CN116908468A - 一种基于分子相互作用表征中药及其有效成分性味作用的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于分子相互作用表征中药及其有效成分性味作用的方法，1)将代表性性味靶点蛋白，进行生物素化，稀释成合适浓度；2)配制中药有效成分对照品、阳性药和不同批次中药的提取物的待测溶液；3)使用分子相互作用仪来测定样品与蛋白之间的分子动力学参数；4)采用相关软件分析分子动力学数据；5)基于不同批次的有效成分含量和对应批次中药提取物与性味靶点蛋白结合的KD值；6)通过相应模型参数确定不同有效成分在中药提取物总体成分中的含量和其与性味相关蛋白结合作用的相关性，确定其主要性味贡献。本发明对于从分子层次上明确有效成分的在整体成分中的性味贡献和保证中药的组方配伍的合理性具有重要的理论意义和应用价值。

Description

一种基于分子相互作用表征中药及其有效成分性味作用的 方法
技术领域
本发明涉及一种基于分子相互作用表征中药及其有效成分性味作用的方法，属于中药技术领域。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
“四气五味”是中医组方遣药首要考虑的中药药性理论核心，也是中药配伍发挥药效的趋势轮廓。其中五味，即辛、甘、酸、苦、咸，是对中药药性、药效源自的物质基础的共性高度抽象和浓缩，它不仅是对味觉的感知，也反映着中药的功效性能。解析出中药及其有效成分的性味作用，对于理解中药复方的配伍机理和成分之间的相互作用具有重大意义。然而另一方面，中药中的有效成分，其发挥的性味作用以及在整体化学成分中的性味贡献，由于不容易量化，很难通过常规方法表征出来。分子相互作用研究是对配体和受体之间结合形式和能力进行探究的一门学科，而分子之间亲和力的强弱也可以反映药物成分小分子与靶点蛋白大分子之间结合的能力大小。性味相关靶点蛋白可以划分为口尝味靶点蛋白和功能味靶点蛋白，进一步的，口尝味靶点蛋白又可以划分为辛、甘、酸、苦、咸对应的受体蛋白，功能味靶点蛋白可以对应着药物治疗疾病的核心靶点蛋白。从分子动力学方面研究中药有效成分与性味相关靶点蛋白结合的快慢、强弱，可以解析药物性味作用产生的机理，明确成分在药物整体成分的核心性味行为中发挥的作用。
目前，现有技术对中药及其有效成分性味的分析主要是文献归纳、网络药理学和分子模拟等虚拟数据挖掘方法，发明人发现现有的中药有效成分性味分析缺乏实验论证。中药性味研究一直是中医药理论不容易与现代仪器分析方法结合的难点之一，基于分子相互作用表征中药及其有效成分性味作用，对于量化中药有效成分的核心性味作用及在整体成分中的性味贡献，并从分子层次上验证中药复方配伍的合理性，具有重要的理论意义和应用价值。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种分子相互作用表征中药及其有效成分性味作用的方法，所述方法从分子水平揭示中药及其有效成分和性味相关靶点蛋白的分子相互作用，更深层次地解释性味作用机理，为中药有效成分性味作用的系统明确和中药复方的合理配伍提供参考。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种基于分子相互作用表征中药及其有效成分性味作用的方法，包括以下步骤：
(1)将代表性性味靶点蛋白，按照氨基偶联生物素化试剂盒说明书进行生物素化，最后用1×PBS溶液稀释；
(2)中药有效成分对照品和可与性味靶点蛋白结合的阳性药溶于100％DMSO中，之后含药DMSO样品溶液按照1:20比例溶于1×PBS溶液(即为含5％ DMSO的1×PBS溶液)中，不同批次中药的提取物以原药品相等重量计溶于含5％ DMSO的1×PBS溶液中；首先以3倍浓度梯度逐级稀释，作为初筛样品。然后根据初筛的亲和力常数(KD)值大小，调整样品浓度，使KD值落于样品浓度范围之内；以2倍浓度梯度逐级稀释，用于精细筛选获取高度可信的KD值；
