蛋白活性降低的大麦植株。在一个实施方式中，降低大麦DoF转录因子基因或大麦Dof转录因子蛋白的表达可通过非转基因突变、转基因或基因组编辑来完成。

在一个实施方式中，本公开涉及通过非转基因突变、或转基因或基因组编辑修饰大麦DoF转录因子基因。第III部分和第IV部分描述的方法和技术同样适用于大麦植株。

在另一个实施方式中，本公开涉及与野生型植株中大麦醇溶蛋白总水平相比总大麦醇溶蛋白水平降低的大麦植株。在一个实施方式中，与野生型植株中的B、C或D大麦醇溶蛋白相比，所述大麦植株的B、C或D大麦醇溶蛋白中的至少一种减少。

在又一个实施方式中，本公开涉及大麦Dof转录因子基因中的一个或多个突变，所述一个或多个突变降低谷粒中B和/或C大麦醇溶蛋白的水平。在又一个实施方式中，本公开涉及在大麦Dof转录因子基因中具有一个或多个突变并具有野生型D大麦醇溶蛋白水平的大麦植株，所述一个或多个突变降低B和/或C大麦醇溶蛋白的水平。

在另一个实施方式中，当与对应的野生型大麦植株的谷粒相比时，所述谷粒包含约75％或更少，约50％或更少，约25％或更少，约20％或更少，约15％或更少，约10％或更少，约7.5％或更少，约5％或更少或约2.5％或更少的B、C和/或D大麦醇溶蛋白的水平或其任何组合。

在又一个实施方式中，当与野生型谷粒所产生的面粉相比，由所述谷粒产生的面粉包含小于约60％，或小于约50％，或小于约40％，或小于约30％，或小于约25％，或小于约20％，或小于约15％，或小于约10％，或小于约5％的大麦醇溶蛋白。

在另一个实施方式中，由所述谷粒产生的面粉的腹腔毒性小于由相应的野生型大麦植株的谷粒产生的面粉的毒性的约50％，小于约25％，更优选地，为其毒性的约10％以下。

在又一个实施方式中，由谷粒产生的麦芽包含少于约200ppm的大麦醇溶蛋白，少于约125ppm的大麦醇溶蛋白，更优选地，少于约75ppm的大麦醇溶蛋白。

在又一个实施方式中，本公开涉及大麦Dof转录因子基因中的一个或多个突变。在一个实施方式中，本公开涉及大麦Dof转录因子基因中的多个非转基因突变，包括但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和大于10个突变。

在一个实施方式中，本公开涉及大麦Dof转录因子基因的Dof区中的一个或多个突变。在另一个实施方式中，本公开涉及大麦Dof转录因子基因的Dof区中的一种或多种修饰，其中所述修饰包括但不限于突变、非转基因突变、转基因和通过基因组编辑的修饰。

在又一个实施方式中，本公开涉及在大麦Dof转录因子基因中具有一个或多个突变的大麦植株。在又一个实施方式中，本公开涉及在大麦Dof转录因子基因的Dof区中具有一个或多个突变的大麦植株。

在又一个实施方式中，本公开涉及具有修饰的大麦Dof转录因子基因的大麦植株。在又一个实施方式中，本公开涉及具有修饰的大麦Dof转录因子基因的大麦植株，其中所述修饰在Dof区中。

在一个实施方式中，本公开涉及大麦Dof转录因子的SEQ ID NO.12编码序列中的一个或多个突变。在一个实施方式中，所述突变是在SEQ ID NO.12的173位上腺嘌呤变为胸腺嘧啶的突变。

在又一个实施方式中，本公开涉及大麦Dof转录因子的SEQ ID NO.13的氨基酸中的一个或多个突变。SEQ ID NO.13中显示的337个氨基酸中的一个或多个可以突变。所述突变可以是严重的或保守的。

