CN104634909A - 基于亲和色谱测定超分子相互作用解离速率常数的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于亲和色谱测定解离速率常数的方法，特别是针对相互作用较弱、较广泛的超分子相互作用。所述方法是将主分子先进行固定再测定的基于定量亲和色谱的方法。所述方法包括：在一定温度条件下，在多个流速下分别采集第一待分析客分子与第二待分析客分子在键合有目标主分子的亲和色谱柱上的色谱流出曲线，通过峰拟合计算保留时间、半峰宽及塔板高度，计算解离速率常数。本发明无需特殊仪器设备，利用常规色谱分析方法，可测得超分子弱相互作用的动力学速率常数，同时可与紫外、荧光及质谱等多种检测器联用，在低浓度、水溶性差的药物检测方面，以及超分子相互作用动力学参数的低成本、快速测定方面具有独特优势。

Description

基于亲和色谱测定超分子相互作用解离速率常数的方法

技术领域

本发明涉及一种基于亲和色谱的解离速率常数的测定方法，特别是针对相互作用较弱、较广泛的超分子相互作用。

背景技术

超分子一般是两个或两个以上分子的集合体，药物与辅料形成的超分子通常是主分子（超分子载体）与客分子（药物）通过氢键、范德华力等非共价相互作用形成的分子复合物。药物与超分子载体，如环糊精、冠醚和树枝状聚合物等，形成超分子复合物后能改善药物的水溶性、生物利用度和靶向性，在抗肿瘤、抗炎等领域发挥着重要作用。

主客分子之间的相互作用，即主客体识别，是超分子发挥其特殊功能的基础，不仅是超分子化学的研究内容之一，也是分子间相互作用的集中体现。主客体识别过程并非通过传统的共价键相结合，而是依靠分子间非共价键相互作用如：范德华力、静电力、疏水相互作用和氢键等实现结合。研究主客分子相互作用，有助于了解和揭示超分子结构与功能的内在关系，对阐明主客分子间的作用过程以及从分子水平上阐述超分子增溶、改善生物利用度的作用机理等方面具有非常重要的理论价值；同时对于以超分子体系给药的化合物筛选具有重要的实用价值。此外，也能为指导设计高效、低毒的主分子提供有价值的信息。但现有超分子相互作用研究大多停留在主分子衍生物合成、超分子表征、制剂制备和体外细胞活性等，有关超分子主客体相互作用的动力学研究较少。

主分子H（Host）与客分子G（Guest）所形成的非共价复合物H-G的生成与解离，分别可用双分子速率常数k_on及单分子速率常数k_off来表征。前者也称为结合速率常数k_a，后者也称为解离速率常数k_d。

$K_a=\frac{k_a}{k_d}---\left(2\right)$

k_a、k_d又与结合平衡常数K_a具有公式（2）所示关系，已知任意两个，都可以求得第三个。定量测定k_a、k_d及K_a是研究分子间相互作用的首要内容，对于明晰相互作用的动力学过程、复合物的体外体内性质，以及客分子配体的设计和筛选具有重要意义。

研究主客分子间相互作用的方法主要包括离心法、平衡透析法、超滤法、光谱法、质谱法、核磁共振法、电化学分析法、量热法、生物活性回收和固定化配体法等。其中，固定化配体法中的亲和色谱和表面等离子共振技术，由于设备精度高，易于自动化操作和微量化，近来受到普遍关注。其主要原理是将一对能可逆结合和解离的主客分子的一方固定，当含有另一方的溶液流经时，固定的配基就会选择地与其结合，通过原位、动态检测溶液中分子的量随时间的变化规律，即可给出二者相互作用的热力学和动力学参数。

亲和色谱法与表面等离子共振法的区别在于相互作用的检测方式不同。表面等离子共振法是直接检测生物传感器表面的小分子，进而根据信号强弱变化计算相互作用参数，这种信号强弱与待测物的大小、浓度和相互作用亲和力有关。对于小分子或低浓度物质，如水溶性差的药物，检测难度较大，准确性也相对较差。加入有机溶剂或增溶剂可以改善难溶性药物在水中的溶解度，但这些添加剂的加入可能对测定结果有影响。因此，表面等离子共振法研究具有中等～较强亲和力的相互作用（K_a>10⁵M^-1）时，准确度和重现性较好。但不适合低浓度或难溶性小分子以及较弱或中等强度相互作用的研究。

