CN104634750A - 基于超声分散、差速离心和光谱技术测定蛋白质溶解度的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于超声分散、差速离心和光谱技术测定蛋白质溶解度的方法。该方法建立蛋白质浓度标准曲线；然后制备蛋白质分散样品：每个蛋白质样本分别置于体积为V溶剂中，得到相应质量添加浓度为的样品；再进行差速离心以及样品蛋白质浓度的光谱测定；最后进行蛋白质溶解度的计算：将蛋白质样品质量添加浓度按由小到大的顺序纵行排列，离心速度j按由小到大的顺序横向排列，求出每行的标准方差s_i，标准方差s_i随蛋白质样品质量添加浓度小到大呈一次指数增加趋势，计算出曲率最大点对应的浓度为蛋白质的溶解度。该方法测定蛋白质的溶解度，稳定、快速、准确。

Description

基于超声分散、差速离心和光谱技术测定蛋白质溶解度的方法

技术领域

本发明涉及一种测定蛋白质溶解度的方法，特别是涉及一种基于超声分散、差速离心和光谱技术的蛋白质溶解度快速测定方法。

背景技术

蛋白质作为有机大分子化合物，在水中以分散态(胶体态)存在，因此，蛋白质在水中无严格意义上的溶解度，只是将蛋白质在水中的分散量或分散水平相应的称为蛋白质的溶解度。

蛋白质溶解度的大小在实际应用中非常重要，因为溶解度特性数据在确定天然蛋白质的提取、分离和纯化时是非常有用的，蛋白质变性的程度也可以通过蛋白质的溶解行为的变化作为评价指标。此外，蛋白质在饮料中的应用也与其溶解性能有直接的关系。

蛋白质在溶液中的溶解情况，可以将其分为两种：无丁达尔现象和具有明显丁达尔现象的蛋白质分散体。前者说明蛋白质在该溶液中的分散很好，分子基本上完全舒展开；后者则是由于蛋白质分子在溶液体系中无法分散伸展开，以颗粒状或团聚体状存在，结果其光散射性较好，出现明显的丁达尔现象。蛋白质溶解度的常用表示方法为蛋白质分散指数(protein dispersibility index，PDI)、氮溶解指数(nitrogen solubility index，NSI)、水可溶性氮(water soluble nitrogen，WSN)。

PDI＝水分散蛋白/总蛋白

NSI＝水溶解氮/总氮

WSN＝可溶性氮的质量/样品的质量

蛋白质溶解度的大小受到一些条件如pH值、离子强度、温度、溶剂类型等影响。蛋白质的溶解度在等电点(pI)时通常是最低的，pH值在高于或低于等电点时，蛋白质所带的净电荷为负电荷或正电荷，其溶解度均增大。蛋白质的溶解度在pI时虽然是最低的，但是对不同的蛋白质，还是有一定差异。一些蛋白质如酪蛋白、大豆蛋白在等电点时几乎不容，而乳清蛋白在等电点时的溶解度仍然很好。对于溶解性随pH值变化大的蛋白质，通过改变介质的酸碱度对其进行相应的提取、分离是十分方便的；而对于溶解性随pH值变化不大的蛋白质，则需要通过其他的方式才能达到分离、提纯的目的。

盐类对蛋白质的溶解性也产生不同的影响。当中性盐的浓度范围为0.1‐1mol/L时，可增大蛋白质在水中的溶解度(盐溶，salting in)，蛋白质的溶解性与离子强度有关；而在中性盐的浓度大于1mol/L时，可降低蛋白质在水中的溶解度甚至产生沉淀(盐析，salting out)。

Melander W和Horvath C报道了蛋白质的相图(Salt effects on hydrophobic interactions inprecipitation and chromatography of proteins:an interpretation of the lyotropic series.Archivesof biochemistry and biophysics,1977,183(1):200‐215)，在该相图有三条线，三条线从下而上分别为溶解度曲线、稳定度曲线和沉淀曲线，将相图分为四个区域，即不饱和区、亚稳区、不稳定区和沉淀区，见附图1。

