CN104611464B - 检测猪轮状病毒的lamp检测试剂盒 - Google Patents

检测猪轮状病毒的lamp检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测猪轮状病毒的试剂盒，它包括SEQ ID NO：1～4所示引物，用于环介导等温扩增猪轮状病毒的基因。本发明还公开了SEQ ID NO：1～4所示引物在制备检测猪轮状病毒的试剂中的用途。本发明检测试剂盒可以准确、有效的检测猪轮状病毒，且特异性强、灵敏度高、耗时短，检测快速，应用前景良好。

Description

检测猪轮状病毒的LAMP检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测猪轮状病毒的LAMP检测试剂盒。
背景技术
猪轮状病毒(PoRV)与小肠上皮细胞接触并定殖，大量上皮细胞被感染和破坏，小肠内的营养物质的吸收障碍。导致小肠内液体的滞留，小肠内渗透压增高，导致从机体组织中吸收液体，引起腹泻与脱水症状，死亡的最终原因可能是脱水、代谢性酸中毒和高血钾导致的心、肾功能衰竭。由猪轮状病毒(PoRV)引起的猪腹泻性在临床上比较少见，猪轮状病毒的感染发病的轻重与日龄的关系也不大，感染后常呈现水样或糊状腹泻，粪便颜色为黄白色或暗黑色，临床症状的轻重与发病日龄、环境条件及有无母源抗体保护有关。若有母源抗体的，一般不易感染发病或临床症状轻微，死亡率较低；若环境温度低、继发致病性大肠杆菌感染或其它腹泻病毒的感染、无母源抗体保护，感染发病严重，死亡率增高。
传统的检测方法如病毒分离鉴定和血清检查，往往耗时过长。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是众多核苷酸扩增技术(the nucleic acid amplifications tests，NATs)中的一种。自从Notomi等研究者于2000年公布该技术以来，该技术已经被广泛地应用于生命科学领域，其中就包括对病原体感染的检测。当研究者将该技术应用于检测各种病原体的同时，也对该技术提出了很多的改进，使得该技术逐步完善，能够成功地被应用于如疟疾、锥虫病、泰勒尔梨浆虫病和巴贝虫病等疾病病原体的检测。LAMP核酸扩增是在等温条件下进行的，不需要特殊的仪器，可以肉眼观察结果，操作简单。
公开号103451315A的专利申请也公开了采用RT-LAMP检测猪轮状病毒的方法，其能够检测的猪轮状病毒的最低检测限为10pg/μl。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种特异性强、灵敏度高的可检测猪轮状病毒的试剂盒。
本发明检测猪轮状病毒的试剂盒，它包括SEQ ID NO：1～4所示引物，特异扩增猪轮状病毒的基因。
其中，所述试剂盒还包括SEQ ID NO：5所示的基因片段。
本发明还提供了SEQ ID NO：1～4所示引物在扩增猪猪轮状病毒的基因中的用途。
本发明还提供了SEQ ID NO：1～4所示引物在制备检测猪轮状病毒的试剂中的用途。
其中，所述检测猪轮状病毒的试剂是环介导等温扩增猪轮状病毒的基因的试剂。
其中，所述试剂还包括SEQ ID NO：5所示的基因片段。
本发明设计的两对引物，用LAMP技术可以特异有效地扩增猪轮状病毒的基因，病毒的最低检测浓度为8.38×10-5pg/uL，最低检测限比现有方法低了5个数量级，灵敏度高，且特异性强，耗时短，检测快速，具有良好的应用前景。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1 dNTPs对LAMP的影响。M:DL2000DNA Marker；泳道1-7依次对应dNTPs的剂量为:0.5、1.0μL、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5μL。
图2 MgSO4对LAMP的影响。M:DL2000DNA Marker；泳道1-7依次对应MgSO4的剂量为:0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μL。
图3 Bst DNA聚合酶对LAMP的影响。M:DL2000DNA Marker；泳道1-8依次对应Bst大片段DNA聚合酶的剂量为:0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4μL。
图4甜菜碱对LAMP的影响。M:DL2000DNA Marker；泳道1-7依次对应甜菜碱的剂量为:0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μL。