在一个实施方式中，所述突变是SEQ ID NO.13的58位处氨基酸Q至L的突变。

SEQ ID NO.12：大麦(Hordeum vulgare；Hv)DOF基因：

Atggaggaagtgttttcgtccaactccaagagcaaggccggtcagatggcgggagaggcggtggcggcggccgagaagaagtctcggccgaagccagagcagaaggtggagtgccctcggtgcaagtctggtaacaccaagttctgctactacaacaactacagcatgtcccagccgcgctacttctgcaaggcctgccgccgctactggacccatggtggctccctccgcaacgtccccatcggtggtggttgccgcaagcccaaacgcccggggacctctgacgcccacaagctcggcatggcctcctcatcggaacccacgggtgtcgtgcccccctcgaactgcacagggatgaactttgctaacgtcctcccgacgtttatgtctggtggctttgacattcaaagcagcctctccctgacaacttttgggtcatcatcctcatccaacccgacggggttgatgtcccccggtgggacgacttcatttctggatgtgctgagaggtggtgcaggagggcttcttgatggcagcctcggtccaaacaatggctactactatggtgggcatgccaatggatcaggcattgggatgttgatgactccgccaacggtatcgtttggcattccaagtccgatgcaacaacatggcggtctcgtggttggtggaaatggaataggtggcacaacttcttcaacatttcagggcaacgctggcgaggaaggagacgatggtacggggtccattatggggctccagtggcagccacatgttggtaatggtggcggtggtggtgttggattaggaggcgcgcatcatcttgggactgggaacaatgtgacgatgggcaacaacaacaataataacaaccagaacaacaataacggcggcggtgctggtgatgacgacgatggtgggtcatcgagggattgctactggatcaacaatggaggatcgaacccatggcagagcctcctcaacagcacctccctgatctcatacacacca

SEQ ID NO.13：SEQ ID NO.12的蛋白质序列

MEEVFSSNSKSKAGQMAGEAVAAAEKKSRPKPEQKVECPRCKSGNTKFCYYNNYSMSQPRYFCKACRRYWTHGGSLRNVPIGGGCRKPKR

PGTSDAHKLGMASSSEPTGVVPPSNCTGMNFANVLPTFMSGGFDIQSSLSLTTFGSSSSSNPTGLMSPGGTTSFLDVLRGGAGGLLDGSL

GPNNGYYYGGHANGSGIGMLMTPPTVSFGIPSPMQQHGGLVVGGNGIGGTTSSTFQGNAGEEGDDGTGSIMGLQWQPHVGNGGGGGVGLG

GAHHLGTGNNVTMGNNNNNNNQNNNNGGGAGDDDDGGSSRDCYWINNGGSNPWQSLLNSTSLISYTP

在一个实施方式中，在以下段落中以非限制性方式描述本文公开的植株、植物部分和组合物：

1.一种小麦植株，其在A、B或D基因组中的至少一者中的WPBF基因中包含突变，其中，与野生型植株的谷粒相比，所述突变有助于所述小麦植株的谷粒具有减少的谷蛋白。

2.一种小麦植株，其在A、B或D基因组中的至少一者中的WPBF基因的Dof区中包含突变，其中，与野生型植株的谷粒相比，所述突变有助于所述小麦植株的谷粒具有减少的谷蛋白。

