CN101200754A - 无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法 - Google Patents

无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生产植物甾醇酯的方法。无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法,其特征在于它包括如下步骤:1)固定化全细胞酶的制备;2)酯化:将油酸、月见草油或食用大豆油中加入甾醇和固定化全细胞酶,置于水浴恒温振荡器中在温度40~60℃、转速100~300r/min的条件下进行酯化反应,反应时间46~50h,得酯化后的反应产物;其中,油酸、月见草油或食用大豆油与甾醇的质量比为3~7∶1;固定化全细胞酶为下述:(1)油酸、月见草油或食用大豆油,(2)甾醇,二种质量之和的1.0~1.7%;3)离心分离、干燥:将酯化后的反应产物离心分离,离心后的上层液为植物甾醇酯产品。本发明工艺制作简单、成本低、多次使用、环保并可适于工业化生产。

Description

无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法
技术领域
本发明涉及一种生产植物甾醇酯的方法。
背景技术
植物甾醇是一种具有生理功能的天然产物。许多文献报道甾醇起到预防心血管疾病的作用,因为它能有效降低有害低密度胆固醇(LDL)的水平,但游离甾醇在水和油中的溶解度小限制了它的应用,植物甾醇在应用中存在以下问题:1)结晶形式使其在人体内的溶解性和生物可利用性比较差;2)不溶于水,在油中的溶解度也很小,给应用于食品工业带来困难。由于植物甾醇酯具有良好的脂溶性,所以将植物甾醇与脂肪酸酯化后转化成油溶性的植物甾醇酯,能够解决在食品工业中应用的限制。另外由于油酸等脂肪酸本身就具有很好的生理功能,所以脂肪酸的甾醇酯则可兼具两者的功效,降低血清胆固醇和甘油三酯效果更佳,能更好地发挥植物甾醇的生理功能。
目前植物甾醇酯一般采用化学法合成和酶法催化合成两种方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制作工序简单、成本低的无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法。
为了实现上述目的,本发明的技术方案是:无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法,其特征在于它包括如下步骤:
1)固定化全细胞酶的制备:
(1)将葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)按常规方法配制成102~104孢子悬浮液,得葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)孢子悬浮液,备用;
(2)摇瓶培养基配制:按各组份所占质量百分比:全脂豆粉2.0%,菜籽油0.3~0.6%,磷酸氢二钾1.2%,硫酸铵0.3%,硫酸镁0.3%,磷酸二氢钠0.4%,水95.2~95.5%;选取全脂豆粉、菜籽油、磷酸氢二钾、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钠和水混合,得摇瓶培养基,备用;
(3)将聚氨酯剪切成3~5mm泡沫颗粒,备用;
(4)按100ml摇瓶培养基中加1~3ml葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)孢子悬浮液,100ml摇瓶培养基中加聚氨酯泡沫颗粒0.3~0.5g,将葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)和聚氨酯在摇瓶培养基中,26~30℃条件下培养40~60h;取出长满葡枝根霉(Rhizopusstolonifer)的聚氨酯泡沫颗粒,真空干燥,得固定化全细胞酶,备用;
2)酯化:将油酸、月见草油或食用大豆油中加入甾醇和固定化全细胞酶,加塞后置于水浴恒温振荡器中在温度40~60℃、转速100~300r/min的条件下进行酯化反应,反应时间46~50h,得酯化后的反应产物;其中,油酸、月见草油或食用大豆油与甾醇的质量比为3~7∶1;固定化全细胞酶为下述:(1)油酸、月见草油或食用大豆油,(2)甾醇,二种质量之和的1.0~1.7%;
3)离心分离、干燥:将酯化后的反应产物离心分离,离心后的上层液为植物甾醇酯产品;离心后的固体物冷冻干燥,得固定化全细胞酶,可重复使用。
步骤3)所述的离心分离的条件是:2000~4000rpm,离心10~20min。
步骤3)所述的冷冻干燥的条件是:-10~0℃,1mbar,干燥时间3~5小时。
本发明与化学合成法相比,无溶剂全细胞酶催化合成有2个优点:1)反应选择性高,反应过程中副产物少;2)反应条件温和,整个生产过程在常温下进行,可以有效避免多元不饱和脂肪酸的氧化。本发明与有机相脂肪酶合成法相比,无溶剂全细胞酶催化合成有2个优点:1)采用全细胞,免除了脂肪酶的分离、提取、纯化和固定化等复杂工序,是克服目前脂肪酶生产、应用成本高的有效途径之一;2)无溶剂体系可以在生产过程中,不需要任何有机溶剂。这不仅可以在生产工艺中免除了有机溶剂脱除,是一种绿色环保的工艺路线。有利于今后的产品开发;而且不会产生不利于消费者身体健康的残余有机溶剂。
产生脂肪酶的生物全细胞作为催化剂(简称固定化全细胞酶),即将产脂肪酶的微生物细胞固定在聚氨酯泡沫颗粒中,进行发酵培养后,收集聚氨酯泡沫颗粒,经过简单处理后即可作为一种生物催化剂,催化脂肪酸、油脂和植物甾醇转化生成植物甾醇酯。
本发明的有益效果是:
1)制作简单:本发明制作工序简单,不需要复杂设备;将供试菌株进行发酵培养后,收集固定菌体进行干燥。
2)降低成本:以固定化全细胞酶催化剂的形式利用脂肪酶,既省去了脂肪酶的分离提取、纯化和固定等工序,也避免在此过程中的酶损失,节省了大量设备投资、运行费用,适用于工业化生产。
3)技术先进:固定化全细胞酶催化剂代替脂肪酶用于转酯催化剂;本发明采用大分子载体,固定后的葡枝根霉细胞容易收集而且具有脂肪酶活性。
4)多次使用:采用固定化全细胞酶催化剂回收率高,可重复使用。
5)环保:无溶剂,具有很强的环保概念,且可以解决化学方法难以解决的问题。
具体实施方式
为了更好地理解本发明,下面结合实施例进一步阐明本发明的内容,但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1:
无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法,它包括如下步骤:
1)固定化全细胞酶的制备:
(1)将市售的葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)按常规方法配制成102孢子悬浮液,得葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)孢子悬浮液,备用;
(2)摇瓶培养基配制:按各组份所占质量百分比:全脂豆粉(烘干后粉碎,过30目)2.0%,菜籽油(市售)0.3%,磷酸氢二钾1.2%,硫酸铵0.3%,硫酸镁0.3%,磷酸二氢钠0.4%,水95.5%;选取全脂豆粉、菜籽油、磷酸氢二钾、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钠和水混合,得摇瓶培养基,备用;
(3)将聚氨酯剪切成3mm泡沫颗粒,备用;
(4)按100ml摇瓶培养基中加1ml葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)孢子悬浮液,100ml摇瓶培养基中加聚氨酯泡沫颗粒0.3g,将葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)和聚氨酯在摇瓶培养基中,26℃条件下培养40h;取出长满葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)的聚氨酯泡沫颗粒,真空干燥,得固定化全细胞酶(催化剂),备用;
2)酯化:将油酸中加入甾醇和固定化全细胞酶,加塞后置于水浴恒温振荡器中在温度40℃、转速100r/min的条件下进行酯化反应,反应时间46h,得酯化后的反应产物;其中,油酸与甾醇的质量比为3∶1;固定化全细胞酶为下述:(1)油酸,(2)甾醇,二种质量之和的1.0%;
3)离心分离、干燥:将酯化后的反应产物离心分离,4000rpm,20min,离心后的上层液为植物甾醇酯产品;离心后的固体物冷冻干燥,-10℃,1mbar,干燥时间5小时,得固定化全细胞酶,可重复使用。植物甾醇酯产品经气相色谱测定甾醇的酯化率为62.2%。
实施例2:
无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法,它包括如下步骤:
1)固定化全细胞酶的制备:
(1)将市售的葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)按常规方法配制成103孢子悬浮液,得葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)孢子悬浮液,备用;
(2)摇瓶培养基配制:按各组份所占质量百分比:全脂豆粉(烘干后粉碎,过40目)2.0%,菜籽油(市售)0.5%,磷酸氢二钾1.2%,硫酸铵0.3%,硫酸镁0.3%,磷酸二氢钠0.4%,水95.3%;选取全脂豆粉、菜籽油、磷酸氢二钾、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钠和水混合,得摇瓶培养基,备用;
(3)将聚氨酯剪切成4mm泡沫颗粒,备用;
(4)按100ml摇瓶培养基中加3ml葡枝根霉(Rhizopus stoloniifer)孢子悬浮液,100ml摇瓶培养基中加聚氨酯泡沫颗粒0.4g,将葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)和聚氨酯在摇瓶培养基中,28℃条件下培养48h;取出长满葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)的聚氨酯泡沫颗粒,真空干燥,得固定化全细胞酶(催化剂),备用;
2)酯化:将油酸中加入甾醇和固定化全细胞酶,加塞后置于水浴恒温振荡器中在温度50℃、转速200r/min的条件下进行酯化反应,反应时间48h,得酯化后的反应产物;其中,油酸与甾醇的质量比为5∶1;固定化全细胞酶为下述:(1)油酸,(2)甾醇,二种质量之和的1.5%;
3)离心分离、干燥:将酯化后的反应产物离心分离,2000rpm,离心10min,离心后的上层液为植物甾醇酯产品,离心后的固体物冷冻干燥,0℃,1mbar,干燥时间5小时,得固定化全细胞酶,可重复使用。
实施例3:
无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法,它包括如下步骤:
1)固定化全细胞酶的制备:
(1)将市售的葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)按常规方法配制成103孢子悬浮液,得葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)孢子悬浮液,备用;