图5反应温度对LAMP的影响。M:DL2000DNA Marker；泳道1-8依次对应反应温度为:58、59、60、61、62、63、64、65℃。
图6内引物浓度对LAMP反应的影响。M:DL2000DNA Marker；泳道1-6依次对应内引物浓度的剂量为:0、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6μL。
图7引物对反应时间的影响。M:DL2000DNA Marker,泳道1-6依次对应不加环引物不同反应时间为：15min、30min、45min、60min、75min、90min.。
图8 AMV反转录酶对RT-LAMP的影响。M:DL2000DNA Marker；泳道1-6依次对应AMV反转录酶的剂量为:0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0μL。
图9特异性试验，电泳图谱。M:DL2000DNA Marker；1-8:RT-LAMP法扩增的EDV、TGEV、PoRV、CSFV、PRRSV、JEV、PRV和阴性对照的琼脂糖凝胶电泳结果，RT-LAMP反应管由gene genius生物成像系统照相
图10 RT-LAMP灵敏度试验，电泳图谱。M,Marker DL 2000；1-9:使用101-109稀释的阳性RNA模板的RT-LAMP法的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果；10：阴性对照。
具体实施方式
一、实验材料和仪器
病毒及主要试剂与材料
猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒(OSU株)、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、乙型脑炎病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、购自中国兽药监察所或本实验室保存。大肠埃希菌DH5a，反转录试剂盒、T7体外转录试剂盒、限制性内切酶Nde Ⅰ、EcoR Ⅰ、Spe Ⅰ、DNAseⅠ等购自大连宝生物有限公司，质粒小量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒等购自Omega公司，RNA提取试剂盒、2×PCR Mix(含Taq DNA聚合酶、dNTPs、ddH2O、MgCl2)、dNTPs、DNA Marker琼脂糖等购自天根生化有限公司，pGEM T-Easy Vector System Ⅰ和AMV反转录酶购自Progema公司，Bst DNA Polymerase(Large Fragment)、10×ThermoPol Buffer、MgSO4等购自NEB公司，甜菜碱购自Sigma公司，Goldenview核酸染料购自北京赛百盛生物有限公司，钙黄绿素荧光染料购自广州迪澳生物科技有限公司，所设计的引物送至上海生物工程有限公司合成，50×TAE。
主要仪器设备
MyCyclerTM PCR仪、POWER Pac TM电泳仪及水平电泳槽、UNIVERSAL HOOD凝胶成像系统、SmartspecTM Plus核酸蛋白仪、移液枪，美国BIO-RAD公司产品；Legend Micro 17R centrifuge高速冷冻离心机、恒温振荡培养箱，美国Thermo公司产品；WaterPro Plus超纯水仪，美国LABCONCO公司产品；电子天平，恒温水浴锅。
实施例1本发明试剂盒的制备
1、材料和仪器
同前述实验材料和仪器。
2、实验方法
2.1引物和模板制备
2.1.1引物设计
设计PoRV的LAMP引物见表1。
引物如下：
2.1.2阳性模板制备
将目的基因片段(SEQ ID NO：5)
TAGTCGTACTTGCACCGCTCATTAAAGCTCAAAATTACGGAATTAATTTACCAATAACTGGATCTATGGATACGCCATATATGGATTCAACTACAAGTGAAACATTTTTGACTTCGACATTATGTCTATATTATCCAAATGAAGCAGCTACAGAAATTGCAGATACAAAATGGACAGAAACATTGTCGCAGTTGTTTTTAACAAAAGGATGGCCAACAGGGTCAGTTTATTTTAAAGGATATGCAGATATTGCGTCATTTTCTGTAGAACCGCAGTTATACTGCGACTATAATATTGTACTAATGAAATATGATGGAAATTTACAGTTAGACATGTCTGAATTGGCTGATTTAATATTGAATGAATGGCTATGTAATCCAATGGATATAATGCTATATTATTATCAGCAAACAGATGAAGCTAATAAATGGATATCAATGGGTACATCATGTACGATTAAAGTATGTCCTCTAAATACGCAGACTCTCGGGATAGGATGTTCGACTACAG
