CN104642388B

CN104642388B - 多粘类芽孢杆菌dgnkzx004在口红花栽培方面的应用

Info

Publication number: CN104642388B
Application number: CN201510029423.0A
Authority: CN
Inventors: 徐匆; 郑芝波
Original assignee: DONGGUAN RESEARCH CENTER OF AGRICULTURAL SCIENCE
Current assignee: DONGGUAN RESEARCH CENTER OF AGRICULTURAL SCIENCE
Priority date: 2015-01-21
Filing date: 2015-01-21
Publication date: 2017-08-25
Anticipated expiration: 2035-01-21
Also published as: CN104642388A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）菌株dgnkzx004在口红花栽培方面的应用。所述菌株已于2014年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号是CCTCC M 2014504。该菌株不仅对口红花叶斑病病原多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）具有显著、稳定的抑菌效果，还能够促进口红花的生长，因此，在口红花叶斑病防治及促生长方面具有非常重要的应用价值。

Description

多粘类芽孢杆菌dgnkzx004在口红花栽培方面的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及多粘类芽孢杆菌dgnkzx004在口红花栽培方面的应用。

背景技术

花卉在生长过程中，可能遭遇到各种自然灾害，造成植物生长发育不良，甚至植物色泽暗淡，叶枯、花腐、器官畸形、茎干枯，从而降低了花卉产量和质量，造成严重的经济损失。引起花卉病害的主要原因有环境原因和病虫害原因。环境原因主要引起生理病害，是由于气候和土壤等条件不适宜引起的，常发生的生理病害有夏季强光照射引起的灼伤，冬季低温造成的冻害，水分过多导致烂根，水分不足引起叶片焦边、萎蔫，土壤中缺乏某些营养元素，出现缺素症等等。病虫害则是由病菌及病虫引起的。这些生物大多具有寄生力和致病力，并具有较强的繁殖力，能从感病植株通过各种途径蔓延到健康植株上去，在适宜的环境条件下生长、发育、繁殖、传播，周而复始，逐步扩大蔓延，因此，这类病害对花卉造成的危害最大。其中，真菌是没有叶绿素具有真核的低等生物，它以菌丝体为营养体，以孢子进行繁殖，是花卉病害中最主要的一类。

花卉病虫害防治，必须遵循“预防为主，综合防治”的基本原则。预防为主，就是根据病虫害发生规律，针对薄弱环节和防治的关键时期，采取有效，可行的方法，在病虫害大量发生或造成危害之前，予以控制，使其不能发生或蔓延，保护花卉免受损失或少受损失。综合防治，就是从生产和生态的全局观出发，充分利用自然界抑制病虫害的各种因素，创造不利于病虫害发生的条件，采取各种必要的防治措施，以栽培技术防治为基础，根据病虫害发生发展的规律，因地制宜，合理应用生物、物理、化学等防治措施，有效地控制病虫害发生，将其造成的损失减少到最低水平。温室花卉病虫害生物防治，多是利用捕食性天敌、寄生性天敌、微生物农药、各种抗生素以及害虫性外激素等进行防治；物理防治则多使用覆盖薄膜、纱网阻隔、色板（膜、纸）诱杀等方法；化学防治使用化学药剂来抑制或杀死病虫或病菌。其中以生物防治的安全性和持久性最好，是一种绿色、安全、环保、有效的防治手段。

生物防治是指利用自然界各种无害的生物或其代谢产物进行病虫害防治。生物防治通过生物间的相互作用来控制病虫害,其效果可能不能像化学农药那么快速、有效，但它们的防效是持久的、稳定的，且是环境友好的。目前生物防治的基本途径主要有：天敌昆虫的保护利用、昆虫性信息素与不育性的利用、生物农药的应用、拮抗微生物和害虫致病微生物的利用、转基因技术抗虫抗病等。其中，利用微生物对病害进行防治是一种很好的方式。微生物种类丰富、代谢途径多样，并能产生对自然界病害菌有拮抗作用的活性物质。

