CN102318686A - 一种制备含有植物甾醇酯的功能性保健油脂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备含有植物甾醇酯的功能性保健油脂的方法，本发明的一种制备含有植物甾醇酯的功能性保健油脂的方法，其特征在于采用生物酶法，在常压、无水溶剂条件下实现油脂与植物甾醇的酯交换，进而得到含有植物甾醇酯的功能性保健油脂，最高转化率可达86％。本发明方法采用酶法酯交换技术开发含植物甾醇油脂产品，具有反应条件温和、高效专一、无污染、副产物少，产品质量好等优点，和化学方法相比投入少，设备简单，能耗低，生产成本低，无污染，有利于环境保护。

Description

一种制备含有植物甾醇酯的功能性保健油脂的方法

技术领域

本发明涉及一种植物油脂的制备方法，尤其涉及一种含有植物甾醇酯的功能性保健油脂的制备方法，属于植物油脂的提取加工领域。

背景技术

近年来，随着人们生活水平的不断提高，营养过剩和饮食结构不合理的人群在增加。因此，患心血管疾病的人群也不断在增加。卫生部心血管病防治研究中心发布的《中国心血管病报告2007》提到：“估计我国心血管病患者人数至少2.3亿，每10个成年人中有2人是心血管病。估计我国每年心血管死亡300万人，每死亡3人中就有1人是心血管病。我国每天心血管死亡8400人，每10.5秒就有1人死于心血管病”。营养专家认为，以患病人群为侧重点的诊疗并非控制心血管疾病、降低其危害的最佳方案，加强预防及膳食调节才是更好的选择。因此，膳食中合理地摄入植物甾醇，可使心脏病和其他慢性病的发病风险得到降低。

植物甾醇是一种甾体化合物，它具有重要的生理功能，尤其在降低胆固醇、抗癌、抗病毒、免疫调节等方面有明显功效，被科学界誉为“生命的钥匙”。至今已发现100多种植物甾醇，含量较丰富的，主要包括β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇等(Kritchevsky D et al，2005；P Fernades et al，2007)。植物甾醇主要是以游离态、甾醇酯、甾醇脂肪酸酯、甾醇咖啡酸酯、甾基糖苷和酰化甾基糖苷等形式存在。许多研究证明，补充植物甾醇，具有抑制胆固醇吸收效果，能明显降低血液中总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇(LDL)的含量，而不降低高密度脂蛋白胆固醇(HDL)和甘油三酯的含量。

目前，芬兰、美国、荷兰、澳大利亚、英国等多个国家相关机构已认可植物甾醇的安全性，在食品领域应用趋向主要是作为预防心脑血管疾病的功能性活性成分，目前其市场规模已达5000万～6000万美元。据悉，美国食品和药物管理局已推荐植物甾醇为“降低血脂、预防动脉硬化”的天然保健食品新原料，已经有添加植物甾醇的蛋黄酱、甜品、酸奶、牛奶、食用油等产品，添加植物甾醇食品在欧美和日本等国家正形成一股新兴的健康热潮。

食用油是餐餐必用的食物，因此，通过摄入植物甾醇含量高的植物油，来补充植物甾醇，是一种最佳的方式，同时，食用油中富含的亚油酸、维生素E，对预防心脏病、冠心病等心血管疾病也有一定的作用。日本的研究证明，以总胆固醇值200mg/dl以上的健康的成人男性为对象，分别食用含有植物甾醇的油脂和普通的调和色拉油，14g/日(植物甾醇450mg)，经12周连续摄取、胆固醇值获得显著减少。含植物甾醇保健性油脂产品的开发，可以促进人们改善传统食用油的使用习惯，帮助人们向更高层次的健康生活进行转变。