与表面等离子共振法相比，亲和色谱法在检测方式上具有独特的优势，应用于相互作用研究时，并不受检测方式的限制。与常规色谱分析类似，亲和色谱可以与多种检测器相连，针对不同性质的待测物，可以选择紫外、荧光及质谱等多种检测器。对于低浓度、水溶性差的待测物，以及较弱或中等强度的相互作用，亲和色谱是准确测定其热力学、动力学参数的有力工具。

近来，亲和色谱在分子间相互作用研究及其高通量筛选方面得到了广泛应用，如用于配体-受体、配体-膜蛋白、药物-血浆蛋白相互作用的研究，以及与质谱联用，进行高亲和性候选配体分子的高通量筛选，但未见其用于相互作用较弱、较广泛的超分子体系。美国专利US20080293587公开了一种基于亲和色谱的配体与受体之间具有瞬间较弱相互作用的生物靶标筛选方法，主要侧重于配体-受体亲和力的高通量筛选，即基于分子间相互作用的结合平衡常数K_a进行筛选，但未涉及速率常数。

而本发明旨在提供：一种针对相互作用较弱、较广泛体系的，基于亲和色谱的解离速率常数的定量测定方法。因此，本发明与美国专利US20080293587公开的基于亲和色谱的弱相互作用的生物靶标筛选不同。

发明内容

现有解离速率常数测定技术不适用于超分子相互作用体系。

因此，本发明的一个方面提供了一种基于亲和色谱的测定超分子相互作用解离速率常数的方法，该方法是基于定量亲和色谱的方法，包括以下步骤（如图1所示）：

（1）提供一种键合有目标主分子的亲和色谱柱；

（2）用流动相制备一定浓度的第一待分析客分子的样品溶液；

（3）以带流出方式（Zonal elution）将所述第一待分析客分子的样品溶液以一定流速注入色谱系统，采集第一待分析客分子在亲和色谱柱上的流出曲线，并通过峰拟合计算第一待分析客分子流出曲线的保留时间、半峰宽及塔板高度（H_R），所述计算方法可以采用本领域技术人员公知的方法；

（4）用与第一待分析客分子相同的流动相制备第二待分析客分子的样品溶液；

（5）采用与第一待分析客分子相同的方式获得第二待分析客分子流出曲线的保留时间、半峰宽及塔板高度（H_M,C）；

（6）按照（1）～（5）中所述的方法重复测定其他至少三个不同流速下的H_R和H_M,C；

（7）比较各个H_R与H_M,C的大小，若三分之二数目以上的H_R>H_M,C，则以H_M,C作为H_M采用公式（3）通过H_R-H_M对uk/(1+k)²做线性回归，由斜率计算k_d,app：

$H_R-H_M=\frac{2\mathrm{uk}}{k_{d,\mathrm{app}}{(1+k)}^2}---\left(3\right)$

其中，u为线速度，k为容量因子，其可以从流出曲线得到。

若三分之二数目以上的H_R<H_M,C，则需要进行校正。按照一定的校正方法对H_M,C进行校正，得到H_M,T，采用校正后的H_M,T作为H_M按照公式（3）计算k_d,app。

（8）按照（1）～（7）中所述的方法测定第一待分析客分子在空白色谱柱上的容量因子k_control和解离速率常数k_d,control；

（9）通过第一待分析客分子在亲和色谱柱与空白色谱柱上的容量因子比值判断第一待分析客分子与空白基质相互作用的强弱，并采用公式（4）计算k_d。（α_control为k_control与k的比值，α₁=1-α_control）

$\frac{1}{k_{d,\mathrm{app}}}=\frac{{\mathrm{\&alpha;}}_1}{k_d}+\frac{{\mathrm{\&alpha;}}_{\mathrm{control}}}{k_{d,\mathrm{control}}}---\left(4\right)$