3.一种植株，其在转录因子基因的Dof区中包含突变，其中与野生型植株的谷粒相比，所述突变有助于所述植株的谷粒具有减少的谷蛋白。

4.前述段落中任一段所述的小麦植株，其中WPBF基因中的所述突变在B和D基因组中。

5.前述段落中任一段所述的小麦植株，其中WPBF基因中的所述突变在A和B基因组中。

6.前述段落中任一段所述的小麦植株，其中WPBF基因中的所述突变在A和D基因组中。

7.前述段落中任一段所述的小麦植株，其中WPBF基因中的所述突变在A、B和D基因组中。

8.前述段落中任一段所述的小麦植株，其中所述突变导致相对于野生型小麦植株，所述小麦植株的谷粒中的低分子量麦谷蛋白减少。

9.前述段落中任一段所述的小麦植株，其中所述突变导致相对于野生型谷粒，所述小麦植株的谷粒中的麦醇溶蛋白减少。

10.前述段落中任一段所述的小麦植株，其中所述突变导致相对于野生型谷粒，所述小麦植株的谷粒中的高分子量麦谷蛋白增加或未改变。

11.前述段落中任一段所述的小麦植株，其中所述突变导致所述小麦植株的谷粒具有选自野生型谷粒中发现的谷蛋白的约70％，约60％，约50％，约40％，约30％，约20％，约10％和约5％的减少的谷蛋白。

12.前述段落中任一段所述的小麦植株，其中所述小麦植株的所述突变是纯合的。

13.前述段落中任一段所述的小麦植株，其为普通小麦(Triticum aestivumssp.aestivum)。

14.前述段落中任一段所述的小麦植株，其为硬粒小麦(Triticum turgidumsubsp.durum)。

15.前述段落中任一段所述的小麦植株，其中所述突变在表1-3中提及。

16.来自前述段落中任一段所述的小麦植株的小麦谷粒。

17.包含前述段落中任一段所述的小麦谷粒的面粉。

18.一种食品，其包含前述段落中任一段所述的小麦植株的组分。

19.来自前述段落中任一段所述的小麦植株的小麦种子、其植物部分或其后代。

20.一种转基因小麦植株，其包含降低WPBF基因的表达和/或降低WPBF蛋白的活性的转基因，其中与野生型植株的谷粒相比，所述降低的表达和/或降低的活性有助于所述小麦植株的谷粒具有减少的谷蛋白。

21.如第20段所述的小麦植株，其中相对于野生型小麦植株，所述转基因导致所述小麦植株的谷粒中的低分子量麦谷蛋白减少。

22.如第20段所述的小麦植株，其中相对于野生型谷粒，所述转基因导致所述小麦植株的谷粒中的麦醇溶蛋白减少。

23.如第20段所述的小麦植株，其中相对于野生型谷粒，所述转基因导致所述小麦植株的谷粒中的高分子量麦谷蛋白增加或未改变。

24.如第20段所述的小麦植株，其中所述转基因导致所述小麦植株的谷粒具有选自野生型谷粒中发现的谷蛋白的约70％，约60％，约50％，约40％，约30％，约20％，约10％和约5％的减少的谷蛋白。

25.如第20段所述的小麦植株，其是普通小麦(Triticum aestivumssp.aestivum)。

26.如第20段所述的小麦植株，其是硬粒小麦(Triticum turgidumsubsp.durum)。

27.来自第20-26段中任一段所述的小麦植株的小麦谷粒。

28.包含第27段所述的小麦谷粒的面粉。

29.一种食品，其包含第20-28段所述的小麦植株的组分。

30.来自第20-26段所述的小麦植株的小麦种子、其植物部分或其后代。

31.一种包含修饰的WPBF基因的小麦植株，其中所述WPBF基因通过基因组编辑被修饰，并且与野生型植株的谷粒相比，所述修饰有助于谷粒具有减少的谷蛋白。

32.如第31段所述的小麦植株，其中相对于野生型小麦植株，所述修饰的WPBF导致所述小麦植株的谷粒中的低分子量麦谷蛋白减少。

33.如第31段所述的小麦植株，其中相对于野生型谷粒，所述修饰的WPBF基因导致所述小麦植株的谷粒中的麦醇溶蛋白减少。

34.如第31段所述的小麦植株，其中相对于野生型谷粒，所述修饰的WPBF基因导致所述小麦植株的谷粒中高分子量麦谷蛋白增加或未改变。

35.如第31段所述的小麦植株，其中所述修饰的WPBF基因导致所述小麦植株的谷粒具有选自野生型谷粒中发现的谷蛋白的约70％，约60％，约50％，约40％，约30％，约20％，约10和约5％的减少的谷蛋白。