关于保健功能性油脂产品的研究，日本走在世界的前列，日清オイリオ公司已开发了含有植物甾醇的油脂产品。日清オイリオ公司的这种产品含有高含量的植物甾醇，(β-谷甾醇，beta-sitosterol，1.5-3％)。花王公司还将植物性甾醇与甘二酯混合成为含有甘二酯和植物性甾醇的油脂产品植物性甾醇的(β-谷甾醇)含量高达1.9％，是普通大豆油植物性甾醇含量的20倍。这种产品同时具有减肥和抑制胆固醇吸收效果。具有保健功能性油脂产品是今后食用油产品研究和开发的发展方向。

但游离甾醇在水和油中的溶解度小限制了它的应用，甾醇酯相对甾醇具有更好的脂溶性和更高的降胆固醇的效果。美国食品药品监督管理局(FDA)的研究报告表明，每天摄入1.3g植物甾醇酯，即可起到降低胆固醇的功效，摄入越多，降胆固醇效果越佳。

因此开发一种制备含有植物甾醇酯的功能性保健油脂的方法变得至关重要，植物甾醇酯的合成方法主要有化学法和酶法。化学法一般有以下4种途径：通过植物甾醇与脂肪酸直接酯化或同脂肪酸甲酯进行酯交换，或者通过植物甾醇同脂肪酸卤化物或脂肪酸酸酐反应。化学法工艺条件简单，易于控制和实现工业化生产，但缺点是反应温度高，容易发生副反应，导致脂肪酸氧化和植物甾醇脱水等。酶法反应条件比较温和，副反应较少，产物质量好并易于纯化分离，但是酶法一般要求在反应过程中添加有机溶剂，酶价格昂贵，对反应条件要求苛刻，生产成本较高，目前还处于实验室研究阶段。针对这些存在的问题，发明人在进行了大量研究工作后提出了本发明。

发明内容

针对上述问题本发明所要解决的技术问题是提供一种制备含有植物甾醇酯的功能性保健油脂的方法，本发明的一种制备含有植物甾醇酯的功能性保健油脂的方法，其特征在于采用生物酶法，在常压、无水溶剂条件下实现油脂与植物甾醇的酯交换，进而得到含有植物甾醇酯的功能性保健油脂。

具体的包括以下步骤：

(1)调节脂肪酶水分：在真空干燥相中将脂肪酶调节至水分含量为0.1-0.2％；

(2)原料混合：将油酯、占油脂重量3％-15％的植物甾醇和占油脂重量0.8％-1.2％脂肪酶，加入到反应釜中，进行搅拌，使脂肪酶均匀地分布在植物甾醇和油酯的混合体系中；

(3)排除空气：将反应釜中的空气用氮气反复置换，将反应釜中的空气全部除去；

(4)通入氮气：使反应釜内外压力一致；

(5)酯化反应：严格控制升温速度3-5℃/min，达到反应温度80-120℃后，开始搅拌计时，反应1-10小时后结束，立即停止加热，冷却至室温；

(6)离心分离：取出产品，在3000～4000r/min条件下离心10-30min，分离出所述的油脂制品和脂肪酶。

其中，优选的，所述的油脂包括大豆油，葵花籽油，玉米油，花生油和橄榄油等，更优选为大豆油；

其中，优选的，所述的植物甾醇加入量为油脂重量的5.2％；

其中，催化酯交换反应的脂肪酶有很多种，由于本研究目的是为了产业化生产，因此要求所采用的酶不仅应来源广泛、反应专一，更要价格低廉，优选的，所述的脂肪酶为

TL IM固定化脂肪酶，加入量为油脂重量的1.0％；

其中，优选的，所述的酯化反应温度为100℃，所述的酯化反应时间为3小时；

由以上所述的方法即可制备得到含有植物甾醇酯的功能性保健油脂。

本发明方法采用酶法酯交换技术开发含植物甾醇油脂产品，反应条件温和、高效专一、无污染、副产物少，产品质量好，最高转化率可达86％，和化学方法相比投入少，设备简单，能耗低，生产成本低，无污染，有利于环境保护。

