CN104543924A - 发酵果蔬渣生产风味物质的方法及由此得到的风味物质 - Google Patents

Abstract

本发明提供了制备天然香精、风味料或风味提取液的方法。本发明提供的方法包括使用里氏木霉（Trichoderma？reesei）发酵果蔬渣。使用本发明的方法，能获得具有愉悦果香的天然香精或风味料或风味提取液，采用该方法制备天然香精、风味料或风味提取液可有效降低成本。将天然香精、风味料或风味提取液加入豆奶中，发现其风味非常协调，既有一种愉悦的水果风味，又有一种浓郁的奶香味。

Description

发酵果蔬渣生产风味物质的方法及由此得到的风味物质

技术领域

本发明涉及果蔬渣处理领域，具体而言，本发明涉及利用里氏木霉对果蔬渣进行发酵以生产风味物质的方法、里氏木霉在生产风味物质中的应用以及由此得到的风味物质。

背景技术

果渣是果品加工行业的副产物，包括果皮、果核及残余果肉，一般含有水分、碳水化合物、果胶、粗纤维、蛋白质、钾、磷等，营养丰富。每年有大量果渣产生，虽然有部分果渣被用作饲料、用于提取果胶、生产柠檬酸及多酚等，但大部分果渣当作废弃物丢弃。

由于果渣含水丰富且富含可溶性养分，极易滋生微生物，所以废弃的果渣易腐变而污染环境，同时也造成了极大的资源浪费。

为充分利用果蔬渣，国内外科研工作者进行了大量和深入的研究，并取得了一定的成果。例如，可利用苹果渣，发酵生产乳酸（BEATRIZ N,et.al.Production of L-lactic Acid andOligomeric Compounds from Apple Pomace by SimultaneousSaccharification and Fermentation:A Response Surface MethodologyAssessment.J.Agric.Food Chem.2007,55,5580-5587）或燃料乙醇（CN101085993A），利用混合菌（CN102028097A）以固固法（CN1673343A，CN1640291A，CN1470181A）或液固法发酵生产蛋白饲料（CN1663421A）或者益生菌制剂（CN101851584A），或直接用作饲料，用于提取果胶、苹果酚、柠檬酸等（石勇，苹果渣的开发利用，农产品加工，2011,9）。

蔬菜渣，是指工业生产过程中提取完风味物质、色素或者淀粉等残留的渣，例如红薯渣、紫薯渣和豆渣等。其中，红薯渣和紫薯渣，作为淀粉加工的副产品，目前只有部分被利用来提取膳食纤维或者动物饲料，其余全部丢弃，造成环境污染和极大的资源浪费（高路等，分子筛-微生物发酵结合法制备紫薯渣膳食纤维研究，粮食与油脂，2012年第3期；周一冉，年产500吨红薯渣膳食纤维生产线设计及产业化实施，南昌大学硕士学位论文，2011）。我国是农业生产大国，薯类资源丰富，如能将薯渣进行再加工，则有助于将资源优势转化成经济优势。

豆渣是大豆制品（如豆奶、豆腐、豆皮、腐竹）等加工的主要副产品，每年全球的产量都很大。豆渣中一般含水份85%，蛋白质3.0%，脂肪0.5%，碳水化合物（纤维素、多糖等）8.0%，此外，还含有钙、磷、铁等矿物质，营养非常丰富，但因其含有许多抗营养因子（如胰蛋白酶抑制素、致甲状腺肿素、凝血素），豆腥味重，口感粗糙，深加工困难，并且豆渣水分含量高，不易贮存，因此只有少量豆渣用作家畜的饲料，大部分都被废弃，造成了资源的浪费和大量的环境污染。

目前，国内外对豆渣的深加工主要集中在酶解法和微生物发酵法，酶解法在国外研究比较多，主要是通过蛋白酶等对豆渣水解，获得功能性小肽；微生物发酵在国内研究较多，主要为：糖化菌粉、核黄素强化剂、豆渣酱油、豆渣酱、腐乳、功能性食品、可食用纸以及豆渣发酵产品用于菌体蛋白饲料的生产。其中豆渣发酵产品大多用于菌体蛋白饲料的生产，如用于蛋白饲料及饲料添加剂等。

