CN108796023A - 一种高纯度植物甾醇单体酯的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了及一种高纯度植物甾醇单体酯的制备方法，包括，制备植物甾醇单体酯粗品：植物甾醇单体和不饱和脂肪酸甲酯经脂肪酶催化发生转酯化反应，得到植物甾醇单体酯粗品，其中，所述的植物甾醇单体纯度为98％以上；植物甾醇单体酯的纯化：植物甾醇单体酯粗品经硅胶柱层析处理，得到所述高纯度植物甾醇单体酯。本发明合成工艺简便，反应条件温和，无任何有机溶剂的添加和消耗，降低了生产成本，对设备无特殊要求，适合大规模工业化生产。

Description

一种高纯度植物甾醇单体酯的制备方法

技术领域

本发明属于植物甾醇单体酯的合成及纯化技术领域，具体涉及一种高纯度植物甾醇单体酯的制备方法。

背景技术

近年来，人们生活水平不断提高，营养过剩和饮食结构不合理导致的患心血管疾病人数不断激增，《中国心血管病报告2007》指出：“估计我国心血管病患者人数至少2.3亿，每10个成年人中有2人患有心血管病。”大量研究表明血液中胆固醇浓度超标，尤其是低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)浓度超标，是多种心脑血管疾病诱发的主因。研究表明，每天进食1.5～3.0g植物甾醇可使机体血浆总胆固醇和LDL-c水平降低10～20％。然而，膳食中植物甾醇的吸收率仅为5％左右，日常膳食对植物甾醇的摄入量达不到降低人体胆固醇的需要量且生物利用率较差，而游离植物甾醇难溶于水和难溶于油脂的物理性质使其难于应用于食品工业中。

植物甾醇酯是植物甾醇的衍生物之一，同样具备降低血浆胆固醇和LDL-c水平的生理活性。目前，主要通过把植物甾醇衍生化为植物甾醇酯，植物甾醇酯具备更优的脂溶性和降胆固醇功效，且吸收率是植物甾醇的5倍，在提高生物利用率的同时还能改善产品的外观及口感，能够弥补植物甾醇在食品应用中的缺陷。目前，植物甾醇酯的合成方法主要有化学法和酶法。化学法通常使用强酸、强碱、烷氧基碱金属化合物等作为催化剂，反应需高温，易产生高温，且高温致使产物色泽变深，仍需脱色等工艺处理，生产工艺繁琐，易造成环境污染。酶法反应条件温和，利用酶的催化专一性，无副产物生成。目前，酶法催化主要是将植物甾醇和脂肪酸直接酯化合成甾醇酯产品，但由于甾醇在常用反应溶剂体系中溶解度较差，往往需要添加较多的溶剂才能将植物甾醇完全溶解于反应体系内，使得反应底物在体系内过于分散，不利于提高反应效率，抑制酯化反应效率。专利CN1982326A、CN101538306将含富含油酸的食用油与短链醇在催化剂作用下进行醇解，得到富含油酸的脂肪酸短链酯，如脂肪酸甲酯或乙酯，再与植物甾醇进行酶法酯交换反应，由于植物甾醇在脂肪酸酯中的溶解度明显优于正己烷等常规反应溶剂，因此解决了底物在反应体系中溶解性的问题，但以食用油为原料，在分离纯化植物甾醇酯时，非油酸的脂肪酸种类较多，不利于得到高纯度的单一的植物甾醇油酸酯。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。

因此，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种高纯度植物甾醇单体酯的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种高纯度植物甾醇单体酯的制备方法，其包括，

制备植物甾醇单体酯粗品：植物甾醇单体和不饱和脂肪酸甲酯经脂肪酶催化发生转酯化反应，其中，所述的植物甾醇单体纯度为98％以上；

植物甾醇单体酯的纯化：植物甾醇单体酯粗品经硅胶柱层析处理，得到所述高纯度植物甾醇单体酯。

作为本发明所述的高纯度植物甾醇单体酯的制备方法的一种优选方案：所述植物甾醇单体包括豆甾醇单体、β-谷甾醇单体、菜油甾醇单体中的一种。

作为本发明所述的高纯度植物甾醇单体酯的制备方法的一种优选方案：所述脂肪酶包括假丝酵母类脂肪酶CRL；所述植物甾醇单体和不饱和脂肪酸甲酯的反应摩尔比为1：1～1：10；所述脂肪酶的用量为反应底物总质量的2％～12％；