连接包含T7和SP6RNA聚合酶启动子的PGEM-T easy载体，连接体系参照Promega pGEM T-Easy Vector System I说明书反应体系见下表。
表1目的片段连接PGEM-T载体所需的试剂和用量
反应程序为：22℃孵育2h，4℃过夜。
2.2PoRV的RT-LAMP检测方法的建立
2.2.1反应条件及体系的优化
初步设定RT-LAMP反应条件为63℃反应60min，80℃反应10min的25μL反应体系中各组分及含量见下表，用去离子水补充至25μL。以所制备的阳性质粒为模板，按上述体系进行多组实验，所需优化的试剂预先购买和配制，并配成相应的浓度，在条件优化时方便加样，减少一定的工作量。dNTPs(10mmol/L)、MgSO4(100mmol/L)、甜菜碱(5mol/L)、Bst DNA聚合酶(8U/μL)、内引物FIP、BIP混合后的终浓度(25pmol/L)、外引物F3、B3混合后的终浓度(2.5pmol/L)、环引物LF、LB混合后的终浓度(12.5pmol/L)、AMV反转录酶浓度(10U/μL)，以上述试剂浓度优化反应体系的试剂用量和最佳反反应条件，以确定各个试剂最佳反应浓度。
由于肉眼分辨能力有限，若采用SYBR Green Ⅰ、钙黄绿素指示剂的颜色变化、浊度变化等不能准确判读反应的敏感性，所以本试验的条件优化根据琼脂糖凝胶电泳结果判定反应中各个体系的试剂最佳使用量。反应产物于20g/L的琼脂糖凝胶电泳进行分析，选出最佳反应条件。随着条件优化的进行，每次都是从多次重复试验中选定试剂最佳用量及最佳反应条件，进行下一条件优化时，选择上一次的最佳条件及试剂用量，以此类推直到最后一个条件及试剂用量优化完。
dNTPs最佳浓度的优化：分别加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5μL，从多次重复试验中选定最佳dNTP用量；MgSO4最佳浓度优化：分别加0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μL；Bst大片段DNA聚合酶最佳浓度优化：0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4μL；甜菜碱最佳浓度优化：分别加0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μL；最佳温度优化：分别为58、59、60、61、62、63、64、65℃；内引物浓度优化：分别加0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0μL最佳反应时间优化：分别为15、30、45、60、75、90min；AMV反转录酶最佳浓度优化：在以上优化结果试验的基础上，以所制备的病毒RNA模板进行AMV反转录酶优化，AMV反转录酶的范围设为0.1-0.7μL，以0.1μL递增。
2.2.2试剂盒的组装
2.2.2.1检测方法条件优化结果
包括10×T Buffer最佳PH值及用量，10mmol/L的dNTPs、100mmol/L的MgSO4、5pmol/L的外引物、50pmol/L的内引物、8U/μL的Bst大片段DNA聚合酶、5mol/L的甜菜碱、最佳温度、不加环引物反应时间、加环引物后的反应时间、10U/μL的AMV反转录酶的用量。
2.2.2.2试剂盒组装
在完成RT-LAMP反应体系及条件的优化后，重新进行所有试剂的重新购买与配制，按优化好的体系进行试剂盒的试剂的配制与组装。
3、实验结果
3.1dNTPs最佳浓度的优化
随着dNTPs量的增加，条带的亮度增加(图1)。本试验确定10mmol/L的dNTPs的最佳用量为1.5μL，反应终浓度为0.6mmol/L。
3.2MgSO4最佳浓度优化
本试验结果表明当Mg2+的用量超过1.5μL出现明显的抑制反应，扩增条带的亮度明显减弱，加入适量的Mg2+可以使酶达到最高的催化活性而不影响DNA的合成(图2)。根据本试验，确定100mmol/L的MgSO4的最佳用量为1μL，反应终浓度为4mmol/L。
3.3Bst大片段DNA聚合酶最佳浓度优化
电泳结果表明当酶用量高于0.6μL时其扩增产物并无明显增多(图3)，由于酶的价钱比较贵，所以本试验8U/μL的酶的用量选择0.8μL。