附图说明

图1为植物甾醇样品GC图；

图2为豆甾醇标准曲线；

图3为植物甾醇红外光谱图；

图4为含植物甾醇大豆油脂红外光谱图；

图5为大豆油的GC图谱；

图6为含植物甾醇大豆油脂GC图谱(IM脂肪酶)；

图7为不同脂肪酶对酯化效率的影响；

图8为图7为不同温度对酯化效率的影响；

图9为不同甾醇添加量对酯化效率的影响；

图10为不同酶用量对酯化效率的影响；

图11为不同反应时间对酯化效率的影响；

图12为酶用量(X₂)和甾醇添加量(X₃)对酯化效率(Y)的影响；

图13为反应温度(X₁)和甾醇添加量(X₃)对酯化效率(Y)的影响；

图14为反应温度(X₁)和酶用量(X₂)对酯化效率(Y)的影响。

具体实施方式

下面通过药理性及临床观察实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实验材料

试验仪器

实施例1  制备含有植物甾醇酯的功能性保健大豆油脂

(1)调节脂肪酶水分：在真空干燥相中将

TL IM固定化脂肪酶调节至最佳水分含量0.1％；

(2)原料混合：将100g大豆油酯、5.2g植物甾醇和1.0gTL IM固定化脂肪酶，加入到反应釜中，进行搅拌，使脂肪酶均匀地分布在植物甾醇和油酯的混合体系中；

(3)排除空气：将反应釜中的空气用氮气反复置换3-5次，将反应釜中的空气全部除去；

(4)通入氮气：加入氮气时，首先打开氮气瓶中的阀门，当氮气达到一定量的时候，关闭反应釜的阀门，而后关闭氮气瓶的阀门，同时保证反应釜内外压力一致；

(5)酯化反应：严格控制升温速度4℃/min，达到反应温度100℃后，开始搅拌计时，反应3小时后结束，立即停止加热，冷却至室温；

(6)离心分离：取出产品，在4000r/min条件下离心20min，分离出油脂制品和脂肪酶。

将得到的大豆油脂用于以下分析研究：

1、检测方法

1.1中红外(IR)光谱检测

取少量的植物甾醇、植物甾醇酯样品。采用傅里叶红外光谱仪，在400～4000cm^-1范围内进行全反射测定，仪器分辨率为0.5cm^-1，扫描次数定位32。

1.2GC图谱分析

GC分析条件的选择

色谱柱：HP-5号石英毛细管气相色谱柱(30m*0.25mm*0.25μm)；HP-3365色谱工作站；FID检测器。载气：高纯N₂；柱流速：2mL/min；尾吹气流速：30mL/min；分流比30∶1进样量1μL。

a.柱温的选择

在柱温250℃-280℃的范围内，每隔5℃进一次样进行比较，选择最佳温度为260℃。如图1所示，整个气相色谱分析时间可控制在18min内完成，而四种甾醇的分离效果良好。在非极性或弱极性色谱柱中，菜籽甾醇的极性最强，最先出峰；β-谷甾醇极性最弱，最后出峰；豆甾醇和菜油甾醇的极性非常接近，菜油甾醇在C-22位是单键，但C-24位连接的是甲基；豆甾醇虽然在C-22位是双键，但C-24位连接的是乙基，因此二者的极性差别很小。通过标准样品保留时间定性法，确定甾醇的出峰先后顺序为：菜籽甾醇，菜油甾醇，豆甾醇，β-谷甾醇。

对大豆油、酯化大豆油样品(主要含有豆甾醇、β-谷甾醇及少量菜油甾醇和菜籽甾醇)进行定性分析，得到植物甾醇的气相色谱图。经与豆甾醇和β-谷甾醇混合标样的气相色谱对照，确定T＝13.071min和T＝14.753min处的峰分别为豆甾醇和β-谷甾醇的样品峰，根据甾醇的极性、气相色谱出峰次序及相关文可以确定T＝10.741和T＝12.197min处的吸收峰为菜籽甾醇与菜油甾醇的检测峰。

b.定量分析豆甾醇

豆甾醇储备液：豆甾醇5mg溶于10ml容量瓶中，用正己烷定容。

内标液储备液：取角鲨烷200mg溶于50ml容量瓶，用正己烷定容，内标浓度为4mg/ml。

内标液：取一号1ml溶于10ml容量瓶定容至刻度，浓度为0.4mg/ml，2.3标准曲线(见图2)：分别取0.5、1、2、4ml豆甾醇储备液溶于10ml容量瓶，加1ml内标液后，定容至刻度。