作为本发明所述的高纯度植物甾醇单体酯的制备方法的一种优选方案：所述转酯化反应，反应温度为35～85℃，反应时间为24～96h。

作为本发明所述的高纯度植物甾醇单体酯的制备方法的一种优选方案：所述植物甾醇单体酯的纯化，其中，硅胶柱层析所用填料为100～300目硅胶，流动相为正己烷：乙酸乙酯：乙酸，其比例为80～90：10～20：0.01，流速为30～40mL/h。

作为本发明所述的高纯度植物甾醇单体酯的制备方法的一种优选方案：还包括，

豆甾醇的纯化：将植物甾醇加入有机溶剂中，升温，平衡，降温，养晶，干燥，得到豆甾醇粗品；所述有机溶剂包括环己酮、异丁醇、正戊醇中的一种；所述植物甾醇与所述有机溶剂的质量体积比为1：3～1：5。

精制：将所述豆甾醇粗品加入有机溶剂中，平衡，超声预处理，降温，养晶，干燥，得到所述豆甾醇单体；其中，所述有机溶剂包括丙酮，所述植物甾醇与所述有机溶剂的质量体积比为1：20～1：30。

作为本发明所述的高纯度植物甾醇单体酯的制备方法的一种优选方案：所述富集，其中，所述升温，其温度为60～70℃；所述平衡，为恒温平衡15～60min；所述降温，其降温速率为5～10℃/h，温度降至20～35℃；所述养晶，温度为20～35℃，时间为8～24h。

作为本发明所述的高纯度植物甾醇单体酯的制备方法的一种优选方案：所述干燥，为真空干燥4～6h，真空度为0.06MPa，干燥温度为65～70℃。

作为本发明所述的高纯度植物甾醇单体酯的制备方法的一种优选方案：所述精制，其中，所述平衡，为恒温平衡15～60min；所述降温，为自然降温至20～35℃；所述养晶，温度为20～35℃，时间为4～8h。

作为本发明所述的高纯度植物甾醇单体酯的制备方法的一种优选方案：所述超声预处理，超声处理时间为1～3min，超声频率为75～100Hz

本发明的有益效果：本发明用脂肪酸甲酯作为反应底物，由于植物甾醇在脂肪酸甲酯中的溶解性较好，因此脂肪酸甲酯既为反应底物，又可替代反应的溶剂，植物甾醇溶解在脂肪酸甲酯中，经脂肪酶的催化，能够高效地进行转酯化反应得到植物甾醇单体酯，整个转酯化反应无任何有机溶剂的添加，产品安全性高，特别适合应用于食品、医药等安全性要求高的领域。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为实施例1混合植物甾醇经富集和精制后得到的豆甾醇单体的GC-MS色谱图。

图2为本发明富集过程中不同溶剂制得的豆甾醇粗品的纯度图。

图3为本发明精制过程中不同溶剂制得的豆甾醇产品的纯度图。

图4为超声时间对本发明豆甾醇得率的影响图。

图5为超声预处理频率对豆甾醇得率的影响图。

图6为实施例1油酸豆甾醇酯的TLC薄层色谱板中产物合成的验证图

图7为实施例1油酸豆甾醇酯的HPLC-ELSD色谱图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1：油酸豆甾醇酯的合成

称取自制纯度98％以上的豆甾醇0.5g，油酸甲酯1.0g于夹层酶反应器中，添加豆甾醇和油酸甲酯总质量8％的游离脂肪酶CRL作为催化剂，控制温度为55℃，恒温反应48h，经转酯化反应所得油酸豆甾醇酯的酯化率约为70.65％，所得反应产物经硅胶柱层析进行分离纯化，选用200目硅胶作为填料，流动相为正己烷：乙酸乙酯：乙酸，其比例为88：12：0.01(v/v/v)，流速为40mL/h，按一管15min收集洗脱液，将目标产物合并后，旋转蒸发并干燥，得到纯度98％以上的油酸豆甾醇酯。