从已知的方法来看，PDI、NSI值的确定很复杂。以确定NSI为例，文献(陈春佳，张宝琴.大豆蛋白质NSI和PDI的检测方法比较[J].西部粮油科技，2000，25(5)：47‐49.)显示如下：称取5g样品(天平精确度0.01g)，放入500ml的烧杯中，量取200ml 30℃的蒸馏水，分几次加入到样品中，样品混合后把烧杯浸在30℃的水槽中，用机械搅拌器在转速为120r/min的条件下，搅拌混合物120min，然后把混合物转移到250ml的容量瓶中.用蒸馏水稀释到刻度，放置几分钟后往50ml离心试管中倒入40ml试样，在1500r/min的转速下离心10min，用带有玻璃纤维的漏斗过滤离心管中的上清液(不要把分离后的固体倒入过滤器)，把澄清滤液倒入100ml容量瓶中，移取25ml澄清液加入凯式烧瓶中，然后按AOCSAa5‐91测定水溶氮量及总氮量。由上述方法可以看出，其操作过程比较复杂，且最后要应用凯氏测氮法，进行装置搭建和酸碱滴定等操作。

已报道的测定蛋白质溶解度新方法包括：(1)Berg A等采用高通量筛选技术和机器测量结合，以溶菌酶为例，测定蛋白质溶解度(Automated measurement of apparent proteinsolubility to rapidly assess complex parameter interactions[J].Food and Bioproducts Processing.2014,92(2),133‐142)；(2)Forsythe E L等采用微液注技术，以溶菌酶为例，测定蛋白质的溶解度(Tetragonal chicken egg white lysozyme solubility in sodium chloride solutions[J].Journalof Chemical&Engineering Data,1999,44(3):637‐640)。Berg A等测定的溶菌酶的溶解度曲线实际上是相图中的沉淀曲线，即通过溶液中是否产生沉淀作为到达溶解度的标志，其测定原理是将溶菌酶溶于NaCl水溶液形成不饱和的状态，即没有沉淀产生，然后蒸发溶液中的水分，直到其达到饱和有沉淀生成为止。Forsythe E L等测得的溶菌酶的溶解度曲线是基本上相图中的溶解度曲线，其测定方法是先制得溶菌酶的微晶，需要反复的结晶、溶解和重结晶，然后再通过微液柱技术获得所能达到的热力学平衡数据，该方法操作较为复杂且耗时。上述两种方法测定蛋白质溶解度的时间较长，微液注技术需要纯度较高的蛋白质晶体才能测定溶解度，同时两种方法测得的溶解度数据相差较大，因为前者是测定蛋白质的沉淀曲线作为溶解度，而后者是采用热力学平衡作为溶解度，但是都能满足实际应用。上述方法测定的蛋白质溶解度均能达到化学和生物应用的要求，但相对复杂、耗时长。

发明内容

本发明的目的是针对蛋白质溶解度测定的复杂性和不确定性，提供采用超声分散、差速离心操作结合光谱分析技术，对蛋白质的溶解度进行稳定、快速、准确的测定。

本发明通过提供一种较为简便、易行的方法测定蛋白质的溶解度，以便为蛋白质的提取、分离、纯化和改性，以及蛋白质变性的程度提供一种比较简单的参考方法。

本发明的原理如下：

蛋白质加入溶剂体系中时，存在溶解平衡，而且溶解平衡需要较长时间才能达到。蛋白质‐溶剂多数情况下形成的稳定分散体系是胶体，而非溶液，即此时蛋白质小颗粒在体系中存在，蛋白质添加量不是其溶解度。因此，蛋白质在溶剂中的分散通常分两部分，一是溶解，二是以小颗粒分散。溶解的蛋白质稳定分散在溶剂中，但分散的蛋白质小颗粒在离心力的作用下会沉淀析出，而且沉淀析出量随离心速度的增加而增加。据此，本发明提出采用超声辅助快速分散、差速离心测蛋白质胶体稳定性的方法，测定蛋白质的溶解度：(1)当加入的蛋白质较少时，溶解占主要部分，采用差速离心操作后，当测定蛋白质胶体溶液经过差速离心后的蛋白质浓度，并计算各离心速度下对应的蛋白质浓度的标准方差s时，s较小；(2)随着蛋白质加入量的增加，蛋白质小颗粒分散所占比例在所制备的蛋白质‐溶剂胶体分散体系中增大，整个分散体系的稳定性变差，采用差速离心操作后，当测定蛋白质胶体溶液经过差速离心后的蛋白质浓度，并计算各离心速度下对应的蛋白质浓度的标准方差s时，则s变大，直至s出现变化速率最大点后，s的变化速率变小。在分散过程中蛋白质稳定性变差速率最快的点，称为蛋白质分散稳定性变差的临界点(Critical Point，简称CP)。本发明是通过测定蛋白质胶体的稳定性，来测定蛋白质在体系中的溶解度。