所述主分子是超分子体系的主体分子，包括但不仅限于环糊精、冠醚、杯芳烃、葫芦脲、树枝状聚合物、胶束、脂质体、蛋白质、多肽等。

所述亲和色谱柱是市售或自制的色谱柱，包括但不仅限于填充柱、整体柱中的一种或多种，长度在1mm～25cm。所述亲和色谱柱的固定相是将目标主分子键合到色谱基质上，所述色谱基质包括但不仅限于聚丙烯酰胺及其衍生物、甲基丙烯酸酯共聚物、脲醛树脂、高交联度苯乙烯-二乙烯基苯共聚物等多糖聚合物，以及纤维素、硅胶载体等中的一种或多种。

所述流动相包括但不仅限于甲醇、乙腈、水、醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-盐酸缓冲液等中的一种或多种，且pH值在2～8。

所述第一待分析客分子是指能与主分子发生非共价相互作用的有机小分子，包括但不仅限于生物特效配位体、染料、电荷转移配位体、包合配合物配位体等中的一种或多种。

所述一定浓度是指能够保证色谱行为重现性的（信噪比大于10）、符合线性洗脱的浓度，即样品在固定相上的平衡浓度和其在流动相中的浓度成正比，洗脱曲线的形状、保留时间以及谱带运行速度与样品的组成以及数量没有任何关系。每一种组分都是独立的，样品混合物中其他组分的存在对它不产生任何影响，各组分间对固定相不存在竞争作用。混合物中各组分的洗脱曲线和样品组分单独存在时相同。

所述一定流速是能够使相互作用成为影响第一待分析客分子色谱峰展宽的主要因素的流速，一般为色谱柱的常规分析最佳流速的50%～150%，如长度为15cm，内径为4.6mm、填料粒径为5μm的色谱柱，常规分析最佳流速为1.0mL/min，则所述一定流速范围是0.6～1.4mL/min。

所述第二待分析客分子是不与主分子发生非共价相互作用的分子，包括但不仅限于水、甲醇、乙醇、硝酸钠、溴化钾、柠檬酸、尿嘧啶等常规色谱死时间物质中的一种或多种。

所述另外几个流速是除（3）以外的色谱柱常规分析最佳流速50%～150%的其他流速。

所述需要进行校正是指：由于超分子中主分子与某些第一待分析客分子相互作用较弱，且主分子能与众多客分子相互作用，导致与色谱柱固定相不发生相互作用的常规死时间物质，如硝酸钠等，也会与主分子发生相互作用。理想的第二待分析客分子应该是不与主分子发生非共价相互作用且与第一待分析客分子具有相似扩散性质的第二待分析客分子，但实际无法找到理想的第二待分析客分子，因而导致H_R<H_M,C。

所述一定的校正方法的原理及过程是指：

理想第二待分析客分子的范第姆特方程为

$H_{M,T}=A_T+\frac{B_T}{u}+C_{\mathrm{sm},T}\&CenterDot;u$

常规第二待分析客分子的范第姆特方程为：

$H_{M,C}=A_C+\frac{B_C}{u}+(C_{\mathrm{sm},C}+C_{s,C})\&CenterDot;u$

根据第二待分析客分子在亲和色谱柱上的流出曲线，通过拟合常规第二待分析客分子的范第姆特方程，可以得到A_C和B_C，其中，H_M,C为计算得到的塔板高度，u为线速度；

对于同一根亲和色谱柱，A_T与A_C相同；

根据公式计算得到B_T，其中，V_T和V_C分别表示理想第二待分析客分子和常规第二待分析客分子在常压沸点条件下的摩尔体积；本领域的技术人员可以通过查表或通过客分子的分子式计算得到该体积；

根据公式计算得到C_sm,T，其中，d_p在色谱柱的说明书中有记载，k为容量因子，D_T为理想第二待分析客分子在流动相中的分子扩散系数，可根据公式9计算；

根据以上方法，即可通过对H_M,C进行校正计算得到H_M,T；

该方法的具体原理如下：

根据范第姆特方程，导致色谱峰展宽的因素包括涡流扩散（A项）、纵向扩散（B项）和传质阻抗（C项）。

$H=A+\frac{B}{u}+C\&CenterDot;u---\left(5\right)$

式中H为塔板高度；u为线速度；A为涡流扩散系数，与色谱柱的填充均匀程度和填料粒径大小有关；B为纵向扩散系数，主要由客分子的扩散系数决定；C为传质阻抗系数，表示由客分子与固定相间相互作用而导致的色谱峰展宽。

