CN104561215A - 一种固定化脂质酰基转移酶制备植物甾醇酯的方法 - Google Patents

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于殿宇
刘天一
李相昕
江连洲
王立琦
关忠
孙立斌
刘丹怡
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Abstract

本发明提供一种固定化脂质酰基转移酶制备植物甾醇酯的方法。研究了大豆油添加量、植物甾醇添加量、固定化磷脂酶添加量、反应时间、磁力搅拌器的搅拌速度、磁力搅拌器反应温度等不同反应条件下对甾醇酯化为甾醇酯的酯化率的影响，并采用响应面的分析方法对所研究的因素进行优化。通过气相色谱仪测出甾醇和甾醇酯的峰面积，计算出油脂的酯化率，进一步证明了通过海藻酸钙-壳聚糖固定化磷脂酶A2的催化制备植物甾醇酯的转化率更高，简化了工艺过程，减少了工艺制备时间，对工业上生产植物甾醇酯具有重要的指导意义。

Description

一种固定化脂质酰基转移酶制备植物甾醇酯的方法
技术领域
 本发明涉及一种固定化脂质酰基转移酶制备植物甾醇酯的方法。
背景技术
本发明所指的新型固定化脂质酰基转移酶为一种用海藻酸钙-壳聚糖固定的磷脂酶A2(PLA2)。固定化PLA2是一类能够在磷脂甘油部分的Sn-2位点选择性断裂酯键的酶，它以海藻酸钙-壳聚糖为载体，可将磷脂水解成一系列具有生物活性的物质，也可将甾醇转化成甾醇酯。
植物甾醇是一种以环戊烷全氢菲为骨架的一类天然活性物质，产品一般是从植物油精炼时的脱臭馏出物中提取出来的，目前国内已有大规模的工业化生产。植物甾醇具有多种生物功能，它对人体具有较强的抗炎作用，能够抑制人体吸收胆固醇，促进胆固醇的降解，降低胆固醇的生化合成，从而预防动脉粥样硬化、心脏病和癌症等疾病的发生。但是植物甾醇是一种水溶性和脂溶性都极低的物质，故其在化学工业、食品行业的领域中受到了限制。而植物甾醇酯有较好的脂溶性，和比植物甾醇更优良的生物活性，故而，将植物甾醇转化为植物甾醇酯再添加到食品、工业领域中具有更广阔的生物前景。
目前，工业上制备植物甾醇酯的方法一般采用化学酯化或化学酯交换法，现有的工艺过程复杂，得率较低，环境污染大，投资多。国外曾有专利研究用游离的脂质酰基转移酶来制备植物甾醇酯，但是，此游离酶具有比传统化学方法更昂贵、无法回收、对温度等反应环境敏感等缺点。用固定化脂质酰基转移酶制备植物甾醇酯从经济效益和环保的角度出发，具有反应条件温和、不易改变酶分子结构、酶活力损失小和易于回收等优点，能够充分发挥生物酶法酯化的优势。
发明内容
本发明是为了解决现阶段工业上用化学酯化、化学酯交换等方法制备植物甾醇酯生产工艺复杂，得率低，环境污染较大的问题，并且现用固定化脂质酰基转移酶生产植物甾醇酯仍未见报道，而提出的用海藻酸钙-壳聚糖固定化脂质酰基转移酶来制备植物甾醇酯的方法。用海藻酸钙-壳聚糖固定化脂质酰基转移酶制备植物甾醇酯可以通过以下步骤实现：一、脂质酰基转移酶的固定化；二、固定化酶酶活力的测定；三、用海藻酸钙-壳聚糖固定化酶制备植物甾醇酯以及制备条件的优化；四、酯化率的检测。
采用海藻酸钙-壳聚糖固定化脂质酰基转移酶制备植物甾醇酯具有反应条件温和、酯化效率高、重复利用性高等特点，并且用此酶制备植物甾醇酯的工艺过程简单、对反应条件要求较低、投入设备较少、甾醇酯的产量高等特点，对工业上大批量生产植物甾醇酯具有广泛的意义。
具体实施方式
具体实施方式一：用海藻酸钙-壳聚糖固定的磷脂酶A2制备植物甾醇酯的方法通过以下步骤实现：一、脂质酰基转移酶的固定化；二、固定化酶酶活力的测定；三、用海藻酸钙-壳聚糖固定化酶制备植物甾醇酯及制备条件的优化：准确称取大豆油（5~10g），植物甾醇（1~5g），固定化磷脂酶A2（0.1~3.0g），将三者依次加入到洁净干燥的锥形瓶中（带双孔瓶塞），同时，向锥形瓶中注入氮气，将锥形瓶中的空气置换出来，并将锥形瓶至于磁力搅拌器中，调整搅拌速度（100~1000r/min）,反应温度为（40~90℃），开始计时。控制反应时间（1~10h）,反应停止后，及时关闭纯氮气钢瓶和进气阀，停止搅拌，关冷凝水和停止加热，自然冷却到75℃左右，开启装置；四、采用响应面法进行分析讨论最终确定最佳固定化条件；五、酯化率的检测，经过气相色谱的检测，得出甾醇及甾醇酯的峰面积，酯化率={甾醇酯峰面积/（甾醇峰面积 + 甾醇酯峰面积）}×100%。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤四中将8~9 g的大豆油放到洁净干燥的锥形瓶内进行植物甾醇酯的制备。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤四中将1~2 g的植物甾醇放到洁净干燥的锥形瓶内进行植物甾醇酯的制备。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤四中将0.5~1.0 g的海藻酸钙--壳聚糖固定化磷脂酶A2放到洁净干燥的锥形瓶内进行植物甾醇酯的制备。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤四中将反应时间调整到3~8 h进行植物甾醇酯的制备。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤四中将磁力搅拌器的搅拌转速调整到500~600 rpm进行植物甾醇酯的制备。其它步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于步骤四中将磁力搅拌器温度调整到55~75 ℃进行植物甾醇酯的制备。其它步骤与具体实施方式一相同。

