CN105002252A - 在真空无溶剂体系中酯化和酯交换生物合成甾醇酯的方法 - Google Patents

Abstract

一种在真空无溶剂体系中酯化和酯交换生物合成甾醇酯的方法，使用固定化脂肪酶Lipozyme？IM和Novozym？435作为催化剂，在真空、无溶剂和无添加水的反应条件下，甾醇与油酸酯化、与油酸甲酯和甘油三酸酯的酯交换以较高的转换率生成相应的长链酰基酯。在最佳的反应条件下，甾醇与油酸甲酯进行酯交换，使用固定化脂肪酶Lipozyme？IM，即使重复使用10次后仍保持90％以上的转换率，脂肪酶Novozym？435仍保持40％以上的转换率。

Description

在真空无溶剂体系中酯化和酯交换生物合成甾醇酯的方法

技术领域

本发明涉及一种植物甾醇酯的合成方法。

背景技术

植物甾醇是一种甾体化合物，它具有重要的生理功能，尤其在降低胆固醇、抗癌、抗病毒、免疫调节等方面有明显功效，被科学界誉为“生命的钥匙”。许多研究证明，补充植物甾醇，具有抑制胆固醇吸收效果，能明显降低血液中总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇(坏胆固醇，LDL)的含量，而不降低高密度脂蛋白胆固醇(好胆固醇，HDL)和甘油三酸酯的含量。美国食品药品监督管理局(FDA)的研究报告表明，每天摄入1.3g植物甾醇酯，即可起到降低胆固醇的功效。植物甾醇是国际营养学会推荐的未来十大功能性营养成分之一，2000年美国食品与药品管理局(FDA)批准添加了植物甾醇和植物甾醇酯的食品可以使用“有益健康”的标签；2004年欧盟委员会批准了美国的ADM公司、食品巨头联合利华和2家芬兰公司等生产的添加甾醇的新食品。2007年中国卫生部正式批准植物甾醇和植物甾醇酯为“新资源食品”。近年来，随着人们生活水平的不断提高，营养过剩和饮食结构不合理的人群在增加。因此，患心血管疾病的人群也不断在增加。卫生部心血管病防治研究中心发布的《中国心血管病报告2007》提到：“估计我国心血管病患者人数至少2.3亿，每10个成年人中有2人是心血管病。”估计我国每年心血管死亡300万人，每死亡3人中就有1人是心血管病。营养专家认为，以患病人群为侧重点的诊疗并非控制心血管疾病、降低其危害的最佳方案，加强预防及膳食调节才是更好的选择。因此，膳食中合理地摄入植物甾醇，可使心脏病和其他慢性病的发病风险得到降低。

甾醇是甾族化合物其中的一类，由于其常态为固态所以又被称作固醇，主要以游离、高级脂肪酸酯、苷这三种形式存在于动物、植物和微生物体内。至今已发现100多种植物甾醇，含量较丰富的主要有β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇。相关研究表明，植物甾醇可以有效地降低血液中的胆固醇含量，从而降低心脑血管疾病的产生，是一种行之有效的保健食品。植物甾醇具有抗癌、抗动脉粥样硬化、抗氧化和抗炎等功效，被广泛应用于制药、保健品、化妆品、动植物生长激素以及化工、纺织等各领域。国际营养学会推荐的未来十大功能性营养成分中就包括植物甾醇。虽然植物甾醇具有降低血清胆甾醇水平的功效，但游离植物甾醇在水和油脂中的低溶解性限制了它在食品中的实际作用。植物甾醇酯在植物油脂中的含量非常少，但是植物甾醇酯具有更优的脂亲和性和更佳的降胆固醇效果。这不仅方便甾醇在含脂食品中的传递，生物利用率高，溶解度好，还可以改善产品的外观及口感，因此备受青睐。临床试验表明，成人每天只要摄入1.3g以上植物甾醇酯即可达到显著降低胆固醇的目的。

通常，甾醇酯是通过相应的甾醇与脂肪酸酯化、脂肪酸甲酯或三酰甘油酯交换、脂肪酸卤化物或脂肪酸酐反应来制取。Katsunori等、裘爱泳等分别采用脂肪酶催化甾醇与不饱和脂肪酸在含水的溶剂体系中反应生产甾醇酯，关于植物油脂与植物甾醇在真空和无溶剂体系中反应合成植物甾醇酯的研究较少。

发明内容

本发明的目的是提供一种在真空无溶剂体系中酯化和酯交换生物合成甾醇酯的方法，

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种在真空无溶剂体系中酯化和酯交换生物合成甾醇酯的方法，具体步骤如下：