(3)使用分子相互作用仪来测定样品与蛋白之间的分子动力学参数；步骤如下：
将生物传感器用1×PBS缓冲液预湿，并用生物素化后的蛋白固化；之后将生物传感器转移到动力学缓冲液的孔中测量基线，持续120s后，将蛋白固化后的生物传感器尖端置于含中药有效成分对照品，可与性味靶点蛋白结合的阳性药，以及中药提取物的PPD溶液(1×PBS缓冲液中含有5％ DMSO)孵育，进入结合阶段，生成时间-固化高度关联曲线；随后的解离阶段是传感器在与结合阶段相同浓度DMSO的PPD溶液中进行孵育，进入解离阶段；
(4)采用软件分析分子动力学数据。分析物与传感器的结合曲线和解离曲线采用单指数模型拟合，计算结合常数(Kon)、解离常数(Koff)及亲和力常数(KD),其中KD＝Koff/Kon；
(5)基于不同批次的有效成分含量和对应批次中药提取物与性味靶点蛋白结合的KD值，采用多元统计分析软件建立回归分析模型，对两者的相关性进行分析，并验证模型的可靠性；
(6)通过偏最小二乘回归模型参数确定不同有效成分在中药整体化学成分中与性味靶点蛋白结合的贡献排序，以及不同有效成分含量和中药整体成分与性味靶点蛋白结合的KD值的相关性；同时，结合有效成分单体形式与代表性口尝味和功能味靶点蛋白结合的分子动力学参数，解析中药有效成分和性味相关靶点蛋白的分子相互作用情况，对中药的有效成分发挥的核心性味行为及其在整体化学成分中的主要性味贡献进行表征。
优选的，步骤(1)中，代表性性味靶点蛋白，分别选取功能味和口尝味靶点蛋白，按照氨基偶联生物素化试剂盒说明书进行生物素化，最后用1×PBS溶液稀释成50ug/ml的浓度。
优选的，步骤(2)中，不同批次中药的提取物溶液配制为：不同批次中药的70％甲醇干提物以原药品重量计200mg/ml溶于含5％ DMSO的1×PBS溶液中。
优选的，步骤(2)中，3倍浓度逐级稀释，得到8个浓度的样品溶液，作为初筛样品。第2轮根据初筛的亲和力常数(KD)值大小，调整样品浓度，2倍浓度逐级稀释，精细筛选获取高度可信的KD值。
优选的，步骤(3)中，使用ForteBio Octet K2分子相互作用仪来测定样品与蛋白之间的分子动力学参数。输入待测成分相对分子质量和摩尔浓度，中药的相对分子量录入特定数字，本实验中取“1000Da”，在结果中将KD值单位“M”再换算成“g·L-1”；
优选的，步骤(3)中，将梯度浓度配置好的样品溶液和氨基偶联生物素化后的蛋白溶液(50μg/mL)加入Greiner 96孔微孔板中，每孔溶液体系均为200μL。然后将超级链霉亲和素(Super Streptavidin,SSA)生物传感器用1×PBS缓冲液预湿，并用生物素化后的蛋白固化300s。之后将生物传感器转移到动力学缓冲液的孔中测量基线，持续60s后，将蛋白固化后的SSA生物传感器尖端置于含梯度浓度的阳性药、中药提取物及有效成分对照品的PPD溶液(1×PBS缓冲液中含有5％ DMSO)孵育，进入结合阶段，结合时间为120s，生成关联曲线。随后的解离阶段是传感器在与结合阶段相同浓度DMSO的PPD溶液中进行孵育，解离时间为120s。
优选的，步骤(4)中，分子动力学数据分析软件为ForteBio Date Analysis11.0软件。分析物与传感器的结合曲线和解离曲线采用单指数模型拟合，计算结合常数(Kon)、解离常数(Koff)及亲和力常数(KD)；
优选的，步骤(5)中，基于不同批次的有效成分含量和对应批次中药提取物与性味靶点蛋白结合的KD值，采用SIMCA-P 13.0软件建立偏最小二乘回归(PLSR)分析模型，对两者的相关性进行分析，并通过置换检验验证模型的可靠性；