豆甾醇标样标准曲线绘制

豆甾醇回归方程：y＝-7.3456x-0.0742  R＝0.9939

c.样品处理方法皂化处理法

准确称取植物甾醇酯样品200mg，置于100mL磨口锥形瓶中，加入25mL1.0mo/L的KOH-乙醇溶液，置于80℃水浴中，磁力搅拌，反应2h后取出；待反应液冷却至室温后，加饱和氯化钠水溶液25mL移至分液漏斗中，分3次每次用50mL异丙醚萃取，把异丙醚萃取液合并；用蒸馏水洗异丙醚层至pH为中性，异丙醚层加入适量无水硫酸钠脱水，过滤，滤液在旋转蒸发器中浓缩；残液用正己烷定容至25mL，供气相色谱检测。该方法的特点是皂化处理完全，植物甾醇中基本上可全部转化为游离植物甾醇。

d.植物甾醇酯的气相色谱定量分析

准确称取植物甾醇酯样品二份。一份用定量甲苯溶解后，采用气相色谱法直接进样测定样品中各种游离甾醇的含量m_0x、及甾醇总含量∑m_0x。定量分析采用标准曲线法。

另一份经过皂化法处理后，用气相色谱法检测样品皂化后各种游离甾醇的含量m_1x及甾醇总含量∑m_1x。

由甾醇酯转化的各种游离甾醇量m_x为：m_x＝m_1x-m_0x

总游离甾醇含量∑m_x为：∑m_x＝∑m_1x-∑m_0x

如果己知构成植物甾醇酯的脂肪酸的种类(如己知该样品全部为植物甾醇油酸酯)和各种植物甾醇的种类，则就能知道相应的各种植物甾醇酯的摩尔质量。植物甾醇酯的总含量∑Wx为：∑Wx＝∑m_x×M₂/M₁

式中：M₁为某种植物甾醇的摩尔质量，M₂为相应的某种植物甾醇酯的摩尔质量。

e.精密度测定

准确称取植物甾醇酯样品100mg，置于100mL磨口锥形瓶中，加入25mL1.0mo/L的KOH-乙醇溶液，置于80℃水浴中，磁力搅拌，反应2h后取出；待反应液冷却至室温后，加饱和氯化钠水溶液25mL移至分液漏斗中，分3次每次用50mL异丙醚萃取，把异丙醚萃取液合并；用蒸馏水洗异丙醚层至pH为中性，异丙醚层加入适量无水硫酸钠脱水，过滤，滤液在旋转蒸发器中浓缩；残液用正己烷定容至25mL，供气相色谱检测。重复实验5次，计算出峰时间、峰面积、含量的标准偏差和相对标准偏差。

表1  GC测定误差分析

由表1可知，气相色谱法测定大豆油中豆甾醇的含量，出峰时间的标准偏差为0.0358，峰面积得到标准偏差为1.007，含量的标准偏差为0.0004；出峰时间的相当标准偏差为0.2737％，峰面积相当标准偏差为1.86％，含量的相当标准偏差为0.839％，可知气相色谱法测定的精密度较高，可用于植物油中甾醇含量的分析。