本发明通过如下技术方案实现：

一种基于超声分散、差速离心和光谱技术测定蛋白质溶解度的方法，包括如下步骤：

(1)建立蛋白质浓度标准曲线：将蛋白质溶入溶剂体系中，采用光谱技术测量其浓度，建立蛋白质浓度的标准曲线y＝ax+b，其中y代表特征吸收峰值，x代表蛋白质浓度；a、b分别为标准曲线的斜率和截距，由标准曲线待定系数法确定；

(2)蛋白质分散样品的制备：根据分散过程蛋白质在所述溶剂体系中的溶解情况，从小到大等质量间隔称取蛋白质样品7～10个，样品质量分别记为m₁、m₂、…m_i，其中i＝7～10，每个蛋白质样本分别置于体积为V溶剂中，得到相应质量添加浓度为的样品；将i个样品置于超声场中，在温度为10～60℃，搅拌速度为100～500r/min的条件下搅拌分散，形成均一的胶体分散体系；

(3)差速离心：离心速度0～3000r/min之间等转速间隔取j个点，j＝6～10，将步骤(2)得到的各样品在选定的j个速度下离心，得到(7～10)×(6～10)个样品；

(4)样品蛋白质浓度的光谱测定：分别取步骤(3)离心后得到的上清液，稀释到步骤(1)标准曲线的蛋白质浓度范围内，采用光谱技术测量其特征吸收峰值，代入步骤(1)中标准曲线方程，计算离心后分散体系中各样品对应的质量浓度

(5)蛋白质溶解度的计算：将蛋白质样品质量添加浓度按由小到大的顺序纵行排列，离心速度j按由小到大的顺序横向排列，根据步骤(4)中在不同离心速度下离心后每个样品对应的质量浓度求出每行的标准方差s_i，s_i由式(1)计算：

$s_i=\sqrt{\frac{\underset{j=1}{\overset{j}{\mathrm{\Σ}}}{(c_i^j-\stackrel{\‾}{c_i^j})}^2}{j}}---\left(1\right)$

式(1)中：标准方差s_i随蛋白质样品质量添加浓度由小到大呈一次指数增加趋势，采用修正指数方程拟合得方程(2)：

$s_i=\mathrm{nexp}(c_i^{\mathrm{add}}/t)---\left(2\right)$

式(2)中n、t为指数方程系数，由拟合方程待定系数法确定(将s_i作为y轴，作为x轴，然后采用指数方程拟合各个数据点)；根据指数方程特征，式(2)存在曲率最大点，曲率最大点为s_i变化速率最大处，表示该蛋白质胶体分散体系稳定性恶化最快点，曲率最大点对应的浓度由式(3)得出，为蛋白质的溶解度：

$c=\left|t\right|\ln \left|\frac{t}{\sqrt{2}n}\right|---\left(3\right).$

优选地，体积V为50毫升。

所述蛋白质为玉米醇溶蛋白、大豆蛋白或溶菌酶。

所述溶剂体系的溶剂为NaOH水溶液、乙醇水溶液或NaCl水溶液。

所述根据分散过程蛋白质在所述溶剂体系中的溶解情况是将蛋白质在所选溶剂体系进行超声辅助搅拌预分散，直至蛋白质加入到无法均匀分散，有明显析出，确定蛋白质在所述溶剂体系中的溶解情况。

式(3)的确定如下：本发明经过大量测试发现，发现标准方差s_i随蛋白质样品质量添加浓度由小到大呈一次指数增加趋势，可以采用修正指数方程拟合得方程(2)：确定方程(2)指数函数曲线上曲率最大点的浓度作为蛋白质的溶解度。在溶解度测定中，曲线上曲率的最大值处，表明蛋白质溶液的稳定性开始变差的速率越快。本发明方程(2)为指数函数，在数学上表明曲线在某一点的弯曲程度的数值。曲率越大，表示曲线的弯曲程度越大。根据指数函数性质，可以假定方程(2)的函数曲线如图6所示，设图6的曲线C是光滑的，曲线C上从点M到M'的弧为Δs，切线的转角为Δα，则称为弧段M M'的平均曲率，而为曲线C在M点处的曲率。在存在的条件下 $K=\frac{\mathrm{d\α}}{\mathrm{ds}}.$