36.如第31段所述的小麦植株，其是普通小麦(Triticum aestivumssp.aestivum)。

37.如第31段所述的小麦植株，其是硬粒小麦(Triticum turgidumsubsp.durum)。

38.来自第31-37段中任一段所述的小麦植株的小麦谷粒。

39.包含第38段所述的小麦谷粒的面粉。

40.一种食品，其包含第31-39段所述的小麦植株的组分。

41.来自第31-37段所述的小麦植株的小麦种子、其植物部分或其后代。

42.一种大麦植株，其在大麦转录物MLOC_12852.2中包含一个或多个突变，其中与野生型植株的谷粒相比，所述一个或多个突变有助于所述大麦植株的谷粒具有减少的谷蛋白。

43.一种大麦植株，其包含修饰的大麦转录物MLOC_12852.2，其中与野生型植株的谷粒相比，所述修饰有助于所述大麦植株的谷粒具有减少的谷蛋白。

44.一种大麦植株，其包含修饰的大麦转录物MLOC_12852.2，其中大麦转录物MLOC_12852.2通过突变、或转基因、或基因组编辑进行修饰，并且进一步其中，与野生型植株的谷粒相比，所述修饰有助于所述大麦植株的谷粒具有减少的谷蛋白。

45.一种大麦植株，其在大麦转录物MLOC_12852.2的Dof区中包含一个或多个突变，其中与野生型植株的谷粒相比，所述一个或多个突变有助于所述大麦植株的谷粒具有减少的谷蛋白。

46.一种大麦植株，其包含大麦转录物MLOC_12852.2的Dof区的修饰，其中与野生型植株的谷粒相比，所述修饰有助于所述大麦植株的谷粒具有减少的谷蛋白。

47.一种大麦植株，其包含大麦转录物MLOC_12852.2的Dof区的修饰，其中所述大麦转录物MLOC_12852.2的Dof区通过突变、或转基因、或基因组编辑被修饰，并且进一步其中，与野生型植株的谷粒相比，所述修饰有助于所述大麦植株的谷粒具有减少的谷蛋白。

48.一种大麦植株，其包含SEQ ID NO.12中的一个或多个突变，其中与野生型植株的谷粒相比，所述一个或多个突变有助于所述大麦植株的谷粒具有减少的谷蛋白。

49.一种大麦植株，其包含大麦Dof转录因子的SEQ ID NO.12中的至少两种突变，其中一种突变是在SEQ ID NO.12的173位处腺嘌呤到胸腺嘧啶的突变，并且进一步其中，与野生型植株的谷粒相比，所述突变有助于所述大麦植株的谷粒具有减少的谷蛋白。

50.一种大麦植株，其包含SEQ ID NO.12中的突变，其中与野生型植株的谷粒相比，所述突变有助于所述大麦植株的谷粒具有减少的谷蛋白，并且进一步其中，所述突变不是在SEQ ID NO.12的173位处腺嘌呤到胸腺嘧啶的突变。