1.3酯化率计算

酯化率(％)＝[1-(w₂/w₁)]×100％

式中：w₁——反应前豆甾醇添加量；w₂——反应后豆甾醇剩余量

本实施例中，W₁＝5.2g，W₂＝0.7g，转化效率为86％。

1.4产品各项指标的检测

1)含植物甾醇大豆油透明度、色泽、气味、滋味检测：GB/T 5525-1985

2)含植物甾醇大豆油色泽检测：GB/T 5525-1985

3)含植物甾醇大豆油脂水分及挥发物含量检测：GB/T 5528

4)含植物甾醇大豆油不溶性杂质含量检测：GB/T 5529

5)含植物甾醇大豆油酸价检测：GB/T 5530-1998，eqv ISO 660：1983

6)含植物甾醇大豆油过氧化值检测：GB/T 5538-2005，eqv ISO 3960：2001

7)含植物甾醇大豆油烟点检测：GB/T 17756-1999

8)含植物甾醇大豆油加热试验检测：GB/T 5531

9)含植物甾醇大豆油冷冻试验(0℃储藏5.5h)检测：GB/T 17756-1999

10)含植物甾醇大豆油甾醇含量检测：(INTERNATIONAL STANDARDISO 12228 Animal and vegetable fats and oils——Determination of individual andtotal sterols contents——Gas chromatographic method)。

以上指标经检测均符合国家一级大豆油标准，见下表2：

1.5数据处理

测定结果均以“平均值±标准误”表示，用SAS数据分析软件中GLM程序对所有试验数据进行方差分析，F检验差异显著者，以LSD法比较平均数间的差异显著性。折线图和柱形图采用Excel工作表绘制。

动物实验数据经统计分析后用X±S表示，组间差经t检验。

2植物甾醇和含植物甾醇大豆油脂的定性和定量分析

2.1植物甾醇的定量分析

植物甾醇组分测定

图1为植物甾醇的GC谱图，出峰顺序为：菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇。角鲨烷、菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇出峰的保留时间分别为3.62min、10.625min、12.047min、12.919min、14.57min。

经GC分析植物甾醇组分为β-谷甾醇含量52.825％，豆甾醇含量为24.225％、其它甾醇含量为22.95％。

出峰顺序依次为溶剂(正己烷)，角鲨烷(squalane)，菜籽甾醇(brassicasterol)，菜油甾醇(campesterol)，豆甾醇(stigmasterol)，β-谷甾醇(β-sitosterol)

2.2含植物甾醇大豆油脂的定性分析

将植物甾醇和含植物甾醇大豆油脂分别进行红外光谱分析，其结果见图3和4。图3为植物甾醇的红外光谱图，从图中可以明显看出植物甾醇在3431cm^-1，处有O-H键的伸缩振动吸收峰，1057cm^-1为O-H键的弯曲振动吸收峰。2936nclcm^-1、2868cm^-1，的吸收峰分别表明有-CH₃和-CH₂等基团(碳氢伸缩振动)。1464cm^-1，和1378cm^-1的吸收峰为-CH₂基团的弯曲振动吸收峰。

含植物甾醇大豆油脂的红外光谱图见图4，从红外图谱可以看出在3200-3600cm^-1范围内无明显吸收峰，说明无-OH存在，植物甾醇与大豆油酯化完全，可以判断产品中无游离甾醇存在。1745cm^-1处出现了强烈的吸收峰，为酯C＝O的伸缩振动。1165cm^-1处出现的强吸收峰为C-O伸缩振动，该信号属于酯键上C-0峰。3008cm^-1处出现的强烈的吸收峰为C＝C双键，证明植物甾醇酯为不饱和脂肪酸酯。

2.3含植物甾醇大豆油脂的定量分析

一级大豆油和含植物甾醇大豆油脂的GC图谱见图5和6。图5为一级大豆油的GC图谱，从图中可明显看出无明显的各种甾醇(菜籽甾醇，菜油甾醇，豆甾醇，β-谷甾醇)的吸收峰出现，说明经过精制后的大豆油中不含植物甾醇。