一般地，可设方程(2)的指数函数直角坐标方程是y＝f(x)，且f(x)具有二阶导数，因为tanα＝y′，所以

${\sec }^2\mathrm{\α}\frac{\mathrm{d\α}}{\mathrm{dx}}=y^{\′\′},\frac{\mathrm{d\α}}{\mathrm{dx}}=\frac{y^{\′\′}}{1+{\tan }^2\mathrm{\α}}=\frac{y^{\′\′}}{1+y^{\′2}}$

于是 $\mathrm{d\α}=\frac{y^{\′\′}}{{1+y}^{\′2}}\mathrm{dx},$ 又由弧微分方程可知： $\mathrm{dx}=\sqrt{{1+y}^{\′2}}\mathrm{dx},$ 故：

$K=\frac{\left|y^{\′\′}\right|}{{\left({1+y}^{\′2}\right)}^{3/2}}$

曲线函数方程存在二阶导数和曲率最大点，因此该修正指数函数的曲率K如下：

$K=\frac{\frac{n}{t^2}\·e^{(c_i^{\mathrm{add}}/t)}}{{\{1+{[\frac{n}{e}\·e^{(c_i^{\mathrm{add}}/t)}]}^2\}}^{3/2}}$

该方程存在曲率最大点，则其一阶导数存在一值使K'＝0，故：

若K'＝0，则 $1-2\frac{n^2}{t^2}{e}^{2(c_i^{\mathrm{add}}/t)}=0,$ 得 $c=\left|t\right|\ln \left|\frac{t}{\sqrt{2}n}\right|---\left(3\right)$

相对于现有技术，本发明具有如下优点：

(1)从整个过程来看，本发明只涉及到超声分散、差速离心和光谱测定，比传统的测定PDI、NSI值的方法简便、易行，不需要搭建特殊装置，只涉及到以上常规制样和测试方法，且每一步所费时间较少。

(2)从分析方法来看，采用测定蛋白质胶体经差速离心后离心液中的浓度，确定各离心液中蛋白质浓度标准方差的变化趋势指数方程，该方程曲率最大点处对应的蛋白质浓度即为蛋白质在该条件下的溶解度，属首创，且简便、易行。

(3)从应用前景来看，该测定蛋白质溶解度的方法有诸多优点，将来可用于各种蛋白质溶解度的测定，以便更好的应用在蛋白质的提取、分离、纯化和改性，蛋白质变性的程度的判定等领域。

附图说明

图1为蛋白质相图。

图2为实施例1中Zein的的标准方差(s)随着初始添加量增加的变化曲线。

图3为实施例2中Soy Protein(SP)的的标准方差(s)随着初始添加量增加的变化曲线。

图4为实施例3中lysozyme(Ly)的的标准方差(s)随着初始添加量增加的变化曲线。

图5为不同方法测定的lysozyme(Ly)在pH为6.5、温度为18℃条件下的溶解度曲线。

图6为本发明方程(2)的曲率计算图。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步介绍。本发明的实施例分别是以玉米醇溶蛋白(Zein)溶于NaOH水溶液、溶菌酶(Lysozyme)溶于pH为6.56的NaCl水溶液及大豆蛋白(Soy Protein)溶于乙醇水溶液，其中Zein不溶于水，溶菌酶和大豆蛋白溶于水，NaCl能使蛋白质的溶解度降低。但需要说明的是，本发明所要求的保护的范围并不局限于下面实施例所表述的蛋白质和溶剂范围。

实施例1

第一步：建立蛋白质浓度标准曲线：称取0.01g，0.02g，0.03g，0.04g，0.05g，0.06g，0.07g，0.08g，0.09g，0.1g玉米醇溶蛋白(Zein)，分别分散于10个盛有50ml浓度为8g/L的NaOH水溶液的烧杯中，将该10个样品利用紫外技术测量其吸光度，得到其标准曲线为：y＝19.32x+0.024。其中，特征吸收峰为293nm，相关系数R²＝0.999，y代表样品溶液的吸光度(无量纲)；x代表蛋白质样品的质量浓度，单位为g/L。