多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）是土壤中常见的细菌，也是一类重要的病害生物防治微生物，有一些还具有刺激植物生长的特点。大量研究表明，有些多粘类芽孢杆菌除了可以直接抑制植物病原菌，还能通过产生抗菌物质如抗菌蛋白质或酶、诱导寄主的抗病能力等。对于多粘类芽孢杆菌诱导寄主的抗病能力机制的研究越来越受到重视，2004年童蕴慧等公开了利用多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）W3菌株处理番茄叶片，对灰霉病有明显的诱导抗病作用。而目前尚未见有多粘类芽孢杆菌抑制花卉病菌及应用于花卉栽培的报道和研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有口红花栽培技术的缺陷和不足，提供多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）菌株dgnkzx004在口红花栽培方面的应用。该菌株不仅对多主棒孢菌具有显著的抑制作用，还能够促进口红花的生长，可以很好地应用于口红花的栽培。

本发明的另一目的是提供一种用于口红花生物防治和/或促生长的复合菌剂。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）菌株dgnkzx004在抑制多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）方面的应用。

本发明还提供了多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）菌株dgnkzx004在口红花栽培方面的应用，所述应用是应用于防治口红花叶斑病和/或促进口红花生长方面，尤其是应用于毛萼口红花的生物防治及促生长方面。

上述多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）菌株dgnkzx004于2014年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号是CCTCC M 2014504，也已在申请号为201410630169.5的专利中公开。

本发明提供了一种用于口红花生物防治和/或促生长的复合菌剂，是以多粘类芽孢杆菌菌株dgnkzx004的菌体为有效活性成分，配合甲壳素制备得到。溶剂可以为水或者多粘类芽孢杆菌菌株dgnkzx004的液体培养基等。从更适宜保存的角度考虑，使用dgnkzx004的液体培养基更有利于菌株的生存和繁殖。

所述复合菌剂中多粘类芽孢杆菌dgnkzx004的终浓度为10⁸～10⁹CFU/mL，甲壳素的体积百分浓度为0.5～2%。

优选地，所述复合菌剂中多粘类芽孢杆菌dgnkzx004的终浓度为7～8×10⁸CFU/mL，甲壳素的体积百分浓度为1%。

本发明通过长期大量的实验研究发现，多粘类芽孢杆菌dgnkzx00及其复合菌剂不仅对引起口红花叶斑病的多主棒孢菌具有明显、稳定的抑菌效果，还能够促进口红花的生长。因此，在口红花的生物防治及促生长方面具有重要的应用价值，能获得很好的效果，其中对毛萼口红花的效果最为突出。

本发明上述的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）菌株dgnkzx004是本发明人从东莞农业科学研究中心果园土壤中采集分离所得，已于2014年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号是CCTCC M 2014504。

具体地，本发明人在荔枝果园，选用对角线法和棋盘法采样。确定取土地点后，除去上面的枯枝落叶层以及地表5cm左右的浮土；之后用铲斜向下（离地表5～15cm深度的土壤）切取一片片的土壤样品。每个取样点取5～15个样，将取好的土样在灭菌牛皮纸上混合，四分法获取所需土壤的量。编号，记录采集信息：每一采样地的采集地点、采集日期、采集深度等。

将各采样点混合土样各称取10g，放入盛有100mL无菌水（制备1：10土壤悬液）并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合并分散，此为原稀释液；再用1mL无菌吸管吸取1mL稀释后的土壤溶液注入盛有9mL无菌水的试管中，用吸耳球多次吹吸充分混匀，此为10^-1稀释悬液；依次类推将土样梯度稀释成10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6的土壤稀释悬液，重复3次。多次吹吸混匀所制备好的稀释液，取10^-2、10^-4、10^-6三个梯度的稀释液，用无菌移液管吸取（吸取前再次吹吸，确保稀释液均匀）0.2mL加到已凝固的LB平板上，然后用涂布棒迅速将菌液均匀涂开。待菌落长出，挑取菌落形态差异明显的单菌落进入平板划线分离，划线分离3次进行纯化并进行革兰氏染色镜检。