里氏木霉（Trichoderma reesei，anamorph；Hypocrea jecorina）是产纤维素酶的主要工业生产菌，具有代谢能力多样化、对人体没有毒性以及生长快、无性繁殖等竞争性生长的重要特征。目前尚没有报道过使用里氏木霉处理果蔬渣的报道。

发明内容

本发明的发明人发现，以果蔬渣（例如苹果渣、紫薯渣、椰肉渣、豆渣等）为原料，以里氏木霉为发酵剂进行发酵，其发酵液具有愉悦的水果香味，进一步处理发酵液，可获得具有愉悦果香的风味料、风味提取液或天然香精，采用该方法制备天然香精、风味料或风味提取液可有效降低成本。将天然香精、风味料或风味提取液加入豆奶中，发现其风味非常协调，既有一种愉悦的水果风味，又有一种浓郁的奶香味。

因此，本发明的目的在于，提供一种制备天然香精的方法。

本发明提供的制备天然香精的方法包括使用里氏木霉（Trichoderma reesei）发酵果蔬渣和从发酵液提取天然香精。

在本发明的一个实施方案中，该方法还包括纯化天然香精的步骤。

在本发明的一个实施方案中，该方法中使用的里氏木霉选自保藏号为NBRC31326、GIM3.498、GIM3.538、CBS383.78、CICC40358、CICC40360、CICC40929、CICC41491、CICC41493的里氏木霉。

在本发明的一个实施方案中，使用的果蔬渣可以是果渣、蔬菜渣或豆渣或其组合。更具体地，使用的果蔬渣可以是苹果渣、葡萄渣、紫薯渣、红薯渣、椰子渣、芹菜渣、番茄渣、黄瓜渣、青椒渣、甜椒渣、苦瓜渣、柠檬渣、胡萝卜渣、芦荟渣、菠萝渣和/或豆渣中的一种或多种。

在本发明的一个实施方案中，里氏木霉以果蔬渣或果蔬渣培养基为底物进行发酵。

本发明的另一个目的在于，提供一种制备风味料的方法。

本发明提供的制备风味料的方法包括使用里氏木霉（Trichoderma reesei）发酵果蔬渣和从发酵液提取风味料。

在本发明的一个实施方案中，使用的里氏木霉选自保藏号为NBRC31326、GIM3.498、GIM3.538、CBS383.78、CICC40358、CICC40360、CICC40929、CICC41491、CICC41493的里氏木霉。

在本发明的一个实施方案中，使用的果蔬渣可以是果渣、蔬菜渣或豆渣或其组合。更具体地，使用的果蔬渣可以是苹果渣、葡萄渣、紫薯渣、红薯渣、椰子渣、芹菜渣、番茄渣、黄瓜渣、青椒渣、甜椒渣、苦瓜渣、柠檬渣、胡萝卜渣、芦荟渣、菠萝渣和/或豆渣中的一种或多种。

在本发明的一个实施方案中，所述里氏木霉以果蔬渣或果蔬渣培养基为底物进行发酵。

本发明的另一个目的在于，提供一种制备风味提取液的方法。

本发明提供的制备风味提取液的方法包括使用里氏木霉（Trichoderma reesei）发酵果蔬渣或果蔬渣培养基的步骤；优选地，所述方法还包括从发酵产物制备风味提取液的步骤。

在本发明的一个实施方案中，使用的里氏木霉选自保藏号为NBRC31326、GIM3.498、GIM3.538、CBS383.78、CICC40358、CICC40360、CICC40929、CICC41491、CICC41493的里氏木霉。

在本发明的一个实施方案中，使用的果蔬渣可以是果渣、蔬菜渣或豆渣或其组合。更具体地，使用的果蔬渣可以是苹果渣、葡萄渣、紫薯渣、红薯渣、椰子渣、芹菜渣、番茄渣、黄瓜渣、青椒渣、甜椒渣、苦瓜渣、柠檬渣、胡萝卜渣、芦荟渣、菠萝渣和/或豆渣中的一种或多种。

在本发明的一个实施方案中，所述里氏木霉以果蔬渣或果蔬渣培养基为底物发酵。

本发明的另一个目的在于，提供通过以上述方法制备的天然香精、风味料或风味提取液。

本发明的另一个目的在于，提供上述天然香精、风味料或风味提取液用于制备蔬菜汁、水果原浆、冰淇淋、饮料、烘焙食品、果味油脂或日化产品的用途。

本发明的另一个目的在于，提供包含上述天然香精、风味料或风味提取液的产品。在本发明的一个实施方案中，所述产品为蔬菜汁、水果原浆、冰淇淋、饮料、烘焙食品、果味油脂、或日化产品。