定量亲和色谱统计理论中，理想第二待分析客分子Van Deemter方程的B项应与第一待分析客分子的相近，同时与键合的主分子间不存在相互作用。因此，理想第二待分析客分子的Van Deemter方程为：

$H_{M,T}=A_T+\frac{B_T}{u}+C_{\mathrm{sm},T}\&CenterDot;u---\left(6\right)$

式中H_M,T为理想第二待分析客分子的塔板高度；A_T与B_T分别为理想第二待分析客分子的A项与B项；C_sm,T为理想第二待分析客分子的静态流动相传质阻抗系数。

常规第二待分析客分子的Van Deemter方程为：

$H_{M,C}=A_C+\frac{B_C}{u}+(C_{\mathrm{sm},C}+C_{s,C})\&CenterDot;u---\left(7\right)$

式中H_M,C为常规第二待分析客分子的塔板高度；A_C、B_C分别为常规第二待分析客分子的A项、B项；C_sm,C和C_s,C分别为静态流动相传质阻抗系数和固定相传质阻抗系数。

由于常规第二待分析客分子在亲和色谱柱上有较强保留，故实验测得的H_M,C大于H_M,T，H_M,T的测定只能通过间接方式，即通过测得的H_M,C校正得到。对于同一根亲和色谱柱，A_T与A_C相同，因此H_M,C的校正即为B_T与C_sm,T的校正计算。

B_T的计算：

根据第二待分析客分子的分子扩散系数（D）计算B_T。B_T与B_C的主要差别在于理想第二待分析客分子与常规第二待分析客分子在流动相，如水中的分子扩散系数不同。

B_T与B_C的关系为：

$B_T=\frac{D_T}{D_C}\&CenterDot;B_C---\left(8\right)$

式中D_T和D_C分别表示理想第二待分析客分子和常规第二待分析客分子在流动相，如水中的分子扩散系数，将D_C和D_T的比值定义为校正因子λ。

根据Wilke-Chang方程，待分析客分子在流动相中的扩散系数为：

式中D为待分析客分子的扩散系数，为溶剂的缔合因子，其为本领域技术人员已知的或者能够从现有技术中查到的，例如，对于水其推荐值为2.6，T为绝对温度，M为溶剂的分子量，μ为溶剂粘度（查表得到），V为待分析客分子在沸点下的摩尔体积（常压，查表或通过客分子的分子式计算）。色谱条件相同（即溶剂相同）时，不同客分子D的比值与分子体积的三分之二次幂（V^2/3）成反比，则：

$B_T={\left(\frac{V_C}{V_T}\right)}^{\frac{2}{3}}\&CenterDot;B_C---\left(10\right)$

V_T和V_C分别表示理想第二待分析客分子和常规第二待分析客分子在沸点条件下的摩尔体积。

C_sm,T的计算：

C_sm,T的计算公式如下：

$C_{\mathrm{sm},T}=\frac{2V_p{(1+\frac{V_m}{V_p}k)}^2}{{k_{-1}{V}_m(1+k)}^2}---\left(11\right)$

式中V_p为色谱柱填料颗粒内孔隙的总体积，V_m是色谱柱的死体积，k_-1是描述第一待分析客分子从静态流动相移动至动态流动相的传质速率常数。采用多孔硅胶作为填充材料的色谱柱，V_m/V_p≈2，k_-1=(60γD)/d_p ²，γ为弯曲因子（约为0.6），D为扩散系数，d_p为载体材料的粒径。因此上式可以改写为：

$C_{\mathrm{sm},T}=\frac{{{d_p}^2(1+2k)}^2}{36D_T{(1+k)}^2}---\left(12\right)$

其中，d_p在色谱柱的说明书中有记载。

综上，通过拟合常规第二待分析客分子的Van Deemter方程，可以得到A_C和B_C，A_C与A_T相同，由B_C可计算B_T，根据公式12可计算出C_sm,T。最终可通过对H_M,C进行校正计算得到H_M,T，可归结为：

$H_{M,T}=A_C+\frac{B_C}{\mathrm{\&lambda;}\&CenterDot;u}+C_{\mathrm{sm},T}\&CenterDot;u---\left(13\right)$

