CN104596998A

CN104596998A - N端b型排尿利钠肽快速检测方法及相应的检测试剂盒

Info

Publication number: CN104596998A
Application number: CN201510057348.9A
Authority: CN
Inventors: 张伟; 卫君超; 郑东; 葛望舒
Original assignee: Shanghai Fenghui Medical Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Fenghui Medical Science And Technology Co Ltd
Priority date: 2015-02-04
Filing date: 2015-02-04
Publication date: 2015-05-06

Abstract

本发明涉及一种N端B型排尿利钠肽快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)：将内部带有染料的纳米级的感光微球、包被有活性分子的发光微球以及已标记生物素的活性分子以及待测样本混合，得到混合物；步骤(2)：对所述的混合物进行温育培养，具有免疫特性的各组分反应得到结合物；步骤(3)：采用激发光对所述的结合物进行照射后，所述的结合物发光，使用光子计数器进行测定，得到检测数值。本发明还提供了一种N端B型排尿利钠肽快速检测试剂盒。采用本发明的N端B型排尿利钠肽快速检测方法及检测试剂盒，检测结果稳定，准确率高、成本低，灵敏度高，精密性好，检测范围宽、适用临床推广。

Description

N端B型排尿利钠肽快速检测方法及相应的检测试剂盒

技术领域

本发明涉及体外诊断技术领域，特别涉及免疫测定，具体是指一种N端B型排尿利钠肽快速检测方法及相应的检测试剂盒。

背景技术

NT-proBNP全名氨基末端脑钠肽前体，有研究显示：心室功能障碍患者的NT-proBNP含量会升高，而且含量与心衰的严重程度直接相关(NYHA，纽约心脏协会分级)。

心脏不仅具有泵血功能，而且还是一个内分泌腺。目前为止，已经确认有两种多肽由心脏分泌通过心肌细胞拉伸进入血液循环，它们分别是心房利钠肽(ANP)和B型利钠肽(BNP)。ANP主要由心房分泌，而BNP由心室分泌的。在心衰患者中，由于心容量超负荷、心压升高会使血浆利钠肽水平升高。由于BNP主要由心室分泌，因此在诊断心室功能障碍时，相对ANP而言是个更为直接的标志物。

BNP是作为激素原合成的，称之为proBNP(BNP前体)。在受到心肌细胞的刺激后(例如，心肌细胞拉伸)，proBNP在蛋白酶作用下列解为NT-proBNP(氨基末端-proBNP或N端-proBNP)和生物活性激素BNP。两种多肽都释放进入血循环。NT-BNP生物半衰期是60-120分钟，相比生物半衰期仅为20分钟的BNP要长的多，因此检测NT-proBNP更有利于实验室操作。

NT-proBNP在临床应用领域较为广泛。其在医学上的价值正得到广泛验正和承认。现将其临床意义综述如下：

1、用于诊断各种类型心衰

从2005年开始ESC/AHA心衰防治指南将NT-proBNP加入作为诊治心衰标准之一。首先NT-proBNP<300pg/m1可以排除急性心衰的诊断，用于鉴别诊断急性呼吸困难的患者、急性心衰和肺部疾病。同时NT-proBNP与NYHA分级呈正相关，NYHA分级越高，NT-proBNP血浆值越高。但是在临床应用时，还需将年龄、性别、检测方法等影响NT-proBNP的因素考虑在内。NT-proBNP还可辅助筛选无症状的左室功能障碍患者，尤其是对那些存在发生左室功能障碍高危因素的患者，如糖尿病、新发心梗、终末期肾功能不全、使用葱环类化疗药物的患者。包括主动脉狭窄，肥厚型心肌病，限制型心肌病等引起的舒张性心功能不全也会使NT-proBNP值升高。右室功能障碍的疾病如原发性肺动脉高压，肺源性心脏病，肺栓塞等也导致NT-proBNP值升高，但是其升高的程度不及左室功能障碍的疾病。

