ES2968199T3

ES2968199T3 - Granos con gluten disminuido y composiciones de los mismos

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Publication number: ES2968199T3
Application number: ES16729434T
Authority: ES
Inventors: Charles Moehs; William Austill; Dayna Loeffler; Jessica Mullenberg
Original assignee: Arcadia Biosciences Inc
Current assignee: Arcadia Biosciences Inc
Priority date: 2015-05-29
Filing date: 2016-05-31
Publication date: 2024-05-08
Anticipated expiration: 2036-05-31
Also published as: CN107920488B; MX2017015315A; US10750690B2; US20230292689A1; CN107920488A; MX2021014253A; US11553659B2; US10412909B2; EP4282875A3; WO2016196489A1; US20190000025A1; JP2021184739A; CA2987111C; US20200000053A1; AU2016271342B2; US20180273971A1; EP4282875A2; AU2016271342A1; JP2018516601A; BR112017025724A2

Abstract

En el presente documento se describen plantas con granos de gluten reducido y composiciones de las mismas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Granos con gluten disminuido y composiciones de los mismos

Campo

La descripción se refiere a plantas de trigo con una o más mutaciones no transgénicas en un gen que dan como resultado granos con gluten disminuido. La descripción también se refiere al grano de la planta de trigo, la harina que comprende el grano y los productos alimenticios que comprenden un componente de la planta de trigo.

Antecedentes

El trigo es el cultivo de cereales más importante y estratégico para la mayoría de la población mundial y es el alimento de primera necesidad más importante para unos dos mil millones de personas (el 36% de la población mundial). A nivel mundial, el trigo proporciona casi el 55% de los carbohidratos y el 20% de las calorías alimentarias consumidas globalmente (Breiman y Graur, 1995). El trigo supera en superficie y producción a todos los demás cultivos de cereales (incluidos el arroz, maíz, etc.) y se cultiva en una amplia gama de condiciones climáticas. La comprensión de la genética del trigo y la organización del genoma mediante el uso de marcadores moleculares es de gran valor para fines genéticos y de fitomejoramiento.

Las proteínas son el componente más importante del grano de trigo, que determina el valor de su uso final. Se sabe que la composición de la proteína de almacenamiento de los granos (GSP) determina la cohesividad y la viscoelasticidad de la masa. Las GSP más abundantes en el trigo son las gliadinas y gluteninas que forman el gluten, que representan del 60% al 80% de la proteína total del grano.

La enfermedad celíaca es una afección en la que el revestimiento del intestino delgado se ve dañado por el gluten, una mezcla de diferentes proteínas de almacenamiento que se encuentran en el endospermo amiláceo de los granos de trigo, centeno y cebada, así como en especies estrechamente relacionadas. La matriz de gluten consta de mezclas aproximadamente iguales de las proteínas gliadina y glutenina. La enfermedad celíaca está causada principalmente por las proteínas gliadinas. En concreto, en esta enfermedad se destruyen las vellosidades del intestino delgado y el revestimiento se aplana, perjudicando gravemente la absorción de nutrientes. Los síntomas típicos son pérdida de peso, diarrea maloliente, vómitos, dolor abdominal e hinchazón de las piernas. La única cura disponible actualmente es una dieta exenta de gluten de por vida, evitando estrictamente todas las composiciones alimentarias y farmacéuticas que contengan trigo, centeno y cebada. Además de la enfermedad celíaca, muchas personas padecen una intolerancia general al gluten. El alcance de esta intolerancia varía mucho, aunque no hay síntomas clínicos claros como en la enfermedad celíaca.

Por tanto, existe una necesidad clínica de disminuir el consumo de gluten y la correspondiente necesidad de desarrollar trigo y otros cereales con gluten disminuido. Aunque la necesidad existe desde hace mucho tiempo, la identificación de las mutaciones en los genes del trigo que disminuyen el gluten ha avanzado lentamente porque, entre otras posibles razones, existe una diversidad genética limitada en las variedades comerciales de trigo actuales y el genoma del trigo es complejo. El trigo harinero es hexaploide, con tres genomas completos denominados A, B y D en el núcleo de cada célula. Cada uno de estos genomas tiene casi el doble de tamaño que el genoma humano y consta de alrededor de 5500 millones de nucleótidos. Por otro lado, el trigo duro, también conocido como trigo candeal o trigo para pasta(Triticum durumoTriticum turgidumsubesp.durum),es la mayor especie tetraploide de trigo de importancia comercial, que se cultiva ampliamente en la actualidad. El trigo duro tiene dos genomas completos, A y B, y se utiliza mucho para elaborar pasta.

Dong et al. (Plant Mol Biol, vol. 63, 2006, p. 73-84 describe ciertas interacciones del factor de unión a la caja de prolamina de trigo (WPBF).

Wang et al. (Gene, vol. 527, 2013, p. 484-490 describe la estructura de ciertos promotores del gen de glutenina del trigo.

Ravel et al. (Funct Integr Genomics, vol. 6, 2006, p. 310-321 describe la variabilidad de la secuencia de diferentes alelos del WPBF.

Szabolcs et al. Funct. Integr. Genomics, vol. 15, 2015, p. 661-672; She et al.: Funct. Integral Genomics, vol. 11,2010, p. 23-35; y Y.-S. Hwang et al: Plant and Cell Physiology, vol. 45, 2004, p. 1509-1518 se refieren al gen W p BF del trigo.

Los inventores han identificado genes en los que las mutaciones y modificaciones de dichos genes producen granos con gluten disminuido.

En general, la descripción se refiere a plantas con una o más mutaciones no transgénicas en un gen que dan como resultado granos con gluten disminuido, incluidos, entre otros, los granos de las plantas de cebada y trigo. Por ejemplo, la descripción se refiere a plantas con uno o más transgenes que alteran la expresión de un gen y/o la actividad de una proteína, lo que da como resultado granos con gluten disminuido. En otro ejemplo, la descripción se refiere a plantas transgénicas con granos con gluten disminuido. En otro ejemplo más, la descripción se refiere a plantas con genes modificados, en donde los genes se modificaron mediante edición genómica y contribuyen a producir granos con gluten disminuido en comparación con los granos de las plantas de tipo silvestre.

En un ejemplo, la descripción se refiere a plantas con mutaciones no transgénicas en uno o más genes del factor de unión a la caja de prolamina de trigo (WPBF), o genes homólogos, que dan como resultado granos con gluten disminuido. En un ejemplo, la descripción se refiere a mutaciones no transgénicas en el gen WPBF, en donde dichas mutaciones dan como resultado granos con gluten disminuido.

Sumario

La invención se define en la reivindicación 1. Las realizaciones preferidas de la invención se definen en las reivindicaciones dependientes.

En un primer aspecto, la invención se refiere a una planta de trigo que comprende una o más mutaciones homocigotas inducidas por el ser humano en un gen del factor de unión a la caja de prolamina de trigo (WPBF) en al menos un genoma B y un genoma D, en donde la una o más mutaciones dan como resultado un cambio de aminoácidos en la proteína WPBF seleccionado de los cambios de aminoácidos enumerados en las Tablas 2-3, y además en donde una o más mutaciones contribuyen a que el grano de dicha planta de trigo tenga gluten disminuido en comparación con el grano de una planta de tipo silvestre.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un grano de trigo procedente de la planta de trigo del primer aspecto.

En un tercer aspecto, la invención proporciona una harina que comprende el grano de trigo del segundo aspecto.

En un cuarto aspecto, la invención proporciona un producto alimenticio que comprende el grano de trigo del segundo aspecto o la harina del tercer aspecto.

En un quinto aspecto, la invención proporciona una semilla de trigo, una parte de una planta o su progenie procedente de la planta de trigo del primer aspecto, en donde dicha progenie tiene una o más mutaciones en el gen WPBF. En los ejemplos, las semillas de trigo, las partes de la planta de trigo y la progenie tienen granos con gluten disminuido en comparación con la planta de trigo de tipo silvestre, las semillas de trigo, las partes de la planta de trigo y su progenie.

Los siguientes ejemplos en esta sección son útiles para resaltar aspectos específicos de la invención, que se define mediante las reivindicaciones.

En un ejemplo, la descripción se refiere a una planta de trigo, semillas de trigo, partes de una planta de trigo y su progenie con gluteninas de alto peso molecular aumentadas en comparación con la planta de trigo de tipo silvestre, semillas de trigo, partes de una planta de trigo y su progenie.

En otro ejemplo, la descripción se refiere a una planta de trigo, semillas de trigo, partes de una planta de trigo y su progenie con gluteninas de bajo peso molecular disminuidas en comparación con la planta de trigo de tipo silvestre, semillas de trigo, partes de una planta de trigo y su progenie.

En otro ejemplo, la descripción se refiere a una planta de trigo, semillas de trigo, partes de una planta de trigo y su progenie con gliadinas disminuidas en comparación con la planta de trigo de tipo silvestre, semillas de trigo, partes de una planta de trigo y su progenie.

En otro ejemplo, esta invención se refiere a una planta de trigo, semillas de trigo, partes de una planta de trigo y su progenie que tienen granos con gluten disminuido en comparación con la planta de trigo de tipo silvestre, en donde la disminución del gluten está causada por una mutación no transgénica inducida por el ser humano en uno o más de los genes WPBF de la planta de trigo. En otra realización, la proteína WPBF tiene una actividad disminuida.

En otro ejemplo, la descripción se refiere a una planta de trigo que contiene uno o más genes WPBF mutados, así como semillas, polen, partes de plantas y la progenie de esa planta.

En otro ejemplo, la descripción se refiere a alimentos y productos alimenticios que incorporan semillas de trigo y harina de trigo que tienen una actividad disminuida de la proteína WPBF causada por una mutación no transgénica inducida por el ser humano en uno o más genes WPBF.

Esta descripción también describe una planta de trigo que tiene una actividad disminuida de una o más proteínas WPBF en comparación con las plantas de trigo de tipo silvestre, creada mediante las etapas de obtener material vegetal de una planta de trigo originaria, inducir al menos una mutación en al menos una copia de un gen WPBF del material vegetal tratando el material vegetal con un mutágeno para crear un material vegetal mutagenizado (por ejemplo, semillas o polen), analizar las plantas de trigo de la progenie para detectar al menos una mutación en al menos una copia de un gen WPBF, seleccionar las plantas de trigo de la progenie que tienen al menos una mutación en al menos una copia de un gen WPBF, cruzar las plantas de trigo de la progenie que tienen al menos una mutación en al menos una copia de un gen WPBF con otras plantas de trigo de la progenie que tienen al menos una mutación en una copia diferente de un gen WPBF, y repetir el ciclo de identificar las plantas de trigo de la progenie que tienen mutaciones y cruzar las plantas de trigo de la progenie que tienen mutaciones con otras plantas de trigo de la progenie que tienen mutaciones para producir plantas de trigo de la progenie con una actividad de WPBF disminuida. En otra realización, el método comprende cultivar o usar el material vegetal mutagenizado para producir plantas de trigo de la progenie.

En un ejemplo, la descripción se refiere a las semillas de una planta de trigo que tienen un perfil de almacenamiento de proteínas alterado.

En un ejemplo, la descripción se refiere a una composición que comprende semillas de trigo que tienen una actividad disminuida de la proteína WPBF causada por una mutación en uno o más genes WPBF y una glutenasa.

En otro ejemplo más, la descripción se refiere a una composición que comprende una harina de trigo que tiene una actividad disminuida de la proteína WPBF causada por una mutación en uno o más genes WPBF y una glutenasa. En un ejemplo, la descripción se refiere a una composición que comprende alimentos y/o productos alimenticios que incorporan semillas de trigo y harina de trigo que tienen una actividad disminuida de la proteína WPBF causada por una mutación no transgénica inducida por el ser humano en uno o más genes WPBF y una glutenasa.

En un ejemplo, la descripción se refiere a una composición que comprende un alimento y/o productos alimenticios que incorporan semillas de cebada y/o harina de cebada que tiene una actividad disminuida del factor de transcripción Dof de cebada y una glutenasa.

En otro ejemplo más, la descripción se refiere a una composición que comprende alimentos y/o productos alimenticios que incorporan cebada ultra-baja en gluten y una glutenasa.

En un ejemplo, la glutenasa se selecciona del grupo que consiste en Tolerase® G, Glutenase ALV003, GlutenEase, Glutenase Plus, Digest Gluten Plus, Gluten Cutter.

En otro ejemplo, la glutenasa se puede usar con una o más enzimas adicionales que incluyen, entre otras, amilasa, glucoamilasa y DPP4 (dipeptidil peptidasa-4).

Breve descripción del listado de secuencias

La SEQ ID N° 1 muestra la secuencia del gen del factor de unión a la caja de prolamina de trigo (WPBF) del genoma A (2024 pares de bases).

La SEQ ID N° 2 muestra la secuencia codificante de WPBF-A de SEQ ID N°: 1 (990 pares de bases).

La SEQ ID N° 3 muestra la secuencia de la proteína WPBF-A de SEQ ID N° 2 (330 aminoácidos).

La SEQ ID N° 4 muestra el gen del factor de unión a la caja de prolamina de trigo (WPBF) del genoma B (2027 pares de bases).

La SEQ ID N° 5 muestra la secuencia codificante de WPBF-B de SEQ ID N°: 4 (984 pares de bases).

La SEQ ID N° 6 muestra la secuencia de la proteína WPBF-B de SEQ ID N° 5 (328 aminoácidos).

La SEQ ID N° 7 muestra la secuencia genética del gen del factor de unión a la caja de prolamina de trigo (WPBF) del genoma D (2081 pares de bases).

La SEQ ID N° 8 muestra la secuencia codificante de WPBF-D de SEQ ID N°: 7 (990 pares de bases).

La SEQ ID N° 9 muestra la secuencia de la proteína WPBF-D de SEQ ID N° 8 (330 aminoácidos).

La SEQ ID N° 10 muestra la secuencia de ácido nucleico de la región Dof del gen WPBF.

La SEQ ID N° 11 muestra la secuencia de aminoácidos de la región Dof de la proteína WPBF.

La SEQ ID N° 12 muestra la secuencia codificante del DOF de cebada(Hordeum vulgare; Hv) (1011 pares de bases). La SEQ ID N° 13 muestra la secuencia de proteínas de SEQ ID N° 12 (337 aminoácidos).

Breve descripción de los dibujos

Las FIG. 1A y 1B son fotografías de un gel de SDS-poliacrilamida que muestra las hordeínas B, C y D presentes en la cebada de tipo silvestre y una cebada mutante con gluten bajo. La FIG. 1B tiene un aumento de cinco veces en la proteína cargada para los carriles de cebada mutante con gluten bajo en comparación con los mismos carriles de la FIG. 1A.

La FIG. 2 es una fotografía de semillas de cebada de tipo silvestre y cebada mutante con gluten bajo.

Las FIG. 3A, 3B, 3C y 3D representan barridos digitales de geles de SDS-poliacrilamida teñidos con azul de Coomassie. Cada pocillo representa las proteínas de almacenamiento del grano solubles en alcohol del endospermo extirpado de una sola semilla de trigo. Las medias semillas de endospermo que contienen un perfil de proteínas de almacenamiento de semillas alterado con varias bandas de proteínas ausentes y otras proteínas con una cantidad disminuida se indican con flechas.

Descripción detallada

Definiciones

Los rangos numéricos en esta descripción son aproximados y, por lo tanto, pueden incluir valores fuera del rango a menos que se indique lo contrario. Los rangos numéricos incluyen todos los valores desde e que incluye los valores inferior y superior, en incrementos de una unidad, siempre que haya una separación de al menos dos unidades entre cualquier valor inferior y cualquier valor superior. Como ejemplo, si una propiedad de una composición, una propiedad física o de otro tipo, tal como, por ejemplo, el peso molecular, la viscosidad, etc., es de 100 a 1000, se pretende enumerar expresamente todos los valores individuales, tales como 100, 101 , 102, etc., y los subrangos, tales como 100 a 144, 155 a 170, 197 a 200, etc. Para los rangos que contienen valores menores de uno o que contienen números fraccionarios mayores de uno (por ejemplo, 1,1, 1,5, etc.), se considera que una unidad es 0,0001, 0,001,0,01 o 0,1, según corresponda. Para los rangos que contienen números de un solo dígito menores de diez (p. ej., 1 a 5), normalmente se considera que una unidad es 0,1. Estos son solo ejemplos de lo que se pretende específicamente, y todas las combinaciones posibles de valores numéricos entre el valor más bajo y el valor más alto enumerados deben considerarse expresamente indicadas en esta descripción. En esta descripción se proporcionan rangos numéricos para, entre otras cosas, las cantidades relativas de componentes de una mezcla y los diversos rangos de temperatura y otros parámetros enumerados en los métodos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "alelo" es cualquiera de una o más formas alternativas de un gen, todas las cuales se relacionan con un rasgo o característica. En una célula u organismo diploide, los dos alelos de un gen determinado ocupan los loci correspondientes en un par de cromosomas homólogos. En una célula u organismo tetraploide o hexaploide, como el trigo, los dos alelos de un gen dado en uno de los genomas ocupan los loci correspondientes en un par de cromosomas homólogos y los dos alelos del mismo gen ocupan los mismos loci en el otro genoma, tales como los genomas A o B del trigo tetraploide, o se dice que los genomas A, B o D del trigo hexaploide son homeólogos respecto del gen del primer genoma y están presentes en los cromosomas homeólogos.

Tal como se utilizan en la presente memoria, los términos "alterar", "incrementar", "incrementado", "disminuir", "disminuido", "inhibido" o similares se consideran términos relativos, es decir, en comparación con el tipo silvestre o el estado inalterado. El "nivel de una proteína" se refiere a la cantidad de una proteína particular, por ejemplo, WPBF, que puede medirse mediante cualquier medio conocido en la técnica tal como, por ejemplo, el análisis de transferencia de Western u otros medios inmunológicos. Como se utiliza en la presente memoria, la "actividad del factor de transcripción ("TF")" se refiere al grado en que el TF activa la transcripción de sus genes objetivo.

Como se utiliza en la presente memoria, la "actividad de WPBF" puede medirse mediante una o más de las siguientes características: (1) el grado en que WPBF activa la transcripción; (2) el grado en que WPBF se une al ADN; (3) el grado en que WPBF se une a coactivadores y/u otros complejos reguladores transcripcionales; y (4) la estabilidad del WPBF unido al ADN. Se apreciaría que el nivel de actividad de WPBF o el nivel de actividad del factor de transcripción podrían alterarse en un mutante, pero no el nivel de expresión (cantidad) de la proteína en sí. A la inversa, la cantidad de proteína podría verse alterada, pero la actividad sigue siendo la misma si se produce una proteína más o menos activa. También son posibles las reducciones tanto en la cantidad como en la actividad, como, por ejemplo, cuando se inactiva un gen que codifica la enzima. En determinados ejemplos, la disminución del nivel de la proteína o de la actividad es de al menos un 10% o de al menos un 20% o de al menos un 30% o de al menos un 40% o de al menos un 50% o de al menos un 60% en comparación con al nivel de la proteína o actividad en el endospermo del trigo no modificado, o en al menos un 70%, o en al menos un 80% o en al menos un 85% o en al menos un 90% o al menos un 95%. La disminución del nivel de la proteína o de la expresión genética o del nivel de actividad de WPBF o del nivel de actividad del factor de transcripción puede ocurrir en cualquier etapa del desarrollo del grano, particularmente durante la etapa de llenado del grano, o en todas las etapas del desarrollo del grano hasta la madurez.

Como se usa en la presente memoria, la "identidad" y la "similitud" de la secuencia de aminoácidos o nucleótidos se determinan a partir de una alineación global óptima entre las dos secuencias que se comparan. Una alineación global óptima se logra utilizando, por ejemplo, el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.

48:443-453). Las secuencias también se pueden alinear usando algoritmos conocidos en la técnica que incluyen, entre otros, el algoritmo CLUSTAL V o los programas de secuencias Blastn o BLAST 2.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "cebada" se refiere a cualquier especie del Génerohordeum,lo que incluye sus progenitores, así como su progenie producida mediante cruces con otras especies. Una forma preferida de cebada es la especieHordeum vulgare.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el factor de transcripción Dof de la cebada se refiere al transcrito de la cebada MLOC_12852.2, un factor de transcripción Dof.

Como se usa en la presente memoria, un "gen del factor de transcripción Dof de cebada modificado" incluye la modificación del gen del factor de transcripción Dof de cebada a través de mutaciones no transgénicas o transgenes o edición genómica o combinaciones de los mismos.

La "identidad" significa que un aminoácido o nucleótido en una posición particular en un primer polipéptido o polinucleótido es idéntico a un aminoácido o nucleótido correspondiente en un segundo polipéptido o polinucleótido que está en una alineación global óptima con el primer polipéptido o polinucleótido. A diferencia de la identidad, la "similitud" abarca los aminoácidos que son sustituciones conservativas. Una sustitución "conservativa" es cualquier sustitución que tenga una puntuación positiva en la matriz de sustitución Blosum62 (Hentikoff y Hentikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919).

La expresión "la secuencia A es similar en un n% a la secuencia B", quiere decir que el n% de las posiciones de una alineación global óptima entre las secuencias A y B consiste en residuos o nucleótidos idénticos y sustituciones conservativas. La expresión "la secuencia A es idéntica en un n% a la secuencia B" significa que el n% de las posiciones de una alineación global óptima entre las secuencias A y B consiste en residuos o nucleótidos idénticos.

Como se usa en la presente memoria, el término "gen" o "secuencia genética" se refiere a la secuencia codificante parcial o completa de un gen, su complemento y sus regiones 5' o 3' no traducidas. Un gen también es una unidad funcional de herencia y, en términos físicos, es un segmento o secuencia particular de nucleótidos a lo largo de una molécula de ADN (o ARN, en el caso de los virus de ARN) involucrado en la producción de una cadena polipeptídica. Esta última puede someterse a un procesamiento posterior, como la modificación química o el plegamiento, para obtener una proteína o polipéptido funcional. Un gen puede estar aislado, parcialmente aislado o encontrarse dentro del genoma de un organismo. A modo de ejemplo, un gen de un factor de transcripción codifica un polipéptido del factor de transcripción, que puede ser funcional o requerir un procesamiento para funcionar como iniciador de la transcripción.

Operativamente, los genes pueden definirse mediante la prueba cis-trans, una prueba genética que determina si se producen dos mutaciones en el mismo gen y que puede usarse para determinar los límites de la unidad genéticamente activa. Un gen generalmente incluye regiones que preceden ("líderes"; en posición anterior) y siguen ("tráileres"; en posición posterior) a la región codificante. Un gen también puede incluir secuencias intermedias no codificantes, denominadas "intrones", ubicadas entre los segmentos codificantes individuales, denominados "exones". La mayoría de los genes tienen una región promotora asociada, una secuencia reguladora en 5' del codón de iniciación de la transcripción (hay algunos genes que no tienen un promotor identificable). La función de un gen también puede estar regulada por potenciadores, operadores y otros elementos reguladores.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "planta modificada" incluye una planta que tiene una mutación no transgénica, o una planta que contiene un transgén, o una planta que ha sido sometida a edición genómica o combinaciones de las mismas.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "planta" incluye una referencia a una planta entera madura o inmadura, lo que incluye una planta de la que se han eliminado semillas, granos o anteras. También se considera planta a la semilla o embrión que producirá la planta.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "partes de plantas" incluye los protoplastos de plantas, los cultivos de tejidos de células vegetales a partir de los cuales se pueden regenerar plantas de trigo, los callos de plantas, los grupos de plantas y las células de plantas que están intactas en las plantas o las partes de plantas, tales como embriones, polen, óvulos, pericarpio, semillas, flores, cogollos, cabezas, espigas, hojas, raíces, puntas de raíces, anteras y similares.