图6为含植物甾醇大豆油脂的GC图谱，从GC图谱可以看出菜籽甾醇，菜油甾醇，豆甾醇，β-谷甾醇按照在甾醇中各种甾醇的含油量比例呈现不同的峰值。其中β-谷甾醇在甾醇中含油52.8％，峰值也最大。保留时间在T＝13.071min的峰为豆甾醇，保留时间在T＝14.753minmin的峰为β-谷甾醇，保留时间在T＝10.741的峰为菜籽甾醇，保留时间在T＝12.197min的峰为菜油甾醇。气相色谱出峰次序和出峰时间与相关文献一致。从GC图片可以说明植物甾醇与大豆油发生了酯化反应。

实验例1  工艺参数优选试验

1、试验设计

根据预备试验，在单因素试验的基础上，选择适宜的因素和水平进行旋转正交组合设计优化常压生物酶法合成植物甾醇酯反应条件。按表3给出的因素水平编码表，选取反应温度(℃)、酶用量(％)和甾醇添加量(％)三个因素为自变量(xi)以植物甾醇酯的转换率(％)为响应值(Y)，进行二次旋转正交试验设计，共23个试验点，各因素的变化区间由预备试验所确定，每个试验点做3个平行样试验，取其平均值，优化交联反应条件。利用SAS软件分析试验数据。

表3  因素水平编码表

2、脂肪酶的选择

本研究中采用该公司的Novozym 435和TL IM固定化脂肪酶。试验分别以大豆油和葵花油为原料，以大豆油为原料，IM酶催化酯化率为84.231％，435酶催化酯化率为70.71％。以葵花油为原料，IM酶催化酯化率为87.734％，435酶催化酯化率为74.39％。实验证明

TL IM固定化脂肪酶具有最佳的酯化率，故在实验中选用TL IM固定化脂肪酶作为生物酶催化剂。

Novozym435和Lipozyme TL IM固定化脂肪酶都属于三甘油酯水解酶一类(EC 3.1.1.3)，最佳的反应温度和其他性能类似，在酯化率方面的差别可能在于产品的粒度和水分含量不同。

脂肪酶对于催化大豆油与植物甾醇酯化的酯化率比葵花油低，主要是由于大豆油中含油大量的具有2个不饱和双键的亚油酸，较多的不饱和双键增加了酯化反应的位阻，使酯化反应较困难。

图7不同脂肪酶对酯化率的影响。

3、温度对酯化率的影响

在植物甾醇添加量为5％，酶用量1％，反应时间3h，搅拌速度600r/min的条件下，考查不同温度对甾醇酯化率的影响。

TL IM固定化脂肪酶的最佳反应温度在30～70℃之间，高温会使酶变性失活，由于在本实验在无水无溶剂条件下进行，所以在较高温度下酶也可以保证其活性。油脂中含有微量的水分，过低的水分可使酶的耐高温程度增加，甘三酯的酯交换反应是在含水量非常低的条件下反应。因此，

TL IM固定化脂肪酶可耐受一定程度的高温而不变性。从图8可以看出，在80～100℃范围内，酯化率随着反应温度的升高而增加，但是在100～120℃这一区间转换率开始下降。这是因为酶的活性会随着温度的上升而增大，达到最适温度以后，再升高温度反而会使酶变性失活，从而使酯化率下降。因此，反应最佳温度确定为100℃。

图8不同温度对酯化率的影响。

4、甾醇浓度对酯化率的影响

在酶用量1％，反应时间3h，反应温度100℃，搅拌速度600r/min的条件下，考查不同甾醇添加量对甾醇酯交换的影响见图9。从图9可以明显看出，植物甾醇的添加量为5％时转换率最高。随着植物甾醇添加量的增加，酯化率呈下降趋势。试验发现，植物甾醇浓度过低时反应并不完全，超过15％以后，植物甾醇不能很好地溶于大豆油中。因此，5％为最佳甾醇添加量。

图9不同植物甾醇添加量对酯化率的影响。

5、酶用量对酯化率的影响

从图10可以看出，酶用量为1％时转换率最大，随着酶用量的增加，酯化率呈下降趋势。这是因为，酶的用量过小，不能使底物完全与其活性中心结合，造成底物的浪费；酶用量过大，造成酶聚集在一起使其与底物接触面积相对减小，并且产物与酶结合在一起不利于产品的精炼。因此，选择酶用量1％为最佳条件。