NT-proBNP排除/诊断心衰的标准年龄<50岁，NT-proBNP值<450pg/m1心衰可能性高，300-450pg/m1时心衰可能性较低需结合其他临床表现诊断，<300pg/m1时可以排除心衰可能；年龄在50-75岁，NT-proBNP值<900pg/m1时心衰可能性高，300-900pg/m1时心衰可能性较低需结合其他临床表现诊断，<300pg/m1时可排除心衰可能；年龄>75岁，NT-proBNP值<1800pg/m1时心衰可能性高，300-1800pg/m1时心衰可能性较低需结合其他临床表现诊断，<300pg/m1时可排除心衰可能。当NT-proBNP值处于过度区时可结合其他临床表现，诊断心衰：无咳嗽症状；就诊期间服用髓伴利尿剂；阵发性夜间呼吸困难；颈静脉扩张。

2、指导心衰的治疗

NT-proBNP能帮助临床医生选择恰当地治疗心衰的药物和剂量。NT-proBNP升高的患者对ACEI更敏感有效，强剂量的ACEI可明显降低NT-proBNP值，改善预后。除此之外NT-proBNP也有助于判断某些心衰病人是否要选择手术治疗，如植入除颤器，心脏移植等。

3、判断心衰和心梗后新发心衰患者的预后

在慢性心衰的患者中，NT-proBNP值越高，预示预后发生各种原因死亡可能性大。急性心梗后，NT-proBNP升高高度提示左室发生重构，左室功能障碍，预后发生心衰、死亡等不良事件可能性大。且这些预测能力独立于年龄、NYHA心功能分级、及左室射血分数等其他因素。

4、NT-proBNP在治疗ACS中的应用，可用于冠心病的诊断。

NT-proBNP可以由心肌梗死区周围的未死亡心肌细胞甚至未发生缺血的心肌细胞分泌，因此可以早期敏感地预测心肌缺血的发生，尤其对于非ST段抬高心肌梗死(NSEMI)的患者，发生梗塞的血管越重要(如前降支等)，缺血程度越严重，NT-proBNP血浆值越高。但是由于NT-proBNP受到多种生理、病理因素的影响，诊断冠心病的特异性较差。

5、用于预测ACS预后

越来越多的临床随访发现，急性冠脉综合症的患者入院时NT-proBNP血浆水平升高与短期及长期预后转归均有密切的关系。包括STEM、NSTEMI、UA在内的ACS患者中，入院时NT-proBNP血浆值升高，4个月、6个月、1年、2年的新发心衰率，死亡率显著升高。并且NT-proBNP血浆值越高，ACS患者预后发生各种不良事件的机率越大。ACS症状出现至采集血样3h至72h左右之内的NT-proBNP值均能很好的预测1年死亡率。

6、用于指导ACS治疗

目前ACS治疗方法分为保守治疗和手术治疗。保守治疗包括抗血小板，稳定斑块，静脉溶栓，抗凝治疗等。而手术治疗主要包括PCI术和CABG术。目前研究认为对于高危ACS患者，早期手术治疗能明显改善预后，并且患者危险分级越高，手术治疗的有效性越显著。但由于手术治疗本身是一种侵入性的操作，因此对于低危ACS患者,手术将会增加治疗风险。

NT-proBNP可对ACS患者进行有效的危险分层，从而帮助临床医生选择最恰当的治疗方法，更好地降低预后不良事件发生率。研究将ACS患者根据NT-proBNP血浆值由低到高分为四组。NT-proBNP数值处于最高组的患者进行早期的手术治疗后，其预后死亡率明显下降；NT-proBNP数值处于中间两组的患者，是否行手术治疗其死亡率没有明显变化；NT-proBNP数值最低组中，进行手术治疗的患者较非手术治疗的患者死亡率增加。

7、用于判断ACS治疗的效果

NT-proBNP血浆水平会随着ACS患者预后危险性的下降而下降。有效的治疗后NT-proBNP血浆水平下降，预后不良事件发生率下降。如果PCI术后NT-proBNP值持续不降或持续升高可预示患者预后不佳。