本发明的另一个目的在于，提供里氏木霉（Trichoderma reesei）用于制备天然香精、风味料或风味提取液的用途。对于此用途，在本发明的一个实施方案中，使用的里氏木霉选自保藏号为NBRC31326、GIM3.498、GIM3.538、CBS383.78、CICC40358、CICC40360、CICC40929、CICC41491、CICC41493的里氏木霉。

附图说明

图1为20%豆渣发酵液的GC-MS总离子流图，化合物经过NIST11谱库鉴定。

图2为20%豆渣发酵前后的SDS-聚丙烯酰胺凝胶图，其中，泳道1为发酵前的电泳结果，泳道2为发酵后的电泳结果。

图3为40%豆渣发酵液的GC-MS总离子流图，化合物经过NIST11谱库鉴定。

图4为苹果渣发酵天然香精GC-MS总离子流图，化合物经过NIST11谱库鉴定。

图5为紫薯渣发酵天然香精GC-MS总离子流图，化合物经过NIST11谱库鉴定。

图6为椰肉渣发酵天然香精GC-MS总离子流图，化合物经过NIST11谱库鉴定。

具体实施方式

本文所公开的“范围”以下限和/或上限的形式界定。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和/或一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60－120和80－110的范围，理解为60－110和80－120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1－3、1－4、1－5、2－3、2－4、和2－5。

在本发明中，除非有其他说明，组合物的各组分的含量范围以及其优选范围之间可以相互组合形成新的技术方案。

在本发明中，除非有其他说明，“其组合”表示多种所列组分的混合物，例如两种、三种、四种以及直到最大可能的多组分混合物。

在本发明中，除非有其他说明，所有“份”和百分数（%）都指重量百分数。

在本发明中，除非有其他说明，所有组合物中各组分的百分数之和为100%。

在本发明中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。

在本发明中，除非有其他说明，整数数值范围“a-b”表示a到b之间的任意整数组合的缩略表示，其中a和b都是整数。例如整数数值范围“1-N”表示1、2……N，其中N是整数。

如果没有特别指出，本说明书所用的术语“一种”指“至少一种”。

如果没有特别指出，本发明所述的百分数（包括重量百分数）的基准都是所述组合物的总重量。

在本文中，除非另有说明，各组分的比例或者重量都指干重。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有步骤可以顺序进行，也可以随机进行，但是优选是顺序进行的。例如，所述方法包括步骤（a）和（b），表示所述方法可包括顺序进行的步骤（a）和（b），也可以包括顺序进行的步骤（b）和（a）。例如，所述提到所述方法还可包括步骤（c），表示步骤（c）可以任意顺序加入到所述方法，例如，所述方法可以包括步骤（a）、（b）和（c），也可包括步骤（a）、（c）和（b），也可以包括步骤（c）、（a）和（b）等。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的“包括”表示开放式，也可以是封闭式。例如，所述“包括”可以表示还可以包含没有列出的其他元件，也可以仅包括列出的元件。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文实施例中的具体数值以及具体物质可与本文描述部分的其他特征结合。例如，本文描述部分提到反应的温度为10-100℃，而实施例提到的反应温度为20℃，那么可以认为本文已经具体公开了10-20℃的范围，或者20-100℃的范围，且该范围可以描述部分的其他特征结合起来形成新的技术方案。又例如，本文描述部分提到一类化合物醇，而实施例提到的具体的醇为乙醇，那么乙醇可以与描述部分的其他特征结合起来形成新的技术方案。

本发明的发明人发现，以果蔬渣（包括但不限于苹果渣、紫薯渣、椰肉渣、豆渣）为原料，以里氏木霉为发酵剂进行发酵，其发酵液具有愉悦的水果香味，进一步处理发酵液，可获得发酵风味料以及具有愉悦果香的风味提取液、风味料或天然香精。将风味提取液、风味料或天然香精加入豆奶等产品中，发现其风味非常协调，既有一种愉悦的水果风味，又有一种浓郁的奶香味。