所述空白色谱柱是指没有固定主分子，其他组成、制备方法及规格与亲和色谱柱完全相同的色谱柱。

其中，优选地，当第一待分析客分子在空白色谱柱与亲和色谱柱上的容量因子的比值≤0.1时，第一客分子与空白基质的相互作用较弱，第一客分子与空白基质的相互作用可忽略，以k_d,app近似k_d，即采用公式（3）计算k_d,app的值作为k_d；

反之，则认为第一客分子与空白基质的相互作用较强，此时第一客分子与空白基质的相互作用不可忽略，即k_d,app不等于k_d，需要在k_d,app基础上通过公式（4）扣除k_d,control，计算k_d。

所述带流出方式是色谱洗脱方式的一种，是将微量的客分子样品溶液注入到色谱系统，然后用所述流动相在所述流速条件下进行洗脱。

所述色谱系统是常规的高效液相色谱系统，由泵、进样器、柱温箱、检测器和色谱工作站组成，所述检测器包括但不仅限于光学检测器（如紫外、二极管阵列、荧光、示差折光、蒸发光散射）、热学检测器（如吸附热）、电化学检测器（如极谱、库仑、安培）、电学检测器（电导、介电常数、压电石英频率）、放射性检测器（闪烁计数、电子捕获、氦离子化）以及氢火焰离子化检测器、质谱检测器等中的一种或多种。

所述流出曲线是第一待分析客分子的信号-时间曲线，即色谱图。

所述峰拟合是经过指数修正的高斯分布（EMG）函数拟合过的色谱流出曲线，拟合相关系数>0.99，可以准确计算第一待分析客分子的保留时间和半峰宽。

本发明还提供了一种基于亲和色谱测定超分子相互作用解离速率常数的系统，该系统包括以下部件：

（1）一种键合有目标主分子的亲和色谱柱；

（2）一种未键合目标主分子的空白色谱柱；

（3）一种色谱系统，其具有部件（1）或（2）中所述的色谱柱，用于以带流出方式（Zonal elution）将第一待分析客分子的样品溶液以一定流速注入时，采集所述第一待分析客分子在所述未键合目标主分子的空白色谱柱上的流出曲线；以带流出方式（Zonal elution）将第一待分析客分子的样品溶液以一定流速注入时，采集所述第一待分析客分子在所述键合有目标主分子的亲和色谱柱上的流出曲线；以及以同样的方式采集第二待分析客分子在所述键合有目标主分子的亲和色谱柱上的流出曲线；

（4）第一计算部件，其用于在具有部件（1）或（2）中所述的色谱柱的情况下，分别通过峰拟合计算第一待分析客分子流出曲线的保留时间、半峰宽及塔板高度（H_R）；以及用于通过峰拟合计算第二待分析客分子流出曲线的保留时间、半峰宽及塔板高度（H_M,C）；

（5）第二计算部件，其用于比较在具有部件（1）或（2）中所述的色谱柱的情况下，所述第一计算部件中计算得到的对应于相同色谱柱的至少三个不同流速下的H_R和H_M,C；而且，

若三分之二数目以上的H_R>H_M,C，则以H_M,C作为H_M采用公式（3）通过H_R-H_M对uk/(1+k)²做线性回归，由斜率计算k_d,app作为所述键合有目标主分子的亲和色谱柱的解离速率常数以及k_d,control作为所述未键合目标主分子的空白色谱柱的解离速率常数；

$H_R-H_M=\frac{2\mathrm{uk}}{k_{d,\mathrm{app}}{(1+k)}^2}---\left(3\right)$

其中，u为线速度，k为容量因子；

若三分之二数目以上的H_R<H_M,C，则按照一定的校正方法对H_M,C进行校正，得到H_M,T，并采用校正后的H_M,T作为H_M按照公式（3）计算k_d,app以及k_d,control；

（6）第三计算部件，其通过第一待分析客分子在亲和色谱柱与空白色谱柱上的容量因子比值判断第一待分析客分子与空白基质相互作用的强弱，并采用公式（4）计算k_d，其中α_control为k_control与k的比值，α₁=1-α_control，

$\frac{1}{k_{d,\mathrm{app}}}=\frac{{\mathrm{\&alpha;}}_1}{k_d}+\frac{{\mathrm{\&alpha;}}_{\mathrm{control}}}{k_{d,\mathrm{control}}}---\left(4\right).$