上述LB平板就是由改良LB液体培养基加入琼脂制备而成；所述改良LB液体培养基的成分：蛋白胨15g，葡萄糖20g，酵母提取物5g，NaCl 10g，水1000mL，pH6.8，121℃灭菌20min。

所述菌株dgnkzx004的培养方法，使用上述改良LB液体培养基作为培养基，具体步骤如下：

S1.菌株的活化：将多粘类芽孢杆菌dgnkzx004的甘油菌种按体积比2%的接种量接种到改良LB液体培养基中，32℃静置活化培养20小时，得种子液；

S2.扩大培养：将种子液按体积比5%的接种量接种到改良LB液体培养基中，并于32℃静置培养20小时，得发酵液；

S3.菌体悬液制备：发酵液经离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2次，离心获得所需的活菌体，最后用生理盐水将菌体悬起制成细胞悬浮液。

其中，S3所述离心是9500r/min、4℃离心15min。

本发明所述多粘类芽孢杆菌株dgnkzx004的菌落形态为圆形，奶油白色，表面干燥不透明，凸起生长，湿润，边缘整齐，直径1.3～1.7mm；显微镜观察菌体形态为革兰式阳性菌，杆状。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）dgnkzx004菌株的新应用，该菌株不仅对引起口红花叶斑病的多主棒孢菌具有明显、稳定的抑菌效果，对口红花叶斑病具有良好的防治作用，而且还能够促进口红花的生长，对口红花的栽培，主要是生物防治及促生长方面具有显著的应用效果，能获得很好的效果，尤其是对毛萼口红花效果最为突出，为口红花等花卉的生物防治及促生长领域提供了一个新的微生物成员。

本发明基于多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）dgnkzx004菌株，为花卉的生物防治领域提供一种新的复合菌剂，以多粘类芽孢杆菌菌株dgnkzx004的菌体为有效活性成分，配合甲壳素，实现了协同增效的目的，所述复合菌剂尤其是对口红花的生物防治及促生长具有良好的作用。

上述复合菌剂是将甲壳素与多粘类芽孢杆菌dgnkzx004的菌体悬液相配伍，获得了显著的口红花生物防治及促生长效果，经过不断分析研究和大量实验总结，在本发明提供的合适的配伍构成的体系下，菌株可以很好地成活并发挥活性作用，重要的是本发明菌体悬液体系共同产生了显著的应用技术效果。

本发明在获得的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）dgnkzx004菌株的基础上，进一步总结得到各组分的合理配伍比例，在适宜的用量范围内，本发明的复合菌剂具有很好的生物防治及促生长效果，应用于口红花，尤其是毛萼口红花，接种多主棒孢菌后，病情指数仅为23（对照组病情指数为89）；除此之外，本发明复合菌剂安全无毒、对土壤不会产生任何副作用。

本发明应用所述菌株制备复合菌剂，并成功实现应用，克服了通常微生物菌的活性应用局限于实验室的缺陷，具有很好的实际应用前景。所述复合菌剂制备方法简单，应用方便，为微生物菌在花卉生物防治及促生长方面的应用提供有力的技术启示和指导，具有重要的应用价值和实际推广应用可行性。

附图说明

图1为多粘类芽孢杆菌dgnkzx004菌株菌落形态（LB培养基，32℃，2天）。

图2为多粘类芽孢杆菌dgnkzx004革兰氏染色镜检结果。

图3 为实施例 2的叶斑病病情指数。

图4 为实施例 2的叶斑病防效。

图5 为实施例 3的枝条数量变化情况。

图6为实施例 3的枝条节间生长变化情况。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例来进一步详细阐述本发明。本发明以下实施例为本发明较佳的实施方式，但并不对本发明做任何形式的限定。本发明主要阐述所述菌株以及基于所述菌株的应用思想，实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，但并不因此限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，都应包含在本发明范围内。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