Como se usa en la presente memoria, el término "polipéptido(s)" se refiere a cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados. "Polipéptido(s)" se refiere tanto a las cadenas cortas, comúnmente denominadas péptidos, oligopéptidos y oligómeros, como a cadenas más largas generalmente denominadas proteínas. Los polipéptidos pueden contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos codificados por los genes. "Polipéptido(s)" incluye aquellos modificados mediante procesos naturales, tales como el procesamiento y otras modificaciones postraduccionales, pero también mediante técnicas de modificación química. Tales modificaciones están bien descritas en los textos básicos y en las monografías más detalladas, así como en una voluminosa bibliografía de investigación y son muy conocidas para los expertos en la técnica. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en un grado variable en varios sitios de un polipéptido concreto.

Como se usa en la presente memoria, el término "polinucleótido(s)" generalmente se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Esta definición incluye, sin limitación, el ADN monocatenario y bicatenario, el ADN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias o regiones monocatenarias, bicatenarias y tricatenarias, el ADNc, el ARN monocatenario y bicatenario, y el ARN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser regiones monocatenarias o, más típicamente, bicatenarias o tricatenarias, o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. El término "polinucleótido(s)" también abarca los fragmentos cortos de nucleótidos, a menudo denominados "oligonucleótidos", que debido a la mutagénesis no son un 100% idénticos pero que, sin embargo, codifican la misma secuencia de aminoácidos.

Un "fragmento disminuido o no funcional", como se usa en la presente memoria, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína WPBF que tiene una actividad biológica disminuida en comparación con la secuencia codificante de proteína de la secuencia completa de ácido nucleico. En otras palabras, se refiere a un ácido nucleico o fragmento(s) del mismo que conserva sustancialmente la capacidad de codificar un polipéptido WPBF de la invención, pero el polipéptido WPBF codificado tiene una actividad disminuida.

El término "fragmento", como se usa en la presente memoria, se refiere a una secuencia de polinucleótidos, (p. ej., un fragmento de PCR) que es una porción aislada del ácido nucleico en cuestión construida artificialmente (p. ej., mediante síntesis química) o escindiendo un producto natural en múltiples fragmentos, usando endonucleasas de restricción o ruptura mecánica, o una porción de un ácido nucleico sintetizado mediante PCR, una ADN polimerasa o cualquier otra técnica de polimerización bien conocida en la técnica, o expresada en una célula huésped mediante la tecnología de ácidos nucleicos recombinantes muy conocida por un experto en la técnica.

Con referencia a los polinucleótidos de la descripción, a veces se utiliza la expresión "polinucleótido aislado". Esta expresión, cuando se aplica al ADN, se refiere a una molécula de ADN que está separada de las secuencias con las que está inmediatamente contigua (en las direcciones 5' y 3') en el genoma natural del organismo del que deriva. Por ejemplo, el "polinucleótido aislado" puede comprender un fragmento de PCR. En otro ejemplo, el "polinucleótido aislado" puede comprender una molécula de ADN insertada en un vector, tal como un plásmido o vector viral, o integrada en el ADN genómico de un procariota o eucariota. Una "molécula polinucleotídica aislada" también puede comprender una molécula de ADNc.

Como se usa en la presente memoria, un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) es una diferencia de una sola base nucleotídica entre dos ADN según las sustituciones de nucleótidos, ya sea como transiciones (C/T o G/A) o transversiones (C/G, A/T, C/A o T/G). Las variantes de una sola base se consideran SNP, al igual que las inserciones y deleciones de una sola base (in/del) en el genoma.

Como se usa en la presente memoria, Tolerase® G es una enzima digestiva específica de prolina que ha demostrado ser eficaz para ayudar a digerir el gluten. Tolerase® G funciona con comidas tanto bajas como altas en calorías.

Como se utiliza en la presente memoria, la "actividad del factor de transcripción ("TF")" se refiere al grado en que el TF activa la transcripción de sus genes objetivo.

Como se usa en la presente memoria, una "planta transgénica" se refiere a una planta que contiene una construcción genética ("transgén") que no se encuentra en una planta de tipo silvestre de la misma especie o variedad. Un "transgén", como se menciona en la presente memoria, tiene el significado normal en la técnica de la biotecnología, e incluye una secuencia genética que ha sido producida o alterada mediante tecnología de ADN o ARN recombinante y que ha sido introducida en la célula vegetal. El transgén puede incluir secuencias genéticas derivadas de una célula vegetal. Normalmente, el transgén se ha introducido en la planta mediante manipulación humana tal como, por ejemplo, mediante transformación, pero se puede utilizar cualquier método tal como reconoce un experto en la técnica.

Como se usa en la presente memoria, un "gen WPBF modificado" incluye la modificación del gen WPBF a través de mutaciones no transgénicas o transgenes o edición genómica o combinaciones de los mismos.

Como se usa en la presente memoria, un "derivado de WPBF" se refiere a una secuencia de proteína/péptido/polipéptido de WPBF que posee una actividad biológica que está sustancialmente disminuida en comparación con la actividad biológica de toda la secuencia de proteína/péptido/polipéptido de WPBF. En otras palabras, se refiere a un polipéptido de una proteína WPBF modificada que tiene una actividad de WPBF disminuida. La expresión "derivado de WPBF" abarca los "fragmentos" o "derivados químicos" de una proteína/péptido de WPBF modificado.

Una planta de trigo se define en la presente memoria como cualquier planta de una especie del géneroTriticum,especie que se cultiva comercialmente, que incluye, por ejemplo,Triticum aestivum L. ssp. aestivum(trigo común o harinero), otras subespecies deTriticum aestivum, Triticum turgidum L. ssp. durum(trigo duro, también conocido como trigo candeal o trigo para pasta),Triticum monococcum L. ssp. monococcum(escanda o espelta pequeña cultivada),Triticum timopheevi ssp. timopheevi, Triticum turgidum L. ssp. dicoccum(farro cultivado) y otras subespecies deTriticum turgidum(Feldman). El trigo puede ser trigo hexaploide que tiene un genoma de tipo AABBDD o trigo tetraploide que tiene un genoma de tipo AABB. Dado que la variación genética en el trigo se transfirió a ciertas especies relacionadas, incluidos el centeno y la cebada, mediante hibridación, la descripción también incluye las especies híbridas así formadas, incluido el triticale, que es un híbrido entre el trigo harinero y el centeno. En un ejemplo, la planta de trigo es de la especieTriticum aestivum,y preferiblemente de la subespecieaestivum.Alternativamente, dado que las mutaciones o transgenes pueden transferirse fácilmente deTriticum aestivumal trigodurum,el trigo es preferiblementeTriticum turgidum L. ssp. durum.

En otro ejemplo, la descripción describe plantas de trigo que exhiben granos con gluten disminuido en comparación con las plantas de trigo de tipo silvestre sin la inclusión de ácidos nucleicos exógenos en el genoma de la planta de trigo. En un ejemplo, la descripción se refiere a mutaciones no transgénicas en uno o más genes WPBF.

En otro ejemplo más, la descripción se refiere a una serie de mutaciones no transgénicas independientes inducidas por el ser humano en uno o más genes WPBF; las plantas de trigo que tienen una o más de estas mutaciones en al menos un gen WPBF de las mismas; y un método para crear e identificar mutaciones similares y/o adicionales en al menos un gen WPBF del trigo.

En otro ejemplo más, la descripción se refiere a una planta de trigo transgénica con un transgén que disminuye la expresión del gen WPBF y/o la actividad de la proteína WPBF, en donde dicho transgén contribuyó a que el grano tuviera gluten disminuido en comparación con el grano de una planta de tipo silvestre.

En otro ejemplo más, la descripción se refiere a una planta de trigo que tiene un gen WPBF modificado, en donde el gen WPBF está modificado mediante edición genómica, y además dicha modificación contribuye a que el grano tenga gluten disminuido en comparación con el grano de una planta de tipo silvestre.

I. Factor de unión a la caja de prolamina de trigo

El factor de unión a la caja de prolamina de trigo (WPBF), un factor de transcripción que se une al ADN con un dedo (DoF), funciona como un activador de la expresión del gen de la prolamina durante el desarrollo de la semilla; WPBF es un activador de los genes de proteínas de almacenamiento. Durante el desarrollo del endospermo central, la transcripción de los genes que codifican las proteínas de almacenamiento se regula temporal y espacialmente a través de una vía que requiere factores de transcripción que se unen a motivos del ADN específicos, incluida la caja del endospermo (EB) y el motivo ACAA. La EB consta de dos sitios de unión de proteínas distintos: el motivo similar a GCN4 y la caja de prolamina.

Las proteínas Dof son factores de transcripción vegetales que tienen un dominio de unión al ADN altamente conservado. El dominio Dof, que está compuesto por aproximadamente 50-60 residuos de aminoácidos, es similar al dominio de unión al ADN con dedos de zinc Cys2/Cys2 de GATA1 y los receptores de hormonas esteroides, pero tiene un bucle supuesto más largo en comparación con los dominios de dedos de zinc.

En un ejemplo, la descripción se refiere a disminuir la expresión del gen WPBF y/o disminuir la actividad de la proteína WPBF. En un ejemplo, la descripción se refiere a plantas con una expresión disminuida del gen WPBF y/o a la disminución de la actividad de la proteína WPBF. En un ejemplo, la disminución de la expresión del gen WPBF o la disminución de la actividad de la proteína WPBF se puede lograr mediante mutaciones no transgénicas, transgenes o edición genómica.

En un ejemplo, la descripción se refiere a la modificación del gen WPBF mediante mutaciones no transgénicas, o transgenes o edición genómica.

A. Gluteninas

El gluten de trigo es una mezcla binaria de gliadina y glutenina. Las gluteninas, que incluyen tanto las subunidades de glutenina de alto peso molecular (APM) como las subunidades de glutenina de bajo peso molecular (BPM), comprenden una clase económicamente importante de proteínas de almacenamiento de las semillas de trigo. Los pesos moleculares aparentes de los polipéptidos o las subunidades de glutenina de APM individuales oscilan entre 90 y 200 kDa. Estas subunidades se entrecruzan mediante enlaces disulfuro entre sí y con polipéptidos de glutenina de BPM para formar polímeros que superan el millón de daltons de peso molecular. Las gluteninas de APM constituyen del 8 al 10%, mientras que las gluteninas de BPM constituyen del 15 al 20% de la proteína total del endospermo. Tanto las proteínas gluteninas de APM como las de BPM desempeñan papeles funcionales importantes en la determinación de los usos finales de la harina de trigo.

En el trigo, las gluteninas de APM están codificadas en los loci Glu-1 en los brazos largos de los cromosomas del grupo 1. Cada locus consta de dos genes distintos, que codifican una subunidad de tipo x y una de tipo y, respectivamente. Tanto la cantidad como la identidad de los alelos específicos de glutenina de APM contribuyen a las diferencias en la calidad de elaboración del pan de diversas variedades cultivadas. Por ejemplo, la eliminación de los genes de glutenina da como resultado una disminución de los niveles generales de gluteninas de APM, lo que resulta en una disminución de la calidad de la elaboración del pan.

En un ejemplo, la descripción se refiere a plantas modificadas que tienen una mayor cantidad de gluteninas de alto peso molecular en comparación con las plantas de tipo silvestre. En un ejemplo, la descripción se refiere a composiciones y métodos para aumentar la cantidad de gluteninas de alto peso molecular en los granos. En otro ejemplo, la descripción se refiere a la modificación del gen del factor de unión a la caja de prolamina de trigo para aumentar la cantidad de gluteninas de alto peso molecular en los granos. En otro ejemplo más, la descripción se refiere a una o más mutaciones en el gen WPBF o modificaciones del gen WPBF para aumentar la cantidad de gluteninas de alto peso molecular en los granos.

En un ejemplo, la descripción se refiere a plantas, que incluyen la cebada, el centeno y el trigo, con una o más mutaciones en el gen WPBF o modificaciones del gen WPBF que tienen aproximadamente el 5%, o 10%, o 15%, o 20%, o 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de gluteninas de alto peso molecular en comparación con los granos de las plantas de tipo silvestre.

En un ejemplo, la descripción se refiere a plantas, que incluyen la cebada, el centeno y el trigo, con una o más mutaciones en el gen WPBF o modificaciones del gen WPBF que tienen de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 20%, o de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 40%, o de aproximadamente el 40% a aproximadamente el 60%, o de aproximadamente el 60% a aproximadamente el 80%, o del 80% a aproximadamente el 95% más de gluteninas de alto peso molecular en comparación con los granos de las plantas de tipo silvestre.

En un ejemplo, la descripción se refiere a plantas modificadas que tienen una cantidad disminuida de gluteninas de bajo peso molecular en comparación con las plantas de tipo silvestre. En un ejemplo, la descripción se refiere a composiciones y métodos para disminuir la cantidad de gluteninas de bajo peso molecular en los granos. En otro ejemplo, la descripción se refiere a la modificación del gen del factor de unión a la caja de prolamina de trigo para disminuir la cantidad de gluteninas de bajo peso molecular en los granos en comparación con los granos de tipo silvestre. En otro ejemplo más, la descripción se refiere a una o más mutaciones en el gen WPBF o modificaciones del gen WPBF para disminuir la cantidad de gluteninas de bajo peso molecular en los granos en comparación con los granos de tipo silvestre.

En un ejemplo, la descripción se refiere a plantas, que incluyen la cebada, el centeno y el trigo, con una o más mutaciones en el gen WPBF o modificaciones del gen WPBF que tienen aproximadamente menos del 5%, o menos del 10%, o menos del 15%, o menos del 20%, o menos del 25%, o menos del 30%, o menos del 40%, o menos del 50%, o menos del 60%, o menos del 70%, o menos del 80%, o menos del 85%, o menos del 90%, o menos del 95% de la cantidad de gluteninas de bajo peso molecular halladas en los granos de tipo silvestre.

En un ejemplo, la descripción se refiere a plantas, que incluyen la cebada, el centeno y el trigo, con una o más mutaciones en el gen WPBF o modificaciones del gen WPBF que tienen de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 20%, o de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 40%, o de aproximadamente el 40% a aproximadamente el 60%, o de aproximadamente el 60% a aproximadamente el 80%, o del 80% a aproximadamente el 95% menos de gluteninas de bajo peso molecular en comparación con los granos de las plantas de tipo silvestre.

B. Gliadina

La gliadina es la fracción proteica soluble en alcohol del gluten de trigo. Las gliadinas suelen ser ricas en glutamina y prolina, particularmente en la parte N-terminal. Por ejemplo, los primeros 100 aminoácidos de las alfa y gammagliadinas contienen aproximadamente un 35% y aproximadamente un 20% de residuos de glutamina y prolina, respectivamente.

En un ejemplo de la descripción, se proporcionan plantas modificadas que se diferencian de sus homólogos naturales por tener cantidades disminuidas de gliadinas en comparación con las plantas de tipo silvestre. En un ejemplo, la descripción se refiere a composiciones y métodos para disminuir la cantidad de gliadinas en los granos. En otro ejemplo, la descripción se refiere a la modificación del gen WPBF para disminuir la cantidad de gliadinas en los granos en comparación con los granos de tipo silvestre. En otro ejemplo más, la descripción se refiere a una o más mutaciones en el gen WPBF para disminuir la cantidad de gliadinas en los granos en comparación con los granos de tipo silvestre.

En un ejemplo, la descripción se refiere a plantas, que incluyen la cebada, el centeno y el trigo, con una o más mutaciones en el gen WPBF o modificaciones del gen WPBF que tienen aproximadamente menos del 5%, o menos del 10%, o menos del 15%, o menos del 20%, o menos del 25%, o menos del 30% o menos del 40% o menos del 50%, o menos del 60%, o menos del 70%, o menos del 80%, o menos del 85%, o menos del 90%, o menos del 95% de la cantidad de gliadinas en los granos de tipo silvestre.

En un ejemplo, la descripción se refiere a plantas, que incluyen la cebada, el centeno y el trigo, con una o más mutaciones en el gen WPBF o modificaciones del gen WPBF que tienen de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 20%, o de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 40%, o de aproximadamente el 40% a aproximadamente el 60%, o de aproximadamente el 60% a aproximadamente el 80%, o de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 95% menos de gliadinas en comparación con los granos de las plantas de tipo silvestre.

II Mutaciones del gen WPBF

A. Gen WPBF

En un ejemplo, la descripción se refiere a una o más mutaciones no transgénicas del gen WPBF. En otro ejemplo, la descripción se refiere a una o más mutaciones del gen WPBF. En un ejemplo, la descripción se refiere a múltiples mutaciones no transgénicas del gen WPBF que incluyen, entre otras, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y más de 10 mutaciones.

En otro ejemplo, el gen WPBF puede contener una o más mutaciones no transgénicas enumeradas en las Tablas 1-3 y las mutaciones correspondientes en los homeólogos y las combinaciones de los mismos.

En otro ejemplo, la descripción se refiere a mutaciones correspondientes a una o más mutaciones no transgénicas descritas en la presente memoria en el gen WPBF en un homeólogo correspondiente. A modo de ejemplo, una mutación identificada en el gen WPBF del genoma A puede ser una mutación beneficiosa en el gen WPBF del genoma B y/o D. Un experto en la técnica entenderá que la mutación en el homeólogo puede no estar exactamente en la misma ubicación.

Un experto en la técnica entiende que puede haber una variación natural en las secuencias genéticas de los genes WPBF en las diferentes variedades de trigo.

Los inventores han determinado que para lograr una disminución del gluten en los granos procedentes de las plantas, son deseables las mutaciones que reduzcan la función del gen WPBF. Las mutaciones preferidas incluyen los cambios de sentido y sin sentido, que incluyen las mutaciones que truncan prematuramente la traducción de una o más proteínas WPBF del ARN mensajero, como aquellas mutaciones que crean un codón de terminación dentro de la región codificante de un ARN mensajero de WPBF. Dichas mutaciones incluyen las inserciones, secuencias repetidas, mutaciones de la unión del corte y empalme, marcos de lectura abiertos (ORF) modificados y mutaciones puntuales.

En otro ejemplo más, hay una o más mutaciones en el gen WPBF del genoma A. En otro ejemplo, hay una o más mutaciones en el gen WPBF del genoma B. En otro ejemplo más, hay una o más mutaciones en el gen WPBF del genoma D. En otro ejemplo más, hay una o más mutaciones en los genes WPBF de los genomas A y B. En otro ejemplo más, hay una o más mutaciones en los genes WPBF de los genomas A y D. En otro ejemplo, hay una o más mutaciones en los genes WPBF de los genomas B y D. En otro ejemplo más, hay una o más mutaciones en los genes WPBF de los genomas A, B y D.

1. Genoma A

En un ejemplo, la descripción se refiere a múltiples mutaciones no transgénicas en el gen WPBF del genoma A que incluyen, entre otras, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y más de 10 mutaciones. En un ejemplo, hay una o más mutaciones no transgénicas en ambos alelos del gen WPBF del genoma A. En otro ejemplo, las mutaciones no transgénicas son idénticas en ambos alelos del gen WPBF del genoma A. En un ejemplo, las mutaciones son homocigotas.

En otro ejemplo más, hay una o más mutaciones en la región DoF del gen WPBF del genoma A. En otro ejemplo más, hay una o más mutaciones en la región DoF del gen WPBF que alteran la unión al ADN de la proteína WPBF. En otro ejemplo más, hay una o más mutaciones en la región DoF del gen WPBF que no alteran la unión al ADN pero alteran la función de WPBF de otra manera.

Las siguientes mutaciones identificadas en las Tablas 1-3 son ejemplos de las mutaciones creadas e identificadas según los diversos ejemplos descritos en la presente memoria. Se ofrecen a modo de ilustración, no de limitación. Debe entenderse que las mutaciones siguientes son meramente ejemplares y que también se contemplan mutaciones similares.

La Tabla 1 proporciona una lista de mutaciones representativas en el gen WPBF del genoma A. Una mutación ejemplar es G41A, que da como resultado un cambio de guanina a adenina en la posición del nucleótido 41 identificada según su posición en la secuencia de SEQ ID N°: 2. Esta mutación da como resultado un cambio de glicina a ácido aspártico en la posición del aminoácido 14 identificada según su posición en la proteína expresada (SEQ ID N°: 3). Un experto en la técnica entenderá que para ciertos alelos la posición del nucleótido puede variar ligeramente debido a regiones anteriores no traducidas. Todos los cambios de ácidos nucleicos que dan como resultado los cambios de aminoácidos enumerados en las Tablas 1-3 están abarcados en la presente memoria.

Tabla 1: Mutaciones representativas en el gen WPBF del genoma A

En un ejemplo, la descripción se refiere a un polinucleótido del gen WPBF del genoma A con una o más mutaciones no transgénicas enumeradas en la Tabla 1 y que corresponde a la SEQ ID N°: 2. En otro ejemplo, el polinucleótido con una o más mutaciones no transgénicas enumeradas en la Tabla 1 tiene un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más del 99% de identidad respecto de SEQ ID N°: 2.

En otro ejemplo más, el polinucleótido con una o más mutaciones no transgénicas enumeradas en la Tabla 1 codifica una proteína WPBF, en donde la proteína WPBF comprende una o más mutaciones no transgénicas y tiene un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más del 99% de identidad respecto de SEQ ID N°: 3.