第二步：蛋白质预分散：向50ml 8g/L的NaOH溶液中加入1g Zein，先以300r/min的搅拌速度分散10分钟，并在超声中分散5分钟，然后再次以300r/min的搅拌速度分散10分钟，看蛋白质的分散情况，若没有明显沉淀，再次加入1g Zein，并重复上述操作，直到沉淀明显出现为止；观察发现，当加入2g时，溶液有明显的颗粒存在；

第三步：蛋白质分散样品的制备：在20℃，200r/min的搅拌条件下，称取0.2g，0.4g，0.6g，0.8g，1.0g，1.2g，1.4g，1.6g，1.8g，2.0g Zein，分别分散于10只盛有50ml、8g/L NaOH水溶液的烧杯中，所得溶液浓度用表示(i取1～10的整数，代表0.2g～2.0g Zein)，并超声5min，形成均一分散体；

第四步：差速离心：将第三步中0.2g/50ml的样品溶液均匀倒入6个10ml离心管中，每个离心管约7ml溶液，分别选取500r/min，1000r/min，1500r/min，2000r/min，2500r/min，3000r/min 6个离心速度进行离心。步骤三中0.4～2.0g/50ml样品溶液也做如上处理，则6个离心速度下每个离心速度都有10个样品，共60个样品，分成6组，每组样品离心10分钟。

第五步：样品蛋白质浓度的光谱测定：将步骤四中离心后的溶液用移液管取出0.5ml，加入9.5ml水溶液进行稀释20倍，采用紫外测量其吸光度A，将A代入标准曲线方程式，计算其离心后各个样品的质量浓度

第六步：蛋白质溶解度的计算。Zein的加入量相对应及每行的标准方差s见表1，将样品初始添加质量浓度按由小到大的顺序纵行排列，离心速度j按由小到大的顺序横向排列，将每个样品的值填入对应表格，并采用式(1)计算每行的标准方差s。

将表1中zein的初始添加浓度作为x轴，每行的标准方差s作为y轴，对数据采用式(2)进行拟合，得到的曲线方程为R²＝0.8924，附图2是其对应的s和关系曲线。将n、t代入式(3)，得c＝48.74g/L，即Zein在该溶剂体系中的溶解度为48.74g/L。

表1.Zein的初始添加量和不同离心速度下每行值的标准方差s

实施例2

第一步：称取0.01g，0.02g，0.03g，0.04g，0.05g，0.06g，0.07g，0.08g，0.09g，0.1g SP，分别分散于10只盛有50ml浓度为60％乙醇水溶液的烧杯中，将该10个样品利用紫外技术测量其吸光度，得到其标准曲线为：y＝6.239x+0.005。其中：R²＝0.9982，特征吸收峰为247nm，其中y代表样品溶液的吸光度，－；x代表加入的蛋白质样品的质量浓度，单位为g/L。

第二步：蛋白质预分散：向50ml 60％乙醇水溶液中加入1g SP，先以300r/min的搅拌速度分散10分钟，并在超声中分散5分钟，然后再次以300r/min的搅拌速度分散10分钟，看蛋白质的分散情况，若没有明显沉淀，再次加入1g SP，并重复上述操作，直到沉淀明显出现为止；观察发现，当加入2g时，溶液有明显的颗粒存在；

第三步：在20℃，200r/min的搅拌条件下，称取0.2g，0.4g，0.6g，0.8g，1.0g，1.2g，1.4g，1.6g，1.8g SP分别分散于9只盛有50ml60％乙醇水溶液的烧杯中，所得溶液浓度用表示(i取1～10的整数，代表0.2g～1.8g SP)，并超声5min，形成均一分散体；并超声5min，直至形成均一分散体；

第四步：差速离心：将步骤三中0.2g/50ml的样品溶液均匀倒入6个10ml离心管中，分别选取500r/min，1000r/min，1500r/min，2000r/min，2500r/min，3000r/min 6个离心速度进行离心。步骤三中0.4‐1.8g/50ml样品溶液也做如上处理，则6个离心速度下每个离心速度都有10个样品，共60个样品，分成6组，每组样品离心10分钟。

第五步：样品蛋白质浓度的光谱测定：将步骤四中离心后的溶液用移液管取出0.5ml，加入9.5ml水溶液进行稀释20倍，采用紫外测量其吸光度A，将A代入标准曲线方程式，计算其离心后各个样品的质量浓度