图6为实施例1油酸豆甾醇酯的TLC薄层色谱板中产物合成的验证图，薄板上层的斑块为油酸豆甾醇酯，下层的斑块为未反应的豆甾醇和过量的油酸甲酯。图7为实施例1油酸豆甾醇酯的HPLC-ELSD色谱图，图中保留时间为7.688min的色谱峰为油酸豆甾醇酯，经峰面积归一化法测定其纯度为98.34％。

实施例2：油酸豆甾醇酯的合成

称取自制纯度98％以上的豆甾醇0.5g，油酸甲酯1.0g于夹层酶反应器中，添加豆甾醇和油酸甲酯总质量12％的游离脂肪酶CRL作为催化剂，控制温度为45℃，恒温反应48h，经转酯化反应所得油酸豆甾醇酯的酯化率约为86.17％所得反应产物经硅胶柱层析进行分离纯化，选用200目硅胶作为填料，流动相为正己烷：乙酸，其比例为88：0.01(v/v/v)，流速为40mL/h，按一管15min收集洗脱液，将目标产物合并后，旋转蒸发并干燥，得到纯度95％以上的油酸豆甾醇酯，其中由于单一流动无法将油酸豆甾醇酯和过量豆甾醇完全分离开，导致最终的油酸豆甾醇酯中仍残留有豆甾醇的存在，致使纯度降低。

实施例3：油酸豆甾醇酯的合成

称取自制纯度98％以上的豆甾醇0.5g，油酸甲酯1.0g于夹层酶反应器中，添加豆甾醇和油酸甲酯总质量12％的游离脂肪酶CRL作为催化剂，控制温度为45℃，恒温反应48h，经转酯化反应所得油酸豆甾醇酯的酯化率约为86.17％所得反应产物经硅胶柱层析进行分离纯化，选用200目硅胶作为填料，流动相为正己烷：乙酸乙酯：乙酸，其比例为88：12：0.01(v/v/v)，流速为40mL/h，按一管15min收集洗脱液，将目标产物合并后，旋转蒸发并干燥，得到纯度98％以上的油酸豆甾醇酯。通过将流动相从单一溶剂复配成两种不同有机溶剂，能够改变流动相极性，从而使油酸豆甾醇酯和豆甾醇完全分离开，经分离纯化后的油酸豆甾醇酯纯度显著提高，无豆甾醇的残留。

实施例4：油酸豆甾醇酯的合成

称取自制99.49％纯度豆甾醇0.3g，99％油酸甲酯0.6g于夹层酶反应器中，添加豆甾醇和油酸甲酯总质量10％的游离脂肪酶CRL作为催化剂，控制温度为45℃，恒温反应24h，经转酯化反应所得油酸豆甾醇酯的酯化率约为91.47％所得反应产物经硅胶柱层析进行分离纯化，选用200目硅胶作为填料，流动相为正己烷：乙酸乙酯：乙酸，其比例为88：12：0.01(v/v/v)，流速为40mL/h，按一管15min收集洗脱液，将目标产物合并后，旋转蒸发并干燥，得到纯度99.32％以上的油酸豆甾醇酯。

实施例5：亚油酸菜油甾醇酯的合成

称取自制纯度98％以上的菜油甾醇0.5g，亚油酸甲酯1.5g于夹层酶反应器中，添加菜油甾醇和亚油酸甲酯总质量12％的固定化的L435脂肪酶作为催化剂，控制温度为55℃，恒温反应24h，所得反应产物经硅胶柱层析进行分离纯化，选用100目硅胶作为填料，流动相为正己烷：乙酸乙酯：乙酸，其比例为85：15：0.01(v/v/v)，流速为30mL/h，按一管10min收集洗脱液，将目标产物合并后，旋转蒸发并干燥，重复硅胶柱层析操作2次，得到纯度98％以上的油酸豆甾醇酯。

实施例6：共轭亚油酸植物甾醇酯的合成

称取自制纯度98％以上的植物甾醇0.5g，共轭亚油酸甲酯1.0g于夹层酶反应器中，添加植物甾醇和共轭亚油酸甲酯总质量10％的游离CRL脂肪酶作为催化剂，控制温度为50℃，恒温反应72h，所得反应产物经硅胶柱层析进行分离纯化，选用300目硅胶作为填料，流动相为正己烷：乙酸乙酯：乙酸，其比例为80：20：0.01(v/v/v)，流速为30mL/h，按一管15min收集洗脱液，将目标产物合并后，旋转蒸发并干燥，重复硅胶柱层析操作2次，得到纯度98％以上的共轭亚油酸甾醇酯。