SEQ ID N° 1: Factor de unión a la caja de prolamina de trigo (WPBF), genoma A (la secuencia de nucleótidos puede diferir muy levemente en los diferentes alelos de las diferentes variedades de trigo):

CTGGCTTGCTCATTTTGCGGTAGTGTTTAAACATCGGCTAGCCTTACGGGTATAAAAAGGTG

GGCAACTTCACCCTATCCCATAGCACTAGACCAAAGAACACCTATACTCCATACTACCCTTC

GTTCACCTGGTGAGCTTCTTCTTCCTTTGATCTATATCACTTACTATTTCTCCCTTGTCCAGCT

TCTTCTTCTTCCTCGTGCATGCGACTTTTTCTAGATAATATCCCGCACTATCGCTCGCCGCAA

GATGTGCTAGCTAGCGATCTTCACTTTAATACCTGTTGTAGATCTAACCACGGGCTATTCCAA

AAAATATTTGTCTTGTTTGCGTGTTCCTGTGTACATGCACGTATCTAGATCTTGATTTTGAAG

AATTCATAATTAATTCATGACCTACCTTGTTTGGTTTGTGTAATTTTGATGTTGTCGTATCAAT

TTTAGCAAACCACTCGTAGCTAGAACAATAGAGGGGGCGATCGTATGTTTCTGTTTTGAAAA

GGGGATATTTCCAGGCTCTGCATCGGTTCATGCACACAGCCGTTACCACATTCAATAGGCAC

TGATCCATGGATGCATGCCAGATTTACTAGTTTTGTATACAAAGTTTTACTTTTTTGCTTTGAT

TTATGAAAAGTTGGATCAGATTTTGCAGTTCTCTTTTATCCATGTTGGATTCACTACTTTGTA

CCCAAGATTTTATTTATTTTGTCTTGGTTTCTTACCTGCCTGGTTAGTAACTAGGAGATCCTG

GGATTAGACTTTCAAGGAATCCTAATACTAGTGAGTATAGGGAAAGGAAGCTTATTTTTAAG

CTGCCCAAAAGAATGGGCGCTTAGAGTTGTAGTTGATTAATTGAATCTGTTCTGTGGATTTG

AGAATTTCAGACCTGATTCTACATGACATTTTGAGTTAACCAATGATTCTACATGTCTCACTC

CTTGGGATTAACAATTTAACTTTATTTAATTCGATATGTGTGTACACATGTGTTGCAGATGGA

GGAAGTGTTTCCGTCAAACTCCAAGAGCAAGGCCGGTCAGATGGCGGGGGAGGCGACAGCG

GCGGCGGAGAAGAAGCCTCGGCCGAAGCCAGAGCAGAAGGTGGAATGCCCTCGGTGCAAG

TCTGGCAACACCAAGTTCTGCTACTACAACAACTATAGTATGTCTCAGCCCCGCTACTTCTGC

AAGGCCTGCCGCCGCTACTGGACCCATGGTGGCTCCCTCCGCAACGTCCCCATCGGTGGCGG

CTGCCGCAAGCCCAAGCGCCCGGGGACCTCCGACGCCCACAAGCTCGGCGTGGCCTCCTCGT

CAGAACCCACGGTTGTCATGCCGCCCTCGACCTGCACAGGGATGAACTTTGCCAACGTCCTC

CCAACATTTATGTCTGCTGGTTTTGAGATTCCAAGCAGCCTTTCCCTGACTGCCTTTGGGTCA

TCGTCATCGTCCAACACGGCGGCAGTGATGTCCCCTGGTGGGACGACGTCATTTCTAGACGT

GTTGAGAGGGGGCGCAGGAGGGCTTCTTGATGGCAGCCTCAGTCAGAACAATGGCTACTAC

TATGGTGGGCCTGCCACTGGATCAGGCATTGGGATGCTGATGACGCCGCCAGTGGCGTCATT

TGGCATTCCAGGTCCGATGCAGCAACATGGTGATCTCGTGGTTGGTGGAAATGGAATAGGTG

CTGCAACTGCTTCAATATTTCAGGGGGGCACTGGCGAGGAAGGAGATGATGGTACGGGGGG

CGTGATGGGGCTCCAATGGCAGCCACAGGTTGGCAATGGTGGAGGTGCTGGTGTTGTATCAG

GAGGCGTGCATCACCTTGGGACTGGGAACAATGTGACGATGGGCAACAACAATATACACAA

CAACAACAATAACAACAGTGGGGGTGATGACAACAATGGTGCGTCATCGAGGGATTGCTAC

TGGATCAACAATGGAGGATCGAACCCATGGCAGAGCCTCCTCAACAACAGCTCCCTGATGT

AAGT GC AATA AGAAA AT GGGAAAT GGAGGT CAT

SEQ ID N° 2: Factor de unión a la caja de prolamina de trigo (WPBF), región codificante A:

ATGGAGGAAGTGTTTCCGTCAAACTCCAAGAGCAAGGCCGGTCAGATGGCGGGGGAGGCGA

CAGCGGCGGCGGAGAAGAAGCCTCGGCCGAAGCCAGAGCAGAAGGTGGAATGCCCTCGGT

GCAAGTCTGGCAACACCAAGTTCTGCTACTACAACAACTATAGTATGTCTCAGCCCCGCTAC

TTCTGCAAGGCCTGCCGCCGCTACTGGACCCATGGTGGCTCCCTCCGCAACGTCCCCATCGG

TGGCGGCTGCCGCAAGCCCAAGCGCCCGGGGACCTCCGACGCCCACAAGCTCGGCGTGGCC

TCCTCGTCAGAACCCACGGTTGTCATGCCGCCCTCGACCTGCACAGGGATGAACTTTGCCAA

CGTCCTCCCAACATTTATGTCTGCTGGTTTTGAGATTCCAAGCAGCCTTTCCCTGACTGCCTT

TGGGTCATCGTCATCGTCCAACACGGCGGCAGTGATGTCCCCTGGTGGGACGACGTCATTTC

TAGACGTGTTGAGAGGGGGCGCAGGAGGGCTTCTTGATGGCAGCCTCAGTCAGAACAATGG

CTACTACTATGGTGGGCCTGCCACTGGATCAGGCATTGGGATGCTGATGACGCCGCCAGTGG

C GTC ATTT GGC ATT C C AGGTCC GAT GC AGC A AC AT GGT GAT C TC GT GGTT GGT GGAAAT GGA

ATAGGTGCTGCAACTGCTTCAATATTTCAGGGGGGCACTGGCGAGGAAGGAGATGATGGTA

C GGGGGGCGT GAT GGGGC T C C A AT GGC AGC C AC AGGTTGGC AATGGT GGAGGT GC T GGT GT

TGTATCAGGAGGCGTGCATCACCTTGGGACTGGGAACAATGTGACGATGGGCAACAACAAT

ATACACAACAACAACAATAACAACAGTGGGGGTGATGACAACAATGGTGCGTCATCGAGGG

ATTGCTACTGGATCAACAATGGAGGATCGAACCCATGGCAGAGCCTCCTCAACAACAGCTCC

CTGATG

SEQ ID N° 3: Secuencia de aminoácidos de WPBF-A:

' MEEVFPSNSKSKAGQMAGEATAAAEKKPRPKPEQKVECPRCKSGNTKFCYYNNYSMSQ

PRYFCKACRRYWTHGGSLRNVPIGGGCRKPKRPGTSDAHKLGVASSSEPTVVMPPSTCTGMNFA

NVLPTFMSAGFEIPSSLSLTAFGSSSSSNTAAVMSPGGTTSFLDVLRGGAGGLLDGSLSQNNGYY

YGGPATGSGIGMLMTPPVASFGIPGPMQQHGDLVVGGNGIGAATASIFQGGTGEEGDDGTGGV

MGLQWQPQ V GN GGGAGVV S GGVHHLGT GNNVTMGNNNIHNNNNNN S GGDDNN GA S SRDC Y

WINNGGSNPWQSLLNNS SLM

2. Genoma B

En un ejemplo, la descripción se refiere a múltiples mutaciones no transgénicas en el gen WPBF del genoma B que incluyen, entre otras, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y más de 10 mutaciones. En un ejemplo, una o más mutaciones no transgénicas están en ambos alelos del gen WPBF del genoma B. En otro ejemplo, las mutaciones no transgénicas son idénticas en ambos alelos del gen WPBF del genoma B. En otro ejemplo más, las mutaciones son homocigotas.

En otro ejemplo más, hay una o más mutaciones en la región DoF en el gen WPBF del genoma B. En otro ejemplo más, hay una o más mutaciones en la región DoF del gen WPBF que alteran la unión al ADN de la proteína W p Bf . En otro ejemplo más, hay una o más mutaciones en la región DoF del gen WPBF que no alteran la unión al ADN pero alteran la función de WPBF de otra manera.

La Tabla 2 proporciona una lista representativa de las mutaciones en el gen WPBF del genoma B de las plantas de trigo Kronos y Express. Los cambios de nucleótidos y aminoácidos se identifican según sus posiciones en las SEQ ID N°: 5 y 6, respectivamente. El indica un codón de parada.

Tabla 2. Mutaciones representativas en el gen WPBF del genoma B

En un ejemplo, la descripción se refiere a un polinucleótido del gen WPBF del genoma B con una o más mutaciones no transgénicas enumeradas en la Tabla 2 y que corresponde a la SEQ ID N°: 5. En otro ejemplo, el polinucleótido con una o más mutaciones no transgénicas enumeradas en la Tabla 2 tiene un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más del 99% de identidad respecto de SEQ ID N°: 5.

En otro ejemplo más, el polinucleótido con una o más mutaciones no transgénicas enumeradas en la Tabla 2 codifica una proteína WPBF, en donde la proteína WPBF comprende una o más mutaciones no transgénicas y tiene 85%, 86%, 87%, 88%., 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más del 99% de identidad respecto de SEQ ID N°: 6.

SEQ ID N° 4: WPBF-B (genoma B):

CTGGCTTGCTCATTTTGCGGTAGTGTTTAAACATTGGCTGGAATTACGGGTATAAAAAGGAG

GGCAACTTCACCCTATCCCATAGCACTAGACCAAACAACTCCTATACTCCATACTACCCTTC

ATTCACCTGGTGAGCTTCTTCTTTCTTTGATTTCTATCACTTACTCTTTCTCCCTCGTCCAGCTT

CTTCTTCTTCCTCGTGCATGTGACTTTTGCTAGATAATCTCCCACATTATCGCTCAATGCAAG

CCGTGCTAGCTAGCTAGCGATCTAGCTAGCGATCTTCACTTTAATACCCGTTGTAGATCTAAC

CATGGGCTATTCCAAAACATATTTCTCTTGTTTGCGTGTTCGTGTGTACATGCATGCATCTAG

ATCTTGATTTTGAGGAATTCATAAGTAATTCCTGACCTACCTTGTTTGGTTTGTTTAATTTTGA

TGTTGTTGTCTCAATTTTAGCAAATTGCTCGTAGCTAGAACAATAGAGGGGGCGGCCGTATG

TTTCCGTTTTGAAAAGGGGATATTTCCAGGCTCTGCATCGGTTGATGCACACAGCCGTTACC

ACATTCAATAGGCACTGATCCATGGATGCATGCTATATTTACAAGTTTTCTATAGAAATTTTT

TTTATTTATGAAAAATTGGATCGGTATAGTTCTTCTTTATCCATGTCGGATTCACTACTTTGTA

CCCAAGATTTTATTTATTTTGTCTCGGTTTCTTACATGTCTAGTTAGGTAACTAGGAGAGCCT

GGGATTAGGCTTTCAAGGAATCCTAATACTAGAGACTATGGGGAGAGACAGCTTATTCTTTA

AGCTGCGCAAAAGAATGGGCGCTTAGAGTTGTAGTTGATAAATTGAATCTGTTGTATGGATT

TGAGAATTTGAGACCTGATTATGCACTTATCATGAAATTTTGAGTTAACCAATGATTCTACAT

GTCTCACTCCTTAGGATTAACAATTTAACTTAATTTAATTCGATATGTGTGTACACATGTGTT

GAAGATGGAGGAAGTGTTTCCGTCAAACTCCAAGAGCAAGGCTGGTCAGATGGCGGGGGAG

GCGACAGCGGCGGCGGAGAAGAAGCCTCGGCCGAAGCCAGAGCAGAAGGTGGAATGCCCT

CGGTGCAAGTCTGGCAACACCAAGTTCTGCTACTACAACAACTATAGTATGTCTCAGCCCCG

CTACTTCTGCAAGGCCTGCCGCCGCTACTGGACCCATGGTGGGTCCCTCCGTAACGTCCCCA

T C GGT GGT GGC TGC C GC AAGC C C AAGC GC TC GGGGAC C T C CGAC GC CC AC AAGC T C GGC GT

GGCCTCCTCGTCGGAACACACGGCTGTCATGCCCCCCTCGACCTGCACAGGGATAAACTTTG

CCAATGTCCTCCCGACGTTTATGTCTGCTGGTTTTGAGATTCCAAGAAGCCTTTCCCTGACCA

C CTTT GGGT C ATC GtcGT C GTC C A AC AC GAC GGC TGTC ATGTC C CC T GGT GGGAC GAC GTC AT

TTCTAGACGTGCTGAGAGGGGGAACAGGAGGGCTTCTTGATGGCAACCTCGGTCAGAACAA

TGGCTACTACTATGGTGGGTCTAGATCAGGCATTGGGATGCTGATGACGCCGCCAGCGGCGT

CATTTGGCATTCCAGGTCCAATGCAGCAGCATGGCGATCTCATGGTTGGTGGAAATGGAATA

GGTGCCGCAACTGCTTCAATATTTCAGGGGGGCACTGGTGAGGAAGGAGATGACGGCAAAG

GGGCCATGATGGGGCTCCAATGGCAGCCACATGTTGGTAATGGTGGAGGTGGTGGTGTTGTA

TCAGGAGGCGTGCATCACCTTGGGACTGGGAACAATGTGACGATGGGCAACAACAACATAA

ACAACAATAACAATAATGGCAGCCACAGTGATGACAACACTGGTGGGTCATCGAGGGATTG

CTACTGGATCAATAATGGAGGATCGAACCCATGGCAAAGCCTCCTCAATAGCAGCTCCCTGA

T GT AAGT GC A AGAAGA AAAT GCGAAAT GGAGAT C AT

SEQ ID N° 5: Secuencia codificante de WPBF-B:

AT GGAGGA AGT GTTTC C GT C AAAC T C C AAGAGC A AGGC T GGT C AGAT GGCGGGGGAGGC GA

CAGCGGCGGCGGAGAAGAAGCCTCGGCCGAAGCCAGAGCAGAAGGTGGAATGCCCTCGGT

GCAAGTCTGGCAACACCAAGTTCTGCTACTACAACAACTATAGTATGTCTCAGCCCCGCTAC

TTCTGCAAGGCCTGCCGCCGCTACTGGACCCATGGTGGGTCCCTCCGTAACGTCCCCATCGG

TGGTGGCTGCCGCAAGCCCAAGCGCTCGGGGACCTCCGACGCCCACAAGCTCGGCGTGGCC

TCCTCGTCGGAACACACGGCTGTCATGCCCCCCTCGACCTGCACAGGGATAAACTTTGCCAA

TGTCCTCCCGACGTTTATGTCTGCTGGTTTTGAGATTCCAAGAAGCCTTTCCCTGACCACCTT

T GGGT C ATC GtcGT C GTC C AAC AC GAC GGC TGTCATGTCCCCT GGT GGGAC GACGT C ATTTC T

AGACGTGCTGAGAGGGGGAACAGGAGGGCTTCTTGATGGCAACCTCGGTCAGAACAATGGC

TACTACTATGGTGGGTCTAGATCAGGCATTGGGATGCTGATGACGCCGCCAGCGGCGTCATT

TGGCATTCCAGGTCCAATGCAGCAGCATGGCGATCTCATGGTTGGTGGAAATGGAATAGGTG

CCGCAACTGCTTCAATATTTCAGGGGGGCACTGGTGAGGAAGGAGATGACGGCAAAGGGGC

CATGATGGGGCTCCAATGGCAGCCACATGTTGGTAATGGTGGAGGTGGTGGTGTTGTATCAG

GAGGCGT GCATCACCTT GGGAC T GGGA AC A AT GT GAC GAT GGGC AAC AAC A AC AT AAAC A A

CAATAACAATAATGGCAGCCACAGTGATGACAACACTGGTGGGTCATCGAGGGATTGCTAC

TGGATCAATAATGGAGGATCGAACCCATGGCAAAGCCTCCTCAATAGCAGCTCCCTGATG

SEQ ID N° 6: Secuencia de aminoácidos de WPBF-B:

MEEVFPSNSKSKAGQMAGEATAAAEKKPRPKPEQKVECPRCKSGNTKFCYYNNYSMSQPRYFC

KACRRYWTHGGSLRNVPIGGGCRKPKRSGTSDAHKLGVASSSEHTAVMPPSTCTGINFANVLPT

FMSAGFEIPRSLSLTTFGSSSSSNTTAVMSPGGTTSFLDVLRGGTGGLLDGNLGQNNGYYYGGSR

SGIGMLMTPPAASFGIPGPMQQHGDLMVGGNGIGAATASIFQGGTGEEGDDGKGAMMGLQWQ

PHV GNGGGGGVVSGGVHHLGTGNNVTMGNNNINNNNNN GSHSDDNT GGS SRDC YWINNGGS

NPWQSLLNSSSLM

3. Genoma D

En un ejemplo, la descripción se refiere a múltiples mutaciones no transgénicas en el gen WPBF del genoma D que incluyen, entre otras, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y más de 10 mutaciones. En un ejemplo, una o más mutaciones no transgénicas están en ambos alelos del gen WPBF del genoma D. En otro ejemplo, las mutaciones no transgénicas son idénticas en ambos alelos del gen WPBF del genoma D.

La Tabla 3 proporciona ejemplos representativos de mutaciones creadas e identificadas en el gen WPBF del genoma D de las plantas de trigo Express. Los cambios de nucleótidos y aminoácidos se identifican según sus posiciones en las SEQ ID N°: 8 y 9, respectivamente.

Tabla 3. Lista representativa de mutaciones en el gen WPBF del genoma D

En un ejemplo, la descripción se refiere a un polinucleótido del gen WPBF del genoma D con una o más mutaciones no transgénicas enumeradas en la Tabla 3 y que corresponde a la SEQ ID N°: 8. En otro ejemplo, el polinucleótido con una o más mutaciones no transgénicas enumeradas en la Tabla 3 tiene un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más del 99% de identidad respecto de SEQ ID N°: 8.

En otro ejemplo más, el polinucleótido con una o más mutaciones no transgénicas enumeradas en la Tabla 3 codifica una proteína WPBF, en donde la proteína WPBF comprende una o más mutaciones no transgénicas y tiene un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más del 99% de identidad respecto de SEQ ID N°: 9.

SEQ ID N° 7: WPBF-D (genoma D):

CTGGCTTGCTCATTCTGCGGTAGTGTTTAAACATCAGCTAGCCTTACGGGTATAAAAAGGTG

GGCAACTTCACCCTATCCCATAGCACTAGACCAAACAACACCTATACTCCATACTACCCTTC

ATTCACCTGGTGAGATTCTTCTTCCTTTGATCTCTATCACTTACTCTTTCTCCCTTCTTCTTCTT

CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCCTCGTGCATGCTAC

TTTTGCTACATAATCTCCTGCAGTATCGCTCGCCGCAAGCTGTGCTAGCTAGCTAGCGATCTT

CACTTTAAGACCCGTTGTAGATCTAGCCACGGGCTATTCCAAAAAATATTTCTCTTGTTTGCG

TGTTCCTGTGTACATGCATGTATTTAGATCTTGATCTTGAAGAATTCATACTGAATTCATGAC

CTACCTTGTTTGGTTTGTGTAATTTTGATGTTGTTGTATCAATTTTAGCAAACCGCTCGTAGCT

AGAACAATAGAGGGGGCGGCCGTATGTTTCCATTTCGAAAAGGGGATATTTCCAGGCTCTGC

ATCGGTTCATGCACACAGCCGTTACCACATTCAATAGGCACTAATCCATGGATGCATGCCAG

ATTTACTAGTTTTGTTTACAAAGTTTTATTTTTTTTTGCTTTGATTTACGAAAAATTGGATCGG

ATTTTGCAGTTCTTTTTTATCCATGTTGGATTCACTACTTTGAACCCAAGATTTTATTTATTTT

GTCTCGGTTTCTTACACGCCTGGTTAGGTAACTAGGAGATCCTGGGATTAGGCTTTCAAGGA

ATCCTAATACTAGAGAGTATGGGGAGAGGCACCTTATTTTTTAAGTTGCCCAAAAGAATGGG

CGCTTAGAGTTGTAGCTAATTAATTGAATCTGTTGTATGGATCTGAGAATTTGAGACCTGATT

ATGCACTTATCATGACATTTTGAGTCAACCAATGATTCTACATGTCTCACTCCTTAGGATTAA

CAATTTAACTTAATTTAATTCGATATGTGTGTACACATGTGTTGTAGATGGAGGAAGTGTTTC

CGTCAAACTCCAAGAGCAAGGCAGGTCAGATGGCGGGGGAGGCGATAGCGGGGGCGGAGA

AGAAGCCTCGGCCAAAGCCAGAGCAGAAGGT GGAAT GCCCTCGGTGCAAGT CT GGCAACAC

CAAGTTCTGCTACTACAACAACTATAGTATGTCTCAGCCCCGCTACTTCTGCAAGGCCTGCC

GCCGCTACTGGACCCATGGTGGCTCCCTCCGCAACGTCCCCATCGGTGGTGGCTGCCGCAAG

CCCAAGCGCTCGGGGACCTCCGACGCCCACAAGCTCGGCGTGGCCTCCTCACCGGAACCCAC

GACTGTCGTGCCCCCCTCGACCTGCACAGGGATGAACTTTGCGAACGTCCTCCCGACGTTTA

TGTCTGTTGGTTTTGAGATTCCAAGCAGCCTTTCCCTAACCGCCTTTGGGTCATCAtcGTCGTC

CAACACGGCGGCGATGATGTCCCCTGGTGGGACGACGTCATTTCTAGACGTGCTAAGAGGG

GGTGCAGGAGGGCTTCTTGATGGCAGCCTCAGTCAGAACAATGGCTACTACTATGGTGGGCC

AGCCATTGGATCAGGCAATGGGATGCTGATGACGCCGCCAGCGGTGTCATTTGGCATTCCAG

TTCCGATGCAGCAGCATGGTGATCTCGTGGTTGGTGGAAATGGAATAGGTGCCGCAACTGCT

TCAATATTTCAAGGGGCCACTAGCGAGGAAGGAGATGACGGCATGGGGGGCGTGATGGGGC

TCCAATGGCAACCACAGGTTGGCAATGGTGGAGGTGGTGGTGGTGTATCAGGAGGCGTGCA

TCACCTTGGGACTGGGAACAATGTGACGATGGGCAACAGCAACATACACAACAACAACAAT

AACGACAGCGGCGGTGATGACAACAATGGTGGGTCATCGAGGGATTGCTACTGGATCAACA

ATGGAGGATCAAACCCATGGCAGAGCCTCCTCAACAGCAGCTCCCTGATGTAAGTGCAAGA

AGAAAAT GGGAAAT GGAGGT CAT

SEQ ID N° 8: Secuencia codificante de WPBF-D:

ATGGAGGAAGTGTTTCCGTCAAACTCCAAGAGCAAGGCAGGTCAGATGGCGGGGGAGGCGA

TAGCGGGGGCGGAGAAGAAGCCTCGGCCAAAGCCAGAGCAGAAGGTGGAATGCCCTCGGT

GCAAGTCTGGCAACACCAAGTTCTGCTACTACAACAACTATAGTATGTCTCAGCCCCGCTAC

TTCTGCAAGGCCTGCCGCCGCTACTGGACCCATGGTGGCTCCCTCCGCAACGTCCCCATCGG

TGGTGGCTGCCGCAAGCCCAAGCGCTCGGGGACCTCCGACGCCCACAAGCTCGGCGTGGCC

TCCTCACCGGAACCCACGACTGTCGTGCCCCCCTCGACCTGCACAGGGATGAACTTTGCGAA

CGTCCTCCCGACGTTTATGTCTGTTGGTTTTGAGATTCCAAGCAGCCTTTCCCTAACCGCCTT

TGGGTCATCAtcGTCGTCCAACACGGCGGCGATGATGTCCCCTGGTGGGACGACGTCATTTCT

TACTACTATGGTGGGCCAGCCATTGGATCAGGCAATGGGATGCTGATGACGCCGCCAGCGGT

GTCATTTGGCATTCCAGTTCCGATGCAGCAGCATGGTGATCTCGTGGTTGGTGGAAATGGAA

TAGGTGCCGCAACTGCTTCAATATTTCAAGGGGCCACTAGCGAGGAAGGAGATGACGGCAT

GGGGGGCGT GAT GGGGCTCCA AT GGCA ACCAC AGGTT GGC AAT GGT GGAGGT GGT GGT GGT

GTATCAGGAGGCGTGCATCACCTTGGGACTGGGAACAATGTGACGATGGGCAACAGCAACA

TACACAACAACAACAATAACGACAGCGGCGGTGATGACAACAATGGTGGGTCATCGAGGGA

TTGCTACTGGATCAACAATGGAGGATCAAACCCATGGCAGAGCCTCCTCAACAGCAGCTCCC

TGATG

SEQ ID N° 9: Secuencia de aminoácidos de WPBF-D

MEEVFPSNSKSKAGQMAGEAIAGAEKKPRPKPEQKVECPRCKSGNTKFCYYNNYSMSQPRYFC

KACRRYWTHGGSLRNVPIGGGCRKPKRSGTSDAHKLGVASSPEPTTVVPPSTCTGMNFANVLPT

FMSYGFEIPSSLSLTAFGSSSSSNTAAMMSPGGTTSFLDYLRGGAGGLLDGSLSQNNGYYYGGPA

IGSGNGMLMTPPAVSFGIPVPMQQHGDLVVGGNGIGAATASIFQGATSEEGDDGMGGVMGLQW

QPQV GN GGGGGGV S GGVHHLGT GNNVTMGN SNIHNNNNNDS GGDDNN GGS SRDC YWINN GG

SNPWQSLLNSSSLM

4. Región Dof

En un ejemplo, la descripción se refiere a múltiples mutaciones no transgénicas en la región Dof del gen WPBF del genoma A, B o D. En un ejemplo, la descripción se refiere a múltiples mutaciones no transgénicas en la región Dof del gen WPBF del genoma A y B. En un ejemplo, la descripción se refiere a múltiples mutaciones no transgénicas en la región Dof del gen WPBF del genoma A y D. En un ejemplo, la descripción se refiere a múltiples mutaciones no transgénicas en la región Dof del gen WPBF del genoma B y D.

