CN104610444A - 一种glp-1衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种GLP-1衍生物。本发明还公开了上述GLP-1衍生物的制备方法和应用，所述衍生物为在相对于序列GLP-1(7-37)第i和i+7的位置上的氨基酸用Cys替换，其中i的取值为13，14，15，16，17，18，20，23，24，27，然后通过连接臂成环后形成的化合物。本发明制备的GLP-1衍生物具有长于天然GLP-1的体内降糖时间，特别适于在制备治疗糖尿病的药物中作为该药物的活性成分。
Description
技术领域
本发明涉及治疗性多肽领域，具体涉及新型长效GLP-1衍生物及其制备方法，同时还涉及这些衍生物的医疗用途。
背景技术
胰高血糖素样肽-1(Glucagon-Like Peptide 1，GLP-1)是由人胰高血糖素基因编码，并由肠道L细胞分泌的一种肽类激素，其具有以下重要生理作用：以葡萄糖依赖方式作用于胰岛β细胞，促进胰岛素基因的转录，增加胰岛素的生物合成和分泌；刺激β细胞的增殖和分化，抑制β细胞凋亡，从而增加胰岛β细胞数量，抑制胰高血糖素的分泌，抑制食欲及摄食，延缓胃内容物排空等。这些功能都有利于降低餐后血糖并使血糖维持在恒定水平。
GLP-1可用于II型糖尿病的治疗。GLP-1对血糖的调节作用主要通过环磷酸腺苷-蛋白激酶A(cAMP-PKA)途径实现。GLP-1与β细胞上特异受体结合，通过G蛋白激活腺苷酸活化酶(AC)，使细胞内cAMP水平升高，增加胰岛素的生物合成和释放，抑制胰高血糖素的分泌。当血糖浓度的升高时，通过与GLP-1受体高度特异性的结合，刺激胰岛素分泌，使血糖维持在恒定水平。而在生理条件下，GLP-1刺激胰岛素分泌的作用依赖于血糖浓度，因此可以避免传统降糖药物产生的严重低血糖危险。此外，与传统降糖药物相比，GLP-1只在血糖浓度升高时才刺激β细胞分泌胰岛素，因此GLP-1另一显著的功能是保护β细胞。另外，随着对GLP-1研究的不断深入，发现GLP-1对患者还具有抑制食欲、减轻体重及保护神经元等优点。
GLP-1由30或31个氨基酸残基组成，有GLP-1(7-36)amide和GLP-1(7-37)两种亚型，其结构式分别为：
GLP-1(7-36)amide：
His-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-NH2
GLP-1(7-37)：
His-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-Gly
GLP-1作为完全人源化多肽，作为临床药物在安全性上具有较大优势。然而，人体产生的GLP-1很不稳定，在体内很快由DPP-4降解失活，半衰期不足2分钟。因此若使用天然GLP-1降低血糖，需要持续静脉注射给药，临床使用上非常不方便。为了解决这一问题，目前已有许多研究，通过对GLP-1进行结构改造，来延长其在体内的药效作用时间。如诺和诺德公司研发的利拉鲁肽(Liraglutide)是将GLP-1(7-37)的26位的赖氨酸处连接一个16碳脂肪酸侧链，同时将34位赖氨酸突变为精氨酸，其血浆半衰期超过10小时；罗氏公司研发的Taspoglutide是以氨基异丁基替代Ala8和Gly35残基的GLP-1类似物，一周一次用药，耐受性良好；加拿大Conjuchem公司研发的CJC-1131，是用D-Ala取代GLP-1的N端第2位的L-Ala8，并通过Lys34侧链氨基上的接头分子与血浆白蛋白形成复合物，其经注射给药的半衰期达15-19天。
虽然通过对GLP-1的序列进行改造能够延长药效作用时间，但是改造后分子往往存在药效降低、副作用增加等问题，因而需要开发能够有效延长药效时间，同时具有更好的活性与疗效的新的GLP-1衍生物。
通过对GLP-1与GLP-1R的结合方式与结合位点的研究表明，GLP-1序列从Thr13到Val33形成一段两亲性α-螺旋结构，位于疏水面的Phe28、Ile29、Leu32、Val33与GLP-1R的疏水空腔相互作用，Lys26通过氢键与GLP-1R上Glu128侧链相互作用，这些氨基酸残基是重要的活性位点。GLP-1这种α-螺旋结构对于保持其生物活性极为重要。然而化学合成的多肽通常都是一段无序的结构，很难保持其在生理条件下的二级结构。因此，通过发展合适的化学修饰方法，来稳定合成多肽的α-螺旋结构，一方面可以增强其与受体的亲和力，另一方面，还能大幅提升多肽的抗蛋白水解能力，这种方法在多肽药物改造方面具有重要的潜在应用价值。通常可以通过在多肽序列合适的位置侧链成环的方式来稳定多肽的α-螺旋结构，侧链一般在多肽α-螺旋的同一面上，侧链氨基酸的位置一般为i/i+3，i/i+4，i/i+7，i/i+11等，其中应用较多的是i/i+4和i/i+7。
本发明以GLP-1(7-37)为模板，通过用Cys替换i/i+7位置上的氨基酸，然后通过连接臂侧链成环的策略，来稳定GLP-1(7-37)的α-螺旋结构。通过这种方法得到的GLP-1衍生物，在保留良好的体内降糖活性的同时，解决了天然GLP-1体内半衰期短的问题，这种GLP-1衍生物在治疗和预防糖尿病的药物中具有更大的应用潜力。
发明内容
本发明的一个目的是针对临床上GLP-1及其类似物在体内半衰期短，需要频繁注射给药的缺陷，提供一种作用时间更长、疗效更好的GLP-1衍生物。
本发明的另一个目的是提供该GLP-1衍生物的制备方法。
本发明的又一个目的是提供该GLP-1衍生物在治疗/预防糖尿病的药物中的应用。