实施例7：纯度98％以上的豆甾醇的制备方法

本发明实施例1～4中纯度98％以上的自制豆甾醇的制备方法：

富集：称取100g植物甾醇(纯度98.3％，其中豆甾醇含量26.99％)于500mL结晶夹层反应釜中，加入350mL分析纯正戊醇中65℃混合溶解，搅拌均匀后平衡30min，利用低温水浴槽进行程序降温至25℃，降温速率为10℃/h，恒温养晶8h，得滤饼，置于真空干燥器内65℃干燥4h，真空度为0.06MPa，重复以上条件5次得到95％以上纯度豆甾醇粗品；

精制：称取豆甾醇粗品10g于250mL结晶夹层反应釜中，加入200mL分析纯丙酮中60℃混合溶解，搅拌均匀后平衡30min，转移至超声水浴锅内，超声预处理1.5min，超声频率设置为85Hz，再置于室温下自然冷却至25℃，养晶4h，得滤饼，置于真空干燥器内65℃干燥4h，真空度为0.06MPa，重复以上条件2次得到99％以上纯度豆甾醇。

下表1中列出了豆甾醇纯度的测定结果，纯度测定是用气相色谱法。

表1豆甾醇重结晶的纯度和得率

图1为实施例1混合植物甾醇经富集和精制后得到的豆甾醇单体的GC-MS色谱图，图中保留时间为13.87min的色谱峰为豆甾醇，经峰面积归一化法测得纯度为99.15％。

实施例8：纯度98％以上的豆甾醇的制备方法

本发明实施例1～4中纯度98％以上的自制豆甾醇的制备方法：

富集：称取100g植物甾醇(纯度98.3％，其中豆甾醇含量26.99％)于500mL结晶夹层反应釜中，加入300mL分析纯环己酮中70℃混合溶解，搅拌均匀后平衡30min，利用低温水浴槽进行程序降温至25℃，降温速率为5℃/h，恒温养晶16h，得滤饼，置于真空干燥器内65℃干燥4h，真空度为0.06MPa，重复以上条件6次得到94.58％以上纯度豆甾醇粗品。

精制：称取豆甾醇粗品3g于250mL结晶夹层反应釜中，加入180mL分析纯丙酮中60℃混合溶解，搅拌均匀后平衡30min，转移至超声水浴锅内，超声预处理4min，超声频率设置为90Hz，再置于室温下自然冷却至25℃，养晶4h，得滤饼，置于真空干燥器内65℃干燥2h，真空度为0.06MPa，重复以上条件3次得到99.50％以上纯度豆甾醇。

表2豆甾醇重结晶的纯度和得率

图2为本发明富集过程中不同溶剂制得的豆甾醇粗品的纯度。图3为本发明精制过程中不同溶剂制得的豆甾醇产品的纯度。图4为超声时间对本发明豆甾醇得率的影响图，从图4可以看出，超声预处理后豆甾醇的得率随时间的增加而提高，但当超声时间超过5min时，得率开始下降。超声预处理4min相较于未进行超声预处理所得的精制豆甾醇得率显著提升。图5为超声预处理频率对豆甾醇得率的影响图，从图5可以看出，超声频率提高，豆甾醇精制所得得率越高，但高于90Hz时，则得率下降，可见90hz为豆甾醇精制的最优超声频率。

值得一提的是，传统植物甾醇脂肪酸酯的合成多以植物甾醇与脂肪酸进行直接酯化反应得到，由于植物甾醇在常规的反应溶剂中，如正己烷、异辛烷等中溶解性较差，往往需要添加较多的溶剂才能将植物甾醇完全溶解于反应体系内，使得反应底物在体系内过于分散，不利于提高反应效率，抑制酯化反应效率。在我方发明过程中，以不饱和脂肪酸甲酯作为反应底物和反应“溶剂”介质，由于植物甾醇在不饱和脂肪酸甲酯中的溶解性较好，因此无需再添加任何反应溶剂，直接以无溶剂的形式，经脂肪酶的催化，植物甾醇与不饱和脂肪酸甲酯能够高效地进行转酯化反应得到植物甾醇单体酯。由此可见，本发明合成工艺简便，反应条件温和，无任何有机溶剂的添加和消耗，降低了生产成本，对设备无特殊要求，适合大规模工业化生产。