Claims (9)

1.一种固定化脂质酰基转移酶制备植物甾醇酯（Photysterol ester）的方法，其特征在于用海藻酸钙-壳聚糖固定的脂质酰基转移酶制备植物甾醇酯通过以下步骤实现：一、脂质酰基转移酶的固定化；二、固定化酶酶活力的测定；三、用海藻酸钙-壳聚糖固定化酶制备植物甾醇酯及制备条件的优化：首先，向洁净干燥的锥形瓶内连续通入一定时间的氮气，将锥形瓶内的空气置换出来，再准确称取5~10 g的大豆油放到锥形瓶内，同时称取1~5 g的植物甾醇放到锥形瓶内，再向大豆油和植物甾醇混合物中加入0.1~3.0 g的海藻酸钙--壳聚糖固定化磷脂酶A2，充分搅拌混匀；将锥形瓶置于磁力搅拌器中，调整搅拌速度100~1000 r/min,反应温度为40~90 ℃，开始计时，控制反应时间1~10 h，反应停止后，及时关闭纯氮气钢瓶和进气阀，停止搅拌，关闭冷凝水和停止加热，自然冷却到75 ℃左右，开启装置；四、采用响应面法进行分析讨论最终确定的最佳固定化条件；五、固定化脂质酰基转移酶重复利用性的研究；六、酯化率的检测，经过气相色谱的检测，得出甾醇及甾醇酯的峰面积，酯化率={甾醇酯峰面积/（甾醇峰面积 + 甾醇酯峰面积）}×100%。
2.根据权利要求1所述的一种用固定化脂质酰基转移酶制备植物甾醇酯的方法，其特征在于步骤三中称取8~9 g的大豆油放到锥形瓶内保温。
3.根据权利要求1所述的一种用固定化脂质酰基转移酶制备植物甾醇酯的方法，其特征在于步骤三中称取8~9 g的大豆油，1~2 g的植物甾醇放到锥形瓶内保温。
4.根据权利要求1所述的一种用固定化脂质酰基转移酶制备植物甾醇酯的方法，其特征在于步骤三中称取8~9 g的大豆油，1~2 g的植物甾醇，0.5~1.0 g海藻酸钙--壳聚糖固定化磷脂酶A2放到锥形瓶内保温。
5.根据权利要求1所述的一种用固定化脂质酰基转移酶制备植物甾醇酯的方法，其特征在于步骤三中称取8~9 g的大豆油，1~2 g的植物甾醇，0.5~1.0 g海藻酸钙--壳聚糖固定化磷脂酶A2，调整磁力搅拌器的搅拌速度500~600 r/min来制备植物甾醇酯。
6.根据权利要求1所述的一种用固定化脂质酰基转移酶制备植物甾醇酯的方法，其特征在于步骤三中称取8~9 g的大豆油，1~2 g的植物甾醇，0.5~1.0 g海藻酸钙--壳聚糖固定化磷脂酶A2，调整磁力搅拌器的搅拌速度500~600 r/min，反应温度为55~75 ℃来制备植物甾醇酯。
7.根据权利要求1所述的一种用固定化脂质酰基转移酶制备植物甾醇酯的方法，其特征在于步骤三中称取8~9 g的大豆油，1~2 g的植物甾醇，0.5~1.0 g海藻酸钙--壳聚糖固定化磷脂酶A2，调整磁力搅拌器的搅拌速度500~600 r/min，反应温度为55~75 ℃，反应时间3~8 h来制备植物甾醇酯。
8.根据权利要求1所述的一种用固定化脂质酰基转移酶制备植物甾醇酯的方法，其特征在于步骤四中采用响应面法进行分析讨论最终确定最佳固定化条件，在最优条件下甾醇酯化率为90%。
9.根据权利要求1所述的一种用固定化脂质酰基转移酶制备植物甾醇酯的方法，其特征在于步骤五中回收固定化脂质酰基转移酶，重复使用10次后，酯化率仍保持80%。
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