用于实现上述目的的技术方案如下：
本发明提出了一种GLP-1衍生物，所述衍生物为在相对于序列GLP-1(7-37)第i和i+7的位置上的氨基酸用Cys替换，然后通过连接臂(linker)成环后形成的化合物，其中i的取值为13，14，15，16，17，18，，20，23，24，27，所述连接臂(linker)选自化学式1-4：
化学式1：
化学式2：
化学式3：
化学式4：
当i＝13时，GLP-1衍生物的结构如式(I)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的GLP-1衍生物记为Ia；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的GLP-1衍生物记为Ib；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的GLP-1衍生物记为Ic；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的GLP-1衍生物记为Id；
当i＝14时，GLP-1衍生物的结构如式(II)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的GLP-1衍生物记为IIa；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的GLP-1衍生物记为IIb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的GLP-1衍生物记为IIc当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的GLP-1衍生物记为IId；
当i＝15时，GLP-1衍生物的结构如式(III)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的GLP-1衍生物记为IIIa；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的GLP-1衍生物记为IIIb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的GLP-1衍生物记为IIIc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的GLP-1衍生物记为IIId；
当i＝16时，GLP-1衍生物的结构如式(IV)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的GLP-1衍生物记为IVa；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的GLP-1衍生物记为IVb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的GLP-1衍生物记为IVc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的GLP-1衍生物记为IVd；
当i＝17时，GLP-1衍生物的结构如式(V)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的GLP-1衍生物记为Va；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的GLP-1衍生物记为Vb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的GLP-1衍生物记为Vc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的GLP-1衍生物记为Vd；
当i＝18时，GLP-1衍生物的结构如式(VI)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的GLP-1衍生物记为VIa；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的GLP-1衍生物记为VIb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的GLP-1衍生物记为VIc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的GLP-1衍生物记为VId；
当i＝20时，GLP-1衍生物的结构如式(VII)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的GLP-1衍生物记为VIIa；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的GLP-1衍生物记为VIIb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的GLP-1衍生物记为VIIc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的GLP-1衍生物记为VIId；