以固定化脂肪酶Lipozyme IM或Novozym 435作为催化剂，甾醇与酰基供体：油酸酯化、油酸甲酯或甘油三酸酯在40～80℃的真空条件下反应10～50h，控制酶添加量为总反应物(酰基供体+甾醇+酶)质量的0.4～1％，甾醇添加量为总反应物质量的2～7％。

最佳的反应条件：以固定化脂肪酶Lipozyme IM作为催化剂，反应温度80℃、真空30 mbar、反应时间48h、酶添加量1％、甾醇添加量5.6％。

本发明使用固定化脂肪酶Lipozyme IM和Novozym 435作为催化剂，在真空、无溶剂和无添加水的反应条件下，甾醇与油酸酯化、与油酸甲酯和甘油三酸酯的酯交换以较高的转换率生成相应的长链酰基酯，在酯交换过程中没有有害溶剂加入，避免了有害溶剂残留的问题。同时本发明还具有工艺简单，生产成本低等特点。在最佳的反应条件下，甾醇与油酸甲酯进行酯交换，使用固定化脂肪酶LipozymeIM，即使重复使用10次后仍保持90％以上的转换率，脂肪酶Novozym435仍保持40％以上的转换率。

附图说明

图1为温度对油酸和油酸甲酯与甾醇酯化和酯交换转换率的影响(使用酶Novozym 435)；

图2为温度对油酸和油酸甲酯及三油酸酯与甾醇酯化和酯交换转换率的影响(使用酶Lipozym IM)；

图3为时间对油酸和油酸甲酯及三油酸酯与谷甾醇酯化和酯交换的转换率影响(使用酶Lipozym IM)；

图4为酶催化剂量对转换率的影响(Novozym 435)；

图5为酶催化剂量对转换率的影响(Lipozyme IM)；

图6为甾醇添加量对转换率的影响(Lipozyme IM)；

图7为脂肪酶Novozym 435和Lipozyme IM重复使用的稳定性。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

本发明提供了一种在真空无溶剂体系中酯化和酯交换生物合成甾醇酯的方法，该方法研究在真空，无溶剂、无添加水的反应条件下，使用固定化脂肪酶Lipozyme IM和Novozym 435作为催化剂，生物合成植物甾醇酯，对油酸、脂肪酸甲酯和油脂与植物甾醇发生酯化和酯交换反应合成植物甾醇酯的方法进行探索，考察在真空和不同脂肪酶的条件下，反应温度、反应时间、脂肪酶添加量，甾醇与底物的不同摩尔比、脂肪酶的使用次数等各种试验条件下对酯化和酯交换反应的影响。

1.材料与方法

1.1.材料和试剂

甾醇、油酸、油酸甲酯和三油酸甘油酯及固定化脂肪酶LipozymeIM均购自Sigma公司，固定化脂肪酶Novozym 435购自诺维信公司，其他试剂药品均为分析纯。

1.2.方法

精确称量一定量的植物甾醇、脂肪酸或脂肪酸甲酯或三油酸甘油酯及脂肪酶Novozym435或Lipozyme IM，通过磁力搅拌在有螺旋盖真空管中进行40，60和80℃及不同反应条件的试验，真空为30 mbar，反应完成后，在3000～4000r/min条件下离心20min，取出上层反应物。

1.3.转换率的测定

在反应过程中每隔2小时收集样品，然后注入气相色谱并使用下列公式计算转换率(％)。

转换率(％)＝(谷甾醇酯面积/谷甾醇面积+谷甾醇酯面积)×100

谷甾醇和谷甾醇酯使用标准试剂确定，峰面积与浓度成比例。

2.结果与讨论

酯化和酯交换反应和脂肪酶催化技术，已广泛用于有机合成和脂肪及其他脂肪转化。在本发明中，使用固定化脂肪酶Lipozyme IM和Novozym 435作为催化剂，在真空、无溶剂、无添加水的反应条件下，对甾醇与油酸、油酸甲酯和三油酸酯的酯化和酯交换合成植物甾醇酯的技术条件进行了研究。

2.1.反应温度对转换率的影响

反应温度是影响转换率的一个主要因素。图1和2总结了在真空和不同温度条件下，采用固定化脂肪酶Novozym 435和Lipozyme IM催化，在甾醇与不同的酰基供体在酯化反应和酯交换反应中的转换率。图1显示了在使用酶Novozym 435催化的条件下，反应温度对油酸和油酸甲酯与甾醇酯化和酯交换转换率的影响，结果显示反应温度对转换率影响显著，在40和60℃条件下转换率明显下降，在80℃反应条件下，油酸与甾醇酯化的转换率达到了88.7％，油酸甲酯与甾醇酯交换的转换率达到了99.2％，转换率的增加随着温度的升高而增加，在使用酶Lipozym IM催化的条件下，反应温度对油酸、油酸甲酯和三油酸甘油酯的酯化和酯交换的转换率也显示了相似的影响(见图2)。