En otro ejemplo más, la descripción se refiere a una o más mutaciones no transgénicas en la región Dof como se muestra en SEQ ID N° 10 del gen WPBF.

En otro ejemplo más, la descripción se refiere a una o más mutaciones no transgénicas en la región Dof como se muestra en SEQ ID N° 11 de la proteína WPBF. Se puede mutar uno o más de los 63 aminoácidos mostrados en SEQ ID N° 11. Las mutaciones pueden ser graves o conservativas.

En un ejemplo, la Q de la posición 28 de SEQ ID N° 11 está mutada. En un ejemplo, la glutamina (Q) de la posición 28 de SEQ ID N° 11 puede mutarse hasta una leucina (L).

SEQ ID N° 10: Región Dof del gen WPBF

AAGCCAGAGCAGAAGGTGGAATGCCCTCGGTGCAAGTCTGGCAACACCAAGTTCTGCTACT

ACAACAACTATAGTATGTCTCAGCCCCGCTACTTCTGCAAGGCCTGCCGCCGCTACTGGACC

CATGGTGGCTCCCTCCGCAACGTCCCCATCGGTGGTGGCTGCCGCAAGCCCAAGCGCTCGGG

GACC SEQ ID N° 11: región Dof de la proteína WPBF

KPEQKVECPRCKSGNTKFCYYNNYSMSQPRYFCKACRRYWTHGGSLRNVPIGGGCRKPKRSGT

B. Proteínas WPBF

En otro ejemplo más, la descripción se refiere a una o más mutaciones no transgénicas en el gen WPBF (como se analizó anteriormente en la sección titulada Mutaciones de WPBF) que dan como resultado una proteína WPBF con una o más mutaciones en comparación con la proteína WPBF de tipo silvestre. En un ejemplo, las mutaciones no transgénicas incluyen, entre otras, las mutaciones enumeradas en las Tablas 1-3, las mutaciones correspondientes en los homeólogos y las combinaciones de las mismas.

En otro ejemplo, la descripción se refiere a una o más mutaciones no transgénicas en el gen WPBF que inhiben la producción de la proteína WPBF. En algunos ejemplos, una mutación en el gen WPBF disminuye la expresión de la proteína WPBF. En otros ejemplos, una mutación en el gen WPBF crea una proteína WPBF inestable o con una función disminuida.

1. Nivel de expresión de la proteína WPBF

En otro ejemplo, el nivel de expresión de la proteína WPBF con una o más mutaciones descritas en la presente memoria se reduce en un 0-2%, 2-5%, 5-7%, 7-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-35%, 35-40%, 40-45%, 45-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95% y 95-99% del nivel de expresión de la proteína WPBF de tipo silvestre.

En otro ejemplo más, el nivel de expresión de la proteína WPBF con una o más mutaciones descritas en la presente memoria se reduce del 10 al 20%, o del 20 al 30%, o del 30 al 40%, o del 40 al 50%, o del 50-60%, o del 60-70%, o del 70-80%, o del 80-90%, o del 90-99% en comparación con el nivel de expresión de la proteína WPBF de tipo silvestre.

2. Actividad de la proteína WPBF

En otro ejemplo más, la actividad de la proteína WPBF con una o más mutaciones descritas en la presente memoria se reduce al 0-1, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% y en más del 99% del nivel de actividad de la proteína WPBF de tipo silvestre. En otro ejemplo, la proteína WPBF con una o más mutaciones descritas en la presente memoria no tiene actividad o tiene una actividad nula en comparación con la proteína WPBF de tipo silvestre.

En otro ejemplo más, la actividad de la proteína WPBF con una o más mutaciones descritas en la presente memoria es del 1 -10% o del 10-30% o del 30-50% o del 50-70% o del 70-80% o del 80-90% o del 90-95% del nivel de actividad de la proteína WPBF de tipo silvestre.

III. Transgenes

En un ejemplo, la descripción se refiere a una planta transgénica que comprende un transgén que codifica un polinucleótido, que regula negativamente la expresión del gen WPBF y/o la actividad de la proteína WPBF. Los ejemplos de dichos polinucleótidos incluyen, entre otros, un polinucleótido complementario, un polinucleótido codificante, un polinucleótido catalítico, un microARN artificial o una molécula de ARN dúplex.

En un ejemplo, la descripción se refiere a una planta de trigo que comprende un transgén que disminuye la expresión del gen WPBF y/o la actividad de la proteína WPBF, en donde la planta de trigo tiene granos con gluten disminuido en comparación con los granos de una planta de tipo silvestre.

A. Polinucleótidos complementarios

Se considerará que la expresión "polinucleótido complementario" se refiere a una molécula de ADN o ARN, o una combinación de las mismas, que es complementaria respecto de al menos una porción de una molécula de ARNm específica que codifica WPBF y que es capaz de interferir con un evento postranscripcional tal como la traducción del ARNm.

Un polinucleótido complementario en una planta se hibridará con un polinucleótido objetivo en las condiciones fisiológicas. Como se usa en la presente memoria, la expresión "un polinucleótido complementario que se hibrida en las condiciones fisiológicas" significa que el polinucleótido (que es total o parcialmente monocatenario) es al menos capaz de formar un polinucleótido bicatenario con el ARNm que codifica una proteína.

Las moléculas complementarias pueden incluir secuencias que corresponden al gen estructural o secuencias que efectúan el control sobre la expresión génica o un evento de corte y empalme. Por ejemplo, la secuencia complementaria puede corresponder a la región codificante seleccionada como objetivo de WPBF o la región no traducida (UTR) de 5' o la 3'-UTR o una combinación de estas. Puede ser complementaria en parte a secuencias de intrones, que pueden cortarse durante o después de la transcripción, preferiblemente sólo a secuencias de exones del gen objetivo. En vista de la divergencia generalmente mayor de las UTR, la selección como objetivo de estas regiones proporciona una mayor especificidad de la inhibición genética.

La longitud de la secuencia complementaria debe ser de al menos 19 nucleótidos contiguos, preferiblemente de al menos 50 nucleótidos y más preferiblemente de al menos 100, 200, 500 o 1000 nucleótidos. Puede usarse la secuencia de longitud completa complementaria a todo el transcrito del gen. La longitud es lo más preferentemente de 100-2000 nucleótidos. El grado de identidad de la secuencia complementaria con el transcrito objetivo debe ser al menos del 90% y más preferiblemente del 95-100%. Por supuesto, la molécula de ARN complementaria puede comprender secuencias no relacionadas, que pueden funcionar para estabilizar la molécula.

B. Polinucleótidos catalíticos

El término polinucleótido/ácido nucleico catalítico se refiere a una molécula de ADN o una molécula que contiene ADN (también conocida en la técnica como "desoxirribozima") o un ARN o una molécula que contiene ARN (también conocida como "ribozima") que reconoce específicamente una sustrato distinto y cataliza la modificación química de ese sustrato. Las bases de ácido nucleico del ácido nucleico catalítico pueden ser las bases A, C, G, T (y U para el ARN).

Normalmente, el ácido nucleico catalítico contiene una secuencia complementaria para el reconocimiento específico de un ácido nucleico objetivo y una actividad enzimática de escisión del ácido nucleico (también denominada en la presente memoria "dominio catalítico").

Las ribozimas de las plantas descritas en la presente memoria y el ADN que codifica las ribozimas se pueden sintetizar químicamente usando métodos muy conocidos en la técnica. Las ribozimas también se pueden preparar a partir de una molécula de ADN (que tras la transcripción produce una molécula de ARN) unida de forma operable a un promotor de la ARN polimerasa, p. ej., el promotor de la ARN polimerasa T7 o la ARN polimerasa SP6. Cuando el vector también contiene un promotor de a Rn polimerasa unido de forma operable a la molécula de ADN, la ribozima se puede producirin vitrotras la incubación con la ARN polimerasa y nucleótidos. En un ejemplo distinto, el ADN se puede insertar en un casete de expresión o en un casete de transcripción. Después de la síntesis, la molécula de ARN puede modificarse mediante ligadura a una molécula de ADN que tenga la capacidad de estabilizar la ribozima y hacerla resistente a la ARNasa.

Al igual que con los polinucleótidos complementarios descritos en la presente memoria, los polinucleótidos catalíticos también deberían ser capaces de hibridarse con una molécula de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ARNm que codifica WPBF) en las "condiciones fisiológicas", es decir, las condiciones del interior de una célula vegetal.

C. Interferencia de ARN

La interferencia de ARN (ARNi) es particularmente útil para inhibir específicamente la producción de una proteína particular. Esta tecnología se basa en la presencia de moléculas de ARNbc que contienen una secuencia esencialmente idéntica al ARNm del gen de interés o parte del mismo. Convenientemente, el ARNbc puede producirse a partir de un único promotor en un vector recombinante o célula huésped, donde las secuencias codificantes y complementarias están flanqueadas por una secuencia no relacionada que permite que las secuencias codificantes y complementarias se hibriden para formar la molécula de ARNbc con la secuencia no relacionada formando una estructura de bucle. El diseño y la producción de las moléculas de ARNbc adecuadas para la presente invención está dentro de la capacidad de un experto en la técnica, considerando particularmente los documentos WO 99/32619, WO 99/53050, WO 99/49029, y WO 01/34815.

En un ejemplo, se introduce un ADN que dirige la síntesis de uno/varios producto(s) de ARN al menos parcialmente bicatenario(s) (dúplex) con homología hacia el gen objetivo que se va a inactivar. Por lo tanto, el ADN comprende secuencias tanto codificantes como complementarias que, cuando se transcriben hasta ARN, pueden hibridarse para formar la región de ARN bicatenario. En un ejemplo preferido, las secuencias codificantes y complementarias están separadas por una región espaciadora que comprende un intrón que, cuando se transcribe hasta ARN, se elimina mediante corte y empalme. Se ha demostrado que esta disposición da como resultado una mayor eficiencia del silenciamiento de genes. La región bicatenaria puede comprender una o dos moléculas de ARN, transcritas a partir de una o dos regiones de ADN. Se cree que la presencia de la molécula bicatenaria desencadena una respuesta de un sistema endógeno de la planta que destruye tanto el ARN bicatenario como el transcrito de ARN homólogo del gen objetivo de la planta, disminuyendo o eliminando eficientemente la actividad del gen objetivo.

La longitud de las secuencias codificantes y complementarias que se hibridan debe ser cada una de al menos 19 nucleótidos contiguos, preferiblemente al menos 30 o 50 nucleótidos, y más preferiblemente al menos 100, 200, 500 o 1000 nucleótidos. Puede usarse la secuencia de longitud completa correspondiente al transcrito del gen completo. Las longitudes son más preferentemente de 100 a 2000 nucleótidos. El grado de identidad de las secuencias codificantes y complementarias con el transcrito objetivo debe ser de al menos el 85%, preferentemente al menos el 90% y más preferentemente del 95-100%. Por supuesto, la molécula de ARN puede comprender secuencias no relacionadas que pueden funcionar para estabilizar la molécula. La molécula de ARN puede expresarse bajo el control de un promotor de la ARN polimerasa II o ARN polimerasa III. Los ejemplos de estos últimos incluyen los promotores del ARNt o ARNnp.

En un ejemplo, las moléculas de ARN de interferencia pequeñas ("ARNip") comprenden una secuencia de nucleótidos que es idéntica a aproximadamente 19-21 nucleótidos contiguos del ARNm objetivo. Preferiblemente, la secuencia de ARNm objetivo comienza con el dinucleótido AA, comprende un contenido de GC de aproximadamente un 30-70% (preferiblemente, un 30-60%, más preferiblemente un 40-60% y más preferiblemente aproximadamente un 45%-55%), y no tiene un alto porcentaje de identidad respecto de ninguna secuencia de nucleótidos distinta del objetivo en el genoma de la planta de cebada en donde se va a introducir, por ejemplo, según lo determinado mediante una búsqueda BLAST estándar.

D. MicroARN

La regulación del microARN es una rama claramente especializada de la vía de silenciamiento del ARN que evolucionó hacia la regulación genética, divergiendo del ARNi/silenciamiento génico postranscripcional (PTGS) convencional. Los microARN son una clase específica de ARN pequeños que están codificados en elementos similares a genes organizados en una repetición invertida característica. Cuando se transcriben, los genes del microARN dan lugar a ARN precursores con bucles en forma de tallo a partir de los cuales se procesan posteriormente los microARN. Los microARN suelen tener una longitud de unos 21 nucleótidos. Los miARN liberados se incorporan a complejos similares a RISC que contienen un subconjunto particular de proteínas Argonauta que ejercen una represión genética específica de la secuencia.

E. Co-inhibición

Otro enfoque de biología molecular que puede usarse es la co-inhibición. El mecanismo de co-inhibición no se comprende bien, pero se cree que implica el silenciamiento génico postranscripcional (PTGS) y, en ese sentido, puede ser muy similar a muchos ejemplos de inhibición mediante moléculas complementarias. Implica introducir una copia adicional de un gen o un fragmento del mismo en una planta en una orientación codificante con respecto a un promotor para su expresión. El tamaño del fragmento codificante, su correspondencia con las regiones del gen objetivo y su grado de identidad de secuencia con el gen objetivo son los mismos que para las secuencias complementarias descritas anteriormente. En algunos casos, la copia adicional de la secuencia genética interfiere con la expresión del gen de la planta objetivo. Se hace referencia a los documentos WO 97/20936 y EP 0465572 para los métodos de implementación de los enfoques de co-inhibición.

IV. Edición genómica

En un ejemplo, la descripción se refiere a una planta con una expresión disminuida del gen WPBF y/o una actividad disminuida de la proteína WPBF, en donde la expresión disminuida del gen WPBF y/o la actividad disminuida de la proteína WPBF se logra mediante la edición genómica.

En un ejemplo, la descripción se refiere a una planta de trigo con un gen WPBF editado genómicamente, en donde la planta de trigo tiene granos con gluten disminuido en comparación con una planta de tipo silvestre.

La edición del genoma, o edición del genoma con nucleasas diseñadas (GEEN), es un tipo de ingeniería genética en donde se inserta, reemplaza o elimina ADN de un genoma utilizando nucleasas diseñadas artificialmente o "tijeras moleculares". Las nucleasas crean roturas bicatenarias específicas (DSB) en ubicaciones deseadas del genoma y aprovechan los mecanismos endógenos de la célula para reparar la rotura inducida mediante procesos naturales de recombinación homóloga (HR) y unión de extremos no homólogos (NHEJ). Actualmente se utilizan cuatro familias principales de nucleasas diseñadas: nucleasas con dedos de zinc (ZFN), nucleasas con efector similar a un activador de la transcripción (TALEN), el sistema CRISPR/Cas y meganucleasas diseñadas con endonucleasas dirigidas rediseñadas.

A. Nucleasas con dedos de zinc (ZFN)

Las nucleasas con dedos de zinc (ZFN) son enzimas de restricción artificiales generadas al fusionar un dominio de unión al ADN con dedos de zinc a un dominio de escisión del ADN. Los dominios con dedos de zinc se pueden diseñar para seleccionar como objetivo secuencias de ADN específicas deseadas, y esto permite que las nucleasas con dedos de zinc se dirijan a secuencias únicas dentro de los genomas complejos. Aprovechando la maquinaria endógena de reparación del ADN, estos reactivos pueden usarse para alterar con precisión los genomas de los organismos superiores.

Las ZFN consisten en un dominio de unión al ADN con dedos de zinc diseñado fusionado al dominio de escisión de la endonucleasa de restricción FokI. Las ZFN se pueden utilizar para inducir roturas bicatenarias (DSB) en secuencias de ADN específicas y promover así la recombinación homóloga específica del sitio con una plantilla exógena. La plantilla exógena contiene la secuencia que se va a introducir en el genoma.

Los métodos disponibles públicamente para diseñar dominios de dedos de zinc incluyen: (1) el ensamblaje dependiente del contexto (CoDA), (2) la ingeniería de mezclas oligomerizadas (OPEN) y (3) el ensamblaje modular.

En un ejemplo, la descripción se refiere a disminuir la expresión del gen WPBF y/o disminuir la actividad de la proteína WPBF usando ZFN.

B. Nucleasas con efector similar a un activador de la transcripción (TALEN)

TALEN es una endonucleasa específica de secuencia que consta de un efector similar a un activador de la transcripción (TALE) y una endonucleasa FokI. TALE es una proteína de unión al ADN que tiene una región central altamente conservada con unidades repetidas en tándem de 34 aminoácidos. La preferencia de bases para cada unidad repetida está determinada por dos residuos de aminoácidos llamados di-residuos de repetición variable (RVD), que reconocen un nucleótido específico en el ADN objetivo. Se pueden personalizar matrices de las unidades repetidas de unión al ADN para seleccionar como objetivo secuencias de ADN específicas. Al igual que con las ZFN, la dimerización de dos TALEN en secuencias específicas objetivo en un genoma da como resultado la introducción dependiente de FokI de DSB, que estimulan los mecanismos de reparación dirigida por homología (HDR) y la unión de extremos no homólogos (NHEJ).

En un ejemplo, la descripción se refiere a disminuir la expresión del gen WPBF y/o disminuir la actividad de la proteína WPBF usando TALEN.

C. Sistema CRISPR/Cas

El sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y espaciadas a intervalos regulares (CRISPR) de tipo II es una tecnología de endonucleasa guiada por ARN para la ingeniería del genoma. Hay dos componentes distintos en este sistema: (1) un ARN guía y (2) una endonucleasa, en este caso la nucleasa asociada a CRISPR (Cas), Cas9.

El ARN guía es una combinación del ARNcr bacteriano endógeno y el ARNtracr en una única transcripción de ARN guía quimérico (ARNg). El ARNg combina la especificidad selectiva del ARNcr con las propiedades estructurales del ARNtracr en un único transcrito. Cuando el ARNg y Cas9 se expresan en la célula, la secuencia objetivo genómica puede modificarse o alterarse permanentemente.

El complejo ARNg/Cas9 se recluta en la secuencia objetivo mediante el emparejamiento de bases entre la secuencia de ARNg y la complementariedad con la secuencia objetivo en el ADN genómico. Para una unión eficaz de Cas9, la secuencia objetivo genómica también debe contener la secuencia correcta del motivo adyacente al protoespaciador (PAM) inmediatamente después de la secuencia objetivo. La unión del complejo ARNg/Cas9 localiza la Cas9 en la secuencia objetivo genómica, de modo que la Cas9 de tipo silvestre puede cortar ambas cadenas de ADN provocando una rotura bicatenaria (DSB). Cas9 cortará de 3 a 4 nucleótidos antes de la secuencia PAM. Una DSB se puede reparar a través de una de dos vías de reparación generales: (1) la vía de reparación del ADN NHEJ o (2) la vía HDR. La vía de reparación NHEJ a menudo da como resultado inserciones/deleciones (InDels) en el sitio de DSB que pueden provocar cambios de marco y/o codones de parada prematuros, alterando efectivamente el marco de lectura abierto (ORF) del gen objetivo.

La vía HDR requiere la presencia de una plantilla de reparación, que se utiliza para reparar la DSB. HDR copia fielmente la secuencia de la plantilla de reparación en la secuencia objetivo del corte. Se pueden introducir cambios de nucleótidos específicos en un gen objetivo mediante el uso de HDR con una plantilla de reparación.

En un ejemplo, la descripción se refiere a disminuir la expresión del gen WPBF y/o disminuir la actividad de la proteína WPBF usando el sistema CRISPR/cas9.

D. Meganucleasa con nucleasa selectiva rediseñada

Las meganucleasas son endodesoxirribonucleasas caracterizadas por un gran sitio de reconocimiento (secuencias de ADN bicatenario de 12 a 40 pares de bases); como resultado, este sitio generalmente se da solo una vez en un genoma determinado. Por ejemplo, la secuencia de 18 pares de bases reconocida por la meganucleasa I-SceI requeriría en promedio un genoma veinte veces mayor que el genoma humano para encontrarla una vez por casualidad (aunque las secuencias con una sola discrepancia de bases se dan aproximadamente tres veces por genoma de tamaño humano). Por lo tanto, se considera que las meganucleasas son las enzimas de restricción naturales más específicas.

Entre las meganucleasas, la familia LAGLIDADG de endonucleasas selectivas se ha convertido en una herramienta valiosa para el estudio de los genomas y la ingeniería genómica durante los últimos quince años. Modificando su secuencia de reconocimiento mediante ingeniería de proteínas, se puede cambiar la secuencia objetivo.

En un ejemplo, la descripción se refiere a la disminución de la expresión del gen WPBF y/o la disminución de la actividad de la proteína WPBF usando una meganucleasa con una nucleasa selectiva rediseñada.

V. Variedades de trigo

En un ejemplo, se puede usar una variedad de trigo que tenga al menos un gen WPBF que sea diploide, poliploide, tetraploide y hexaploide.

En otro ejemplo, el trigo esTriticum aestivum.

En un ejemplo, se puede utilizar cualquier variedad de trigo para crear mutaciones en un gen WPBF. En un ejemplo, se puede utilizar cualquier variedad de trigo para crear mutaciones en el gen WPBF del genoma A. En otro ejemplo, se puede utilizar cualquier variedad de trigo para crear mutaciones en el gen WPBF del genoma B. En otro ejemplo, se puede utilizar cualquier variedad de trigo para crear mutaciones en el gen WPBF del genoma D.