当i＝23时，GLP-1衍生物的结构如式(VIII)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的GLP-1衍生物记为VIIIa；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的GLP-1衍生物记为VIIIb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的GLP-1衍生物记为VIIIc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的GLP-1衍生物记为VIIId；
当i＝24时，GLP-1衍生物的结构如式(IX)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的GLP-1衍生物记为IXa；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的GLP-1衍生物记为IXb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的GLP-1衍生物记为IXc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的GLP-1衍生物记为IXd；
当i＝27时，GLP-1衍生物的结构如式(X)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的GLP-1衍生物记为Xa；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的GLP-1衍生物记为Xb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的GLP-1衍生物记为Xc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的GLP-1衍生物记为Xd；
本发明也提出了上述GLP-1衍生物的制备方法，包括以下步骤：
(1)相对于序列GLP-1(7-37)第i和i+7的位置上的氨基酸用Cys替换的线性多肽的固相合成；
(2)步骤(1)得到的Cys替换的线性多肽与连接臂反应成环，经HPLC纯化、冷冻干燥得到所述的GLP-1衍生物。
步骤(1)中，先将用于多肽合成的树脂置于固相反应器，再将带保护的氨基酸单体按照序列，从C端到N端依次偶联，合成带侧链保护基的线性多肽树脂，再经脱除保护基、切断树脂、HPLC纯化，得到第i和i+7的位置上的氨基酸用Cys替换的GLP-1线性多肽衍生物；所述的带保护的氨基酸单体选自于：Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Glu(0tBu)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-His(Trt)-OH；
步骤(2)中，将步骤(1)中得到的第i和i+7的位置上的氨基酸用Cys替换的GLP-1(7-37)线性多肽衍生物溶解于体积比为(0.1～10)∶1的乙腈-水的混合溶液中，调节pH值至7.5～8.5，然后加入5～10摩尔当量的连接臂，室温下反应0.5～4小时，经HPLC纯化、冷冻干燥得到GLP-1衍生物。
本发明还提出了上述GLP-1衍生物在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
具体实施方式
本发明包含但不局限于以下实施例。
试剂名称缩写：
DMF：N，N-二甲基甲酰胺
DCM：二氯甲烷
NMP：N-甲基吡咯烷酮
DIC：N，N’-二异丙基碳二亚胺
TFA：三氟乙酸
DIPEA：N，N’二异丙基乙胺
NMM：N-甲基吗啉
HOBt：1-羟基苯并三唑
HOAt：N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑
HOOBt：3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮
Cl-HOBt：6-氯-1-羟基苯并三氮唑
HBTU：苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯
HATU：2-7(偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯
PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
PyAOP：(3H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基磷六氟磷酸盐
PPTS：对甲苯磺酸吡啶盐
DMP：2，2-二甲氧基丙烷
EDT：1，2-乙二硫醇
PIP：哌啶
TIS：三异丙基硅烷
本发明中GLP-1衍生物的制备方法采用通常的Fmoc固相合成法合成：
实施例1：GLP-1衍生物Ia的合成
(1)合成Cys替换的线性多肽
称取1g替代度为0.6mmol/g的Wang树脂于固相反应器中，加入DCM溶胀20min，随后加入20％PIP/DMF溶液反应20min脱除Fmoc保护基，分别用DCM、MeOH与DMF洗涤多次，抽干。向固相反应器中加入Fmoc-Gly-OH(0.36g，1.2mmol)、HOBt(0.19g，1.44mmol)、DIC(0.23mL，1.44mmol)、DMF(5mL)，25℃反应1h。将树脂洗涤抽干，即得Fmoc-Gly-Wang树脂，测得树脂替代度为0.5mmol/g。向树脂中加入封闭试剂4mL(醋酸酐(mmol)∶DIPEA(mmol)＝1∶1)，反应2.5h，封闭剩余的氨基，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤。加入20％PIP/DMF溶液反应20min脱除Fmoc保护基，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤，得H-Gly-Wang树脂；