图10不同酶用量对酯化率的影响。

6、反应时间对酯化率的影响

在植物甾醇添加量5％，酶用量1％，反应温度100℃，搅拌速度600r/min条件下，考查不同反应时间对甾醇酯化率的影响见图11。从图中可以看出，随着反应时间的延长，转换率增加并不十分明显，并且反应时间过长，产生的水分会使反应向反方向进行，降低反应效率。从节省资源，减少副产物角度来看，选择反应时间3h。

图11不同反应时间对酯化率的影响。

7大豆油与植物甾醇酯化条件的优化

7.1统计分析结果

在单因素试验的基础上，采用旋转正交组合设计，对常压生物酶法合成植物甾醇酯反应条件进行优化，试验结果见表4。

表4  三因素二次旋转正交组合试验结果

经过SAS8.0软件分析后得出合成植物甾醇酯的回归方程为：

Y＝90.50327066-1.33390461x₁-1.20254077x₂-2.54236122x₃+0.31250000x₁x₂+0.31250000x₁x₃+0.43750000x₂x₃-3.32006136x₁x₁-1.74713631x₂x₂-1.53505653x₃x₃

回归方程的方差分析见表5。

表5  回归方程的方差分析

表5中Pr＝0.0007＜0.05，表明回归方程差异显著，回归方程拟合较好。

7.2酶用量和甾醇添加量对酯化率的影响

将植物甾醇酯合成模型中的反应温度(x₁)固定在0水平上，可以得到酶用量(x₂)和甾醇添加量(x₃)对酯化率(Y)的子模型：

Y＝90.50327066-1.33390461x₁-1.20254077x₂-2.54236122x₃+0.31250000x₁x₂+0.31250000x₁x₃+

0.43750000x₂x₃-3.32006136x₁x₁-1.74713631x₂x₂-1.53505653x₃x₃

图12酶用量(X₂)和甾醇添加量(X₃)对酯化率(Y)的影响。

由图12可知，在选取的条件范围内，当反应温度在0水平时，酶用量不变，随着甾醇添加量的逐渐增大，酯化率逐渐升高，当达到一定值后升高速度缓慢，最后略有下降；当甾醇添加量不变时，随着酶用量的增加，酯化率先增高，当达到一定值后，有所下降。由等高线图可知：酯化率的极值出现在试验范围内，在84％～87％之间，在适宜的酶用量和适当的甾醇添加量，得到的酯化率较高，综合两个图得出酶用量范围在1.00％～1.03％之间，甾醇添加量在5.12％～5.30％之间时，极值可取到84％～86％。

7.3反应温度和甾醇添加量对酯化率的影响

将植物甾醇酯合成模型中的酶用量(x₂)固定在0水平上，可以得到反应温度(x₁)和甾醇添加量(x₃)对酯化率(Y)的子模型：

Y＝90.50327066-1.33390461x₁-1.20254077x₂-2.54236122x₃+0.31250000x₁x₂+0.31250000x₁x₃+0.43750000x₂x₃-3.32006136x₁x₁-1.74713631x₂x₂-1.53505653x₃x₃

图13反应温度(X₁)和甾醇添加量(X₃)对酯化率(Y)的影响。

由图13可知，在选取的条件范围内，当酶用量在0水平时，反应温度不变，随着甾醇添加量的增加，酯化率逐渐升高，当达到一定值后开始下降；当甾醇添加量不变时，随着酶用量的增加，酯化率逐渐升高，当达到一定值后升高速度缓慢，最后略有下降。由等高线图可知：酯化率的极值出现在试验范围内，在84％～87％之间，在适宜的反应温度和适当的甾醇添加量得到的酯化率较高，综合两个图得出反应温度范围在100.00℃～101.20℃之间，甾醇添加量在5.18％～5.30％之间时，极值可取到84％～86％。