2.2.反应时间对转换率的影响

反应时间是影响转换率的另一主要因素。反应的时间过短，酯化和酯交换反应不完全；反应时间过长，影响其品质，并且会造成资源的浪费。图3显示了在使用酶Lipozym IM催化的条件下，反应时间对油酸和油酸甲酯及三油酸甘油酯与甾醇酯化和酯交换转换率的显著影响，随着时间的增加，转换率快速上升，反应时间24h，已达到了较高的转换率，其中油酸与谷甾醇酯化率达到了63.5％，油酸甲酯与谷甾醇酯的酯交换率达到了97.3％，三油酸甘油酯与谷甾醇酯的酯交换率达到了90.1％。反应时间48h后，转换率分别缓慢增加到各自的最高值。

2.3.酶添加量对转换率的影响

图4和图5给出的数据表明，在真空30mbar和温度80℃，使用固定化脂肪酶Novozym 435和Lipozyme IM为催化剂，采用油酸甲酯作为酰基供体的条件下，不同的酶添加量(0.4％、0.6％、0.8％、1％和1.2％)对油酸甲酯与甾醇酯交换转换率的影响。结果显示在酶添加量1％的条件下，两种酶的催化效果相近，最高的酯交换率均达到约98％，试验结果显示在酶用量0.4-1％的范围内，转换率随着脂肪酶添加的比例的增加而增加。

2.4.甾醇添加量对转换率的影响

图6显示在真空30mbar和80℃，使用固定化脂肪酶Lipozyme IM作为催化剂的条件下，甾醇添加量对酯交换转换率的影响，结果表明甾醇添加量在2-7％的范围内，对酯交换转换率有显著影响，即酯交换转换率随着甾醇添加量的增加而显著增加，在5.6％的添加量达到了较高的转换率。

2.5.酶重复使用次数对转换率的影响

图7显示在真空30mbar和80℃，使用固定化脂肪酶Novozym 435和Lipozyme IM为催化剂的条件下，脂肪酶重复使用酯交换反应的程度的影响。显而易见，在重复使用过程中Novozyme 435失去了一些活性，然而，即使重复使用10次，仍保留40％的活性。Lipozyme IM酶经过10次酯交换反应的重复使用，仍保留大部分活性。

3.结论

在真空，无溶剂、无添加水的反应条件下，使用固定化脂肪酶Lipozyme IM和Novozym 435作为催化剂，经过酯化和酯交换生物合成植物甾醇酯的研究，考察了在真空和不同脂肪酶的条件下，各种试验条件下对酯化和酯交换反应的影响。研究结果表明反应温度、反应时间和酶用量影响转换率的主要因素，在一定范围内，酯化和酯交换反应的程度强烈随着这些参数的增加而增加。在最佳的反应条件下，植物甾醇与油酸酯化或与油酸甲酯或甘三酯酯交换反应几乎全部转换为相应的长链酰基酯，脂肪酶经过10次酯交换反应的重复使用，仍保留较高的活性。

Claims (8)

1.一种在真空无溶剂体系中酯化和酯交换生物合成甾醇酯的方法，其特征在于所述方法步骤如下：

以固定化脂肪酶Lipozyme IM或Novozym 435作为催化剂，甾醇与酰基供体：油酸酯化、油酸甲酯或甘油三酸酯在40～80℃的真空条件下反应10～50h，控制酶添加量为总反应物质量的0.4～1％，甾醇添加量为总反应物质量的2～7％。

2.根据权利要求1所述的在真空无溶剂体系中酯化和酯交换生物合成甾醇酯的方法，其特征在于所述催化剂为固定化脂肪酶Lipozyme IM。

3.根据权利要求1所述的在真空无溶剂体系中酯化和酯交换生物合成甾醇酯的方法，其特征在于所述催化剂为固定化脂肪酶Lipozyme IM。

4.根据权利要求1所述的在真空无溶剂体系中酯化和酯交换生物合成甾醇酯的方法，其特征在于所述反应温度为80℃。

5.根据权利要求1所述的在真空无溶剂体系中酯化和酯交换生物合成甾醇酯的方法，其特征在于所述真空度为30mbar。

6.根据权利要求1所述的在真空无溶剂体系中酯化和酯交换生物合成甾醇酯的方法，其特征在于所述反应时间为48h。

7.根据权利要求1所述的在真空无溶剂体系中酯化和酯交换生物合成甾醇酯的方法，其特征在于所述酶添加量为1％。

8.根据权利要求1所述的在真空无溶剂体系中酯化和酯交换生物合成甾醇酯的方法，其特征在于所述甾醇添加量5.6％。