取1g上一步得到的H-Gly-Wang树脂于固相反应器中，加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH(0.97g，1.5mmol)、HOBt(0.24g，1.8mmol)、DIC(0.28mL，1.8mmol)、DMF(5mL)，30℃反应2h。偶联完成度可以使用Kaiser测试检测；检测通过后，用20％PIP/DMF溶液脱除Fmoc保护基5+15min，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤。以此方法依次偶联剩余的氨基酸，得到侧链全保护多肽树脂2.63g。
将此侧链全保护多肽树脂用20％PIP/DMF溶液5mL反应5min，DMF洗涤一次，再加入20％PIP/DMF溶液5mL反应15min，抽干，分别用DCM(1次)、MeOH(1次)与DMF(3次)洗涤，抽干；配置裂解液，其各组分体积比为TFA∶EDT∶苯甲醚∶苯甲硫醚∶水＝90∶2.5∶2.5∶2.5∶2.5；将裂解液加入固相反应器中，与脱除了N端保护基产物在室温下震荡反应2h后，将反应液注入乙醚中，沉淀，离心后收集白色固体沉淀，经HPLC纯化、冷冻干燥，即得Cys替换的线性多肽。
(2)合成GLP-1衍生物Ia
称取0.1g步骤(1)中得到的Cys替换的线性多肽，置于50mL圆底烧瓶中，加入8mL乙腈水溶液(乙腈∶水＝2∶1)溶解，用碳酸氢铵饱和溶液调节pH至8-9；将100mg溶解于3mL乙腈中的4，4’-二(溴甲基)二苯醚加入圆底烧瓶中，搅拌反应1h，加入0.3mL醋酸淬灭反应，得到的产物经HPLC分离纯化、冷冻干燥，得到GLP-1衍生物Ia。
实施例2：GLP-1衍生物IIIb的合成
(1)合成Cys替换的线性多肽
同实施例1步骤(1)，不同之处仅在于Cys替换的位置和氨基酸为Asp15和Gly22。
(2)合成GLP-1衍生物IIIb
称取0.1g步骤(1)中得到的Cys替换的线性多肽，置于50mL圆底烧瓶中，加入8mL乙腈水溶液(乙腈∶水＝2∶1)溶解，用碳酸氢铵饱和溶液调节pH至8-9；将150mg溶解于3mL乙腈中的4，4’-二(溴甲基)二苯胺加入圆底烧瓶中，搅拌反应1h，加入0.3mL醋酸淬灭反应，得到的产物经HPLC分离纯化、冷冻干燥，得到GLP-1衍生物IIIb。
实施例3：GLP-1衍生物IXc的合成
(1)合成Cys替换的线性多肽
同实施例1步骤(1)，不同之处仅在于Cys替换的位置和氨基酸为Ala24和Trp31。
(2)合成GLP-1衍生物IXc
称取0.1g步骤(1)中得到的Cys替换的线性多肽，置于50mL圆底烧瓶中，加入8mL乙腈水溶液(乙腈∶水＝2∶1)溶解，用碳酸氢铵饱和溶液调节pH至8-9；将120mg溶解于3mL乙腈中的N，N′-(oxybis(4，1-phenylene))bis-(2-bromoacetamide)加入圆底烧瓶中，搅拌反应0.5h，加入0.3mL醋酸淬灭反应，得到的产物经HPLC分离纯化、冷冻干燥，得到GLP-1衍生物IXc。
实施例4：GLP-1衍生物Xd的合成
(1)合成Cys替换的线性多肽
同实施例1步骤(1)，不同之处仅在于Cys替换的位置和氨基酸为Glu27和Lys34。
(2)合成GLP-1衍生物Xd
称取0.1g步骤(1)中得到的Cys替换的线性多肽，置于50mL圆底烧瓶中，加入8mL乙腈水溶液(乙腈∶水＝2∶1)溶解，用碳酸氢铵饱和溶液调节pH至8-9；将110mg溶解于3mL乙腈中的N，N′-(azanediylbis(4，1-phenylene))bis(2-bromoacetamide)加入圆底烧瓶中，搅拌反应0.5h，加入0.3mL醋酸淬灭反应，得到的产物经HPLC分离纯化、冷冻干燥，得到GLP-1衍生物Xd。
实验例5：GLP-1衍生物的体外活性实验
通过使用Perkin-Elmer的FlashPlateTM cAMP试剂盒，在由GLP-1(7-37)及本发明GLP-1衍生物刺激GLP-1R后测量cAMP的诱导来评估本发明GLP-1衍生物的体外活性。简要地说，将表达人GLP-1R(通过转染GLP-1R的cDNA和选择稳定克隆而产生的稳定细胞系)的CHO细胞以每孔4000个细胞接种于96孔微量滴定板，并在生长培养基中培育48h。移除生长培养基并用缓冲液(含有20mM HEPES，0.1％BSA，pH 7.4)洗涤细胞一次，在室温下，将细胞在含有浓度递增的测试化合物(浓度10-12到10-6M)、0.33mM IBMX和0.67mM R020-1724的缓冲液中孵育1h，然后细胞用1％的Triton X-100处理，产生的cAMP用Perkin-Elmer的FlashPlateTM cAMP试剂盒测量，EC50值用XLfit软件进行计算得到，结果如表1所示。
表1：GLP-1衍生物的体外活性实验
表1结果表明：N端环化修饰的GLP-1衍生物VIIIa、VIIIb、VIIIc、VIIId、IXa、IXb、IXc、IXd、Xa、Xb、Xc、Xd显示出更好的活性水平。
实验例6：GLP-1衍生物的体内降糖实验