优选的，步骤(6)中，通过变量重要性因子(VIP)值确定不同有效成分在中药整体化学成分中与性味靶点蛋白结合的贡献排序，VIP值大于1且置信区间不过零点，有统计学意义；通过归一化回归系数确定不同有效成分含量和中药整体成分与性味靶点蛋白结合的KD值的相关性，置信区间不过零点，代表有统计学意义。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明提供了一种基于分子相互作用表征中药及其有效成分性味作用的方法，该方法中根据分子相互作用仪得到的分子动力学数据，将分析物与传感器的结合曲线和解离曲线采用单指数模型拟合，计算结合常数(Kon)、解离常数(Koff)及亲和力常数(KD)，客观地描述中药及有效成分与性味靶点蛋白结合的分子相互作用情况，为中药及有效成分核心性味行为的表征提供实验数据支持。
本发明的表征方法基于分子相互作用从分子水平上对中药有效成分的性味作用行为进行解释，揭示了中药有效成分和性味相关靶点蛋白的分子相互作用，更深层次地理解了性味产生过程，为其进一步的研究和使用提供参考。
本发明中表征方法操作简便快捷，无分子颗粒度大小限度，适应于绝大部分中药及其有效成分的性味作用表征，为建立中药及其有效成分性味作用的评价方法提供新的视角。
本发明利用基于分子相互作用表征中药及其有效成分性味作用，对于明确有效成分的在整体成分中的性味贡献、保证中药的组方配伍的合理性、将中医药理论与现代仪器分析方法系统结合等具有重要的理论意义和应用价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为心可舒片有效成分与ACE靶点蛋白结合的分子动力学拟合曲线；
图2为心可舒片有效成分与OR7D4靶点蛋白结合的分子动力学拟合曲线；
图3为心可舒片有效成分与TAS2R10靶点蛋白结合的分子动力学拟合曲线；
图4心可舒片提取物与ACE、OR7D4和TAS2R10靶点蛋白结合的分子动力学拟合曲线；
图5(A)为PLSR模型的归一化回归系数图；(B)为PLSR模型的变量重要性因子图，其中1-8成分编号分别对应丹参素、原儿茶醛、葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、丹酚酸B、大豆苷元和丹酚酸A；
图6为PLSR模型的置换检验验证图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
分子相互作用研究，可以用于研究分子间结合的快慢、强弱和机理，在发现和筛选药物、识别药物作用机理生物学过程已经有不少应用，但对于中药及其有效成分的性味作用表征还没有研究。
将本发明的方法应用于心可舒片及其有效成分的性味作用表征。为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
实施例1：
首先，将功能味靶点蛋白血管紧张素转换酶(ACE)以及口尝味靶点蛋白，包括苦味对应的味觉受体第二家族成员10(TA2R10)和辛味对应的嗅觉受体7D4(OR7D4)，按照氨基偶联生物素化试剂盒说明书进行生物素化，最后用1×PBS溶液稀释成50ug/ml的浓度。
然后，将丹参素、葛根素、大豆苷、丹酚酸B、大豆苷元、丹酚酸A、原儿茶醛、3’-甲氧基葛根素八种心可舒片的有效成分和赖诺普利、辣椒素、奎宁(与三种代表性性味相关蛋白结合的阳性药)以20mM的浓度溶于100％DMSO中，之后含药DMSO样品溶液按照1:20比例溶于1×PBS溶液(即为含5％ DMSO的1×PBS溶液)中，43批心可舒片的70％甲醇干提物以原药品重量计200mg/ml溶于含5％ DMSO的1×PBS溶液中。3倍浓度逐级稀释，得到8个浓度的样品溶液，作为初筛样品。将梯度浓度配置好的样品溶液和氨基偶联生物素化后的蛋白溶液(50μg/mL)加入Greiner 96孔微孔板中，每孔溶液体系均为200μL。利用ForteBio Octet K2分子相互作用仪测量固定在生物传感器上的靶点蛋白与小分子(心可舒片8种有效成分和阳性药)结合和解离后固化高度的变化，利用ForteBio Date Analysis11.0分子动力学数据分析软件，对分析物与传感器的结合曲线和解离曲线采用单指数模型拟合，计算Kon、Koff及KD。第2轮根据初筛的亲和力常数(KD)值大小，调整样品浓度，2倍浓度逐级稀释，精细筛选获取高度可信的KD值。