第六步：蛋白质溶解度的计算：SP的加入量相对应及每行的标准方差s见表2，将样品初始添加质量浓度按由小到大的顺序纵行排列，离心速度j按由小到大的顺序横向排列，将每个样品的值填入对应表格，并采用式(1)计算每行的标准方差s。

将表2中SP的初始添加浓度作为x轴，每行的标准方差s作为y轴，对数据采用式(2)进行拟合，得到的曲线指数方程为其中R²＝0.9268，附图3是其对应的s和关系曲线。将n和t代入溶解度方程式(3)，得：c＝50.76g/L，即大豆蛋白在该溶剂体系中的溶解度为50.76g/L。

表2.SP的初始添加量和不同离心速度下每行值的标准方差s

实施例3

第一步：建立蛋白质浓度标准曲线：称取0.01g，0.02g，0.03g，0.04g，0.05g，0.06g，0.07g，0.08g，0.09g，0.1g Ly样品，分别溶入10只盛有50ml H₂O的烧杯中，将该10个样品用近红外光谱法测量其浓度，得到标准曲线方程为：y＝18.92x+0.1043。其中：R²＝0.9915，特征吸收光谱为250nm，y代表样品的峰值高度，－；x代表加入的蛋白质样品的质量浓度，单位为g/L。

第二步：蛋白质预分散：向0.4M的NaCl水溶液中加入1g Ly，先以300r/min的搅拌速度分散10分钟，并在超声中分散5分钟，然后再次以300r/min的搅拌速度分散10分钟，看蛋白质的分散情况，若没有明显沉淀，再次加入1g Ly，并重复上述操作，直到沉淀明显出现为止；观察发现，当加入2g时，溶液有明显的颗粒存在；

第三步：蛋白质分散样品的制备：在20℃，200r/min的搅拌条件下，称取0.2g，0.3g，0.4g，0.6g，0.7g，0.8g，1.0g，1.2g Ly分别分散于8只盛有50ml 0.4M的NaCl水溶液的烧杯中，所得溶液浓度用表示(i取1～10的整数，代表0.2g～1.8g Ly)，并超声5min，形成均一分散体；并超声5min，直至形成均一分散体；

第四步：差速离心：将步骤三中0.2g/50ml的样品溶液均匀倒入6个10ml离心管中，分别选取500r/min，1000r/min，1500r/min，2000r/min，2500r/min，3000r/min 6个离心速度进行离心。步骤三中0.3‐1.2g/50ml样品溶液也做如上处理，则6个离心速度下每个离心速度都有10个样品，共60个样品，分成6组，每组样品离心10分钟。

第五步：样品蛋白质浓度的光谱测定：将步骤四中离心后的溶液用移液管取出0.5ml，加入9.5ml水溶液进行稀释20倍，采用紫外测量其吸光度A，将A代入标准曲线方程式(9)，计算其离心后各个样品的质量浓度计算公式为：

$c_i^j=(A-0.1043)/18.92\×20---\left(10\right)$

第六步：蛋白质溶解度的计算：Ly的加入量相对应及每行的标准方差s见表3。将样品初始添加质量浓度按由小到大的顺序纵行排列，离心速度j按由小到大的顺序横向排列，将每个样品的值填入对应表格，并由式(1)计算每行的标准方差s。

将表3中Ly的初始添加浓度作为x轴，每行的标准方差s作为y轴，对数据采用式(1)进行拟合，得到的曲线指数方程为其中R²＝0.9196，附图4是其对应的s和关系曲线。将n和t代入溶解度方程式(2)，得：c＝50.29g/L，即大豆蛋白在该溶剂体系中的溶解度为50.29g/L。

表3.Ly的初始添加量和不同离心速度下每行值的标准方差s

实施例效果验证

附图5是在pH＝6.5、18℃条件下，用本发明(图5中黑色三角形，实施例3得到的))、Berg等(图5中黑色方块，Automated measurement of apparent protein solubility to rapidlyassess complex parameter interactions[J].Food and Bioproducts Processing.2014,92(2),133‐142)；)和Forsythe E L等(图5中黑色圆形，Tetragonal chicken egg white lysozymesolubility in sodium chloride solutions[J].Journal of Chemical&Engineering Data,1999,44(3):637‐640)的三种方法测定lysozyme溶解度的实验数据对比。蛋白质溶解的相图见附图1(Berg等)，该相图有三条线，三条线从下而上分别为溶解度曲线、稳定度曲线和沉淀曲线，将相图分为四个区域，即不饱和区、亚稳区、不稳定区和沉淀区。Berg等(黑色方块)测定的溶菌酶溶解度曲线实际上是相图中的沉淀曲线；Forsythe E L等(黑色圆形)测得的溶菌酶溶解度曲线实际上是相图中的溶解度曲线；本发明是依据蛋白质在溶剂中的稳定度来确定蛋白质溶解度，故所测得的是相图中的稳定度曲线，该曲线比沉淀曲线数据准确，同时比Berg等(黑色方块)的方法用时少很多。可见，本发明较简便快捷，测得的蛋白质溶解度数据误差较小、较稳定。