7.4反应温度和酶用量对酯化率的影响

将植物甾醇酯合成模型中的甾醇含量(x₃)固定在0水平上，可以得到反应温度(x₁)和酶用量(x₂)对酯化率(Y)的子模型：

Y＝90.50327066-1.33390461x₁-1.20254077x₂-2.54236122x₃+0.31250000x₁x₂+0.31250000x₁x₃+0.43750000x₂x₃-3.32006136x₁x₁-1.74713631x₂x₂-1.53505653x₃x₃

图14反应温度(X₁)和酶用量(X₂)对酯化率(Y)的影响。

由图14可知，在选取的条件范围内，当甾醇添加量在0水平时，反应温度不变，随着酶用量的增加，酯化率先升高后下降；当酶用量不变时，随着反应温度的提高，酯化率先升高到一定值后略有下降。由等高线图可知：脱色率的极值出现在试验范围内，在84％～87％之间，在适宜的反应温度和适当的酶用量条件下得到的酯化率较高，综合两个图得出反应温度范围在100.00℃～101.20℃之间，酶用量在1.00％～1.02％之间时，极值可取到84％～86％。

通过等高线分析，并结合实际试验条件，得到合成植物甾醇酯的最优反应条件为：X₁＝-0.1392，X₂＝-0.0992，X₃＝-0.3318，即反应温度为100.83℃，酶用量为1.01％，甾醇添加量为5.19％。将此最优条件组合代入二次回归方程中，计算出生物酶法合成植物甾醇酯的转换率为85.45％。由于试验设备所限，取反应温度100℃，酶用量1％，甾醇添加量5.2％，按照上述最优条件进行试验，得到植物甾醇的酯化率为85.67％，预测值与试验值之间的良好拟合性证实了模型的有效性。表明所得出的回归方程可以很好的体现反应温度、酶用量和甾醇添加量与转换率之间的关系，为植物甾醇合成产业化提供直接的参考依据。

实验例2  动物实验

对不同剂量的含植物甾醇大豆油脂对高脂血症小鼠血脂水平的影响进行了研究。与高脂模型组比较，植物甾醇酯会明显降低血清总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平，增加HDL-C/LDL-C和HDL-C/TC值，降低动脉硬化指数(AI)，对甘油三酯(TG)水平却无明显影响；含植物甾醇大豆油脂具有调节血脂的作用，高于75mg/kg·BW含植物甾醇大豆油脂开始出现明显的降血脂作用，统计有显著差异(P＜0.05)。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种制备含有植物甾醇酯的功能性保健油脂的方法，其特征在于采用生物酶法，在常压、无水溶剂条件下实现油脂与植物甾醇的酯交换，进而得到含有植物甾醇酯的功能性保健油脂，具体的包括以下步骤：

(1)调节脂肪酶水分：在真空干燥相中将脂肪酶调节至水分含量为0.1-0.2％；

(2)原料混合：将油酯、占油脂重量3％-15％的植物甾醇和占油脂重量0.8％-1.2％脂肪酶，加入到反应釜中，进行搅拌，使脂肪酶均匀地分布在植物甾醇和油酯的混合体系中；

(3)排除空气：将反应釜中的空气用氮气反复置换，将反应釜中的空气全部除去；

(4)通入氮气：使反应釜内外压力一致；

(5)酯化反应：严格控制升温速度3-5℃/min，达到反应温度80-120℃后，开始搅拌计时，反应1-10小时后结束，立即停止加热，冷却至室温；

(6)离心分离：取出产品，在3000～4000r/min条件下离心10-30min，分离出所述的油脂制品和脂肪酶。

2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的油脂包括大豆油，葵花籽油，玉米油，花生油和橄榄油。

3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的植物甾醇加入量为油脂重量的5.2％。

4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的脂肪酶为

TL IM固定化脂肪酶，加入量为油脂重量的1.0％。

5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的酯化反应温度为100℃，所述的酯化反应时间为3小时。

6.由权利要求1-5任一项所述的方法所制备的含有植物甾醇酯的功能性保健油脂。

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