在与ACE靶点蛋白结合的分子动力学实验中，设赖诺普利为与ACE靶点蛋白结合的小分子阳性药，通过第一轮KD值初筛选，发现丹参素、大豆苷、大豆苷元与ACE靶点蛋白基本无结合。心可舒片的其余有效成分与ACE靶点蛋白结合的分子动力学参数与拟合曲线见表1和图1。可以看出，与ACE靶点蛋白结合能力的强弱顺序为：丹酚酸A＞丹酚酸B＞3'-甲氧基葛根素＞葛根素＞原儿茶醛。另外，丹酚酸A相比阳性药赖诺普利，与ACE靶点蛋白结合的KD值还要小，结合能力更强。丹酚酸A是心可舒片8种有效成分中与ACE靶点蛋白结合能力最强的成分。
表1心可舒片有效成分与ACE靶点蛋白结合的分子动力学参数
在与OR7D4靶点蛋白结合的分子动力学实验中，设辣椒素为与OR7D4靶点蛋白结合的小分子阳性药，通过第一轮KD值初筛选发现，丹参素、大豆苷、大豆苷元与OR7D4靶点蛋白同样基本无结合。如表2和图2所示，从心可舒片的其余有效成分与OR7D4靶点蛋白结合的分子动力学参数与拟合曲线结果中可以看出，与OR7D4靶点蛋白结合能力的强弱顺序为：丹酚酸A＞3'-甲氧基葛根素＞丹酚酸B＞葛根素＞原儿茶醛。丹酚酸A是心可舒片8种有效成分中与OR7D4靶点蛋白结合能力最强的成分。
表2心可舒片有效成分与OR7D4靶点蛋白结合的分子动力学参数
在与TAS2R10靶点蛋白结合的分子动力学实验中，设奎宁为与TAS2R10靶点蛋白结合的小分子阳性药，通过第一轮KD值初筛选发现，丹参素、大豆苷、大豆苷元与TAS2R10靶点蛋白还是基本无结合。如表3和图3所示，从心可舒片的其余有效成分与TAS2R10靶点蛋白结合的分子动力学参数与拟合曲线结果中可以看出，与TAS2R10靶点蛋白结合能力的强弱顺序为：丹酚酸A＞丹酚酸B＞3'-甲氧基葛根素＞原儿茶醛＞葛根素。丹酚酸A是依然心可舒片8种有效成分中与TAS2R10靶点蛋白结合能力最强的成分。
表3心可舒片有效成分与TAS2R10靶点蛋白结合的分子动力学参数
对于拟合得到的心可舒片与ACE、OR7D4和TAS2R10靶点蛋白结合的分子动力学参数，在结果中将单位“M”换算成“g·L-1”。如表4和图4，心可舒片的提取物与三种靶点蛋白结合情况良好。如表1-5，将心可舒片8种有效成分的KD单位也“M”换算成“g·L-1”后，心可舒片提取物换算后的KD与这些成分的换算后的KD相比发现，与ACE蛋白的结合中，其值小于丹酚酸A的，同时大于其他有效成分的；与OR7D4蛋白的结合中，其值小于丹酚酸A和丹酚酸B的，同时大于其他有效成分的；与TAS2R10蛋白的结合中，其值小于丹酚酸A，同时大于其他有效成分的。据此推测，心可舒片整体成分与ACE、OR7D4和TAS2R10靶点蛋白结合的贡献中，可能以丹酚酸A为主，其他成分次之。
表4心可舒片提取物与ACE、OR7D4和TAS2R10靶点蛋白结合的分子动力学参数
采用相同的心可舒片提取物所对应的成药质量浓度梯度，以同样的步骤，考察了43批心可舒片提取物与ACE靶点蛋白的分子动力学参数，得到换算KD，见图5，用于下一步研究分析。
基于利用HPLC法测得的43批心可舒片的8种有效成分含量和利用分子动力学实验测得的对应批次心可舒片提取物与ACE靶点蛋白结合的KD值，基于此，采用SIMCA-P 13.0软件建立偏最小二乘回归(PLSR)分析模型，对两者的相关性进行分析，并通过置换检验验证模型的可靠性。