NT-proBNP的检测方法市面上常见为电化学发光免疫分析法(ECLIA法)、酶免疫测定法(EIA法)和放射免疫分析法(RIA法)，近些年已有部分厂商引入了部分更为先进的检测方法，现有的方法存在着检测灵敏度低、精密性差等局限性。

所以需要提供一种新的NT-proBNP检测方法和试剂盒，以解决现有技术中的存在的问题。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述现有技术中的缺点，提供一种检测结果稳定，准确率高、成本低，灵敏度高，精密性好，检测范围宽、适用临床推广的N端B型排尿利钠肽快速检测方法及相应的检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种N端B型排尿利钠肽快速检测方法，其特点在于，包括以下步骤：

步骤(1)：将内部带有染料的纳米级的感光微球、包被有活性分子的发光微球以及已标记生物素的活性分子以及待测样本混合，得到混合物；

步骤(2)：对所述的混合物进行温育培养，具有免疫特性的各组分反应得到结合物；

步骤(3)：采用激发光对所述的结合物进行照射后，所述的结合物发光，使用光子计数器进行测定，得到检测数值。

较佳地，所述的活性分子为NT-proBNP抗体。

较佳地，所述的感光微球为填充了光敏氰基化合物的醛基感光微球。

较佳地，所述的发光微球为填充了稀土螯合物的醛基发光微球。

本发明第二方面提供了一种N端B型排尿利钠肽快速检测的试剂盒，包括连接了活性分子发光微球的第一试剂、主要成份为已标记生物素活性分子的第二试剂以及主要成份为感光微球的第三试剂。

采用本发明的N端B型排尿利钠肽快速检测方法及检测试剂盒，在均相条件下，将内部带有染料的感光微球(纳米级)、标记生物素的活性分子以及包被有活性分子并且内部带有发光化合物的发光微球(纳米级)的混合物作为试剂和检测样品混合。此时纳米感光微球与标记生物素的活性分子形成连接物再和包被有活性分子的纳米发光微球可迅速有效地捕捉待测样本中的靶分子，在近距离内，三者形成免疫夹心复合物。激发光照射后，纳米感光微球中的染料(光敏氰基化合物)被诱导激活，并释放高能态的活性氧离子(单线态氧)。该高能态的活性氧离子被近距离的纳米发光微球俘获，从而传递能量以激活所述发光微球中的发光化合物(稀土螯合物)。数微秒后，发光微球中的发光化合物将释放出高能级红光。用光子计数器测定这些高能级光子，并通过电脑将光子数换算为目标分子浓度，光子数的多少即精确地反映了目标分子的浓度。而当样本不含靶分子时，无法在近距离形成免疫夹心复合物，活性氧离子也无法传递至发光微球表面。活性氧离子在液相中迅速衰减，检测时则无光能级红光产生。其采用全液相的反应模式，液态均相的模式使各测试间的一致性更好，使产品具有更好的重复性与一致性。且免冲洗，避免反应中引入不必要的干扰物及其它不确定因素，使得检测结果更为稳定。可以快速诊断领域引入独特的化学发光技术，使整体检测性能更优。

附图说明

图1为本发明N端B型排尿利钠肽检测方法微球结合形成二聚体的原理图。

图2为本发明N端B型排尿利钠肽检测方法微球微粒未结合时的原理图。

图3为本发明单线态氧随微粒距离衰减时的曲线图。

图4为本发明实施例的检测结果与进口N端B型排尿利钠肽试剂盒检测结果的平行比较图。

图5为本发明实施例的N端B型排尿利钠肽快速检测的试剂盒的结构图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，下面对本发明的具体实施方法作进一步说明。

本实施例的检测方法的原理如图1～2所示，单线态氧随微粒距离衰减时的曲线图如图3所示。

在下述实施例中使用的原料、试剂、仪器来源如下：

缓冲液

NaHCO₃溶液的配方：

原料名称	标准用量(1L)
		碳酸氢钠	8.410g
纯化水	定容至1000ml

CB(pH9.6)缓冲液(0.05M)