3.4甜菜碱最佳浓度优化
试验结果表明不加甜菜碱影响本次LAMP反应不扩增(图4)，本试验确定5mol/L的甜菜碱的用量为3μL，最佳反应浓度为0.6M。
3.5最佳温度优化
试验结果表明(图5)，LAMP在58-65℃均能进行反应，在62-65℃时的扩增反应的电泳条带无明显的区别，58-61℃的扩增反应的电泳条带相对较淡，本试验确定反应的温度为63℃以进行后续试验。
3.6内引物浓度优化
优化的结果表明，结果表明内引物在0.8-1.6μL都有较亮的扩增条带，随着用量增加，引物二聚体现象无明显变化，扩增条带的亮度增加(图6)。所以根据本试验，确定25pmol/L的内引物FIP、BIP的用量为1.2μL。
3.7时间优化
从试验电泳图(图7)可以看出，在30min就出现比较明显的条带，随着反就的进行，条带的亮度也越来越亮，所以本试验确定最佳反应时间为60min。
3.8AMV反转录酶最佳浓度优化
AMV反转录酶的用量为0和0.1是未出现扩增条带，随着用量增加，扩增的DNA也越大，但由于AMV反转录酶的价格昂贵(图8)。本试验确定10U/μL的AMV反转录酶的用量为0.5μL。
3.9试剂盒
根据上述结构，优选25μL反应体系中：
10mmol/L的dNTPs 1.5μL；
100mmol/L的MgSO4 1.0μL；
5pmol/L的外引物1μL；
50pmol/L的内引物0.6μL；
Bst大片段DNA聚合酶用量大于0.8μL；
5mol/L的甜菜碱3μL；
10U/μL的AMV反转录酶用量0.5μL；
10×T Buffer PH值为8.76，用量为3.0μL。
最佳温度63℃、反应时间60min。
加ddH2O补足至25μL。
实施例2特异性实验
一、试验方法
提取TGEV、PEDV、PoRV、CSFV、PRRSV、JEV和PRV的核酸，按实施例1定的最优条件进行RT-LAMP检测，检验其特异性，设DEPC处理水作为阴性对照。
二、结果
实验结果如图9所示，采用本发明方法检测，只有PoRV才有阳性结果，TGEV、PoRV、PEDV之间无交叉反应，琼脂糖凝胶电泳呈现梯状条带，反应产物于紫外灯下可见明显的绿色荧光反应，CSFV、PRRSV、JEV和PRV检测均为阴性，琼脂糖凝胶电泳无梯状条带，反应产物于紫外灯下无绿色荧光反应。
本发明方法只会检出PoRV病毒，不会检出其他病毒，说明本发明引物和试剂盒的特异性强。
实施例3灵敏度试验
一、试验方法
将所制备的阳性RNA模板用DEPC处理水稀释，分别调整PoRV的RNA浓度为1.5×108copies/μL，将模板10倍梯度稀释，按实施例1定的最优条件进行RT-LAMP检测，进行敏感性试验，同时以DEPC处理水作为阴性对照。
二、结果
如图10所示，对10倍梯度稀释的阳性RNA模板进行检测表明，1-6泳道均有明显的梯状条带及反应产物在紫外灯下有明显绿色荧光反应，PoRV的RT-LAMP可以检测到106倍稀释的所制备的阳性RNA模板，约150copies/μL的样本。
实验结果说明，采用本发明试剂盒检测PoRV的最低检测浓度为150copies/μL，8.38×10-5pg/uL，灵敏度高。
实施例4临床检测
1、实验方法
取送检的31份腹泻临床病料，按实施例1的最优条件进行RT-LAMP方法进行检测，样品信息见下表：
表2样品统计表
2、实验结果
如下表3所示：
表3床样品检测结果
送检地 检测份数 结果R+
绵阳 5 0
茂县 4 0
射洪 5 0
蒲江 4 4
乐山 5 0
大邑 4 0
安岳 4 0
总数 31 4
31份临床样品中，4份PoRV阳性。
实验结果说明，本发明试剂盒可用于临床检测。
综上，本发明试剂盒可以同时检测猪轮状病毒，特异性强、灵敏度高、耗时短，检测快速，具有良好的应用前景。

Claims (3)

1.一种检测猪轮状病毒的试剂盒，其特征在于：它包括SEQ ID NO：1～4所示引物，用于环介导等温扩增猪轮状病毒的基因。
2.SEQ ID NO：1～4所示引物在制备检测猪轮状病毒的试剂中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述检测猪轮状病毒的试剂是环介导等温扩增猪轮状病毒的基因的试剂。
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CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20170111

Termination date: 20180204

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