En un ejemplo, se puede usar cualquier variedad de trigo como líneas para cruzar las mutaciones de WPBF en diferentes variedades. En otro ejemplo, se puede usar cualquier variedad de trigo que tenga al menos un gen WPBF, que incluye, entre otros, trigo rojo duro de primavera, trigo blanco duro, trigo duro, trigo blanco blando de primavera, trigo blanco blando de invierno, trigo rojo duro de invierno, trigo común, trigo club, trigo espelta, trigo escanda, trigo para pasta y trigo turgidum.

En un ejemplo, el trigo rojo duro de primavera incluye, sin limitación, Bullseye, Cabernet, Cal Rojo, Hank, Joaquin, Kelse, Lariat, Lassik, Malbec, Mika, PR 1404, Redwing, Summit 515, SY 314, Triple iV, Ultra., WB-Patron, WB-Rockland, Yecora Rojo, Accord, Aim, Anza, Baker, Beth Hashita, Bonus, Borah, Brim, Brooks, Buck Pronto, Butte 86, Cavalier, Challenger, Chief, Ciano T79, Colusa, Companion, Copper, Cuyama, Dash 12, Eldon, Enano, Express, Expresso, Jefferson, Genero F81, Grandin, Helena 554, Hollis, Imuris T79, Inia 66R, Jerome, Kern, Len, Marshall, McKay, Nomad, Northwest 10, Oslo, Pavon F76, Pegasus, Pitic 62, Poco Red, Powell, Probrand 711, Probrand 751, Probrand 771, Probrand 775, Probred, Prointa Queguay, Prointa Quintal, Rich, RSI 5, Sagittario, Scarlet, Serra, Shasta, Solano, Spillman, Sprite, Stander, Stellar, Stoa, Success, Summit, Sunstar 2, Sunstar King, Tadinia, Tammy, Tanori 71, Tara 2000, Tempo, Tesia T79, Topic, UI Winchester, Vance, Vandal, W444, Wampum, Wared, WB-Fuzion, Westbred 906R, Westbred 911, Westbred 926, Westbred 936, Westbred Discovery, Westbred Rambo, Yolo y Zeke.

En otro ejemplo, el trigo blanco duro incluye, sin limitación, Blanca Fuerte, Blanca Grande 515, Blanca Royale, Clear White, Patwin, Patwin 515, WB-Cristallo, WB-Paloma, WB-Perla, Alta Blanca, Blanca Grande, Delano, Golden Spike, ID377S, Klasic, Lochsa, Lolo, Macon, Otis, Phoenix, Pima 77, Plata, Pristine, Ramona 50, Siete Cerros 66, Vaiolet y Winsome.

En otro ejemplo más, el trigo duro incluye, sin limitación, Crown, Desert King, Desert King HP, Duraking, Fortissimo, Havasu, Kronos, Maestrale, Normanno, Orita, Platinum, Q-Max, RSI 59, Saragolla, Tango, Tipai, Topper, Utopia, Volante, WB-Mead, Westmore, Aldente, Aldura, Altar 84, Aruba, Bittern, Bravadur, Candura, Cortez, Deluxe, Desert Titan, Durex, Durfort, Eddie, Germains 5003D, Imperial, Kofa, Levante, Matt, Mead, Mexicali 75, Minos, Modoc, Mohawk, Nudura, Ocotillo, Produra, Reva, Ria, Septre, Sky, Tacna, Titan, Trump, Ward, Westbred 803, Westbred 881, Westbred 883, Westbred 1000D, Westbred Laker, Westbred Turbo y Yavaros 79.

En otro ejemplo, el trigo blanco blando de primavera incluye, sin limitación, Alpowa, Alturas, Babe, Diva, JD, New Dirkwin, Nick, Twin, Whit, Blanca, Bliss, Calorwa, Centennial, Challis, Dirkwin, Eden, Edwall, Fielder, Fieldwin, Jubilee, Louise, Owens, Penawawa, Pomerelle, Sterling, Sunstar Promise, Super Dirkwin, Treasure, UI Cataldo, UI Pettit, Urquie, Vanna, Waduel, Waduel 94, Wakanz, Walladay, Wawawai, Whitebird y Zak.

En otro ejemplo más, el trigo blanco blando de invierno incluye, sin limitación, AP Badger, AP Legacy, Brundage 96, Bruneau, Cara, Goetze, Legion, Mary, Skiles, Stephens, SY Ovation, Tubbs, WB-Junction, WB-528, Xerpha, Yamhill, Barbee, Basin, Bitterroot, Bruehl, Castan, Chukar, Coda, Daws, Edwin, Eitan, Faro, Finch, Foote, Gene, Hill 81, Hiller, Hubbard, Hyak, Hyslop, Idaho 587, Kmor, Lambert, Lewjain, MacVicar, Madsen, Malcolm, Masami, McDermid, Moro, Nugaines, O<r>CF-101, ORCF-102, ORCF-103, Rod, Rohde, Rulo, Simon, Salute, Temple, Tres, Tubbs 06, UICF-Brundage, WB-523 y Weatherford.

En otro ejemplo, el trigo rojo duro de invierno incluye, sin limitación, Andrews, Archer, Batum, Blizzard, Bonneville, Boundary, Declo, Deloris, Finley, Garland, Hatton, Hoff, Longhorn, Manning, Meridian, Promontory, Vona, Wanser, Winridge.

En otro ejemplo, el trigo blando (hexaploide, de trilla libre),Triticum aestivum ssp aestivumincluye, sin limitación, Sonora, Wit Wolkoring, Chiddam Blanc De Mars, India-Jammu, Foisy.

En otro ejemplo más, la espelta (hexaploide, no de trilla libre),Triticum aestivum ssp speltaincluye, sin limitación, la espelta española y la espelta suiza.

En otro ejemplo más, el farro (tetraploide),Triticum turgidum ssp. dicoccumincluye, sin limitación, el Ethiopian Blue Tinge.

En otro ejemplo, el trigo para pasta (tetraploide, de trilla libre),Triticum turgidum ssp durumincluye, sin limitación, Blue Beard, Durum-Iraq.

En otro ejemplo más, el trigo Turgidum (tetraploide, de trilla libre),Triticum turgidum ssp turgidumincluye, sin limitación, Akmolinka, Maparcha.

En un ejemplo, una variedad de trigo que tiene al menos un gen WPBF con un porcentaje sustancial de identidad respecto de SEQ ID N2: 1, SEQ ID N2: 2, SEQ ID N2: 4, SEQ ID N2: 5, SEQ ID N2: 7, o SEQ ID N28 se puede utilizar con los métodos y composiciones descritos en la presente memoria.

Como se usa en la presente memoria con respecto a las variedades de trigo, "porcentaje de identidad sustancial" significa que la secuencia de ADN del gen es suficientemente similar a la SEQ ID N°: 1, 2, 4, 5, 7 y 8 a nivel de nucleótidos para codificar una proteína sustancialmente similar, lo que permite diferencias alélicas (o corte y empalme alternativo del ARNm) entre variedades. Según un ejemplo de la invención, un "porcentaje de identidad sustancial" puede estar presente cuando el porcentaje de identidad en la región codificante entre el gen WPBF y las SEQ ID N°: 1, 2, 4, 5, 7 y 8 es tan bajo como alrededor del 85%, siempre que el porcentaje de identidad en las regiones conservadas del gen sea mayor (p. ej., al menos alrededor del 90%). Preferiblemente, el porcentaje de identidad en la región codificante es del 85 al 90%, más preferiblemente del 90 al 95%, y de manera óptima, está por encima del 95%. Por lo tanto, un experto en la técnica puede preferir utilizar una variedad de trigo que tenga popularidad comercial o una que tenga las características específicas deseadas para crear las plantas de trigo con la mutación de WPBF, sin desviarse del alcance y la intención de la presente invención. Alternativamente, un experto en la técnica puede preferir utilizar una variedad de trigo que tenga pocos polimorfismos, tal como una variedad endogámica, para facilitar la detección de las mutaciones dentro de uno o más genes WPBF según la presente invención.

VI. Metodología representativa para la identificación de las mutaciones de WPBF

Un experto en la técnica apreciará que existen numerosas técnicas y métodos disponibles para generar mutaciones y/o mutaciones no transgénicas. A continuación, se describe una metodología representativa.

Para crear e identificar las mutaciones de WPBF y las plantas de trigo descritas en la presente memoria, se utilizó un método conocido como TILLING. Véase McCallum et al., Nature Biotechnology 18:455-457, 2000; McCallum et al., Plant Physiology, 123:439-442, 2000; la publicación de EE. UU. n.° 20040053236; y la patente de EE. UU. n.° 5.994.075. En la metodología básica de TILLING, los materiales vegetales, como las semillas, se someten a una mutagénesis química, lo que crea una serie de mutaciones dentro de los genomas de las células de las semillas. Las semillas mutagenizadas se convierten en plantas M1 adultas y se autopolinizan. Se combinan las muestras de ADN de las plantas M2 resultantes y luego se analizan en busca de mutaciones en un gen de interés. Una vez que se identifica una mutación en un gen de interés, las semillas de la planta M2 que porta esa mutación se cultivan hasta convertirse en plantas M3 adultas y se analizan para detectar las características fenotípicas asociadas con esa mutación en el gen de interés.

En un ejemplo, se utilizó la variedad tetraploide Kronos. En otros ejemplos, se utilizó la variedad hexaploide Express.

En un ejemplo, las semillas de trigo se mutagenizan y luego se cultivan hasta plantas M1. Luego se permite que las plantas M1 se autopolinicen y las semillas de la planta M1 se cultivan hasta plantas M2, que luego se analizan en busca de mutaciones en sus loci de WPBF. Si bien las plantas M1 pueden seleccionarse para detectar mutaciones según los ejemplos alternativos de la invención, una ventaja de seleccionar las plantas M2 es que todas las mutaciones somáticas corresponden a mutaciones de la línea germinal.

Un experto en la técnica entenderá que se pueden mutagenizar una variedad de materiales vegetales de trigo, que incluyen, entre otros, semillas, polen, tejido vegetal o células vegetales, para crear las plantas de trigo con mutaciones en WPBF descritas en la presente memoria. Sin embargo, el tipo de material vegetal mutagenizado puede afectar al momento en que se analiza el ADN de la planta para detectar las mutaciones. Por ejemplo, cuando el polen se somete a mutagénesis antes de la polinización de una planta no mutagenizada, las semillas resultantes de esa polinización crecen hasta convertirse en plantas M1. Cada célula de las plantas M1 contendrá las mutaciones creadas en el polen, por lo que estas plantas M1 pueden examinarse para detectar las mutaciones de WPBF en lugar de esperar hasta la generación M2.

Para crear las mutaciones se pueden usar mutágenos que crean principalmente mutaciones puntuales y deleciones cortas (de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 nucleótidos), inserciones, transversiones y/o transiciones, tales como mutágenos químicos o radiación, tal como rayos X y neutrones rápidos. Los mutágenos que cumplen con el método de la invención incluyen, entre otros, metanosulfonato de etilo (EMS), sulfonato de metilmetano (MMS), N-etil-N-nitrosourea (ENU), trietilmelamina (TEM), N-metil-N-nitrosourea (MNU), procarbazina, clorambucilo, ciclofosfamida, sulfato de dietilo, monómero de acrilamida, melfalán, mostaza nitrogenada, vincristina, dimetilnitrosamina, N-metil-N'-nitro-nitrosoguanidina (MNNG), nitrosoguanidina, 2-aminopurina, 7,12-dimetil-benzo(a)antraceno (DMBA), óxido de etileno, hexametilfosforamida, bisulfán, diepoxialcanos (diepoxioctano (DEO), diepoxibutano (DEB) y similares), dihidrocloruro de 2-metoxi-6-cloro-9[3-(etil-2)-cloroetil)aminopropilamino]acridina (ICR-170), azida sódica y formaldehído. También se pueden identificar mutaciones espontáneas en un gen WPBF que pueden no haber sido causadas directamente por el mutágeno.

Se puede utilizar cualquier método adecuado de preparación de ADN vegetal actualmente conocido o ideado en el futuro para preparar el ADN de la planta de trigo para la detección de las mutaciones de WPBF. Por ejemplo, véase Chen y Ronald,Plant Molecular Biology Repórter17:53-57, 1999; Stewart y Via,Bio Techniques14:748-749, 1993. Además, existen varios kits comerciales diseñados para este propósito, incluidos los kits de Qiagen (Valencia, CA) y Qbiogene (Carlsbad, CA).

En un ejemplo, se agrupa el ADN preparado de plantas de trigo individuales para acelerar la detección de mutaciones en uno o más genes WPBF de toda la población de plantas que se originan a partir del tejido vegetal mutagenizado. El tamaño del grupo combinado puede depender de la sensibilidad del método de detección utilizado. Preferiblemente, se combinan grupos de dos o más plantas de trigo individuales.

En otro ejemplo, después de combinar las muestras de ADN, las mezclas se someten a técnicas de amplificación específicas de la secuencia de WPBF, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para obtener una descripción general de la PCR, véasePCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(Innis, Gelfand, Sninsky y White, eds.), Academic Press, San Diego, 1990.

Puede utilizarse cualquier cebador específico para un locus de WPBF o las secuencias inmediatamente adyacentes a uno de estos loci para amplificar las secuencias de WPBF dentro de la muestra de ADN combinada. Preferiblemente, el cebador está diseñado para amplificar las regiones del locus de WPBF donde es más probable que surjan mutaciones útiles. Lo más preferiblemente, el cebador está diseñado para detectar regiones exónicas de uno o más genes WPBF. Además, es preferible que el cebador se dirija a sitios polimórficos conocidos para diseñar cebadores específicos del genoma con el fin de facilitar la detección de mutaciones puntuales en un genoma particular. Para facilitar la detección de los productos de PCR en un gel, el cebador de PCR se puede marcar usando cualquier método de marcaje convencional o ideado más adelante.

En un ejemplo, los cebadores se diseñan basándose en los genes WPBF (SEQ ID N°: 1,2, 4, 5, 7 y 8). En otro ejemplo, se pueden diseñar cebadores que estén en 5' o 3' con respecto a los genes WPBF.

En otro ejemplo, los productos de amplificación mediante PCR pueden seleccionarse para detectar las mutaciones de WPBF usando cualquier método que identifique diferencias de nucleótidos entre las secuencias de tipo silvestre y las mutantes. Estos pueden incluir, por ejemplo, sin limitación, la secuenciación, la cromatografía líquida de alta presión desnaturalizante (dHPLC), la electroforesis capilar desnaturalizante constante (CDCE), la electroforesis capilar con gradiente de temperatura (TGCE) (véase Li et al.,Electrophoresis23(10): 1499-1511, 2002), o mediante fragmentación por escisión enzimática, como la utilizada en el método de alto rendimiento descrito por Colbert et al.,Plant Physiology126:480-484, 2001. Preferiblemente, los productos de amplificación mediante PCR se incuban con una endonucleasa que escinde preferentemente las discrepancias de bases en moléculas heterodúplex entre las secuencias de tipo silvestre y las mutantes.

En otro ejemplo, los productos de escisión se someten a electroforesis utilizando un aparato de gel de secuenciación automatizado y las imágenes del gel se analizan con la ayuda de un programa de procesamiento de imágenes comercial estándar.

En otro ejemplo más, una vez que se identifica una planta M2 que tiene una secuencia del gen WPBF mutada, las mutaciones se analizan para determinar su efecto sobre la expresión, traducción y/o actividad de una enzima WPBF. En un ejemplo, el fragmento de PCR que contiene la mutación se secuencia utilizando técnicas de secuenciación estándar, para determinar la ubicación exacta de la mutación en relación con la secuencia WPBF general. Cada mutación se evalúa para predecir su impacto sobre la función de la proteína (es decir, desde ser completamente tolerada hasta causar la pérdida de la función) utilizando herramientas bioinformáticas como SIFT (clasificación de intolerante frente a tolerante; Ng y Henikoff,Nucleic Acids Research31:3812-3814, 2003), PSSM (Matriz de puntuación específica de la posición; Henikoff y Henikoff,Computer Applications in the Biosciences12:135-143, 1996) y PARSESNP (Taylor y Greene,Nucleic Acids Research31:3808-3811, 2003). Por ejemplo, una puntuación SI<f>T inferior a 0,05 y un gran cambio en la puntuación PSSM (p. ej., aproximadamente 10 o más) indican una mutación que probablemente tenga un efecto perjudicial sobre la función de las proteínas. Se sabe que estos programas son predictivos y los expertos en la técnica entienden que los resultados previstos no siempre son exactos.

En otro ejemplo, si la evaluación inicial de una mutación en la planta M2 indica que es de naturaleza útil y que se encuentra en una posición útil dentro de un gen WPBF, entonces se puede realizar un análisis fenotípico adicional de la planta de trigo que contiene esa mutación. En el trigo hexaploide, las mutaciones en cada uno de los genomas A, B y D generalmente deben combinarse antes de que se pueda detectar un fenotipo. En el trigo tetraploide, se combinan las mutaciones del genoma A y B. Además, la planta que contiene la mutación se puede retrocruzar o cruzar dos veces o más para eliminar las mutaciones de fondo en cualquier generación. Luego, la planta retrocruzada o cruzada puede autopolinizarse o autocruzarse para crear plantas que sean homocigotas para las mutaciones WPBF.

Se evalúan varias características físicas de estas plantas mutantes de WPBF homocigotas para determinar si la mutación da como resultado un cambio fenotípico útil en la planta de trigo sin provocar efectos negativos indeseables, como una disminución significativa del rendimiento de semillas.

VII. Métodos para producir una planta de trigo

En otro ejemplo, la descripción se refiere a un método para producir una planta de trigo con granos con gluten disminuido. En otro ejemplo, la descripción se refiere a un método para producir una planta de trigo con gluteninas de alto peso molecular incrementadas. En otro ejemplo, la descripción se refiere a un método para producir plantas con gluteninas de bajo peso molecular disminuidas. En otro ejemplo, la descripción se refiere a un método para producir plantas con gliadinas disminuidas. En otro ejemplo más, la descripción se refiere a un método para producir plantas con gluteninas de bajo peso molecular disminuidas respecto de las plantas de tipo silvestre y un nivel de gluteninas de alto peso molecular que es comparable al de las plantas de tipo silvestre.

En otro ejemplo, la descripción se refiere a un método para cruzar las mutaciones del gen WPBF con plantas de tipo silvestre.

En otro ejemplo más, la descripción se refiere a un método para producir una planta que tiene una actividad disminuida de una o más proteínas WPBF en comparación con las plantas de trigo de tipo silvestre.

En un ejemplo, el método comprende inducir al menos una mutación no transgénica en al menos una copia de un gen WPBF en material vegetal o partes de plantas de una planta original; cultivar o usar el material vegetal mutagenizado para producir las plantas de la progenie; analizar el material vegetal mutagenizado y/o las plantas de la progenie para detectar al menos una mutación en al menos una copia de un gen WPBF; y seleccionar las plantas de la progenie que tienen al menos una mutación en al menos una copia de un gen WPBF.

En otro ejemplo, el método comprende además cruzar las plantas de la progenie que tienen al menos una mutación en al menos una copia de un gen WPBF con otras plantas de la progenie que tienen al menos una mutación en una copia diferente de un gen WPBF. El proceso de identificar las plantas de la progenie con mutaciones y cruzar dichas plantas de la progenie con otras plantas de la progenie, que tienen mutaciones, se puede repetir para producir plantas de trigo de la progenie con una actividad de WPBF disminuida.

En otro ejemplo, el nivel de actividad de la proteína WPBF en la planta de trigo se reduce al 0-2%, 2-5%, 5-7%, 7-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-35%, 35-40%, 40-45%, 45-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95%, o 95-99% del nivel de actividad de la proteína WPBF en la planta de tipo silvestre.

A. Métodos para producir una planta con una o más mutaciones en el gen WPBF en más de un genoma

En otro ejemplo más, la descripción se refiere a un método para producir una planta que comprende lo siguiente: inducir al menos una mutación no transgénica en al menos una copia de un gen WPBF en el material vegetal de una planta originaria que comprende una mutación en un gen WPBF; cultivar o usar el material vegetal mutagenizado para producir las plantas de la progenie; y seleccionar las plantas de trigo de la progenie que tengan al menos una mutación en al menos dos copias de un gen WPBF. Por ejemplo, la planta originaria puede tener una mutación en un gen WPBF del genoma D. Las plantas de la progenie seleccionadas pueden tener una mutación en un gen WPBF del genoma D y una o más mutaciones en el gen WPBF del genoma B. Este ejemplo se proporciona simplemente para aclarar y no debe limitar los métodos descritos en la presente memoria.

En otro ejemplo más, la invención se refiere a un método para producir una planta que comprende inducir al menos una mutación no transgénica en al menos una copia de un gen WPBF en el material vegetal de una planta originaria que comprende al menos una mutación en dos genes WPBF; cultivar o usar el material vegetal mutagenizado para producir las plantas de la progenie; y seleccionar las plantas de la progenie que tengan al menos una mutación en tres copias de un gen WPBF. En este ejemplo, habría al menos una mutación en el gen WPBF de los genomas A, B y D.

En otro ejemplo, la descripción se refiere a un método para producir una planta de trigo que comprende cruzar una primera planta que tiene al menos una mutación no transgénica en un primer gen WPBF con una segunda planta que tiene al menos una mutación no transgénica en un segundo gen WPBF; y seleccionar las plantas de la progenie que tengan al menos una mutación en al menos dos copias de un gen WPBF.

En otro ejemplo, la descripción se refiere a un método para producir una planta que comprende cruzar una primera planta que tiene al menos una mutación no transgénica en un primer y segundo gen WPBF con una segunda planta que tiene al menos una mutación no transgénica en un tercer gen WPBF; y seleccionar las plantas de la progenie que tengan al menos una mutación en las tres copias de un gen WPBF. En este ejemplo, habría al menos una mutación en el gen WPBF de los genomas A, B y D.

VIII. Planta de trigo, semilla de trigo y partes de la planta de trigo

En un ejemplo, se produce una planta de trigo con granos con gluten disminuido según los métodos descritos en la presente memoria. En un ejemplo, se produce una planta de trigo con gluteninas de bajo peso molecular disminuidas según los métodos descritos en la presente memoria. En un ejemplo, se produce una planta de trigo con gliadinas disminuidas según los métodos descritos en la presente memoria. En otro ejemplo más, se produce una planta de trigo con gluteninas de alto peso molecular aumentadas o inalteradas de según los métodos descritos en la presente memoria.

En otro ejemplo, la planta de trigo, la semilla de trigo o las partes de una planta de trigo tienen una o más mutaciones en un gen WPBF o un gen WPBF modificado. En otro ejemplo, la planta de trigo, la semilla de trigo o las partes de una planta de trigo tienen una o más mutaciones en los genes WPBF.