本发明的优点进一步在于：本发明无需特殊仪器设备，利用常规色谱分析方法，可测得超分子弱相互作用的动力学速率常数，可与紫外、荧光及质谱等多种检测器联用，在低浓度、水溶性差的药物检测方面，以及超分子相互作用动力学参数的低成本、快速测定方面具有独特优势。

附图说明

图1是本发明基于亲和色谱的超分子相互作用解离速率常数测定方法的示意图；

图2是本发明实施例1中对乙酰氨基酚在β-环糊精亲和色谱柱上的流出曲线，其中从上到下流速分别为0.8、0.6、0.4和0.2mL/min；

图3是本发明实施例1中的H_R、H_M,C、H_M,T值，其中实心三角形图例表示H_M,C，实心菱形图例表示H_R，空心三角形图例表示H_M,T；

图4是本发明实施例1中对乙酰氨基酚在空白色谱柱上的流出曲线，其中从上到下流速分别为0.8、0.6、0.4和0.2mL/min；

图5是本发明实施例2中舍曲林在β-环糊精亲和色谱柱上的流出曲线，其中从上到下流速分别为1.4、1.0、0.8和0.6mL/min；

图6是本发明实施例2中的H_R、H_M,C、H_M,T值，其中实心三角形图例表示H_M,C，实心菱形图例表示H_R，空心三角形图例表示H_M,T；

图7是本发明实施例2中舍曲林在空白色谱柱上的流出曲线，其中从上到下流速分别为1.4、1.0、0.8和0.6mL/min；

图8是本发明实施例3中a-对乙酰氨基酚、b-非那西丁、c-氟比洛芬在β-环糊精亲和色谱柱上的流出曲线，其中从上到下流速分别为0.8、0.6、0.4和0.2mL/min；图9是本发明实施例3中的H_R、H_M,C、H_M,T值，其中实心三角形图例表示H_M,C，实心菱形图例表示H_R，空心三角形图例表示H_M,T，其中，a-对乙酰氨基酚；b-非那西丁；c-氟比洛芬。

图10是本发明实施例3中a-对乙酰氨基酚、b-非那西丁、c-氟比洛芬在空白色谱柱上的流出曲线，流速为0.2mL/min。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的方法、特点及优点作进一步详细地描述，但本实施例并不用于限制本发明，凡是采用与本发明相似的方法及其相似变化，均应列入本发明的保护范围。

实施例1：本发明用于测定对乙酰氨基酚-β-环糊精超分子的解离速率常数

表1实施例1的方法与结果

测定方法：

（1）提供一种键合有目标主分子的亲和色谱柱；

（2）配制流动相，用流动相制备样品溶液；

（3）25℃，以带流出方式（Zonal elution）将5μL的样品溶液以第一预定流速注入色谱系统（安捷伦二元泵G1311C，安捷伦自动进样器G1329B；安捷伦二极管阵列检测器G4212B、安捷伦柱温箱G1316A、安捷伦ChemStation色谱工作站），然后用所述流动相在所述流速条件下进行洗脱；

（4）采集第一待分析客分子在β-环糊精亲和色谱柱上的信号-时间曲线，即色谱图；

（5）采用指数修正的高斯分布（EMG）函数进行峰拟合（拟合相关系数>0.99），并计算保留时间、半峰宽及塔板高度（H_R）；

（6）以第二待分析客分子作为第二待分析客分子H₂O的样品溶液；

（7）采用与第一待分析客分子相同的方式获得第二待分析客分子的流出曲线，及保留时间、半峰宽与塔板高度（H_M,C）；

（8）按照（1）～（7）重复采集其他几个预定流速的色谱图；

（9）比较H_R与H_M,C的大小，结果H_R<H_M,C，需要进行校正。按照发明所述方法对H_M,C进行校正得到H_M,T，并采用校正后的H_M,T作为H_M按照公式（3）计算k_d,app。

（10）按照（1）～（9）同样的方法测定对乙酰氨基酚在空白色谱柱上的k_d,control；

（11）根据第一待分析客分子在亲和色谱柱与空白色谱柱上容量因子的比值，判断第一待分析客分子与空白基质的相互作用强弱，考虑是否需要扣除k_d,control,进而计算k_d，可以看出，根据公式（4）算得的k_d值1.78与k_d,app的值1.82很接近，因此证实了可以以k_d,app的值近似k_d。