(2)摇瓶培养基配制:按各组份所占质量百分比:全脂豆粉(烘干后粉碎,过30~50目)2.0%,菜籽油(市售)0.5%,磷酸氢二钾1.2%,硫酸铵0.3%,硫酸镁0.3%,磷酸二氢钠0.4%,水95.3%;选取全脂豆粉、菜籽油、磷酸氢二钾、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钠和水混合,得摇瓶培养基,备用;
(3)将聚氨酯剪切成4mm泡沫颗粒,备用;
(4)按100ml摇瓶培养基中加2ml葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)孢子悬浮液,100ml摇瓶培养基中加聚氨酯泡沫颗粒0.4g,将葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)和聚氨酯在摇瓶培养基中,28℃条件下培养48h;取出长满葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)的聚氨酯泡沫颗粒,真空干燥,得固定化全细胞酶(催化剂),备用;
2)酯化:将月见草油中加入甾醇和固定化全细胞酶,加塞后置于水浴恒温振荡器中在温度50℃、转速200r/min(转/分钟)的条件下进行酯化反应,反应时间48h,得酯化后的反应产物;其中,月见草油与甾醇的质量比为5∶1;固定化全细胞酶为下述:(1)月见草油,(2)甾醇,二种质量之和的1.5%;
3)离心分离、干燥:将酯化后的反应产物离心分离,3000rpm,离心15min,离心后的上层液为植物甾醇酯产品;离心后的固体物冷冻干燥,0℃,1mbar,干燥时间3小时,得固定化全细胞酶,可重复使用。植物甾醇酯产品经气相色谱测定甾醇的酯化率为55.5%。
实施例4:
无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法,它包括如下步骤:
1)固定化全细胞酶的制备:
(1)将市售的葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)按常规方法配制成104孢子悬浮液,得葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)孢子悬浮液,备用;
(2)摇瓶培养基配制:按各组份所占质量百分比:全脂豆粉(烘干后粉碎,过50目)2.0%,菜籽油(市售)0.6%,磷酸氢二钾1.2%,硫酸铵0.3%,硫酸镁0.3%,磷酸二氢钠0.4%,水95.2%;选取全脂豆粉、菜籽油、磷酸氢二钾、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钠和水混合,得摇瓶培养基,备用;
(3)将聚氨酯剪切成5mm泡沫颗粒,备用;
(4)按100ml摇瓶培养基中加3ml葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)孢子悬浮液,100ml摇瓶培养基中加聚氨酯泡沫颗粒0.5g,将葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)和聚氨酯在摇瓶培养基中,30℃条件下培养60h;取出长满葡枝根霉(Rhizopus stoloniifer)的聚氨酯泡沫颗粒,真空干燥,得固定化全细胞酶(催化剂),备用;
2)酯化:将月见草油中加入甾醇和固定化全细胞酶,加塞后置于水浴恒温振荡器中在温度60℃、转速300r/min的条件下进行酯化反应,反应时间50h,得酯化后的反应产物;其中,月见草油与甾醇的质量比为7∶1;固定化全细胞酶为下述:(1)月见草油,(2)甾醇,二种质量之和的1.7%;
3)离心分离、干燥:将酯化后的反应产物离心分离,4000rpm,离心20min,离心后的上层液为植物甾醇酯产品;离心后的固体物冷冻干燥,0℃,1mbar,干燥时间4小时,得固定化全细胞酶,可重复使用。
实施例5:
无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法,其特征在于它包括如下步骤:
1)固定化全细胞酶的制备:
(1)将市售的葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)按常规方法配制成104孢子悬浮液,得葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)孢子悬浮液,备用;
(2)摇瓶培养基配制:按各组份所占质量百分比:全脂豆粉(烘干后粉碎,过50目)2.0%,菜籽油(市售)0.6%,磷酸氢二钾1.2%,硫酸铵0.3%,硫酸镁0.3%,磷酸二氢钠0.4%,水95.2%;选取全脂豆粉、菜籽油、磷酸氢二钾、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钠和水混合,得摇瓶培养基,备用;
(3)将聚氨酯剪切成5mm泡沫颗粒,备用;
(4)按100ml摇瓶培养基中加3ml葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)孢子悬浮液,100ml摇瓶培养基中加聚氨酯泡沫颗粒0.5g,将葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)和聚氨酯在摇瓶培养基中,30℃条件下培养60h;取出长满葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)的聚氨酯泡沫颗粒,真空干燥,得固定化全细胞酶(催化剂),备用;