原料名称	标准用量(1L)
		碳酸钠	1.540g
碳酸氢钠	2.940g
		纯化水	定容至1000ml

Tris缓冲液的配方：

试剂名称	标准用量(1L)
		Tris	6.000g
Proclin-300	0.500ml
		Tween20	5.000g
BSA	5.000g
		纯化水	定容至1000ml

MES缓冲液的配方：

试剂名称	标准用量(1L)
		MES	10.660g
NaCl	2.922g
		纯化水	定容至1000ml

发光微粒缓冲液配方：

试剂名称	标准用量(1L)
		碳酸钠	1.540g
碳酸氢钠	2.940g
		NaCl	17.532g
BSA	2.000g
		Dextran	1.000g
TritronX-405	1.000g
		Proclin	0.5ml
纯化水	定容至1000ml

生物素化抗体缓冲液配方：

原料名称	标准用量(1L)
		EDTA-NA-2H₂O	1.860g
Tris	12.110g
		BSA	5.000g
Proclin	0.5ml
		NaCl	17.532g
纯化水	定容至1000ml

感光微粒缓冲液配方：

试剂名称	标准用量(1L)
		HEPES	11.915g
NaCl	17.532g
		EDTA-Na-2H₂O	9.306g
Dextran	1.000g
		TritronX-405	1.000g
Proclin	0.5ml
		纯化水	定容至1000ml

步骤(1)：生物素化抗体的制备

生物素标记抗NT-proBNP的制备程序

使用NaHCO₃缓冲液将待标记抗体配制至1mg/ml待用。

使用DMSO将生物素配制至16.17mg/ml待用。

将以上配制好的抗体和生物素处理液按照1：30的体积比进行混合，2～8℃反应12～16小时。得到反应液。

使用PH8.0的TRIS缓冲液对以上反应液进行透析，透析完成后使用生物素化抗体缓冲液调整至终浓度0.5mg/ml。

步骤(2)：发光试剂的制备与配制

使用0.05M CB缓冲液将待包被抗体配制至1mg/ml待用。

按制备量量取醛基发光微粒(内部填充稀土螯合物)于离心管中，12000rpm离心30min，弃上清，按照每10mg微粒添加0.2mg的比例向沉淀中加入待包被抗体，37℃置于旋转混合仪混匀过夜

按每10mg微粒需要0.02ml 8mg/ml的NaBH4溶液，量取NaBH4溶液，迅速加入反应液中，垂直旋转混合器40rpm，2～8℃,反应2小时。。

按每10mg微粒需要0.16ml 75mg/ml的Gly溶液，量取Gly溶液，迅速加入反应液中，垂直旋转混合器40rpm，2～8℃,反应1小时。

用0.05M CB缓冲液离心清洗三次，再用发光微粒缓冲液洗一次，使用发光微粒缓冲液将已包被NT-proBNP抗体的发光微粒调整至终浓度10mg/ml。

步骤(3)亲和素标记感光微粒的制备

按制备量量取醛基感光微粒(内部填充光敏氰基化合物)于离心管中，12000rpm离心30min，弃上清，按照每10mg微粒添加20mg的比例向沉淀中加入SA，再补加一定体积的0.05M MES pH6.0，使微粒终浓度为25mg/ml。

步骤(4)杯式超声迅速混匀。

向离心管按照每10mg微粒加入16ul的比例加入NaBH₃CN(25mg/ml，0.05M MES pH6.0配制)混匀，37℃置于旋转混合仪反应36～48h。

封闭：按照每10mg微粒加入16ul的比例加入80ul Gly(75mg/ml,0.05M MES pH6.0配制)以及40ul NaBH₃CN(25mg/ml，0.05M MES pH6.0配制)37℃置于旋转混合仪反应2h。