以下实施例所用甲壳素为市购；所用棒孢菌为多主棒孢菌（Corynesporacassiicola），保存于东莞市农业科学研究中心。

实施例1 菌株分离及鉴定

1、本发明人于2011年 8月 2日采集东莞农业科学研究中心果园土壤，将各采样点混合土样各称取10g，放入盛有100mL无菌水（制备1：10土壤悬液）并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合并分散，此为原稀释液；再用1mL无菌吸管吸取1mL稀释后的土壤溶液注入盛有9mL无菌水的试管中，用吸耳球多次吹吸充分混匀，此为10^-1稀释悬液；依次类推将土样梯度稀释成10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6的土壤稀释悬液，重复3次。多次吹吸混匀所制备好的稀释液，取10^-2、10^-4、10^-6三个梯度的稀释液，用无菌移液管吸取（吸取前再次吹吸，确保稀释液均匀）0.2mL加到已凝固的LB平板上，然后用涂布棒迅速将菌液均匀涂开。待菌落长出，挑取菌落形态差异明显的单菌落进入平板划线分离，划线分离3次进行纯化并进行革兰氏染色镜检。

上述LB平板是由改良LB液体培养基加入琼脂制备而成；所述改良LB液体培养基的成分：蛋白胨15g，葡萄糖20g，酵母提取物5g，NaCl 10g，水1000mL，pH6.8，121℃灭菌20min。

2、在LB培养基纯化平板上菌落形态为：圆形，奶油白色，表面干燥不透明，凸起生长，湿润，边缘整齐，直径1.3～1.7mm。见附图1所示。

将所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏日期是2014年10月21日，保藏号是CCTCC M 2014504，所述菌株命名为dgnkzx004。

3、革兰氏染色实验

S1.涂片：取一片干净无油载玻片，在中央滴一滴无菌水，然后用接种环以无菌操作方法取少许培养好的菌株，放在载玻片的水滴中涂匀，注意菌量不宜过多，否则，不易看清单个菌体。

S2.固定：将涂好的玻片在酒精灯火焰上快速通过3～4次，使水份蒸发，此时细菌菌体紧贴在玻片上。

S3.初染：加草酸铵结晶紫染色剂1滴，染色1分钟。

S4.媒染：倾去染液并用洗瓶装水轻轻冲洗，加碘液染色1分钟，水洗，然后用吸水纸吸干。

S5.脱色：将载玻片略倾斜，滴加95%酒精脱色20～30秒（洗至流下的酒精中无紫色时为止），然后水洗。

S6.复染：在玻片上滴加番红染液约2分钟，水洗，然后用吸水纸吸干。染色中应防止染液干涸。

S7.镜检：干燥后用油镜进行镜检，镜检显示为一株革兰氏阳性杆菌，杆状。菌体形态结果见附图2。

实施例2生物防治试验

1、菌株的培养：

S1.菌株的活化：将多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）dgnkzx004的甘油菌种按2%(v/v)接种量接到20mL LB液体培养基中，并于32℃培养箱中静置活化培养20小时，得种子液；

S2.扩大培养：将活化好的种子液按5%(v/v)接种量接种到1000mL LB液体培养基中，并于32℃培养箱中静置培养20小时；

其中，S3所述离心是9500r/min、4℃离心15min。

2、复合菌剂的配制：

复合菌剂含有如下体积百分比的组分：甲壳素1%，水余量；在上述组分组成的100%体系中加入多粘类芽孢杆菌dgnkzx004的菌体，使其在体系中的菌体浓度为7.5×10⁸CFU/mL（即首先用水将甲壳素配制成体积百分浓度为1%的水溶液，再在该甲壳素水溶液中加入多粘类芽孢杆菌dgnkzx004的菌体，使其中浓度为7.5×10⁸CFU/mL）。

3、以毛萼口红花为对象进行生物防治试验

（1）试验材料：试验采用扦插苗，直径7cm杯插4枝，当新芽长出4～5cm左右，根系长到盆底，即移栽到直径为170cm的盆里栽培，4小盆苗种1大盆；定植10d后，统一打顶，当分枝长至5～6cm时，同一时间第2次打顶。