En otro ejemplo, la descripción se refiere a una planta de trigo, una semilla de trigo o las partes de una planta de trigo que comprenden una o más mutaciones no transgénicas en el gen WPBF. En otro ejemplo, la descripción se refiere a una planta de trigo, una semilla de trigo o las partes de una planta de trigo que comprenden al menos una mutación no transgénica en el gen WPBF en cada uno de dos genomas. En otro ejemplo más, la descripción se refiere a una planta de trigo, una semilla de trigo o las partes de una planta de trigo que comprenden al menos una mutación no transgénica en el gen WPBF en cada uno de los tres genomas.

En un ejemplo, la planta de trigo, la semilla de trigo o las partes de una planta de trigo comprenden una o más mutaciones no transgénicas en ambos alelos del gen WPBF del genoma A. En otro ejemplo, las mutaciones no transgénicas son idénticas en ambos alelos del gen WPBF del genoma A.

En un ejemplo, la planta de trigo, la semilla de trigo o las partes de una planta de trigo comprenden una o más mutaciones no transgénicas en ambos alelos del gen WPBF del genoma B. En otro ejemplo, las mutaciones no transgénicas son idénticas en ambos alelos del gen WPBF del genoma B.

En un ejemplo, la planta de trigo, la semilla de trigo o las partes de una planta de trigo comprenden una o más mutaciones no transgénicas en ambos alelos del gen WPBF del genoma D. En otro ejemplo, las mutaciones no transgénicas son idénticas en ambos alelos del gen WPBF del genoma D.

En otro ejemplo, la planta de trigo, la semilla de trigo o las partes de la planta de trigo comprenden un polinucleótido con una o más mutaciones no transgénicas enumeradas en la Tabla 1 y tiene un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más del 99% de identidad o similitud con SEQ ID N°: 2.

En otro ejemplo más, la planta de trigo, la semilla de trigo o las partes de una planta de trigo comprenden un polinucleótido con una o más mutaciones no transgénicas enumeradas en la Tabla 1 que codifica una proteína WPBF, en donde la proteína WPBF comprende una o más mutaciones no transgénicas y tiene un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más del 99% de identidad o similitud con SEQ ID N°: 3.

En otro ejemplo, la planta de trigo, la semilla de trigo o las partes de la planta de trigo comprenden un polinucleótido con una o más mutaciones no transgénicas y tiene un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más del 99% de identidad o similitud con SEQ ID N°: 5.

En otro ejemplo más, la planta de trigo, la semilla de trigo o las partes de una planta de trigo comprenden un polinucleótido con una o más mutaciones no transgénicas que codifica una proteína WPBF, en donde la proteína WPBF comprende una o más mutaciones no transgénicas y tiene un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más del 99% de identidad o similitud con SEQ ID N°: 6.

En otro ejemplo, la planta de trigo, la semilla de trigo o las partes de la planta de trigo comprenden un polinucleótido con una o más mutaciones no transgénicas y tiene un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más del 99% de identidad o similitud con SEQ ID N°: 8.

En otro ejemplo más, la planta de trigo, la semilla de trigo o las partes de una planta de trigo comprenden un polinucleótido con una o más mutaciones no transgénicas que codifica una proteína WPBF, en donde la proteína WPBF comprende una o más mutaciones no transgénicas y tiene un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más del 99% de identidad o similitud con SEQ ID N°: 9.

En otro ejemplo, la planta de trigo, la semilla de trigo o las partes de una planta de trigo tienen una o más mutaciones en el gen WPBF que incluyen, entre otras, una o más mutaciones enumeradas en las Tablas 1-3 y las mutaciones correspondientes en los homeólogos. Se puede generar una planta de trigo, una semilla de trigo o las partes de una planta de trigo que tienen 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 o más de 25 de las mutaciones descritas en la presente memoria, que incluyen, pero sin limitación, las mutaciones descritas en las Tablas 1-3, así como las mutaciones de los homeólogos correspondientes.

IX. Granos, harina y almidón

En otro ejemplo, la descripción se refiere a un grano, harina o almidón de trigo que comprende una o más mutaciones no transgénicas en el gen WPBF o un gen WPBF modificado. En otro ejemplo, la descripción se refiere a un grano de trigo que comprende un embrión, en donde el embrión comprende una o más mutaciones no transgénicas en un gen WPBF o un gen WPBF modificado.

En otro ejemplo, el grano, harina o almidón de trigo comprende una o más mutaciones no transgénicas en los genes WPBF que incluyen, entre otras, las mutaciones enumeradas en las Tablas 1-3 y las mutaciones correspondientes en los homólogos y homeólogos.

En otro ejemplo más, la descripción se refiere a un grano o harina de trigo que comprende al menos una mutación no transgénica en el gen WPBF en uno, dos o tres genomas.

En otro ejemplo más, la descripción se refiere a un grano, harina o almidón de trigo que comprende una o más mutaciones no transgénicas en el gen WPBF del genoma A. En otro ejemplo, las mutaciones no transgénicas son idénticas en ambos alelos del gen WPBF del genoma A.

En un ejemplo, el grano, harina o almidón de trigo comprende una o más mutaciones no transgénicas en ambos alelos del gen WPBF del genoma B. En otro ejemplo, las mutaciones no transgénicas son idénticas en ambos alelos del gen WPBF del genoma B.

En un ejemplo, el grano, harina o almidón de trigo comprende una o más mutaciones no transgénicas en ambos alelos del gen WPBF del genoma D. En otro ejemplo, las mutaciones no transgénicas son idénticas en ambos alelos del gen WPBF del genoma D.

En un ejemplo, la descripción se refiere a un grano de trigo, harina de trigo o almidón que comprende un polinucleótido del gen WPBF del genoma A con una o más mutaciones no transgénicas enumeradas en la Tabla 1 y que corresponde a SEQ ID N°: 2. En otro ejemplo, el grano de trigo o la harina de trigo comprenden un polinucleótido con una o más mutaciones no transgénicas enumeradas en la Tabla 1 y tiene un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más del 99% de identidad o similitud con SEQ ID N°: 2.

En otro ejemplo más, el grano de trigo, harina de trigo o almidón comprenden un polinucleótido con una o más mutaciones no transgénicas enumeradas en la Tabla 1 que codifica una proteína WPBF, en donde la proteína WPBF comprende una o más mutaciones no transgénicas y tiene un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más del 99% de identidad o similitud con SeQ ID N°: 3.

En un ejemplo, la descripción se refiere a un grano de trigo, harina de trigo o almidón que comprenden un polinucleótido del gen WPBF del genoma B con una o más mutaciones no transgénicas enumeradas en la Tabla 2 y que corresponde a SEQ ID N°: 5. En otro ejemplo, el grano de trigo o la harina de trigo comprenden un polinucleótido con una o más mutaciones no transgénicas enumeradas en la Tabla 2 y tiene un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más del 99% de identidad o similitud con SEQ ID N°: 5.

En otro ejemplo más, el grano de trigo, harina de trigo o almidón comprenden un polinucleótido con una o más mutaciones no transgénicas enumeradas en la Tabla 2 que codifica una proteína WPBF, en donde la proteína WPBF comprende una o más mutaciones no transgénicas y tiene un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más del 99% de identidad o similitud con S<e>Q ID N°: 6.

En un ejemplo, la descripción se refiere a grano de trigo, harina de trigo o almidón que comprenden un polinucleótido del gen WPBF del genoma D con una o más mutaciones no transgénicas enumeradas en la Tabla 3 y que corresponde a SEQ ID N°: 8. En otro ejemplo, el grano de trigo o la harina de trigo comprenden un polinucleótido con una o más mutaciones no transgénicas enumeradas en la Tabla 3 y tiene un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más del 99% de identidad o similitud con SEQ ID N°: 8.

En otro ejemplo más, el grano de trigo, harina de trigo o almidón comprenden un polinucleótido con una o más mutaciones no transgénicas enumeradas en la Tabla 3 que codifica una proteína WPBF, en donde la proteína WPBF comprende una o más mutaciones no transgénicas y tiene un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más del 99% de identidad o similitud con SeQ ID N°: 9.

En otro ejemplo más, la descripción se refiere a un grano o harina de trigo que comprenden un endospermo y un nivel de expresión genética, actividad o nivel de expresión y actividad del gen WPBF disminuidos en comparación con el grano o la harina de trigo de tipo silvestre.

En otro ejemplo más, la descripción se refiere a un grano o harina de trigo con una o más mutaciones en el gen WPBF o un gen WPBF modificado que presenta un grano con gluten disminuido en comparación con el grano o la harina de trigo de tipo silvestre. En otro ejemplo, el grano o la harina de trigo con una o más mutaciones en el gen WPBF o un gen WPBF modificado presenta un 1-5%, 5-10%, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-35%, 35-40%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95% y más del 95% de gluten disminuido en comparación con el grano o la harina de tipo silvestre.

En otro ejemplo, el grano o la harina de trigo con una o más mutaciones en el gen WPBF o un gen WPBF modificado exhibe un nivel disminuido de gluten en comparación con el grano de tipo silvestre, en donde el grano con la mutación o modificación tiene aproximadamente un 80%, o aproximadamente un 70%, o aproximadamente un 60%, o aproximadamente un 50%, o aproximadamente un 40%, o aproximadamente un 30%, o aproximadamente un 20%, o aproximadamente un 10%, o aproximadamente un 5% o aproximadamente un 3% menos de gluten en comparación con el grano de tipo silvestre.

En otro ejemplo, el grano o la harina de trigo comprende de aproximadamente un 5% a aproximadamente un 15%, o de aproximadamente un 15% a un 25%, o de aproximadamente un 25% a un 45%, o de aproximadamente un 45% a aproximadamente un 65%, o de aproximadamente un 65% a aproximadamente un 85%, o de aproximadamente un 85% a un 97% menos de gluten en comparación con el grano o la harina de tipo silvestre.

En otro ejemplo, el grano o la harina de trigo comprende aproximadamente un 80% o menos, aproximadamente un 70% o menos, aproximadamente un 60% o menos, aproximadamente un 50% o menos, aproximadamente un 40% o menos, aproximadamente un 30% o menos, aproximadamente un 25% o menos, aproximadamente un 20% o menos, aproximadamente un 15% o menos, aproximadamente un 10% o menos, aproximadamente un 7,5% o menos, aproximadamente un 5% o menos o aproximadamente un 2,5% o menos o aproximadamente un 1% o menos, o aproximadamente un 0,5% o menos del nivel de gluteninas de bajo peso molecular en comparación con el grano o la harina de tipo silvestre.

En otro ejemplo, el grano o la harina de trigo comprende de aproximadamente un 5% a aproximadamente un 15%, o de aproximadamente un 15% a un 25%, o de aproximadamente un 25% a un 45%, o de aproximadamente un 45% a aproximadamente un 65%, o de aproximadamente un 65% a aproximadamente un 85%, o de aproximadamente un 85% a un 97% menos de gliadinas en comparación con el grano o la harina de tipo silvestre.

En un ejemplo, los granos descritos en la presente memoria pueden contener embriones que son más grandes que los granos de tipo silvestre. En un ejemplo, los granos descritos en la presente memoria pueden contener embriones que son del 1 -5%, o del 5-10%, o del 10-15%, o del 15-20%, o del 20-25%, o del 25-50%, o del 50-75%, o del 75-95% más grandes que los embriones de los granos de tipo silvestre.

En un ejemplo, los granos descritos en la presente memoria pueden contener embriones que tienen un tamaño al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, y al menos un 90% mayor que los embriones de los granos de tipo silvestre.

En otro ejemplo más, los granos descritos en la presente memoria pueden contener más lípidos en comparación con los granos de tipo silvestre. En un ejemplo, los granos descritos en la presente memoria pueden contener un 1-5%, o un 5-10%, o un 10-15%, o un 15-20%, o un 20-25%, o un 25-50% o un 50-75%, o un 75-95% más lípidos que los granos de tipo silvestre.

En un ejemplo, los granos descritos en la presente memoria pueden contener al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85% y al menos un 90% más lípidos que los granos silvestres.

En otro ejemplo más, los granos descritos en la presente memoria pueden contener más lisina libre o lisina incorporada en proteínas en comparación con el grano de tipo silvestre. Esto puede dar como resultado que estos granos proporcionen un nivel más alto del aminoácido esencial lisina a los animales monogástricos, que incluyen los seres humanos, que el correspondiente grano de tipo silvestre.

En un ejemplo, los granos descritos en la presente memoria pueden contener un 1-5%, o un 5-10%, o un 10-15%, o un 15-20%, o un 20-25%, o un 25-50%, o un 50-75%, o un 75-95% más de lisina libre que los granos silvestres.

En un ejemplo, los granos descritos en la presente memoria pueden contener al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85% y al menos un 90% más de lisina libre que los granos silvestres.

En otro ejemplo más, los granos descritos en la presente memoria pueden contener más lisina incorporada en la proteína en comparación con los cereales de tipo silvestre. En un ejemplo, los granos descritos en la presente memoria pueden contener un 1-5%, o un 5-10%, o un 10-15%, o un 15-20%, o un 20-25%, o un 25-50% o un 50-75%, o un 75-95% más de lisina incorporada en las proteínas que los granos silvestres.

En un ejemplo, los granos descritos en la presente memoria pueden contener al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85% y al menos un 90% más de lisina incorporada a las proteínas que los granos silvestres.

En un ejemplo, los granos descritos en la presente memoria pueden contener menos almidón en comparación con los granos de tipo silvestre. En un ejemplo, los granos descritos en la presente memoria pueden contener un 1-5%, un 5-10%, un 10-15%, un 15-20%, un 20-25% menos de almidón en comparación con los granos de tipo silvestre.

En un ejemplo, los granos descritos en la presente memoria pueden tener un endospermo más pequeño en comparación con los granos de tipo silvestre. En un ejemplo, los granos descritos pueden tener un endospermo que es un 1-5%, un 5-10%, un 10-15%, un 15-20%, un 20-25% más pequeño que el endospermo de los granos de tipo silvestre.

En un ejemplo adicional, la toxicidad celíaca del grano de trigo o cebada o de la harina producida a partir del grano es menos de aproximadamente un 50%, menos de aproximadamente un 25%, menos de aproximadamente un 10%, de la harina producida a partir del grano de una planta de trigo o cebada de tipo silvestre correspondiente.

X. Productos alimenticios

En un ejemplo, la descripción se dirige a una harina u otro producto producido a partir del grano o la harina discutidos anteriormente. En otro ejemplo, la harina, la fracción gruesa o el almidón purificado pueden ser un componente de un producto alimenticio.

El producto alimenticio incluye, entre otros, una rosca, una galleta, un pan, un bollo, un croissant, una bola de masa, un panecillo, una magdalena, un pan de pita, un pan rápido, un pan plano, un pan de masa fermentada, un producto de masa refrigerada/congelada, masa, alubias horneadas, un burrito, chili, un taco, un tamal, una tortilla, un pastel, un cereal listo para comer, un alimento listo para comer, relleno, una comida de microondas, un bizcocho de chocolate, un pastel, un pastel de queso, un pastel de café, una galleta, un postre, un pastel, un panecillo dulce, una barra de chocolate, una masa de pastel, un relleno de pastel, comida para bebés, una mezcla para hornear, una masa, un empanizado, una mezcla de salsa, un suplemento de carne, un sustituto de la carne, una mezcla de condimentos, una mezcla de sopa, una salsa, una mezcla de harina y grasa, un aderezo para ensaladas, una sopa, crema agria, un fideo, una pasta, fideos ramen, fideos chow mein, fideos lo mein, una inclusión de helado, una barra de helado, un cucurucho de helado, un sándwich de helado, una galleta salada, un picatoste, un donut, un rollito de primavera, un refrigerio extruido, una barra de frutas y cereales, un refrigerio para microondas, una barra nutritiva, una tortita, un producto de panadería precocido, una galleta salada, un pudín, un producto a base de granola, un aperitivo, un bocadillo, una mezcla de aperitivos, un gofre, una base de pizza, alimento para animales o alimento para mascotas.

En un ejemplo, la harina es una harina integral (por ejemplo, una harina integral molida ultrafina, tal como una harina de trigo integral molida ultrafina). En un ejemplo, la harina integral incluye un constituyente de harina refinada (por ejemplo, harina de trigo refinada o harina refinada) y una fracción gruesa (por ejemplo, una fracción gruesa molida ultrafina). La harina de trigo refinada puede ser una harina que se prepara, por ejemplo, moliendo y tamizando trigo limpio. La Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) exige que la harina cumpla ciertos estándares de tamaño de partículas para poder incluirla en la categoría de harina de trigo refinada. El tamaño de partícula de la harina de trigo refinada se describe como una harina en la que no menos del 98% pasa a través de una tela que tiene aberturas no mayores que las de una tela metálica tejida denominada "212 micrómetros (U.S. Wire 70)".

En otro ejemplo, la fracción gruesa incluye al menos uno de: salvado y germen. Por ejemplo, el germen es una planta embrionaria que se encuentra dentro del grano de trigo. El germen incluye lípidos, fibra, vitaminas, proteínas, minerales y fitonutrientes, como los flavonoides. El salvado puede incluir varias capas de células y tiene una cantidad importante de lípidos, fibra, vitaminas, proteínas, minerales y fitonutrientes, como los flavonoides.

Por ejemplo, la fracción gruesa o la harina integral o la harina refinada de la presente invención se pueden usar en diversas cantidades para reemplazar la harina refinada o integral en productos horneados, productos de refrigerio y productos alimenticios. La harina integral (es decir, la harina integral molida ultrafina) también puede comercializarse directamente a los consumidores para su uso en los productos horneados caseros. En un ejemplo ejemplar, un perfil de granulación de la harina integral es tal que el 98% de las partículas en peso de la harina integral tienen menos de 212 micrómetros.

En otro ejemplo, la harina integral o la fracción gruesa o la harina refinada pueden ser un componente de un suplemento nutricional. El suplemento nutricional puede ser un producto que se añade a la dieta que contiene uno o más ingredientes, que normalmente incluyen: vitaminas, minerales, hierbas, aminoácidos, enzimas, antioxidantes, hierbas, especias, probióticos, extractos, prebióticos y fibra.

En un ejemplo adicional, el suplemento nutricional puede incluir cualquier ingrediente nutricional conocido que ayude a la salud general de un individuo, y los ejemplos incluyen, sin limitación, vitaminas, minerales, otros componentes de la fibra, ácidos grasos, antioxidantes, aminoácidos, péptidos, proteínas, luteína, ribosa, ácidos grasos omega-3 y/u otros ingredientes nutricionales. Debido al alto contenido nutricional del endospermo de la presente invención, pueden existir muchos usos que confieren numerosos beneficios a un individuo, incluido el suministro de fibra y otros nutrientes esenciales, una mayor función y salud digestiva, control del peso, control del azúcar en la sangre, salud del corazón, reducción del riesgo de diabetes, reducción potencial del riesgo de artritis y salud y bienestar general de un individuo.

En otros ejemplos más, la harina integral o la fracción gruesa o la harina refinada pueden ser un componente de un suplemento dietético. El Código de Regulaciones Federales define un suplemento dietético como un producto destinado a complementar la dieta, y contiene uno o más ingredientes dietéticos que incluyen: vitaminas, minerales, hierbas, productos botánicos, aminoácidos y otras sustancias o sus constituyentes; está destinado a tomarse por vía oral en forma de pastilla, cápsula, comprimido o líquido; y está etiquetado en el panel frontal como un suplemento dietético.

En otro ejemplo más, la harina integral o la fracción gruesa o la harina refinada pueden ser un suplemento de fibra o un componente del mismo. El suplemento de fibra puede ofrecerse, entre otras, en las siguientes formas: mezclas de bebidas instantáneas, bebidas listas para beber, barras nutricionales, obleas, galletas saladas, inyecciones de gel, cápsulas, caramelos masticables, comprimidos masticables y pastillas. Un ejemplo ofrece el suplemento de fibra en forma de un batido aromatizado o una bebida de tipo malta.

En otro ejemplo, la harina integral o la fracción gruesa o la harina refinada pueden incluirse como componente de un suplemento digestivo. La harina integral o la fracción gruesa o la harina refinada pueden ser un componente de un suplemento digestivo solo o en combinación con uno o más compuestos prebióticos y/u organismos probióticos. Los compuestos prebióticos son ingredientes alimentarios no digeribles que pueden afectar beneficiosamente al huésped al estimular selectivamente el crecimiento y/o la actividad de un número limitado de microorganismos en el colon. Los ejemplos de compuestos prebióticos dentro del alcance de la invención pueden incluir, entre otros: oligosacáridos e inulinas.

Los probióticos son microorganismos que, cuando se administran en cantidades adecuadas, confieren un beneficio a la salud del huésped. Los organismos probióticos incluyen, entre otros:Lactobacillus, Bifidobacterias, Escherichia, Clostridium, Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus,ySaccharomyces.

En otro ejemplo más, la harina integral o la fracción gruesa o la harina refinada se pueden incluir como componente de un alimento funcional. El Instituto de Tecnólogos de los Alimentos define los alimentos funcionales como los alimentos y componentes alimentarios que brindan un beneficio para la salud más allá de la nutrición básica. Esto incluye los alimentos convencionales, los alimentos fortificados, enriquecidos o mejorados y los suplementos dietéticos. La harina integral y la fracción gruesa o la harina refinada incluyen numerosas vitaminas y minerales, tienen una alta capacidad de absorción de radicales de oxígeno y son ricas en fibra, lo que las hace adecuadas para su uso en/como un alimento funcional.

En otro ejemplo, la harina integral o la fracción gruesa o la harina refinada se pueden usar en alimentos medicinales. El alimento medicinal se define como un alimento formulado para ser consumido o administrado enteramente bajo la supervisión de un médico y que está destinado al tratamiento dietético específico de una enfermedad o afección para la cual se establecen requisitos nutricionales distintivos, basados en principios científicos reconocidos mediante una evaluación médica. El contenido de nutrientes y las capacidades antioxidantes de la harina integral y la fracción gruesa o la harina refinada las hacen ideales para su uso en los alimentos médicos.

En otro ejemplo más, la harina integral o la fracción gruesa o la harina refinada también se pueden usar en productos farmacéuticos. La harina integral y la fracción gruesa o la harina refinada tienen un alto contenido de fibra y una granulación muy fina, lo que las hace adecuadas para su uso como vehículo en productos farmacéuticos.

En otro ejemplo más, el suministro de la harina integral o la fracción gruesa o la harina refinada como suplemento nutricional, suplemento dietético o suplemento digestivo se contempla a través de mecanismos de suministro en donde la harina integral o la fracción gruesa es el único ingrediente o uno de muchos ingredientes nutricionales. Los ejemplos incluyen, entre otros: mezclas de bebidas instantáneas, bebidas listas para beber, barras nutricionales, obleas, galletas saladas, inyecciones de gel, cápsulas y caramelos masticables.

En otro ejemplo más, se puede utilizar un proceso de molienda para preparar una harina multitrigo o una fracción gruesa multicereal. En un ejemplo, el salvado y el germen de un tipo de trigo se pueden moler y mezclar con endospermo molido o harina de trigo integral de otro tipo de trigo. Alternativamente, el salvado y el germen de un tipo de cereal se pueden moler y mezclar con endospermo molido o harina integral de otro tipo de cereal.

En otro ejemplo más, se pueden mezclar salvado y germen de un primer tipo de trigo o cereal con salvado y germen de un segundo tipo de trigo o cereal para producir una fracción gruesa de múltiples cereales. Se contempla que la invención abarca mezclar cualquier combinación de uno o más de salvado, germen, endospermo y harina integral de uno o más cereales. Este enfoque de múltiples cereales y múltiples trigos se puede utilizar para hacer una harina personalizada y aprovechar las cualidades y contenidos nutricionales de múltiples tipos de cereales o trigos para producir una harina.