51.第42-50段中任一段所述的大麦植株的谷粒。

52.包含第51段所述的谷粒的面粉。

53.包含第42-52段中任一段所述的大麦植株的组分的食品。

54.来自第42-50段所述的大麦植株的大麦种子、其植物部分或其后代。

55.一种小麦植株，其在B和D基因组中的WPBF基因中包含突变，其中与野生型植株的谷粒相比，所述突变有助于所述小麦植株的谷粒具有减少的谷蛋白。

56.如第55段所述的小麦植株，其中B基因组中的突变导致SEQ ID No.3的第70位氨基酸处色氨酸到终止密码子的变化(W70*)。

57.如第55段所述的小麦植株，其中D基因组中的突变导致SEQ IDNo.9的第63位氨基酸处半胱氨酸到酪氨酸的突变(C63Y)。

58.如第55段所述的小麦植株，其中所述突变有助于所述小麦植株的谷粒在所述小麦植株的胚乳中具有改变的种子贮藏蛋白图谱。

59.如第55段所述的小麦植株，其进一步包含A基因组中的WPBF基因中的突变。

60.来自前述段落中任一段所述的小麦植株的小麦谷粒以及至少一种谷蛋白酶。

61.包含前述段落中任一段所述的小麦谷粒和至少一种谷蛋白酶的面粉。

62.一种食品，其包含前述段落中任一段所述的小麦植株的组分以及至少一种谷蛋白酶。

63.来自前述段落中任一段所述的小麦植株的小麦种子、其植物部分或其后代以及至少一种谷蛋白酶。

64.来自前述段落中任一段所述的大麦植株的谷粒以及至少一种谷蛋白酶。

65.包含来自前述段落中任一段所述的大麦植株的谷粒和至少一种谷蛋白酶的面粉。

66.一种食品，其包含前述段落中任一段所述的大麦植株的组分和至少一种谷蛋白酶。

67.来自前述段落中任一段所述的大麦植株的大麦种子、其植物部分或其后代，以及至少一种谷蛋白酶。

以下实施例仅作为说明提供，而不是限制。应该理解，本文讨论的突变仅仅是示例性的，并且也考虑相似的突变。

实施例

实施例1：大麦转录物MLOC_12852.2的识别

分析谷蛋白减少的大麦植株以识别对应于谷蛋白减少的表型的突变。与具有大于100,000ppm谷蛋白(mg/kg)的野生型大麦相比，低谷蛋白大麦给出1,000ppm谷蛋白(mg/kg)的ELISA R5抗体读数。

图1是SDS PAGE(十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)，其显示大麦B、C和D大麦醇溶蛋白的存在或不存在。如图1A和图1B所示，B、C和D大麦醇溶蛋白在低谷蛋白大麦中几乎检测不到。

图2是将野生型大麦种子与低谷蛋白大麦种子对比的照片，它们具有非常相似的物理特性和性状。

使用群体分离RNA测序方法来识别对应于低谷蛋白表型的基因。通过将突变体植物与无关的非突变体大麦栽培变种(Bowman)杂交来产生用于识别与突变连锁的DNA SNP的作图群体。分析F2胚乳半种子的大麦醇溶蛋白含量以识别纯合突变体F2分离子，并使突变体和非突变体种子的一半的胚生长以产生F3种子。在F3中，对来自每个个体F2的约20个非突变体种子进行半种子分析以确定哪个F2非突变体半种子对于单隐性突变是杂合的，哪个是纯合的非突变体。使20-40个之间的个体F3突变体幼苗(各自来自不同的个体突变体F2)生长，以3个重复池(replicated pool)从～7日龄的完整黄化幼苗(包括根和茎组织)分离RNA。

同样使各自来自不同的纯合非突变体F2种子的20-40个之间的个体纯合非突变体幼苗生长，并且以三个重复池从～7天龄完整黄化纯合非突变体幼苗的根和茎组织分离RNA。根据Liu等人的Plos ONE 7(5):e36406进行RNA测序分析，并对大麦基因组的SNP作图。

与突变体共分离的SNP将突变定位于染色体5H长臂上的着丝粒附近的约4cM区域。随后，在更大的作图群体中对由选定的SNP设计的KASP探针作图，并且识别了其中SNP没有显示与突变体重组的600kb区域。在该区域附近的基因图谱的检查识别出在大麦转录物MLOC_12852.2(Dof转录因子)中的突变。大麦转录物MLOC_12852.2的编码序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO.12和13中。低谷蛋白大麦植株包含氨基酸序列第58位处谷氨酰胺至亮氨酸的改变。