2)酯化:将食用大豆油中加入甾醇和固定化全细胞酶,加塞后置于水浴恒温振荡器中在温度60℃、转速300r/min的条件下进行酯化反应,反应时间50h,得酯化后的反应产物;其中,食用大豆油与甾醇的质量比为7∶1;固定化全细胞酶为下述:(1)食用大豆油,(2)甾醇,二种质量之和的1.7%;
3)离心分离、干燥:将酯化后的反应产物离心分离,4000rpm,离心20min,离心后的上层液为植物甾醇酯产品;离心后的固体物冷冻干燥,-10℃,1mbar,干燥时间5小时,得固定化全细胞酶,可重复使用。植物甾醇酯产品经气相色谱测定甾醇的酯化率为39.0%。
实施例6:
无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法,它包括如下步骤:
1)固定化全细胞酶的制备:
(1)将市售的葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)按常规方法配制成103孢子悬浮液,得葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)孢子悬浮液,备用;
(2)摇瓶培养基配制:按各组份所占质量百分比:全脂豆粉(烘干后粉碎,过40目)2.0%,菜籽油(市售)0.4%,磷酸氢二钾1.2%,硫酸铵0.3%,硫酸镁0.3%,磷酸二氢钠0.4%,水95.4%;选取全脂豆粉、菜籽油、磷酸氢二钾、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钠和水混合,得摇瓶培养基,备用;
(3)将聚氨酯剪切成4mm泡沫颗粒,备用;
(4)按100ml摇瓶培养基中加2ml葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)孢子悬浮液,100ml摇瓶培养基中加聚氨酯泡沫颗粒0.4g,将葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)和聚氨酯在摇瓶培养基中,28℃条件下培养48h;取出长满葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)的聚氨酯泡沫颗粒,真空干燥,得固定化全细胞酶(催化剂),备用;
2)酯化:将食用大豆油中加入甾醇和固定化全细胞酶,加塞后置于水浴恒温振荡器中在温度48℃、转速200r/min的条件下进行酯化反应,反应时间48h,得酯化后的反应产物;其中,食用大豆油与甾醇的质量比为5∶1;固定化全细胞酶为下述:(1)食用大豆油,(2)甾醇,二种质量之和的1.5%;
3)离心分离、干燥:将酯化后的反应产物离心分离,3000rpm,离心15min,离心后的上层液为植物甾醇酯产品;离心后的固体物冷冻干燥,0℃,1mbar,干燥时间5小时,得固定化全细胞酶,可重复使用。

Claims (3)

1.无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法,其特征在于它包括如下步骤:
1)固定化全细胞酶的制备:
(1)将葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)按常规方法配制成102~104孢子悬浮液,得葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)孢子悬浮液,备用;
(2)摇瓶培养基配制:按各组份所占质量百分比:全脂豆粉2.0%,菜籽油0.3~0.6%,磷酸氢二钾1.2%,硫酸铵0.3%,硫酸镁0.3%,磷酸二氢钠0.4%,水95.2~95.5%;选取全脂豆粉、菜籽油、磷酸氢二钾、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钠和水混合,得摇瓶培养基,备用;
(3)将聚氨酯剪切成3~5mm泡沫颗粒,备用;
(4)按100ml摇瓶培养基中加1~3ml葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)孢子悬浮液,100ml摇瓶培养基中加聚氨酯泡沫颗粒0.3~0.5g,将葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)和聚氨酯在摇瓶培养基中,26~30℃条件下培养40~60h;取出长满葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)的聚氨酯泡沫颗粒,真空干燥,得固定化全细胞酶,备用;
2)酯化:将油酸、月见草油或食用大豆油中加入甾醇和固定化全细胞酶,置于水浴恒温振荡器中在温度40~60℃、转速100~300r/min的条件下进行酯化反应,反应时间46~50h,得酯化后的反应产物;其中,油酸、月见草油或食用大豆油与甾醇的质量比为3~7∶1;固定化全细胞酶为下述:(1)油酸、月见草油或食用大豆油,(2)甾醇,二种质量之和的1.0~1.7%;
3)离心分离、干燥:将酯化后的反应产物离心分离,离心后的上层液为植物甾醇酯产品;离心后的固体物冷冻干燥,得固定化全细胞酶催化剂。
2.根据权利要求1所述的无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法,其特征在于:步骤3)所述的离心分离的条件是:2000~4000rpm,离心10~20min。
3.根据权利要求1所述的无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法,其特征在于:步骤3)所述的冷冻干燥的条件是:-10~0℃,1mbar,干燥时间3~5小时。
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