天然香精制备方法

本发明提供的制备天然香精的方法包括使用里氏木霉（Trichoderma reesei）发酵果蔬渣。

为获得天然香精产品，在本发明的一个实施方案中，还包括纯化天然香精的步骤。对于本领域的技术人员，纯化天然香精的步骤为本领域的常识，具体参数可根据本发明公开的内容结合本领域的公知常识获得。在本发明的一个实施方案中，提取天然香精的方法包括但不限于：固相微萃取、冷压榨法、蒸馏技术、萃取技术、微波萃取技术、吸收法、色谱法、超临界或亚临界萃取技术、以及结晶法。

在本发明的一个实施方案中，使用的里氏木霉包括但不限于：保藏号为NBRC31326、GIM3.498、GIM3.538、CBS383.78、CICC40358、CICC40360、CICC40929、CICC41491、CICC41493的里氏木霉。

在本发明的一个实施方案中，使用的果蔬渣包括但不限于：苹果渣、葡萄渣、紫薯渣、红薯渣、椰子渣、芹菜渣、番茄渣、黄瓜渣、青椒渣、甜椒渣、苦瓜渣、柠檬渣、胡萝卜渣、芦荟渣、菠萝渣和/或豆渣中的一种或多种。

在本发明中，里氏木霉可直接使用果蔬渣为底物进行发酵，也可使用果蔬渣培养基为底物进行发酵。果蔬渣培养基既可以为仅包含果蔬渣的培养基，也可以是包含有其他组分的培养基。在本发明的一个实施方案中，里氏木霉以果蔬渣或果蔬渣培养基为底物发酵。

制备风味料的方法

本发明提供的制备风味料的方法包括使用里氏木霉（Trichoderma reesei）发酵果蔬渣和从发酵液提取风味料。

在本发明的一个实施方案中，使用的里氏木霉包括但不限于：保藏号为NBRC31326、GIM3.498、GIM3.538、CBS383.78、CICC40358、CICC40360、CICC40929、CICC41491、CICC41493的里氏木霉。

在本发明的一个实施方案中，使用的果蔬渣包括但不限于：苹果渣、葡萄渣、紫薯渣、红薯渣、椰子渣、芹菜渣、番茄渣、黄瓜渣、青椒渣、甜椒渣、苦瓜渣、柠檬渣、胡萝卜渣、芦荟渣、菠萝渣和/或豆渣中的一种或多种。

在本发明中，里氏木霉可直接使用果蔬渣为底物进行发酵，也可使用果蔬渣培养基为底物进行发酵。果蔬渣培养基既可以为仅包含果蔬渣的培养基，也可以是包含有其他组分的培养基。在本发明的一个实施方案中，里氏木霉以果蔬渣或果蔬渣培养基为底物发酵。

制备风味提取液的方法

本发明提供的制备风味提取液的方法包括使用里氏木霉（Trichoderma reesei）发酵果蔬渣。

在本发明的一个实施方案中，还包括从发酵产物获取风味提取液的步骤。

在本发明的一个实施方案中，使用的里氏木霉包括但不限于：保藏号为NBRC31326、GIM3.498、GIM3.538、CBS383.78、CICC40358、CICC40360、CICC40929、CICC41491、CICC41493的里氏木霉。

在本发明的一个实施方案中，使用的果蔬渣包括但不限于：苹果渣、葡萄渣、紫薯渣、红薯渣、椰子渣、芹菜渣、番茄渣、黄瓜渣、青椒渣、甜椒渣、苦瓜渣、柠檬渣、胡萝卜渣、芦荟渣、菠萝渣和/或豆渣中的一种或多种。

在本发明中，里氏木霉可直接使用果蔬渣为底物进行发酵，也可使用果蔬渣培养基为底物进行发酵。果蔬渣培养基既可以为仅包含果蔬渣的培养基，也可以是包含有其他组分的培养基。在本发明的一个实施方案中，里氏木霉以果蔬渣或果蔬渣培养基为底物发酵。

上述方法中的发酵过程在不高于40℃的温度下进行。优选地，里氏木霉进行发酵的温度为15℃以上。更优选地，里氏木霉进行发酵的温度在20℃～35℃的范围内。更优选地，里氏木霉进行发酵的温度在25℃～30℃的范围内。在以下具体示出的实施方式中，里氏木霉进行发酵的温度为28℃。