如图6-A所示，通过VIP图可以看出，对与ACE靶点蛋白结合的KD值影响大小的成分贡献度排序为：丹酚酸A>丹参素>原儿茶醛>大豆苷元>3’-甲氧基葛根素>丹酚酸B>大豆苷>葛根素。丹酚酸A、丹参素和原儿茶醛的VIP值大于1，表示相关性有显著性；如图6-B所示，通过归一化回归系数图可以看到丹酚酸A、丹参素和原儿茶醛与KD值的关系都是负相关的，这与分子相互作用越强，KD值越小这一理论相符。置换检验如图6所示，两条回归线的斜率都较大，Q2回归线在Y轴上的截距为负，左侧随机排列得到的R2和Q2均小于右侧原始值，说明原模型的预测能力大于随机排列变量的预测能力，证明该模型有效可靠，不存在过拟合现象。
结合单体成分与ACE靶点蛋白的分子动力学结果，可以看到丹酚酸A在心可舒片的8种有效成分中，与ACE靶点蛋白结合能力最强，这与本实验结果互为印证。而丹参素和原儿茶醛在单体成分与ACE靶点的分子相互作用结果考察中，几乎没有结合或结合能力很弱，却在心可舒片整体成分与ACE靶点结合结果中有显著性正向贡献，我们据此猜测，中药整体成分与靶点结合的过程可能有协同现象存在，而不是简单的竞争拮抗作用。同时丹酚酸A、丹参素和原儿茶醛都来自心可舒片中的君药丹参，而且丹酚酸A与口尝味靶点蛋白结合的表现也很好，说明心可舒片的治疗适应症的性味体现可能主要源自君药丹参，这与中药的复方配伍原则相符。

Claims (9)

1.一种基于分子相互作用表征中药及其有效成分性味作用的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将代表性性味靶点蛋白，按照氨基偶联生物素化试剂盒说明书进行生物素化，最后用1×PBS溶液稀释；
(2)中药有效成分对照品和可与性味靶点蛋白结合的阳性药溶于100％DMSO中，之后含药DMSO样品溶液按照1:20比例溶于1×PBS溶液(即为含5％DMSO的1×PBS溶液)中，不同批次中药的提取物以原药品相等重量计溶于含5％DMSO的1×PBS溶液中；首先以3倍浓度梯度逐级稀释，作为初筛样品。然后根据初筛的亲和力常数(KD)值大小，调整样品浓度，使KD值落于样品浓度范围之内；以2倍浓度梯度逐级稀释，用于精细筛选获取高度可信的KD值；
(3)使用分子相互作用仪来测定样品与蛋白之间的分子动力学参数；步骤如下：
将生物传感器用1×PBS缓冲液预湿，并用生物素化后的蛋白固化；之后将生物传感器转移到动力学缓冲液的孔中测量基线，持续120s后，将蛋白固化后的生物传感器尖端置于含中药有效成分对照品，可与性味靶点蛋白结合的阳性药，以及中药提取物的PPD溶液(1×PBS缓冲液中含有5％DMSO)孵育，进入结合阶段，生成时间-固化高度关联曲线；随后的解离阶段是传感器在与结合阶段相同浓度DMSO的PPD溶液中进行孵育，进入解离阶段；
(4)采用软件分析分子动力学数据。分析物与传感器的结合曲线和解离曲线采用单指数模型拟合，计算结合常数(Kon)、解离常数(Koff)及亲和力常数(KD),其中KD＝Koff/Kon；
(5)基于不同批次的有效成分含量和对应批次中药提取物与性味靶点蛋白结合的KD值，采用多元统计分析软件建立回归分析模型，对两者的相关性进行分析，并验证模型的可靠性；
(6)通过偏最小二乘回归模型参数确定不同有效成分在中药整体化学成分中与性味靶点蛋白结合的贡献排序，以及不同有效成分含量和中药整体成分与性味靶点蛋白结合的KD值的相关性；同时，结合有效成分单体形式与代表性口尝味和功能味靶点蛋白结合的分子动力学参数，解析中药有效成分和性味相关靶点蛋白的分子相互作用情况，对中药的有效成分发挥的核心性味行为及其在整体化学成分中的主要性味贡献进行表征。