实施例2：小麦种子的诱变

根据本公开的一个示例性实施方式，将六倍体栽培变种(Triticumaestivum)Express或四倍体栽培种Kronos的小麦种子真空渗入H₂O(大约1000粒种子/100ml H₂O，大约4分钟)中。然后在室温下将种子置于通风橱中的摇床(45rpm)上。将诱变剂甲磺酸乙酯(EMS)加入吸收液体的种子中以达到约0.75％至约1.2％(v/v)的最终浓度。在18小时的孵育期之后，EMS溶液用新鲜的H₂O置换4次。然后将种子用流水漂洗约4-8小时。最后，将诱变的种子在盆栽土壤中种植(96粒/托盘)并在室内发芽。将四到六周龄的植物转移到田地上，长到完全成熟的M1植株。使成熟的M1植株自花授粉，然后收集M1植株的种子并种植以产生M2植株。

提取并制备来自根据上述描述产生的M2植株的DNA，以识别哪个M2植株在其一个或多个WPBF基因座上携带突变。使用包含在(Valencia，CA)96PlantKit中的方法和试剂制备M2植株DNA。将约50mg的冷冻植株样品置于具有钨珠的样品管中，在液氮中冷冻并使用Mixer混磨机MM 300在20Hz下研磨两次，每次1分钟。接下来，将400μl溶液AP1[缓冲液AP1，溶液DX和RNA酶(100mg/ml)]在80℃下加入到样品中。将管密封并摇动15秒。加入130μl缓冲液AP2后，将管摇动15秒。将样品置于-20℃的冰箱中至少1小时。然后将样品以5600×g离心20分钟。将400μl等分的上清液转移到另一个样品管中。加入600μl缓冲液AP3/E后，将该样品管密封并摇动15秒。将滤板放置在方孔块上，将1ml样品溶液加到每个孔中并密封该板。将板和块以5600×g离心4分钟。接下来，将800μl缓冲液AW添加到滤板的每个孔中，密封并在方孔块中以5600×g旋转15分钟。然后将滤板放在一组新的样品管上，并将80μl缓冲液AE加到滤器。将其密封并在室温下孵育1分钟，然后以5600×g旋转2分钟。用另外的80μl缓冲液AE重复该步骤。除去滤板并将含有合并滤液的管密封。然后将各个样品标准化至5至10ng/μl的DNA浓度。

TILLING

将M2小麦DNA合并为两个单独植株的组。合并组中每个个体的DNA浓度约为2ng/μl，整个合并组的最终浓度为4ng/μl。然后，将5μl合并的DNA样品(或20ng小麦DNA)在微量滴定板上排列并进行基因特异性PCR。

PCR扩增在含有以下成分的15μl体积中进行：20ng合并的DNA、0.75XExTaq缓冲液(Clonetech，Mountain View，CA)、1.1mM另外的MgCl₂、0.3mMdNTP、0.3μM引物、0.009U Ex-Taq DNA聚合酶(Clonetech，Mountain View，CA)、0.02单位的DyNAzyme II DNA聚合酶(Thermo Scientific)，以及必要时0.33M聚合物-助剂PCR增强剂使用MJ 热循环仪以如下条件进行PCR扩增：95℃2分钟；8个循环的“降落PCR”(94℃20秒，然后在70-68℃下开始退火步骤30秒，每循环下降1℃，然后以每秒0.5℃的速率升温至72℃，接着72℃1分钟)；94℃20秒，63或65℃30秒，以0.5℃/秒升温至72℃，72℃1-2分钟，25-45个循环；72℃8分钟；98℃8分钟；80℃20秒；80℃7秒-0.3度/循环，60个循环。

将PCR产物(2-4μl)在96孔板中消化。将3μl的溶液(含有6mM HEPES[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸](pH 7.0)、6mM MgCl₂、6mM NaCl、0.012X0.03mg/ml牛血清白蛋白、0.5X T-Digest缓冲液[AdvancedAnalytical Technologies，公司(AATI)，Ames，IA]、0.912U各核酸内切酶和增强剂(公司)，和0.5XdsDNA切割酶(AATI，Ames，IA))加入到PCR产物中。消化反应在45℃孵育45分钟。Surveyor酶的比活性为800单位/μl，其中一个单位由制造商定义为剪切的，热变性的小牛胸腺DNA在pH8.5 37℃下1分钟内产生1ng酸溶性物质所需的酶的量。通过加入20μl稀释缓冲液E(AATI，Ames，IA)或1×TE终止反应。将反应物保存在冰箱中，直到在Fragment Analyzer ^TM(AATI，Ames，IA)毛细管电泳系统跑样。根据制造商的方案，使用DNF-920-K1000T MutationDiscovery Kit(AATI，Ames，IA)在Fragment Analyze ^TM上跑样。