按照每10mg微粒加入16ul的比例加入0.25ml的BSA(200mg/ml，0.05M MES pH6.0配制)，37℃置于旋转混合仪反应12～16h。

用0.05M MES缓冲液清洗三次，再用GG-Buffer洗一次，使用感光微粒缓冲液将已标记亲和素的感光微粒调整至终浓度10mg/ml。

步骤(5)：试剂盒的配制与组装

图5为本发明实施例的N端B型排尿利钠肽快速检测的试剂盒的结构图。如图5所示：

其包括盒盖1、盒体2、第一试剂单元3、第二试剂单元4、第三试剂单元5，其中：

第一试剂单元3、第二试剂单元4、第三试剂单元5都由可密封的试剂瓶组成，盒盖1和盒体2连接，第一试剂单元3、第二试剂单元4、第三试剂单元5都按顺序放置于盒体中。

盒体2的形状为长方体形状。

使用发光微粒缓冲液，将第一试剂单元3已包被N端B型排尿利钠肽抗体的发光微粒，按照50ug/ml的终浓度进行稀释。

使用生物素化抗体缓冲液，将第二试剂单元4已标记生物素的N端B型排尿利钠肽抗体，按照1ug/ml的终浓度进行稀释。

使用感光微粒缓冲液，将第三试剂单元5已包被亲和素的感光微粒，按照40ug/ml的终浓度进行稀释。

步骤(6)：样本的检测

将待检测样本与以上得到的试剂置于本试剂配套的快速化学发光全自动分析仪中进行检测，由仪器自动添加样品和各种试剂后反应5分钟得到检测结果。

性能分析

检测范围

本试剂盒线性检测范围为60-3000pg/mL,对其用双对数模型拟合，剂量-反应曲线相关系数(r)的绝对值不低于0.9900。如要准确的测定样品中NT-proBNP浓度值，样品中NT-proBNP浓度值应不超出60-3000pg/mL的浓度范围，超出此范围的测定结果是通过校准品曲线外延得出的计算结果。

分析灵敏度的检测

检测10孔浓度为0的空白样本，计算其RLU均值(AVE)和二个标准偏差(SD)，以AVE+2SD反代入标准曲线，得到的浓度值即为本试剂盒的分析灵敏度，其分析灵敏度为43pg/mL。

精密性的检测

分别采用不同浓度水平的质控品QC L、QC H进行1次检测，复测10次，得到如下结果：

由上述结果可知，精密性小于15％。

线性的检测

对除0值外其他5点校准品用双对数或其他数学模型拟合，剂量-反应曲线相关系数(r)的绝对值应不低于0.9900。经检测两个批号的试剂盒，其线性r值分别为0.9951、0.9973。

Hook实验

由上述结果可知，两个批号的试剂盒其HOOK效应在100000pg/mL均未见。

与国外同类产品的比较，收集进口NT-proBNP试剂盒检测过的临床标本250份，再以本发明NT-proBNP快速检测试剂盒(化学发光法)测定每份标本，作平行比较，结果如图4所示。

由以上结果可知，本试剂盒检测结果与国外同类产品结果相关性r＝0.9588，且该试剂盒成本底、灵敏度高、精密性好、检测范围宽、操作简便、省时，且与国外同类产品对临床样本的符合率良好，适合于向临床推广。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims

1.一种N端B型排尿利钠肽快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利1所述的N端B型排尿利钠肽快速检测方法，其特征在于，所述的活性分子为NT-proBNP抗体。

3.根据权利1所述的N端B型排尿利钠肽快速检测方法，其特征在于，所述的感光微球为填充了光敏氰基化合物的醛基感光微球。

4.根据权利1所述的N端B型排尿利钠肽快速检测方法，其特征在于，所述的发光微球为填充了稀土螯合物的醛基发光微球。

5.一种N端B型排尿利钠肽快速检测的试剂盒，其特征在于，包括连接了活性分子发光微球的第一试剂、主要成份为已标记生物素活性分子的第二试剂以及主要成份为感光微球的第三试剂。