实施例2：本发明用于测定舍曲林-β-环糊精超分子的解离速率常数

以与实施例1相同的方法测定舍曲林-β-环糊精超分子的解离速率常数，测定结果如下表2所示。

表2实施例2的方法与结果

实施例3：本发明用于同时测定对乙酰氨基酚、非那西丁及氟比洛芬-β-环糊精超分子的解离速率常数

以与实施例1相同的方法测定对乙酰氨基酚、非那西丁及氟比洛芬-β-环糊精超分子的解离速率常数，测定结果如下表3所示。

表3实施例3的方法与结果

Claims (10)

1.一种基于亲和色谱测定超分子相互作用解离速率常数的方法，该方法包括以下步骤：

（1）提供一种键合有目标主分子的亲和色谱柱；

（2）用流动相制备一定浓度的第一待分析客分子的样品溶液；

（3）以带流出方式将所述第一待分析客分子的样品溶液以一定流速注入色谱系统，采集第一待分析客分子在亲和色谱柱上的流出曲线，并通过峰拟合计算第一待分析客分子流出曲线的保留时间、半峰宽及塔板高度（H_R）；

（4）用与第一待分析客分子相同的流动相制备第二待分析客分子的样品溶液；

（5）采用与第一待分析客分子相同的方式获得第二待分析客分子流出曲线的保留时间、半峰宽及塔板高度（H_M,C）；

（6）按照（1）～（5）中所述的方法重复测定其他至少三个不同流速下的H_R和H_M,C；

（7）比较各个H_R与H_M,C的大小，若三分之二数目以上的H_R>H_M,C，则以H_M,C作为H_M采用公式（3）通过H_R-H_M对uk/(1+k)²做线性回归，由斜率计算k_d,app：

$H_R-H_M=\frac{2\mathrm{uk}}{k_{d,\mathrm{app}}{(1+k)}^2}---\left(3\right)$

其中，u为线速度，k为容量因子；

若三分之二数目以上的H_R<H_M,C，则按照一定的校正方法对H_M,C进行校正，得到H_M,T，并采用校正后的H_M,T作为H_M按照公式（3）计算k_d,app；

（8）按照（1）～（7）中所述的方法测定第一待分析客分子在空白色谱柱上的容量因子k_control和解离速率常数k_d,control；

（9）通过第一待分析客分子在亲和色谱柱与空白色谱柱上的容量因子比值判断第一待分析客分子与空白基质相互作用的强弱，并采用公式（4）计算k_d。（α_control为k_control与k的比值，α₁=1-α_control）

$\frac{1}{k_{d,\mathrm{app}}}=\frac{{\mathrm{\&alpha;}}_1}{k_d}+\frac{{\mathrm{\&alpha;}}_{\mathrm{control}}}{k_{d,\mathrm{control}}}---\left(4\right).$

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述主分子是超分子体系的主体分子，包括环糊精、冠醚、杯芳烃、葫芦脲、树枝状聚合物、胶束、脂质体、蛋白质或多肽。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述亲和色谱柱是市售或自制的色谱柱，包括填充柱、整体柱中的一种或多种，长度在1mm～25cm。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述亲和色谱柱的固定相是将目标主分子键合到色谱基质上，所述色谱基质包括聚丙烯酰胺及其衍生物、甲基丙烯酸酯共聚物、脲醛树脂或高交联度苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，以及纤维素、硅胶载体中的一种或多种；

所述流动相包括甲醇、乙腈、水、醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-盐酸缓冲液中的一种或多种，且其pH值为2～8。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一待分析客分子是指能与主分子发生非共价相互作用的有机小分子，其为生物特效配位体、染料、电荷转移配位体、包合配合物配位体中的一种或多种；

所述第二待分析客分子是不与主分子发生非共价相互作用的物质，其为水、甲醇、乙醇、硝酸钠、溴化钾、柠檬酸、尿嘧啶中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一定浓度是指能够保证色谱行为重现性的、信噪比大于10的符合线性洗脱的浓度；

所述一定流速是能够使相互作用成为影响第一待分析客分子色谱峰展宽的主要因素的流速。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的校正方法为：