La harina integral de la invención se puede producir mediante una variedad de procesos de molienda. Un proceso ejemplar implica moler el grano en una única corriente sin separar el endospermo, el salvado y el germen del grano en corrientes separadas. El grano limpio y templado se transporta a un molino de primer paso, tal como un molino de martillos, un molino de rodillos, un molino de púas, un molino de impacto, un molino de discos, un molino de fricción por aire, un molino de separación o similares.

Después de la molienda, el grano se descarga y se transporta a un tamiz. Se puede utilizar cualquier tamiz conocido en la técnica para tamizar una partícula molida. El material que pasa a través del tamiz es la harina integral de la invención y no requiere un procesamiento adicional. El material que permanece en el tamiz se denomina segunda fracción. La segunda fracción requiere una reducción adicional de las partículas. Así, esta segunda fracción se puede transportar a un molino de segundo paso.

Después de la molienda, la segunda fracción puede transportarse a un segundo tamiz. El material que pasa a través del segundo tamiz es la harina integral. El material que permanece en el tamiz se conoce como cuarta fracción y requiere un procesamiento adicional para reducir el tamaño de las partículas. La cuarta fracción del segundo tamiz se transporta de regreso al molino de primer paso o al molino de segundo paso para su posterior procesamiento a través de un circuito de retroalimentación.

Se contempla que la harina integral, la fracción gruesa, el almidón purificado y/o los productos de los granos de la invención puedan producirse mediante varios procesos de molienda conocidos en la técnica.

XI. Glutenasa

En un ejemplo, la planta de trigo, las semillas de trigo y las partes de la planta de trigo descritas en la presente memoria se pueden mezclar con una glutenasa.

En otro ejemplo más, el grano, la harina y el almidón descritos en la presente memoria se pueden mezclar con una glutenasa. En otro ejemplo, un producto alimenticio descrito en la presente memoria se puede mezclar con una glutenasa.

En un ejemplo, la descripción se dirige a una harina u otro producto compuesto por el grano o la harina discutidos anteriormente y una glutenasa. En otro ejemplo, una composición de harina, ya sea la fracción gruesa o el almidón purificado y una glutenasa, puede ser un componente de un producto alimenticio.

Como se usa en la presente memoria, el término "glutenasa" se refiere a una enzima que es capaz, sola o en combinación con enzimas endógenas o exógenas añadidas, de escindir los oligopéptidos tóxicos de las proteínas del gluten del trigo, cebada, avena y centeno hasta fragmentos atóxicos. El gluten es la fracción proteica de la masa de los cereales, que se puede subdividir en gluteninas y prolaminas, que se subclasifican en gliadinas, secalinas, hordeínas y aveninas procedentes del trigo, centeno, cebada y avena, respectivamente.

En un ejemplo, el término "glutenasa" también puede referirse a una enzima proteasa o peptidasa. Los términos "proteasa" o "peptidasa" describen una proteína o fragmento de la misma con la capacidad de escindir enlaces peptídicos, donde el enlace peptídico escindible puede ser terminal o interno en los oligopéptidos o las proteínas más grandes. Las peptidasas específicas de prolina son glutenasas.

Las glutenasas incluyen enzimas proteasas y peptidasas que tienen al menos aproximadamente un 20% de identidad de secuencia a nivel de aminoácidos, más habitualmente al menos aproximadamente un 40% de identidad de secuencia y preferiblemente al menos aproximadamente un 70% de identidad de secuencia con una de las siguientes peptidasas: prolil endopeptidasa (PEP) deF. meningosepticum(número de acceso de Genbank D10980), PEP deA. hydrophila(número de acceso de Genbank D14005), PEP de S.capisulata(número de acceso de Genbank AB010298), DCP I de conejo (número de acceso de Genbank X62551), DPP IV deAspergillus fumigatus(número de acceso de Genbank U87950) o cisteína proteinasa B deHordeum vulgare(número de acceso de Genbank JQ1110).

En un ejemplo, la glutenasa es una PEP. Las PEP se producen en microorganismos, vegetales y animales. Las PEP pertenecen a la superfamilia de enzimas serina proteasa y tienen una tríada catalítica conservada compuesta por residuos de Ser, His y Asp. Algunos de estos homólogos se han caracterizado, p. ej., las enzimas deF. meningoscepticum, Aeromonas hydrophila, Aeromonas punctata, Novosphingobium capsulatum, Pyrococcus furiosusy de fuentes de mamíferos son PEP caracterizadas bioquímicamente. Otras, como las enzimas deNostocyArabidopsis, es probable que sean PEP, pero hasta la fecha no se han caracterizado completamente. Otras más, como las enzimas deE. co liyM. xanthus,pueden no ser PEP, pero son miembros homólogos de la superfamilia de serina proteasas y pueden ser materiales de partida útiles en la ingeniería de proteínas para producir una PEP. Con respecto a la enzima deF. meningoscepticum,la identidad de secuencias por pares de esta familia de enzimas está en el rango del 30-60%. En consecuencia, las PEP incluyen las enzimas que tienen >30% de identidad con la enzima deF. meningoscepticum(como en las enzimas dePyrococcus),o que tienen >40% de identidad (como en las enzimas deNovosphingobium),o que tienen >50% de identidad (como en las enzimas deAeromonas)respecto de la enzima deF. meningoscepticum.

En un ejemplo, una glutenasa incluye una peptidasa o proteasa que tiene una actividad específica de al menos 2,5 U/mg, preferiblemente 25 U/mg y más preferiblemente 250 U/mg para la escisión de un péptido que comprende uno o más de los siguientes motivos: Gly-Pro-pNA, Z-Gly-Pro-pNA (donde Z es un grupo benciloxicarbonilo) e Hip-His-Leu, donde "Hip" es ácido hipúrico, pNA es para-nitroanilida y 1 U es la cantidad de enzima necesaria para catalizar el recambio de 1 ^mol de sustrato por minuto.

En un ejemplo, la glutenasa es Kuma030, que es una gliadina peptidasa que degrada rápidamente los péptidos de gliadina inmunogénicos como se describe enJournal of the American Chemical Society,137:13106-13113, 2015. En otro ejemplo, la glutenasa es KumaMax (Kuma010).

En otro ejemplo más, una glutenasa útil en las composiciones y métodos descritos en la presente memoria incluye una enzima que pertenece a cualquiera de las siguientes clasificaciones de enzimas: EC 3.4.21.26, EC 3.4.14.5 o EC 3.4.15.1.

En un ejemplo, la secuencia de aminoácidos de una glutenasa, p. ej. una glutenasa natural, puede alterarse de diversas formas conocidas en la técnica para generar cambios específicos en la secuencia y las enzimas glutenasa adicionales útiles en las formulaciones y composiciones descritas en la presente memoria. Tales variantes serán típicamente variantes funcionalmente conservadas, que difieren generalmente en la secuencia de la proteína nativa u original correspondiente pero aún conservan la actividad biológica deseada.

Las variantes también incluyen los fragmentos de una glutenasa que retienen la actividad enzimática. Se pueden usar varios métodos conocidos en la técnica para generar cambios selectivos, por ejemplo: presentación en fagos en combinación con mutaciones aleatorias y selectivas, introducción de mutaciones de barrido y similares. Una variante puede ser sustancialmente similar a una secuencia nativa, es decir, diferir en al menos un aminoácido, y puede diferir en al menos dos, pero generalmente no más de aproximadamente diez aminoácidos (el número de diferencias depende del tamaño de la secuencia nativa). Los cambios de la secuencia pueden ser sustituciones, inserciones o deleciones. Se pueden utilizar mutaciones de barrido que introducen sistemáticamente alanina u otros residuos para determinar los aminoácidos clave. Las sustituciones conservativas de aminoácidos normalmente incluyen las sustituciones dentro de los siguientes grupos: (glicina, alanina); (valina, isoleucina, leucina); (ácido aspártico, ácido glutámico); (asparagina, glutamina); (serina, treonina); (lisina, arginina); y (fenilalanina, tirosina).

En otro ejemplo, los fragmentos de glutenasa de interés incluyen fragmentos de al menos aproximadamente 20 aminoácidos contiguos, más habitualmente al menos aproximadamente 50 aminoácidos contiguos, y pueden comprender 100 o más aminoácidos, hasta la proteína completa, y pueden extenderse más para comprender secuencias adicionales. En cada caso, el criterio clave es si el fragmento conserva la capacidad de digerir los oligopéptidos tóxicos que contribuyen a los síntomas de la enfermedad celíaca.

XII. Fitomejoramiento

En otro ejemplo, la descripción se dirige a métodos para el fitomejoramiento mediante el uso de plantas de trigo y partes de plantas con una o más mutaciones no transgénicas en el gen WPBF.

Un ejemplo de ello es el método de cruzar una variedad de trigo con una o más mutaciones no transgénicas en el gen WPBF con otra variedad de trigo para formar una población de primera generación de plantas F1. La población de primera generación de plantas F1 producida mediante este método también es un ejemplo de la invención. Esta población de primera generación de plantas F1 comprenderá un conjunto esencialmente completo de alelos de una variedad de trigo con una o más mutaciones no transgénicas en el gen WPBF. Un experto en la técnica puede utilizar libros de fitomejoramiento o métodos moleculares para identificar una planta F1 particular producida usando una variedad de trigo con una o más mutaciones no transgénicas en el gen WPBF, y la presente invención también abarca cualquier planta individual de este tipo. Estos ejemplos también cubren el uso de conversiones transgénicas o retrocruces de variedades de trigo con una o más mutaciones en el gen WPBF para producir plantas F1 de primera generación.

En otro ejemplo, la descripción se refiere a un método para desarrollar una progenie de una planta de trigo. Un método para desarrollar una progenie de una planta de trigo comprende cruzar una variedad de trigo con una o más mutaciones no transgénicas en el gen WPBF con una segunda planta de trigo y realizar un método de fitomejoramiento. Un método específico para producir una línea derivada de una variedad de trigo con una o más mutaciones no transgénicas en el gen WPBF es el siguiente.

Un experto en la técnica cruzaría una variedad de trigo con una o más mutaciones no transgénicas en el gen WPBF con otra variedad de trigo, tal como una variedad de élite. La semilla F1 derivada de este cruce se cultivaría para formar una población homogénea. La semilla F1 contendría un conjunto de alelos de una variedad de trigo con una o más mutaciones no transgénicas en el gen WPBF y un conjunto de alelos de la otra variedad de trigo.

El genoma F1 estaría formado por un 50% de una variedad de trigo con una o más mutaciones no transgénicas en el gen WPBF y un 50% de la otra variedad de élite. La semilla F1 se cultivaría para formar la semilla F2. Se podría permitir que la semilla F1 se reprodujera sola o con otra variedad de trigo.

En promedio, la semilla F2 habría obtenido el 50% de sus alelos de una variedad de trigo con una o más mutaciones no transgénicas en el gen WPBF y el 50% de la otra variedad de trigo, pero varias plantas individuales de la población tendrían un porcentaje mucho mayor de sus alelos procedentes de una variedad de trigo con una o más mutaciones no transgénicas en el gen WPBF (Wang J. y R. Bernardo, 2000, Crop Sci. 40:659-665 y Bernardo, R. y A. L. Kahler, 2001, Theor. Appl. Genet. 102:986-992).

La semilla F2 se cultivaría y la selección de plantas se haría basándose en la observación visual y/o la medición de rasgos y/o la selección asistida por marcadores. Se seleccionaría la variedad de trigo con una o más mutaciones no transgénicas en la progenie derivada del gen WPBF que exhibiera rasgos derivados del gen y cada planta se cosecharía por separado. Esta semilla F3 de cada planta se cultivaría en hileras individuales y se dejaría autoflorecer. Luego, las hileras o plantas seleccionadas de las hileras se cosecharían y se trillarían individualmente. Las selecciones se basarían nuevamente en la observación visual y/o las mediciones de rasgos deseables de las plantas, tales como una o más variedades de trigo deseables con una o más mutaciones no transgénicas en los rasgos derivados del gen WPBF.

El proceso de cultivo y selección se repetiría cualquier número de veces hasta que se obtuviese una variedad de trigo homocigótica con una o más mutaciones no transgénicas en la planta de trigo derivada del gen WPBF. La variedad de trigo homocigótica con una o más mutaciones no transgénicas en la planta de trigo derivada del gen WPBF contendría rasgos deseables derivados de la variedad de trigo con una o más mutaciones no transgénicas en el gen WPBF, algunos de los cuales pueden no haberse expresado en la otra variedad de trigo original con la cual se cruzó la variedad de trigo con una o más mutaciones no transgénicas en el gen WPBF, y algunos de los cuales pueden haberse expresado en ambas variedades de trigo pero ahora estarían en un nivel igual o mayor que el nivel expresado en la variedad de trigo con una o más mutaciones no transgénicas en el gen WPBF.

El proceso de fitomejoramiento, cruce, autofecundación y selección, puede repetirse para producir otra población de una variedad de trigo con una o más mutaciones no transgénicas en las plantas de trigo derivadas del gen WPBF con, en promedio, un 25% de sus genes derivados de la variedad de trigo con una o más mutaciones no transgénicas en el gen WPBF, pero varias plantas individuales de la población tendrían un porcentaje mucho mayor de sus alelos derivados de la variedad de trigo con una o más mutaciones no transgénicas en el gen WPBF. Otro ejemplo de la invención es una variedad de trigo homocigótica con una o más mutaciones no transgénicas en la planta de trigo derivada del gen WPBF que se ha cruzado con otra planta de trigo con una o más mutaciones no transgénicas en los rasgos derivados del gen WPBF.

A. Mutaciones como marcadores

Los marcadores genéticos son características biológicas determinadas por formas alélicas de genes o loci genéticos y pueden transmitirse de una generación a otra y, por lo tanto, pueden usarse como sondas o etiquetas experimentales para realizar un seguimiento de un individuo, una planta, un tejido, una célula, un núcleo, un cromosoma o un gen. Los marcadores genéticos utilizados en la genética y el fitomejoramiento se pueden clasificar en dos categorías: marcadores clásicos y marcadores de ADN. Los marcadores clásicos incluyen marcadores morfológicos, marcadores citológicos y marcadores bioquímicos. Los marcadores de ADN se han desarrollado en muchos sistemas basados en diferentes técnicas o métodos de detección de polimorfismos (transferencia de Southern/hibridación con ácido nucleico, PCR y secuenciación de ADN), como el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), el polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP), el ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD), la repetición de secuencias simples (SSR), el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), etc.

Los SNP proporcionan la forma definitiva/más simple de marcadores moleculares, ya que una única base de nucleótido es la unidad de herencia más pequeña y, por lo tanto, pueden proporcionar la cantidad máxima de marcadores. Los SNP se encuentran con mucha frecuencia en animales y plantas. Normalmente, las frecuencias de los SNP están en el rango de un SNP cada 100 a 300 pares de bases en las plantas. Los SNP pueden estar presentes dentro de las secuencias codificantes de genes, las regiones no codificantes de genes o en las regiones intergénicas entre genes en diferentes frecuencias en diferentes regiones cromosómicas.

Los SNP son marcadores codominantes, a menudo vinculados a genes y presentes en la forma más simple/definitiva para el polimorfismo y, por lo tanto, se han convertido en marcadores genéticos muy atractivos y potenciales en el estudio genético y el fitomejoramiento. Además, los SNP pueden automatizarse muy fácilmente y detectarse rápidamente, con una alta eficiencia para la detección de polimorfismos.

En un ejemplo, la descripción se refiere a mutaciones en el gen WPBF, que son polimorfismos de un solo nucleótido, que pueden usarse como marcadores en el fitomejoramiento. Las mutaciones en el gen WPBF son causales y su segregación puede seguirse utilizando, por ejemplo, sondas KASP.

En otro ejemplo, las mutaciones identificadas en la Sección II de esta descripción se pueden usar como marcadores en el fitomejoramiento. En otro ejemplo más, se pueden usar una o más mutaciones de las Tablas 1-3 como marcadores en el fitomejoramiento.

En un ejemplo, las mutaciones se pueden seguir usando técnicas que incluyen, entre otras, el SNP-polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP); CAPS; matrices Axiom SNP; matriz iSelect; sondas TaqMan y sondas KASP. En otro ejemplo, se pueden usar técnicas de secuenciación de próxima generación que incluyen, entre otras, 454 Life Sciences (Roche Applied Science, Indianápolis, IN); HiSeq (Illumina, San Diego, CA); SOLiD e Ion Torrent (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA).

El ensayo de genotipado KASP™ basado en PCR es un ensayo homogéneo basado en fluorescencia (FRET) que permite una discriminación bialélica precisa de SNP e InDels conocidos. Una característica clave de la tecnología KASP basada en PCR es el uso de un sistema indicador de casete FRET universal que elimina la necesidad de costosas sondas con doble etiquetado. Cada uno de los cebadores directos específicos de alelo tiene una secuencia de cola patentada que corresponde a uno de los dos casetes FRET: una etiqueta con tinte FAM y la otra con tinte HEX. La discriminación bialélica se logra mediante la unión competitiva de dos cebadores directos específicos de alelo.

XIII. Transcrito de cebada MLOC_12852.2, un factor de transcripción Dof

La cebada es un cereal diploide que se cultiva ampliamente en climas más fríos para la producción de alimentos, bebidas y piensos para animales. Las proteínas de las semillas de cebada se clasifican en albúmina, globulina, prolamina (hordeína) y glutelina según su solubilidad en agua, solución salina, alcohol acuoso y disoluciones básicas o ácidas, respectivamente. Aproximadamente la mitad de las proteínas de almacenamiento de las semillas de cebada se encuentran en la fracción de prolamina. Estas prolaminas son principalmente proteínas de reserva que funcionan como fuentes de carbono, nitrógeno o azufre para el crecimiento y desarrollo tras la germinación. La hordeína constituye aproximadamente el 40% de la proteína de la semilla, aunque esto depende del suministro de nitrógeno de la planta durante el crecimiento.

Se han caracterizado los loci que codifican las prolaminas de cebada, principalmente por su contribución a la calidad del malteado de la cebada y a la formación de espuma y turbidez en la producción de cerveza. Hay cuatro clases de prolaminas en la cebada: las hordeínas B, C, D y<y>codificadas por los loci Hor2, Hor1, Hor3 y Hor5, respectivamente, en el cromosoma 1H. Estos loci codifican proteínas que varían desde una única prolamina (p. ej., hordeína D) hasta familias de proteínas que contienen entre 20 y 30 miembros (p. ej., hordeínas B y C). Las hordeínas B y C son relativamente más abundantes y comprenden aproximadamente el 70% y el 24% del total de las hordeínas, respectivamente. Las hordeínas D y y representan componentes menores en aproximadamente un 2-4% cada una. El peso molecular de las hordeínas varía de aproximadamente 35 kDa a 100 kDa. No existen prolaminas de cebada, que tienen una estrecha homología con las a-gliadinas del trigo; sin embargo, está ampliamente aceptado que las hordeínas son tóxicas para los celíacos.

Las hordeínas B son la principal fracción proteica y se diferencian de las hordeínas C por su contenido de azufre. Las hordeínas B representan el 70-80% del total y las hordeínas C el 10-20%. Las hordeínas A generalmente no se consideran una fracción de almacenamiento, mientras que las hordeínas D son homólogas a las gluteninas de alto peso molecular. Las hordeínas, junto con el resto de las prolaminas de los cereales relacionados, no se expresan en el propio embrión cigótico, a diferencia de otras proteínas de almacenamiento como las napinas; se cree que se expresan exclusivamente en el endospermo amiláceo durante las etapas media a tardía del desarrollo de la semilla.

En los EE. UU., la definición de "sin gluten" de la FDA exige que el producto esté elaborado únicamente con materias primas sin gluten, es decir, que no contenga trigo, cebada ni centeno. El Codex Alimentarius permite la etiqueta "sin gluten" en alimentos que no contengan más de 20 ppm de gluten (0,02 g por kilogramo o litro) y este es también el estándar europeo para la expresión "sin gluten". La mayoría de los celíacos pueden tolerar hasta unos 10 mg de gluten al día sin mayores efectos (Thompson, 2001).

Los ejemplos de una planta de cebada de tipo silvestre incluyen, entre otros, Bomi, Sloop, Carlsberg II, K8 o L1.

En otro ejemplo, la descripción se refiere a plantas de cebada con una o más mutaciones no transgénicas en el transcrito de cebada MLOC_12852.2, que es un factor de transcripción Dof (en adelante "factor de transcripción Dof de cebada"). En otro ejemplo, la descripción se refiere a plantas de cebada con una o más mutaciones no transgénicas en el gen del factor de transcripción Dof de cebada, en donde dichas mutaciones dan como resultado granos con gluten disminuido.

En un ejemplo, la descripción se refiere a una planta de cebada con una expresión disminuida del gen del factor de transcripción Dof de cebada o una actividad disminuida de la proteína del factor de transcripción DoF de cebada. En un ejemplo, la disminución de la expresión del gen del factor de transcripción DoF de cebada o de la proteína del factor de transcripción Dof de cebada se puede lograr mediante mutaciones no transgénicas, transgenes o edición genómica.

En un ejemplo, la descripción se refiere a la modificación del gen del factor de transcripción DoF de cebada mediante mutaciones no transgénicas, o transgenes o edición genómica. Los métodos y técnicas descritos en las Secciones III y IV se aplican igualmente a las plantas de cebada.

En otro ejemplo, la descripción se refiere a plantas de cebada con un nivel disminuido de hordeínas totales en comparación con el nivel total de hordeínas en una planta de tipo silvestre. En un ejemplo, la planta de cebada tiene al menos una de las hordeínas B, C o D disminuida en comparación con las hordeínas B, C o D en una planta de tipo silvestre.

En otro ejemplo más, la descripción se refiere a una o más mutaciones en el gen del factor de transcripción Dof de cebada que disminuyen el nivel de hordeínas B y/o C en el grano. En otro ejemplo más, la descripción se refiere a una planta de cebada con una o más mutaciones en el gen del factor de transcripción Dof de cebada que disminuyen el nivel de hordeínas B y/o C y tiene un nivel de hordeínas D de tipo silvestre.

En otro ejemplo, el grano comprende aproximadamente el 75% o menos, aproximadamente el 50% o menos, aproximadamente el 25% o menos, aproximadamente el 20% o menos, aproximadamente el 15% o menos, aproximadamente el 10% o menos, aproximadamente el 7,5% o menos, aproximadamente el 5% o menos o aproximadamente el 2,5% o menos del nivel de hordeínas B, C y/o D o cualquier combinación de las mismas en comparación con el grano de la planta de cebada de tipo silvestre correspondiente.

En otro ejemplo más, la harina producida a partir del grano comprende menos de aproximadamente el 60%, o menos de aproximadamente el 50%, o menos de aproximadamente el 40%, o menos de aproximadamente el 30%, o menos de aproximadamente el 25%, o menos de aproximadamente el 20%, o menos de aproximadamente el 15%, o menos de aproximadamente el 10%, o menos de aproximadamente el 5% de hordeínas en comparación con la harina producida a partir de grano de tipo silvestre.