产品及用途

本发明提供的天然香精、风味料或风味提取液为采用上述方法制备的天然香精、风味料或风味提取液。

本发明还提供了包含上述天然香精、风味料或风味提取液的产品。

在本发明的一个实施方案中，所述产品为蔬菜汁、水果原浆、冰淇淋、饮料、烘焙食品、果味油脂、或日化产品。在本发明的一个实施方案中，本发明的天然香精、风味料或风味提取液作为香料，被添加至蔬菜汁、水果原浆、冰淇淋、和饮料（包括但不限于豆奶、汽酒等）中。在本发明的一个实施方案中，本发明的天然香精、风味料或风味提取液作为烘焙食品（包括但不限于面包，蛋糕，饼干，奶糖，爆米花，植脂末，糖果，膨化食品等）的风味底料。在本发明的一个实施方案中，本发明的天然香精、风味料或风味提取液被加入油脂中，以制备果味油脂（包括但不限于家庭或食品工业用的调和油、人造奶油、无水酥油、酥皮油、液态酥油、黄油、餐桌奶油等），这些产品形式包括但不限于为液态、块状、粉状、片状、颗粒状等。在本发明的一个实施方案中，本发明的天然香精、风味料或风味提取液用于日化行业中，例如作为日化产品（包括但不限于洗发水、香皂、香水、护肤品等）的调香剂。

本发明还提供上述天然香精、风味料或风味提取液用于制备蔬菜汁、水果原浆、冰淇淋、饮料、烘焙食品、果味油脂或日化产品的用途。

本发明还提供了里氏木霉（Trichoderma reesei）用于制备天然香精、风味料或风味提取液的用途。

在本发明的一个实施方案中，所述里氏木霉（Trichodermareesei）包括但不限于保藏号为NBRC31326、GIM3.498、GIM3.538、CBS383.78、CICC40358、CICC40360、CICC40929、CICC41491、CICC41493的里氏木霉。

在本发明的一个实施方案中，所述里氏木霉（Trichodermareesei）以果蔬渣或果蔬渣培养基为发酵底物。

以上列举的果蔬渣只是优选的实例，本领域技术人员可以在不背离本发明的精神和范围的条件下，设计本发明的其它实施方式和变型，其中可使用未在本文中具体列举的果蔬渣。这些实施方式和变型均在本发明的范围之内。此外，在本发明中，用于发酵的果蔬渣可以单独或与其它组分组合用于发酵。具体的其它组分可由本领域技术人员根据工艺需求和本领域现有技术进行选择。在以下实施方式中，出于示例目的将果蔬渣与其它成分配制成发酵培养基，以促进微生物生长。

实施例

在本发明的下述实施例中，使用的菌株选自里氏木霉（Trichoderma reesei）NBRC31326、GIM3.498、GIM3.538、CBS383.78、CICC40358、CICC40360、CICC40929、CICC41491、CICC41493，这些菌株购自广东省微生物菌种保藏中心。

本发明实施过程：

1.孢子悬浮液制备：将培养成熟的斜面培养基用无菌生理盐水洗涤，倒入装有玻璃珠的无菌三角瓶中，充分震荡后，用灭菌后的脱脂棉滤去菌丝片段，制得单孢子悬浮液。

2.发酵方法

在250ml三角瓶中加入果蔬渣培养基，接入孢子悬浮液，于28℃，静置培养5天，获得发酵液。

3.天然香精制备

对发酵获得的发酵液进行提取，得到发酵风味料，进一步纯化得到发酵天然香精。

本发明中可作为发酵底物的果蔬渣指的是果汁和蔬菜汁工业生产中残留的副产物，包括但不限于：苹果渣、葡萄渣、紫薯渣、红薯渣、椰子渣、芹菜渣、番茄渣、黄瓜渣、青椒渣、甜椒渣、苦瓜渣、柠檬渣、胡萝卜渣、芦荟渣、菠萝渣、豆渣。

在本发明的下述实施例中，使用的气相色谱-质谱联用仪购自安捷伦，型号为7890-5975。

实施例1.里氏木霉孢子悬浮液制备

用无菌生理盐水洗涤培养成熟的CICC40929里氏木霉斜面，倒入装有玻璃珠的无菌三角瓶中，充分震荡后，用灭菌后的脱脂棉滤去菌丝片段，制得CICC40929单孢子悬浮液。用血球计数板计数，将孢子数调整为10⁸个/ml。

采用相似的方法，分别制备获得NBRC31326、GIM3.498、GIM3.538、CBS383.78、CICC40358、CICC40360、CICC41491、CICC41493单孢子悬浮液，并用血球计数板计数，将孢子数调整为10⁸个/ml。