本发明中，分步结晶法操作简单，选择性好，产品成本较低，豆甾醇得率较高，使高纯度豆甾醇的制备得以实现，且工业化生产前景广阔。本发明超声处理与分步结晶法协同作用，有效促进晶体成核，改变溶液中晶体的生长速率，防止晶体聚结，缩短结晶时间并提高结晶产率；同时，超声处理能够改变晶体粒度，缩短结晶过滤周期，加快晶体干燥速度，大大缩短豆甾醇的生产工艺周期，同时溶剂的选择也尤为关键，使得本发明在获得高纯度豆甾醇的同时显著提高了得率。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种高纯度植物甾醇单体酯的制备方法，其特征在于：包括，

制备植物甾醇单体酯粗品：植物甾醇单体和不饱和脂肪酸甲酯经脂肪酶催化发生转酯化反应，得到植物甾醇单体酯粗品，其中，所述的植物甾醇单体纯度为98％以上；

植物甾醇单体酯的纯化：植物甾醇单体酯粗品经硅胶柱层析处理，得到所述高纯度植物甾醇单体酯。

2.如权利要求1所述的高纯度植物甾醇单体酯的制备方法，其特征在于：所述植物甾醇单体包括豆甾醇单体、β-谷甾醇单体、菜油甾醇单体中的一种。

3.如权利要求2所述的高纯度植物甾醇单体酯的制备方法，其特征在于：所述脂肪酶包括假丝酵母类脂肪酶CRL；所述植物甾醇单体和不饱和脂肪酸甲酯的反应摩尔比为1：1～1：10；所述脂肪酶的用量为反应底物总质量的2％～12％。

4.如权利要求1～3任一所述的高纯度植物甾醇单体酯的制备方法，其特征在于：所述转酯化反应，反应温度为35～85℃，反应时间为24～96h。

5.如权利要求1～3任一所述的高纯度植物甾醇单体酯的制备方法，其特征在于：所述植物甾醇单体酯的纯化，其中，硅胶柱层析所用填料为100～300目硅胶，流动相为正己烷：乙酸乙酯：乙酸，其比例为80～90：10～20：0.01，流速为30～40mL/h。

6.如权利要求2或3所述的高纯度植物甾醇单体酯的制备方法，其特征在于：还包括，

豆甾醇的纯化：将植物甾醇加入有机溶剂中，升温，平衡，降温，养晶，干燥，得到豆甾醇粗品；所述有机溶剂包括环己酮、异丁醇、正戊醇中的一种；所述植物甾醇与所述有机溶剂的质量体积比为1：3～1：5。

精制：将所述豆甾醇粗品加入有机溶剂中，平衡，超声预处理，降温，养晶，干燥，得到所述豆甾醇单体；其中，所述有机溶剂包括丙酮，所述植物甾醇与所述有机溶剂的质量体积比为1：20～1：30。

7.如权利要求6所述的高纯度植物甾醇单体酯的制备方法，其特征在于：

所述富集，其中，所述升温，其温度为60～70℃；所述平衡，为恒温平衡15～60min；所述降温，其降温速率为5～10℃/h，温度降至20～35℃；所述养晶，温度为20～35℃，时间为8～24h。

8.如权利要求7所述的超声辅助分步结晶制备高纯度豆甾醇的方法，其特征在于：所述干燥，为真空干燥4～6h，真空度为0.06MPa，干燥温度为65～70℃。

9.如权利要求6所述的超声辅助分步结晶制备高纯度豆甾醇的方法，其特征在于：所述精制，其中，所述平衡，为恒温平衡15～60min；所述降温，为自然降温至20～35℃；所述养晶，温度为20～35℃，时间为4～8h。

10.如权利要求6所述的超声辅助分步结晶制备高纯度豆甾醇的方法，其特征在于：所述超声预处理，超声处理时间为1～3min，超声频率为75～100Hz。