电泳后，使用2.0软件(AATI，Ames，IA)分析测定。凝胶图像显示所有96条泳道共有的背景条带的序列特异性图案。罕见事件，如突变，产生超出背景图案的新条带。通过TILLING与野生型DNA混合的合并组中的个别成员，然后对单个PCR产物进行测序来评价带有指示目的突变的条带的植株。如上所述使通过测序确认的携带突变的植株(例如，M2植株可以多次回交或异型杂交以消除背景突变并自花授粉以创建对于突变是纯合的植株)长大或与在不同的同源染色体中含有WPBF突变的另一种植物杂交。

另外，通过从胚乳半种子中提取醇溶谷蛋白，分析来自在A、B或D基因组的WPBF-A、WPBF-B或WPBF-D中具有突变的纯合小麦植株的谷粒中种子贮藏蛋白含量。另外，所选的在A或B或D基因组的WPBF中识别出具有严重突变(表1、2和3)的植株与在其他基因组中的WPBF中含有严重突变的其他植株杂交。分析由这些杂交得到的纯合植物的谷粒中种子贮藏蛋白的积累。严重的突变包括通过其SIFT和PSSM预计会对蛋白质功能产生有害作用的那些突变，以及导致引入终止密码子(截短突变)的那些突变或在剪接点的突变。

实施例3：

WPBF基因中的突变导致小麦种子中种子贮藏蛋白图谱改变。

使用TILLING技术(靶向基因组中诱导的局部病变)来识别小麦中同源转录因子基因的许多突变。已在四倍体面食小麦的A和B基因组的所有同源拷贝以及六倍体面包小麦的所有三个同源基因组(A、B和D基因组)中识别了这些突变。

迄今为止，六倍体面包小麦的B基因组中的突变与D基因组拷贝中的突变杂交。B基因组突变导致70位氨基酸处色氨酸密码子改变为终止密码子(WPBF_B(W70^*))，这可能导致该基因的无功能的B基因组拷贝。D基因组突变将63位氨基酸处半胱氨酸转变成酪氨酸(WPBF_D(C63Y))，由于半胱氨酸负责使锌离子在转录因子的活性DNA结合域中配位，这也可能导致该基因的D基因组拷贝的功能丧失。

在携有这些突变中的一个或其他的亲本植株之间的杂交的F2代中，1/16的后代预计在该基因的B和D基因组的同源拷贝上是纯合的突变体。这些后代将具有该基因的A基因组拷贝的未突变的拷贝，我们希望研究WPBF的B和D基因组拷贝的改变以及对这些种子的种子贮藏蛋白的任何潜在影响。

通过将111个个体F2后代种子切成两半，保存种子的半胚用于种植，从种子的半胚乳中提取最丰富的醇溶谷蛋白贮藏蛋白，并将这些提取的蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上进行电泳来进行实验。如图3A-3D中所示，7个胚乳半种子(由箭头表示)含有改变的种子贮藏蛋白图谱，几种蛋白质条带消失，另外一些是量显著减少。

这些结果表明，WPBF的B和D基因组的改变影响种子贮藏蛋白。然而，将具有该基因的改变的A基因组拷贝的植株与具有该基因的改变的B和D基因组拷贝的植株杂交，预计会对这些植株的种子贮藏蛋白图谱产生更大的影响。