Claims (5)

1.基于超声分散、差速离心和光谱技术测定蛋白质溶解度的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)建立蛋白质浓度标准曲线：将蛋白质溶入溶剂体系中，采用光谱技术测量其浓度，建立蛋白质浓度的标准曲线y＝ax+b，其中y代表特征吸收峰值，x代表蛋白质浓度；a、b分别为标准曲线的斜率和截距，由标准曲线待定系数法确定；

(2)蛋白质分散样品的制备：根据分散过程蛋白质在所述溶剂体系中的溶解情况，从小到大等质量间隔称取蛋白质样品7～10个，样品质量分别记为m₁、m₂、…m_i，其中i＝7～10，每个蛋白质样本分别置于体积为V溶剂中，得到相应质量添加浓度为的样品；将i个样品置于超声场中，在温度为10～60℃，搅拌速度为100～500r/min的条件下搅拌分散，形成均一的胶体分散体系；

(3)差速离心：离心速度0～3000r/min之间等转速间隔取j个点，j＝6～10，将步骤(2)得到的各样品在选定的j个速度下离心，得到(7～10)×(6～10)个样品；

(4)样品蛋白质浓度的光谱测定：分别取步骤(3)离心后得到的上清液，稀释到步骤(1)标准曲线的蛋白质浓度范围内，采用光谱技术测量其特征吸收峰值，代入步骤(1)中标准曲线方程，计算离心后分散体系中各样品对应的质量浓度

(5)蛋白质溶解度的计算：将蛋白质样品质量添加浓度按由小到大的顺序纵行排列，离心速度j按由小到大的顺序横向排列，根据步骤(4)中在不同离心速度下离心后每个样品对应的质量浓度求出每行的标准方差s_i，s_i由式(1)计算：

$s_i=\sqrt{\frac{\underset{j=1}{\overset{j}{\mathrm{\Σ}}}{(c_i^j-\stackrel{\‾}{c_i^j})}^2}{j}}---\left(1\right)$

式(1)中：标准方差s_i随蛋白质样品质量添加浓度由小到大呈一次指数增加趋势，采用修正指数方程拟合得方程(2)：

$s_i=\mathrm{nexp}(c_i^{\mathrm{add}}/t)---\left(2\right)$

式(2)中n、t为指数方程系数，由拟合方程待定系数法确定；根据指数方程特征，式(2)存在曲率最大点，曲率最大点为s_i变化速率最大处，表示该蛋白质胶体分散体系稳定性恶化最快点，曲率最大点对应的浓度由式(3)得出，为蛋白质的溶解度：

$c=\left|t\right|\ln \left|\frac{t}{\sqrt{2}n}\right|---\left(3\right).$

2.根据权利要求1所述的基于超声分散、差速离心和光谱技术测定蛋白质溶解度的方法，其特征在于：步骤(2)中，体积V为50毫升。

3.根据权利要求1所述的基于超声分散、差速离心和光谱技术测定蛋白质溶解度的方法，其特征在于：所述蛋白质为玉米醇溶蛋白、大豆蛋白或溶菌酶。

4.据权利要求1所述的基于超声分散、差速离心和光谱技术测定蛋白质溶解度的方法，其特征在于：所述溶剂体系的溶剂为NaOH水溶液、乙醇水溶液或NaCl水溶液。

5.据权利要求1所述的基于超声分散、差速离心和光谱技术测定蛋白质溶解度的方法，其特征在于：所述根据分散过程蛋白质在所述溶剂体系中的溶解情况是将蛋白质在所选溶剂体系进行超声辅助搅拌预分散，直至蛋白质加入到无法均匀分散，有明显析出，确定蛋白质在所述溶剂体系中的溶解情况。