为了考察GLP-1衍生物的体内降血糖效果，采用正常的B6小鼠腹腔注射受试药物后进行葡糖糖耐受实验，所选择的GLP-1衍生物为体外活性实验EC50值优于GLP-1(7-37)的化合物VIIIa、VIIIb、VIIIc、VIIId、IXa、IXb、IXc、IXd、Xa、Xb、Xc、Xd。
雄性B6小鼠(7-8周)分为14组，每组10只，禁食过夜12h。实验开始时，每组分别按2g/kg腹腔注射葡糖糖溶液和10nmol/kg的受试药物，此时记为零时刻。分别于30min、2h、4h、6h、12h进行尾静脉取雪，用血糖测试仪测定血糖浓度。为长时间观察GLP-1(7-37)和GLP-1衍生物的降血糖作用，在每次测量之前0.5h，重新注射一次葡萄糖(2g/kg小鼠体重)，以检验GLP-1(7-37)和GLP-1衍生物的降血糖作用。降糖率按如下公式计算：降糖率(％)＝(葡糖糖对照组血糖值-给药组血糖值)/葡糖糖对照组血糖值*100％。结果如表2所示。
表2 GLP-1(7-37)与GLP-1衍生物的体内降糖效果
表2结果表明：与葡糖糖对照组小鼠相比，给药后30min内，GLP-1衍生物与GLP-1(7-37)均能降低小鼠体内血糖水平，在给药4h以后，GLP-1衍生物组仍能有效降低血糖水平，而GLP-1(7-37)已基本失去降糖能力。GLP-1衍生物的有效降糖时间可达12h。由此可见，本发明提出的GLP-1衍生物表现出优于GLP-1(7-37)的药效时间，且较GLP-1(7-37)具有更强的降糖活性。
Claims (7)
1.一种GLP-1衍生物，所述衍生物为在相对于序列GLP-1(7-37)第i和i+7的位置上的氨基酸用Cys替换，然后通过连接臂(linker)成环后形成的化合物，其中i的取值为13，14，15，16，17，18，20，23，24，27，所述连接臂(linker)选自化学式1-4：
。
2.根据权利要求1所述的GLP-1衍生物，其特征在于：
当i＝13时，GLP-1衍生物的结构如式(I)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的GLP-1衍生物记为Ia；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的GLP-1衍生物记为Ib；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的GLP-1衍生物记为Ic；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的GLP-1衍生物记为Id；
当i＝14时，GLP-1衍生物的结构如式(II)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的GLP-1衍生物记为IIa；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的GLP-1衍生物记为IIb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的GLP-1衍生物记为IIc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的GLP-1衍生物记为IId；
当i＝15时，GLP-1衍生物的结构如式(III)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的GLP-1衍生物记为IIIa；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的GLP-1衍生物记为IIIb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的GLP-1衍生物记为IIIc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的GLP-1衍生物记为IIId；
当i＝16时，GLP-1衍生物的结构如式(IV)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的GLP-1衍生物记为IVa；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的GLP-1衍生物记为IVb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的GLP-1衍生物记为IVc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的GLP-1衍生物记为IVd；
当i＝17时，GLP-1衍生物的结构如式(V)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的GLP-1衍生物记为Va；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的GLP-1衍生物记为Vb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的GLP-1衍生物记为Vc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的GLP-1衍生物记为Vd；