理想第二待分析客分子的范第姆特方程为

$H_{M,T}=A_T+\frac{B_T}{u}+C_{\mathrm{sm},T}\&CenterDot;u$

常规第二待分析客分子的范第姆特方程为：

$H_{M,C}=A_C+\frac{B_C}{u}+(C_{\mathrm{sm},C}+C_{s,C})\&CenterDot;u$

根据第二待分析客分子在亲和色谱柱上的流出曲线，通过拟合常规第二待分析客分子的范第姆特方程，得到A_C和B_C，其中，H_M,C为计算得到的塔板高度，u为线速度；

对于同一根亲和色谱柱，A_T与A_C相同；

根据公式计算得到B_T，其中，V_T和V_C分别表示理想第二待分析客分子和常规第二待分析客分子在常压沸点条件下的摩尔体积；

根据公式计算得到C_sm,T，其中，d_p在色谱柱的说明书中有记载，k为容量因子，D_T为理想第二待分析客分子在流动相中的分子扩散系数；

根据以上方法，即可通过对H_M,C进行校正计算得到H_M,T。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，当第一待分析客分子在亲和色谱柱与空白色谱柱上的容量因子的比值≤0.1时，采用公式（3）计算的k_d,app的值近似作为k_d。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述色谱系统是常规的高效液相色谱系统，由泵、进样器、柱温箱、检测器和色谱工作站组成，所述检测器包括光学检测器、热学检测器、电化学检测器、电学检测器、放射性检测器以及氢火焰离子化检测器、质谱检测器中的一种或多种。

10.一种基于亲和色谱测定超分子相互作用解离速率常数的系统，该系统包括以下部件：

（1）一种键合有目标主分子的亲和色谱柱；

（2）一种未键合目标主分子的空白色谱柱；

（3）一种色谱系统，其具有部件（1）或（2）中所述的色谱柱，用于以带流出方式将第一待分析客分子的样品溶液以一定流速注入时，采集所述第一待分析客分子在所述未键合目标主分子的空白色谱柱上的流出曲线；以带流出方式将第一待分析客分子的样品溶液以一定流速注入时，采集所述第一待分析客分子在所述键合有目标主分子的亲和色谱柱上的流出曲线；以及以同样的方式采集第二待分析客分子在所述键合有目标主分子的亲和色谱柱上的流出曲线；

（4）第一计算部件，其用于在具有部件（1）或（2）中所述的色谱柱的情况下，分别通过峰拟合计算第一待分析客分子流出曲线的保留时间、半峰宽及塔板高度（H_R）；以及用于通过峰拟合计算第二待分析客分子流出曲线的保留时间、半峰宽及塔板高度（H_M,C）；

（5）第二计算部件，其用于比较在具有部件（1）或（2）中所述的色谱柱的情况下，所述第一计算部件中计算得到的对应于相同色谱柱的至少三个不同流速下的H_R和H_M,C；而且，

若三分之二数目以上的H_R>H_M,C，则以H_M,C作为H_M采用公式（3）通过H_R-H_M对uk/(1+k)²做线性回归，由斜率计算k_d,app作为所述键合有目标主分子的亲和色谱柱的解离速率常数以及k_d,control作为所述未键合目标主分子的空白色谱柱的解离速率常数；

$H_R-H_M=\frac{2\mathrm{uk}}{k_{d,\mathrm{app}}{(1+k)}^2}---\left(3\right)$

其中，u为线速度，k为容量因子；

若三分之二数目以上的H_R<H_M,C，则按照一定的校正方法对H_M,C进行校正，得到H_M,T，并采用校正后的H_M,T作为H_M按照公式（3）计算k_d,app以及k_d,control；

（6）第三计算部件，其通过第一待分析客分子在亲和色谱柱与空白色谱柱上的容量因子比值判断第一待分析客分子与空白基质相互作用的强弱，并采用公式（4）计算k_d，其中α_control为k_control与k的比值，α₁=1-α_control，

$\frac{1}{k_{d,\mathrm{app}}}=\frac{{\mathrm{\&alpha;}}_1}{k_d}+\frac{{\mathrm{\&alpha;}}_{\mathrm{control}}}{k_{d,\mathrm{control}}}---\left(4\right).$