2.根据权利要求1所述基于分子相互作用表征中药及其有效成分性味作用的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，代表性性味靶点蛋白，分别选取功能味和口尝味靶点蛋白，按照氨基偶联生物素化试剂盒说明书进行生物素化，最后用1×PBS溶液稀释成50ug/ml的浓度。
3.根据权利要求1所述基于分子相互作用表征中药及其有效成分性味作用的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，不同批次中药的提取物溶液配制为：不同批次中药的70％甲醇干提物以原药品重量计200mg/ml溶于含5％DMSO的1×PBS溶液中。
4.根据权利要求1所述基于分子相互作用表征中药及其有效成分性味作用的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，3倍浓度逐级稀释，得到8个浓度的样品溶液，作为初筛样品。第2轮根据初筛的亲和力常数(KD)值大小，调整样品浓度，2倍浓度逐级稀释，精细筛选获取高度可信的KD值。
5.根据权利要求1所述基于分子相互作用表征中药及其有效成分性味作用的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，使用ForteBio Octet K2分子相互作用仪来测定样品与蛋白之间的分子动力学参数。
6.根据权利要求1所述基于分子相互作用表征中药及其有效成分性味作用的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，将梯度浓度配置好的样品溶液和氨基偶联生物素化后的蛋白溶液(50μg/mL)加入Greiner 96孔微孔板中，每孔溶液体系均为200μL；然后将超级链霉亲和素(Super Streptavidin,SSA)生物传感器用1×PBS缓冲液预湿，并用生物素化后的蛋白固化300s；之后将生物传感器转移到动力学缓冲液的孔中测量基线，持续60s后，将蛋白固化后的SSA生物传感器尖端置于含梯度浓度的阳性药、中药提取物及有效成分对照品的PPD溶液(1×PBS缓冲液中含有5％DMSO)孵育，进入结合阶段，结合时间为120s，生成关联曲线；随后的解离阶段是传感器在与结合阶段相同浓度DMSO的PPD溶液中进行孵育，解离时间为120s。
7.根据权利要求1所述基于分子相互作用表征中药及其有效成分性味作用的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，分子动力学数据分析软件为ForteBio Date Analysis11.0软件；分析物与传感器的结合曲线和解离曲线采用单指数模型拟合，计算结合常数(Kon)、解离常数(Koff)及亲和力常数(KD)。
8.根据权利要求1所述基于分子相互作用表征中药及其有效成分性味作用的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，基于不同批次的有效成分含量和对应批次中药提取物与性味靶点蛋白结合的KD值，采用SIMCA-P13.0软件建立偏最小二乘回归(PLSR)分析模型，对两者的相关性进行分析，并通过置换检验验证模型的可靠性。
9.根据权利要求1所述基于分子相互作用表征中药及其有效成分性味作用的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，通过变量重要性因子(VIP)值确定不同有效成分在中药整体化学成分中与性味靶点蛋白结合的贡献排序，VIP值大于1且置信区间不过零点，有统计学意义；通过归一化回归系数确定不同有效成分含量和中药整体成分与性味靶点蛋白结合的KD值的相关性，置信区间不过零点，代表有统计学意义。
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