当i＝18时，GLP-1衍生物的结构如式(VI)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的GLP-1衍生物记为VIa；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的GLP-1衍生物记为VIb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的GLP-1衍生物记为VIc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的GLP-1衍生物记为VId；
当i＝20时，GLP-1衍生物的结构如式(VII)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的GLP-1衍生物记为VIIa；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的GLP-1衍生物记为VIIb； 当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的GLP-1衍生物记为VIIc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的GLP-1衍生物记为VIId；
当i＝23时，GLP-1衍生物的结构如式(VIII)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的GLP-1衍生物记为VIIIa；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的GLP-1衍生物记为VIIIb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的GLP-1衍生物记为VIIIc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的GLP-1衍生物记为VIIId；
当i＝24时，GLP-1衍生物的结构如式(IX)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的GLP-1衍生物记为IXa；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的GLP-1衍生物记为IXb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的GLP-1衍生物记为IXc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的GLP-1衍生物记为IXd；
当i＝27时，GLP-1衍生物的结构如式(X)所示：
其中，当连接臂(linker)的结构为化学式1时，对应的GLP-1衍生物记为Xa；当连接臂(linker)的结构为化学式2时，对应的GLP-1衍生物记为Xb；当连接臂(linker)的结构为化学式3时，对应的GLP-1衍生物记为Xc；当连接臂(linker)的结构为化学式4时，对应的GLP-1衍生物记为Xd。
3.根据权利要求1所述的GLP-1衍生物的合成方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)相对于序列GLP-1(7-37)第i和i+7的位置上的氨基酸用Cys替换的线性多肽的固相合成；
(2)步骤(1)得到的Cys替换的线性多肽与连接臂反应成环，经HPLC纯化、冷冻干燥得到所述的GLP-1衍生物。
4.根据权利要求2所述的GLP-1衍生物的合成方法，其特征在于，步骤(1)中，先将用于多肽合成的树脂置于固相反应器，再将带保护的氨基酸单体按照权利要求1或2所述序列，从C端到N端依次偶联，合成带侧链保护基的线性多肽树脂，再经脱除保护基、切断树脂、HPLC纯化，得到第i和i+7的位置上的氨基酸用Cys替换的GLP-1线性多肽衍生物。
5.根据权利要求2所述的GLP-1衍生物的合成方法，其特征在于，步骤(2)中，将步骤(1)中得到的第i和i+7的位置上的氨基酸用Cys替换的GLP-1(7-37)线性多肽衍生物溶解于体积比为(0.1～10)∶1的乙腈-水的混合溶液中，调节pH值至7.5～8.5，然后加入5～10摩尔当量的连接臂，室温下反应0.5～4小时，经HPLC纯化、冷冻干燥得到GLP-1衍生物。
6.根据权利要求2所述的GLP-1衍生物的合成方法，所述的带保护的氨基酸单体选自于：Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH， Fmoc-His(Trt)-OH。
7.如权利要求1所述的GLP-1衍生物在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9931379B2 (en) * | 2015-10-30 | 2018-04-03 | The Research Foundation For The State University Of New York | Oxyntomodulin analogs and methods of making and using same |
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2015
- 2015-02-09 CN CN201510072230.3A patent/CN104610444A/zh active Pending
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