实施例2.20%豆渣发酵

豆渣的制备方法参考赵国志，豆奶的制备，粮食加工，1984,51-58中的方法。

吸取实施例1制备的孢子悬浮液各1ml，分别加入到装有50ml豆渣含量为200g/L的发酵培养基的250ml挡板三角瓶中，放置于旋转摇床上，于200r/min，28℃培养48小时，制备发酵风味料。

其中发酵培养基配方如下：

豆渣200g/L，葡萄糖5g/L，酵母膏5g/L，硫酸铵1.4g/L，KH₂PO₄2.0g/L；MgSO₄.7H₂O0.3g/L，CaCl₂.2H₂O0.3g/L，Mandels微量元素1ml/L，pH5.5。

Mandels微量元素：FeSO₄.7H₂O5g/L，MnSO₄.H₂O1.6g/L；ZnSO₄.7H₂O1.4g/L，CoCl₂2g/L。

对发酵获得的发酵风味料进行感官评定，其中，感官评定方法如下：5个从事风味研究的评价员，采用评分的方法，根据风味强弱分为1-5分，最终评定结果由5个评价员讨论决定，具体方法参考：Pham et al.,Relationships between sensory descriptors,consumeracceptability and volatile flavor compounds of American dry-cured ham.Meat Sci.,2008,80:728-737。

感官评定结果显示：获得的发酵产物具有愉悦的冰糖雪梨风味，香味浓郁，无异味。

采用固相微萃取的方法对发酵结束时发酵产物（即包含豆渣在内的发酵液）中的风味挥发性物质进行提取，具体方法如下：

吸取1ml样品置于5ml顶空瓶中，旋紧带有硅胶隔垫的瓶盖，在60℃萃取30min，萃取头型号：75um Carboxen/PDMS熔融石英SPME萃取头，将老化好的固相微萃取针插入样品瓶中大约1cm，推出萃取头，顶空吸附30min，收进萃取头，拔出针头后直接进样，在290℃解吸10min。

对提取得到的样品进行GC-MS（气相色谱-质谱）检测，以分析其成分，GC-MS检测方法：气质联用仪，Agilent 6890N/5973Agilent（美国公司）；气相色谱条件：HP-5MS（30m x0.25mmx0.25μm膜厚），程序升温：初温60℃，保持2min,后以5℃/min升到150℃，保持1min,再以5℃/min升至300℃，保持10min。载体为高纯He柱流量1.0ml/min，进样口温度250℃，进样量1μl分流50:1，其中，质谱条件：接口温度280℃，EI源，电离电压70eV，离子源温度230℃，扫描范围29-400amu。

并通过内置的NIST谱库检索各峰对应碎片的质荷比、丰度，并得到对应的化合物，检测结果显示，在本实施例中制备获得的发酵产物的挥发性风味涉及25种物质，关键的组成成分为是3-辛醇、3-辛酮。

其中，CICC40929的GC-MS检测结果见图1，CICC40929发酵液中风味组成成分分析结果如表1所示。

表1、20%豆渣发酵液风味组成成分分析

检测所获得的发酵产物的总蛋白含量，结果显示与发酵前豆渣相比，发酵后豆渣中粗蛋白的含量更高，其中，CICC40929的总蛋白含量结果如表2所示。

表2、20%豆渣发酵前后总蛋白含量

其中干基指烘干的豆渣。

通过SDS-PAGE对获得的发酵产物进行蛋白降解分析，结果显示发酵前豆渣中的变应原-伴大豆球蛋白、大分子的大豆球蛋白被最优地去除，表明高分子蛋白质被降解成易被消化吸收的低分子量蛋白质或小肽，其中，CICC40929的蛋白降解情况如图2所示。

实施例3、40%豆渣发酵

吸取实施例1制备的孢子悬浮液各1ml，分别加入到装有50ml豆渣含量为400g/L的发酵培养基的250ml挡板三角瓶中，放置于旋转摇床上，于200r/min，28℃培养48小时，获得发酵风味料。

其中发酵培养基配方如下：

豆渣400g/L，葡萄糖60g/L，酵母膏5g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，MgSO₄.7H₂O 0.5g/L，CaCl₂.2H₂O 0.00132g/L。