上述结果清楚地表明大麦中的转录因子已被识别，当其突变时，导致大麦种子贮藏蛋白图谱的巨大变化。此外，小麦中等同基因中的突变同样导致小麦中贮藏蛋白的改变。

提供上述实施例来说明本发明，但不限制其范围。本发明的其他变化形式对于本领域的普通技术人员而言将是显而易见的，并且被所附权利要求及其所有等同物涵盖。上述实例使用TILLING技术来产生和识别小麦的一种或多种WPBF基因中的突变，但是本领域普通技术人员将理解其他方法，例如定向诱变(也称为定点诱变，位点特异性诱变或寡核苷酸定向诱变)可用于在小麦的一种或多种WPBF基因座中产生本发明的有用突变(请参见例如Zhang等人，PNAS 107(26):12028-12033，2010；Saika等人，Plant Physiology 156:1269-1277,2011)。本领域普通技术人员也将认识到，可以使用其他方法来灭活或降低小麦WPBF基因的活性。这些方法包括但不限于CRISPR/Cas9诱变、TALEN和锌指诱变、RNAi、微小RNA和基于发夹RNA的方法以突变或减少WPBF转录物的积累。本文引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用在此并入。

Claims (21)

1.一种小麦植株，其在A、B或D基因组中的至少一者中的小麦醇溶谷蛋白盒结合因子基因(WPBF)中包含一个或多个突变，其中与野生型植株的谷粒相比，所述一个或多个突变有助于所述小麦植株的谷粒具有减少的谷蛋白。

2.如权利要求1所述的小麦植株，其中所述一个或多个突变在所述WPBF基因的Dof(DNAbinding with one finger)区中。

3.如权利要求1所述的小麦植株，其中所述WPBF基因中的一个或多个突变在B和D基因组中。

4.如权利要求1所述的小麦植株，其中所述WPBF基因中的一个或多个突变在A和B基因组中。

5.如权利要求1所述的小麦植株，其中所述WPBF基因中的一个或多个突变在A和D基因组中。

6.如权利要求1所述的小麦植株，其中所述WPBF基因中的一个或多个突变在A、B和D基因组中。

7.如权利要求1所述的小麦植株，其中所述一个或多个突变导致所述小麦植株的谷粒中的低分子量麦谷蛋白相对于野生型小麦植株的谷粒减少。

8.如权利要求1所述的小麦植株，其中所述一个或多个突变导致所述小麦植株的谷粒中的麦醇溶蛋白相对于野生型小麦植株的谷粒减少。

9.如权利要求1所述的小麦植株，其中所述一个或多个突变导致所述小麦植株的谷粒中的高分子量麦谷蛋白相对于野生型小麦植株的谷粒增加或未改变。

10.如权利要求1所述的小麦植株，其中所述一个或多个突变导致所述WPBF蛋白中的氨基酸改变，所述氨基酸改变选自表1-3中所述的氨基酸改变。

11.来自权利要求1所述的小麦植株的小麦谷粒。

12.包含权利要求11所述的小麦谷粒的面粉。

13.一种食品，其包含权利要求1所述的小麦植株的组分。

14.来自权利要求1所述的小麦植株的小麦种子、其植物部分或其后代。

15.一种小麦植株，其在B基因组和D基因组中的WPBF基因中包含突变，其中与野生型植株的谷粒相比，所述突变有助于所述小麦植株的谷粒具有减少的谷蛋白。

16.如权利要求15所述的小麦植株，其中所述B基因组中的突变导致SEQ ID No.3的第70位氨基酸处色氨酸改变为终止密码子(W70*)。

17.如权利要求15所述的小麦植株，其中所述D基因组中的突变导致SEQ ID No.9的第63位氨基酸处半胱氨酸到酪氨酸的突变(C63Y)。

18.来自权利要求15所述的小麦植株的小麦谷粒。

19.包含权利要求18所述的小麦谷粒的面粉。

20.一种食品，其包含权利要求15所述的小麦植株的组分。

21.来自权利要求15所述的小麦植株的小麦种子、其植物部分或其后代。