（2）实验分组

将扦插苗分为3组，复合菌剂组、dgnkzx004组及对照组（对照组为花多多通用肥20-20-20）。

复合菌剂组：扦插前将扦插苗底部放入复合菌剂中浸泡0.5h，栽入无菌土后，灌入20mL复合菌剂，再灌入5mL的棒孢菌菌悬液。

dgnkzx004组：扦插前将扦插苗底部放入dgnkzx004发酵液中浸泡0.5h，栽入无菌土后，灌入20mL dgnkzx004发酵液，再灌入5mL的棒孢菌菌悬液。

对照组：扦插前将扦插苗底部放入水中浸泡0.5h，栽入无菌土后，灌入20mL20-20-20（2000倍），再灌入5mL的棒孢菌菌悬液。

（3）病情指数及防效结果如附图3、4所示，载入盆中30天后，复合菌剂组病情指数为23，dgnkzx004组为35，而对照组为89。

防效结果如附图4所示，在30天的栽培期后，复合菌剂的防效达到了74%，dgnkzx004为60.7%。

实施例3促进生长试验

1、以毛萼口红花为对象进行促生长试验

（1）试验材料：试验采用扦插苗，直径7cm杯插4枝，当新芽长出4～5cm左右，根系长到盆底，即移栽到直径为170cm的盆里栽培，4小盆苗种1大盆，每4～5天施一次20-20-20（800-1000倍）1次，每天中午叶面喷雾1次；定植10d后，统一打顶，当分枝长至5～6cm时，同一时间第2次打顶。

（2）实验分组

复合菌剂组：扦插前将扦插苗底部放入复合菌剂中浸泡0.5h，栽入无菌土，平时每天叶面喷雾1～2次，保持基质湿润，每周施用复合菌剂1次。

dgnkzx004组：扦插前将扦插苗底部放入dgnkzx004发酵液中浸泡0.5h，栽入无菌土，平时每天叶面喷雾1～2次，保持基质湿润，每周施用dgnkzx004发酵液1次。

对照组：扦插前将扦插苗底部放入水中浸泡0.5h，栽入无菌土后，平时每天叶面喷雾1～2次，保持基质湿润，每10天喷雾施一次20-20-20（2000倍）1次。

2、结果

（1）口红花枝条数量变化情况如附图5所示。

栽培50d后复合菌剂组枝条数量为48cm，dgnkzx004为44.25cm，而对照组为41.25cm；60d后，复合菌剂组枝条数量达到了51.25cm，dgnkzx004为46.38cm，而对照组仅为43cm。

（2）口红花枝条节间生长变化情况如附图6所示。

栽培50d后复合菌剂组枝条节间为3.18cm，dgnkzx004为3.47cm，而对照组为3.63cm；60d后，复合菌剂组枝条节间为3.3cm，dgnkzx004为3.51cm，而对照组为3.7cm。

口红花植株其他生长指标变化情况如表1。

表1 口红花植株其他生长指标

Claims

1.多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）dgnkzx004在抑制多主棒孢菌方面的应用，其特征在于，所述多粘类芽孢杆菌dgnkzx004于2014年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号是CCTCC M 2014504。

2.多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）dgnkzx004在防治口红花叶斑病方面的应用，其特征在于，所述多粘类芽孢杆菌dgnkzx004于2014年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号是CCTCC M 2014504。

3.一种用于防治口红花叶斑病的复合菌剂，其特征在于，所述菌剂包括多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）dgnkzx004和甲壳素；甲壳素的体积百分浓度为0.5～2%，多粘类芽孢杆菌dgnkzx004的终浓度为10⁸～10⁹CFU/mL。

4.根据权利要求3所述复合菌剂，其特征在于，甲壳素的体积百分浓度为1%，多粘类芽孢杆菌dgnkzx004的终浓度为7～8×10⁸CFU/mL。

5.权利要求3或4所述复合菌剂在口红花栽培方面的应用，其特征在于，是应用于防治口红花叶斑病。

6.根据权利要求2或5所述的应用，其特征在于，所述口红花的品种为毛萼口红花、斑纹口红花或细萼口红花。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述口红花的品种为毛萼口红花。