En un ejemplo adicional, la toxicidad celíaca de la harina producida a partir del grano es menos de aproximadamente el 50%, menos de aproximadamente el 25%, más preferiblemente aproximadamente el 10% o menos, de la harina producida a partir del grano de una planta de cebada de tipo silvestre correspondiente.

En otro ejemplo más, la malta producida a partir del grano comprende menos de aproximadamente 200 ppm de hordeínas, menos de aproximadamente 125 ppm de hordeínas, más preferiblemente menos de aproximadamente 75 ppm de hordeínas.

En otro ejemplo más, la descripción se refiere a una o más mutaciones en el gen del factor de transcripción Dof de cebada. En un ejemplo, la descripción se refiere a múltiples mutaciones no transgénicas en el gen del factor de transcripción Dof de cebada que incluyen, entre otras, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y más de 10 mutaciones.

En un ejemplo, la descripción se refiere a una o más mutaciones en la región Dof del gen del factor de transcripción Dof de cebada. En otro ejemplo, la descripción se refiere a una o más modificaciones en la región Dof del gen del factor de transcripción Dof de cebada, en donde las modificaciones incluyen, entre otras, mutaciones, mutaciones no transgénicas, transgenes y modificaciones mediante edición genómica.

En otro ejemplo más, la descripción se refiere a una planta de cebada con una o más mutaciones en el gen del factor de transcripción Dof de cebada. En otro ejemplo más, la descripción se refiere a una planta de cebada con una o más mutaciones en la región Dof del gen del factor de transcripción Dof de cebada.

En otro ejemplo más, la descripción se refiere a una planta de cebada con un gen del factor de transcripción Dof de cebada modificado. En otro ejemplo más, la descripción se refiere a una planta de cebada con un gen del factor de transcripción Dof de cebada modificado, en donde la modificación está en la región Dof.

En un ejemplo, la descripción se refiere a una o más mutaciones en la secuencia codificante de SEQ ID N° 12 para el factor de transcripción Dof de cebada. En un ejemplo, la mutación es una mutación de adenina a timidina en la posición 173 de SEQ ID N212.

En otro ejemplo más, la descripción se refiere a una o más mutaciones en el aminoácido de SEQ ID N° 13 para el factor de transcripción Dof de cebada. Se pueden mutar uno o más de los 337 aminoácidos mostrados en Se Q ID N° 13. Las mutaciones pueden ser graves o conservativas.

En un ejemplo, la mutación es una mutación de Q a L en el aminoácido 58 de SEQ ID N° 13.

SEQ ID N° 12: Gen DOF de cebada(Hordeum vulgare; Hv):

Atggaggaagtgttttcgtccaactccaagagcaaggccggtcagatggcgggagaggcggtggcggcggccgagaagaagtctcggccgaagcc agagcagaaggtggagtgccctcggtgcaagtctggtaacaccaagttctgctactacaacaactacagcatgtcccagccgcgctacttctgcaaggc ctgccgccgctactggacccatggtggctccctccgcaacgtccccatcggtggtggttgccgcaagcccaaacgcccggggacctctgacgcccaca agctcggcatggcctcctcatcggaacccacgggtgtcgtgcccccctcgaactgcacagggatgaactttgctaacgtcctcccgacgtttatgtctggt ggctttgacattcaaagcagcctctccctgacaacttttgggtcatcatcctcatccaacccgacggggttgatgtcccccggtgggacgacttcatttctgg atgtgctgagaggtggtgcaggagggcttcttgatggcagcctcggtccaaacaatggctactactatggtgggcatgccaatggatcaggcattgggat gttgatgactccgccaacggtatcgtttggcattccaagtccgatgcaacaacatggcggtctcgtggttggtggaaatggaataggtggcacaacttcttc

aacatttcagggcaacgctggcgaggaaggagacgatggtacggggtccattatggggctccagtggcagccacatgttggtaatggtggcggtggtg gtgttggattaggaggcgcgcatcatcttgggactgggaacaatgtgacgatgggcaacaacaacaataataacaaccagaacaacaataacggcggc ggtgctggtgatgacgacgatggtgggtcatcgagggattgctactggatcaacaatggaggatcgaacccatggcagagcctcctcaacagcacctcc ctgatctcatacacacca

SEQ ID N° 13: Secuencia de proteínas de SEQ ID N° 12

MEEVFSSNSKSKAGQMAGEAVAAAEKKSRPKPEQKVECPRCKSGNTKFCYYNNYSMSQPRYFC

KACRRYWTHGGSLRNVPIGGGCRKPKR

PGTSDAHKLGMASSSEPTGVVPPSNCTGMNFANVLPTFMSGGFDIQSSLSLTTFGSSSSSNPTGLM

SPGGTTSFLDVLRGGAGGLLDGSL

GPNNGYYYGGHANGSGIGMLMTPPTVSFGIPSPMQQHGGLVVGGNGIGGTTSSTFQGNAGEEG

DDGTGSIMGLQ W QPH V GN GGGGGV GLG

GAHHLGTGNNVTMGNNNNNNNQNNNNGGGAGDDDDGGSSRDCYWINNGGSNPWQSLLNSTS

LISYTP

Los siguientes ejemplos se ofrecen únicamente a modo de ilustración y no de limitación. Debe entenderse que las mutaciones analizadas en la presente memoria son meramente ejemplares y que también se contemplan mutaciones similares.

Ejemplos

EJEMPLO 1: Identificación del transcrito de cebada MLOC_12852.2

Se analizó una planta de cebada con gluten disminuido para identificar la mutación correspondiente al fenotipo con gluten disminuido. La cebada con gluten bajo proporciona una lectura de ELISA con anticuerpos R5 de 1000 ppm de gluten (mg/kg) en comparación con la cebada de tipo silvestre que tiene más de 100000 ppm de gluten (mg/kg).

La FIG. 1 es una SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio) que muestra la presencia o ausencia de las hordeínas B, C y D de cebada. Como se muestra en la Figura 1A y la Figura 1B, las hordeínas B, C y D son apenas detectables en la cebada con gluten bajo.

La FIG. 2 es una fotografía que compara las semillas de cebada de tipo silvestre con las semillas de cebada con gluten bajo, que son bastante similares en características y rasgos físicos.

Se utilizó el método de secuenciación de ARN segregante en masa para identificar el gen correspondiente al fenotipo de gluten bajo. Se creó una población para la cartografía para identificar los SNP del ADN vinculados con la mutación cruzando la planta mutante con una variedad de cebada no mutante no relacionada (Bowman). Se analizó el contenido de hordeína de las medias semillas de endospermo F2 para identificar los segregantes F2 mutantes homocigotos y la mitad del embrión de las semillas mutantes y no mutantes se cultivó para producir semillas F3. En la F3, se realizó un análisis de medias semillas en aproximadamente 20 semillas no mutantes de cada F2 individual para determinar qué medias semillas no mutantes de F2 habían sido heterocigotas para la mutación recesiva única y cuáles habían sido homocigotas no mutantes. Se cultivaron entre 20 y 40 plántulas mutantes F3 individuales, cada una de un mutante F2 individual diferente, y se aisló el ARN en 3 conjuntos replicados de plántulas etioladas enteras de aproximadamente 7 días, incluido el tejido de las raíces y los brotes.

Asimismo, se cultivaron entre 20 y 40 plántulas homocigotas no mutantes individuales, cada una de una semilla F2 homocigota no mutante diferente, y se aisló el ARN en tres conjuntos replicados de tejido de raíces y brotes de plántulas homocigotas no mutantes etioladas completas de aproximadamente 7 días. El análisis de secuenciación del ARN se realizó según Liu et al., Plos ONE 7(5): e36406 y los SNP se cartografiaron en el genoma de la cebada.

Los SNP que se segregaban conjuntamente con el mutante localizaron al mutante en una región de aproximadamente 4 cM cerca del centrómero en el brazo largo del cromosoma 5H. Posteriormente, se cartografiaron sondas KASP diseñadas a partir de SNP seleccionados en la población de cartografía más grande y se identificó una región de 600 kb en donde los SNP no mostraron recombinación con el mutante. El examen de la cartografía de genes cerca de esta región identificó una mutación en el transcrito de cebada MLOC_12852.2, que es un factor de transcripción Dof. La secuencia codificante y la secuencia de aminoácidos del transcrito de cebada MLOC_12852.2 se muestran en las SEQ ID N° 12 y 13, respectivamente. La planta de cebada de gluten bajo contiene un cambio de glutamina a leucina en la posición 58 de la secuencia de aminoácidos.

EJEMPLO 2: Mutagénesis de semillas de trigo

Según un ejemplo ejemplar de la descripción, las semillas de trigo(Triticum aestivum)de la variedad hexaploide Express o la variedad tetraploide Kronos se infiltraron al vacío en H2O (aproximadamente 1000 semillas/100 ml de H2O durante aproximadamente 4 minutos). Las semillas se colocaron después en un agitador (45 rpm) en una campana extractora a temperatura ambiente. El mutágeno metanosulfonato de etilo (EMS) se añadió a las semillas empapadas hasta concentraciones finales que oscilaban entre aproximadamente el 0,75% y aproximadamente el 1,2% (v/v). Después de un período de incubación de 18 horas, la disolución de EMS se reemplazó 4 veces con H2O fresco. Luego se enjuagaron las semillas con agua corriente durante aproximadamente 4-8 horas. Finalmente, las semillas mutagenizadas se plantaron (96/bandeja) en tierra para macetas y se dejaron germinar en el interior. Las plantas de cuatro a seis semanas se transfirieron al campo para que crecieran hasta convertirse en plantas M1 completamente maduras. Se permitió que las plantas M1 maduras se autopolinizaran y luego las semillas de la planta M1 se recogieron y se plantaron para producir plantas M2.

Se extrajo y preparó el ADN de las plantas M2 producidas según la descripción anterior para identificar qué plantas M2 portaban una mutación en uno o más de sus loci de WPBF. El ADN de la planta M2 se preparó utilizando los métodos y reactivos contenidos en el kit para plantas DNeasy® 96 de Qiagen® (Valencia, CA). Se colocaron aproximadamente 50 mg de muestra de planta congelada en un tubo de muestra con una perla de tungsteno, se congelaron en nitrógeno líquido y se molieron 2 veces durante 1 minuto cada una a 20 Hz usando el molino mezclador Retsch® MM 300. A continuación, se añadieron a la muestra 400 gl de disolución AP1 [tampón AP1, disolución DX y ARNasa (100 mg/ml)] a 80 °C. El tubo se selló y se agitó durante 15 segundos. Tras la adición de 130 gl de tampón AP2, el tubo se agitó durante 15 segundos. Las muestras se colocaron en un congelador a -20 °C durante al menos 1 hora. Luego las muestras se centrifugaron durante 20 minutos a 5600 X g. Se transfirió una alícuota de 400 gl de sobrenadante a otro tubo de muestra. Tras la adición de 600 gl del tampón AP3/E, este tubo de muestra se tapó y se agitó durante 15 segundos. Se colocó una placa de filtro sobre un bloque de pocillos cuadrados y se aplicó 1 ml de la disolución de muestra a cada pocillo y se selló la placa. La placa y el bloque se centrifugaron durante 4 minutos a 5600 X g. A continuación, se añadieron 800 gl de tampón AW a cada pocillo de la placa de filtro, se selló y se centrifugó durante 15 minutos a 5600 X g en el bloque de pocillos cuadrados. Luego se colocó la placa de filtro en un nuevo conjunto de tubos de muestra y se aplicaron 80 gl de tampón AE al filtro. Se tapó y se incubó a temperatura ambiente durante 1 minuto y luego se centrifugó durante 2 minutos a 5600 X g. Esta etapa se repitió con 80 gl adicionales de tampón AE. Se retiró la placa de filtro y se taparon los tubos que contenían los filtrados mezclados. Luego, las muestras individuales se normalizaron a una concentración de ADN de 5 a 10 ng/gl.

TILLING

El ADN del trigo M2 se combinó en grupos de dos plantas individuales. La concentración de ADN para cada individuo dentro del grupo fue de aproximadamente 2 ng/gl con una concentración final de 4 ng/gl para todo el grupo. Luego, se dispusieron 5 gl de las muestras de ADN combinadas (o 20 ng de ADN de trigo) en placas de microtitulación y se sometieron a una PCR específica de gen.

La amplificación mediante PCR se realizó en volúmenes de 15 gl que contenían 20 ng de ADN combinado, tampón ExTaq 0,75X (Clonetech, Mountain View, CA), MgCl2 adicional 1,1 mM, dNTP 0,3 mM, cebadores 0,3 gM, 0,009 U de ADN polimerasa Ex-Taq (Clonetech, Mountain View, CA), 0,02 unidades de ADN polimerasa DyNAzyme II (Thermo Scientific) y, si fue necesario, potenciador de PCR Polymer-Aide 0,33 M (Sigma-Aldrich®). La amplificación mediante PCR se realizó utilizando un termociclador MJ Research® de la siguiente manera: 95 °C durante 2 minutos; 8 ciclos de "PCR de aterrizaje" (94° C durante 20 segundos, seguido de una etapa de hibridación que comienza a 70-68 °C durante 30 segundos y disminuye 1 °C por ciclo, luego una rampa de temperatura de 0,5 °C por segundo hasta 72 °C seguido de 72 °C durante 1 minuto); 25-45 ciclos a 94 °C durante 20 segundos, 63 o 65 °C durante 30 segundos, rampa de 0,5 °C/seg hasta 72 °C, 72 °C durante 1 -2 minutos; 72 °C durante 8 minutos; 98 °C durante 8 minutos; 80 °C durante 20 segundos; 60 ciclos a 80° C durante 7 segundos -0,3 grados/ciclo.

Los productos de la PCR (2-4 gl) se digirieron en placas de 96 pocillos. Se añadieron 3 gl de una disolución que contenía HEPES [ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico] 6 mM (pH 7,0), MgCl26 mM, NaCl 6 mM, Triton® X-1000,012X, 0,03 mg/ml de albúmina sérica bovina, tampón T-Digest 0,5X [Advanced Analytical Technologies, Inc. (AATI), Ames, IA], 0,912 U cada uno de endonucleasa y potenciador Surveyor® (Transgenomic®, Inc.) y enzima de escisión de ADNds 0,5X (AATI, Ames, IA) al producto de la PCR. Las reacciones de digestión se incubaron a 45 °C durante 45 minutos. La actividad específica de la enzima Surveyor fue de 800 unidades/gl, donde el fabricante definió una unidad como la cantidad de enzima necesaria para producir 1 ng de material soluble en ácido a partir del ADN de timo de ternero desnaturalizado térmicamente y fragmentado a pH 8,5 en un minuto a 37 °C. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 20 gl de tampón de dilución E (AATI, Ames, IA) o TE 1x. Las reacciones se almacenaron en el congelador hasta que se ejecutaron en el sistema de electroforesis capilar Fragment Analyzer™ (AATI, Ames, IA). Las muestras se procesaron en el Fragment Analyzer™ utilizando el kit de descubrimiento de mutaciones DNF-920-K1000T (AATI, Ames, IA) según el protocolo del fabricante.

Después de la electroforesis, los ensayos se analizaron utilizando el programa informático PROSize® 2.0 (AATI, Ames, IA). La imagen del gel mostró un patrón específico de secuencia de las bandas de fondo comunes a los 96 carriles. Los eventos infrecuentes, como las mutaciones, crean nuevas bandas que se destacan por encima del patrón de fondo. Las plantas con bandas indicativas de mutaciones de interés se evaluaron mediante la técnica TILLING de los miembros individuales de un conjunto mezclado con ADN de tipo silvestre y luego secuenciando los productos de las PCR individuales. Las plantas que portaban mutaciones confirmadas mediante secuenciación se cultivaron como se describió anteriormente (por ejemplo, la planta M2 podría retrocruzarse o cruzarse varias veces para eliminar las mutaciones de fondo y autopolinizarse para crear una planta que fuera homocigótica para la mutación) o se cruzaron con otra planta que contuviera mutaciones de WPBF en un homeólogo diferente.

Además, se analizó el contenido de proteína de almacenamiento de las semillas de los granos de plantas de trigo homocigotas con mutaciones en WPBF-A, WPBF-B o WPBF-D de los genomas A, B o D mediante la extracción de las prolaminas de las medias semillas de endospermo. Además, las plantas seleccionadas identificadas con mutaciones graves en WPBF de los genomas A, B o D (Tablas 1, 2 y 3) se cruzaron con otras plantas que contenían mutaciones graves en WPBF en los otros genomas. Se analizó la acumulación de proteínas de almacenamiento de semillas en los granos de las plantas homocigotas resultantes de estos cruces. Las mutaciones graves incluyeron aquellas mutaciones que se predijo que tendrían un efecto perjudicial sobre la función de la proteína por su SIFT y PSSM, así como aquellas mutaciones que resultaron en la introducción de un codón de parada (mutación de truncamiento) o una mutación en una unión de corte y empalme.

EJEMPLO 3: Las mutaciones en el gen WPBF dan como resultado perfiles alterados de proteínas de almacenamiento en semillas de trigo.

La técnica TILLING (lesiones locales inducidas selectivamente en los genomas) se utilizó para identificar numerosas mutaciones en los genes de factores de transcripción homólogos en el trigo. Estas mutaciones se han identificado en todas las copias homólogas de los genomas A y B del trigo para pasta tetraploide y en los tres genomas homeólogos del trigo harinero hexaploide (genomas A, B y D).

Hasta la fecha, se cruzó una mutación en el genoma B del trigo harinero hexaploide con una mutación en la copia del genoma D. La mutación del genoma B da como resultado la alteración de un codón de triptófano hasta un codón de parada en el aminoácido 70 (WPBF_B(W70*)), lo que puede dar lugar a una copia del genoma B no funcional del gen. La mutación del genoma D transforma la cisteína del aminoácido 63 hasta tirosina (WPBF _D(C63Y)), que, dado que la cisteína es responsable de coordinar un ion zinc en el dominio activo de unión al ADN del factor de transcripción, también puede conducir a una pérdida de función de la copia del genoma D del gen.

En la generación F2 del cruce entre plantas originarias que albergan una u otra de estas mutaciones, se espera que 1/16 de la progenie sean mutantes homocigotos en copias homeólogas de este gen de los genomas B y D. Esta progenie tendrá una copia no mutada de la copia del genoma A del gen. Se deseaba investigar la alteración de las copias del genoma B y D de WPBF y cualquier efecto potencial sobre las proteínas de almacenamiento de estas semillas.

El experimento se llevó a cabo cortando 111 semillas individuales de la progenie F2 por la mitad, guardando la mitad embrionaria de la semilla para plantar, extrayendo las proteínas de almacenamiento de prolaminas más abundantes de la mitad del endospermo de la semilla y sometiendo a electroforesis estas proteínas extraídas en geles de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Como se muestra en las FIGS. 3A-3D, 7 endospermos de las medias semillas (indicadas por flechas) contienen un perfil de proteínas de almacenamiento de semillas alterado con varias bandas de proteína ausentes y otras aparentemente disminuidas en cantidad.

Estos resultados indican que la alteración de los genomas B y D de WPBF afecta a las proteínas de almacenamiento de las semillas. Sin embargo, se espera que cruzar una planta con una copia alterada del genoma A de este gen con una planta con copias alteradas del genoma B y D de este gen produzca mayores efectos en el perfil de proteínas de almacenamiento de las semillas de estas plantas.

Los resultados anteriores indican claramente que se ha identificado un factor de transcripción en la cebada que, cuando muta, produce alteraciones drásticas en el perfil de proteínas de almacenamiento de la semilla de cebada. Además, las mutaciones en el gen equivalente del trigo también provocan alteraciones en las proteínas de almacenamiento del trigo.

Los ejemplos anteriores se proporcionan para ilustrar la invención, pero no para limitar su alcance. Otras variantes de la invención serán fácilmente evidentes para un experto en la técnica y están abarcadas por las reivindicaciones adjuntas y todos sus equivalentes. Los ejemplos anteriores utilizaron la tecnología TILLING para crear e identificar mutaciones en uno o más genes WPBF del trigo, pero un experto en la técnica entendería que podrían usarse otros métodos tales como la mutagénesis dirigida (también conocida como mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis específica de sitio o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos) para crear las mutaciones útiles de la presente invención en uno o más loci de WPBF del trigo (véase, por ejemplo Zhang et al.,PNAS107(26):12028-12033, 2010; Saika et al.,Plant Physiology156:1269-1277, 2011). Un experto en la técnica también reconocería que podrían usarse métodos adicionales para inactivar o disminuir la actividad de los genes WPBF del trigo. Estos métodos incluyen, sin limitación, la mutagénesis CRISPR/Cas9, mutagénesis con dedos de zinc y TALEN, métodos basados en ARNi, microARN y ARN en horquilla para mutar o disminuir la acumulación de los transcritos de WPBF.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una planta de trigo que comprende una o más mutaciones homocigotas inducidas por el ser humano en un gen del factor de unión a la caja de prolamina de trigo (WPBF) en al menos un genoma B y un genoma D, en donde la o las mutaciones dan como resultado un cambio de aminoácidos en la proteína WPBF seleccionado de los cambios de aminoácidos enumerados en las Tablas 2-3, y además en donde la o las mutaciones contribuyen a que el grano de dicha planta de trigo tenga un gluten disminuido en comparación con el grano de una planta de tipo silvestre.

2. La planta de trigo de la reivindicación 1, en donde la mutación en el genoma B da como resultado una alteración de un triptófano hasta un codón de parada en la posición del aminoácido 70 (W70*) de la SEQ ID N° 6.

3. La planta de trigo de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la mutación en el genoma D da como resultado una alteración de una cisteína hasta una tirosina en la posición del aminoácido 63 (C63Y) de la SEQ ID N° 9.

4. La planta de trigo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la planta de trigo comprende además una mutación en un genoma A.

5. La planta de trigo de la reivindicación 4, en donde la mutación en el genoma A da como resultado una alteración de una cisteína hasta una tirosina en la posición del aminoácido 66 (C66Y) de la SEQ ID N° 3.

5. La planta de trigo de la reivindicación 1, en donde la o las mutaciones en el gen WPBF están en los genomas A, B y D.

6. La planta de trigo de la reivindicación 1, en donde la o las mutaciones dan como resultado gluteninas de bajo peso molecular disminuidas en el grano de dicha planta de trigo en comparación con el grano de una planta de trigo de tipo silvestre.

7. La planta de trigo de la reivindicación 1, en donde la o las mutaciones dan como resultado gliadinas disminuidas en el grano de dicha planta de trigo en comparación con el grano de una planta de trigo de tipo silvestre.

8. La planta de trigo de la reivindicación 1, en donde la o las mutaciones dan como resultado gluteninas de alto peso molecular aumentadas o inalteradas en el grano de dicha planta de trigo en comparación con el grano de una planta de trigo de tipo silvestre.

9. Un grano de trigo de la planta de trigo de la reivindicación 1.

10. Una harina que comprende el grano de trigo de la reivindicación 9.

11. Un producto alimenticio que comprende el grano de trigo de la reivindicación 9 o la harina de la reivindicación 10.

12. Una semilla de trigo, parte de una planta o su progenie de la planta de trigo de la reivindicación 1, en donde dicha progenie tiene una o más mutaciones en el gen WPBF.