按实施例2的方法，对发酵获得的发酵风味料进行感官评定，结果显示：获得的发酵产物具有愉悦的冰糖雪梨风味，香味浓郁，无异味。

按实施例2的方法，采用固相微萃取的方法对发酵结束时发酵产物中的风味挥发性物质进行提取，对提取得到的样品进行GC-MS（气相色谱-质谱）检测，结果显示，在本实施例中制备获得的发酵产物的挥发性风味涉及13种物质，关键的风味物质是3-辛酮、3-辛醇。

其中，CICC40929的GC-MS检测结果见图3，CICC40929发酵液中风味组成成分分析结果如表3所示。

表3、40%豆渣发酵液风味组成成分分析

检测所获得的发酵产物的总蛋白含量，并进行蛋白降解分析，结果显示与发酵前豆渣相比，发酵后豆渣中粗蛋白的含量更高，且发酵前豆渣中的变应原-伴大豆球蛋白、大分子的大豆球蛋白被最优地去除，高分子蛋白质被降解成易被消化吸收的低分子量蛋白质或小肽。

实施例4、不同浓度豆渣发酵比较

按实施例5的方法进行发酵培养，并检测，其中豆渣的浓度分别为5%，10%，60%，和80%。

结果显示，当豆渣含量5%时，风味纯正，无异味，但香味较淡，关键的风味物质是3-辛酮、和3-辛醇；当豆渣含量10%时，风味纯正，香味较浓郁，无异味，关键的风味物质是3-辛酮、和3-辛醇；当豆渣含量60%时，风味纯正，香味浓郁，无异味，关键的风味物质是3-辛酮、和3-辛醇；当豆渣含量为80%时，灭菌后呈半固体状态，发酵结束后有淡淡的氨味。

与发酵前豆渣相比，发酵后豆渣中粗蛋白的含量更高，且发酵前豆渣中的变应原-伴大豆球蛋白、大分子的大豆球蛋白被最优地去除，高分子蛋白质被降解成易被消化吸收的低分子量蛋白质或小肽。

结合以上结果，根据本发明的方法对豆渣进行发酵而得到的产品可以有利地用于配制食品、饮品、饲料等。

实施例5、苹果渣培养

将苹果去除皮和果肉后的果核用粉碎机打碎，制得苹果渣。

在250ml三角瓶中加入10g苹果渣，于115℃灭菌15分钟，冷却至室温，获得苹果渣培养基。

吸取实施例1中制备的里氏木霉孢子悬浮液各1ml，分别加入到装有上述10g苹果渣培养基的挡板三角瓶中，于28℃静置培养5天，获得相应的苹果渣培养发酵液。

将二氯甲烷与发酵液分别以体积比2:1的比例混合，于40℃，摇床提取转速为200rpm，12h后，过滤得到风味提取液，将风味提取液使用实验室间歇精馏系统（购自德国Normag公司），于680mbar，水浴40℃条件下精馏至溶剂不回流，经精馏除去溶剂得到天然香精。

对发酵获得的天然香精进行感官评定，其方法如下：采用描述定量分析法对得到的发酵天然香精进行风味分析，测试人员为10人。将测试人员描述的属性进行组合得出发酵物具有苹果、雪梨、玫瑰花香、甜香、红枣、奶香等香味特性。并对各特性采用线性标度说明其强度，该线性标度长度为15cm，距左右两端各1.5cm处标注注释词，强度从左到右递增。感官评定结果显示：本实施例中获得的天然香精，均具有愉悦的苹果底香，而且还体现出红枣香味和甜香味，其香味浓郁，无异味。

对获得的天然香精进行GC-MS（气相色谱-质谱）检测，以分析其成分，GC-MS检测方法：气质联用仪，Agilent6890N/5973Agilent（美国公司）；气相色谱条件：HP-5MS（30m x0.25mmx0.25μm膜厚），程序升温：初温60℃，保持2min,后以5℃/min升到150℃，保持1min,再以5℃/min升至300℃，保持10min。载体为高纯He柱流量1.0ml/min，进样口温度250℃，进样量1μl分流50:1，其中，质谱条件：接口温度280℃，EI源，电离电压70eV,离子源温度230℃，扫描范围29-400amu。

通过内置的NIST谱库检索各峰对应碎片的质荷比、丰度，并得到对应的化合物，结果显示，本实施例中制备获得的天然香精包括14种风味单体，关键的组成组分是己醛、2-甲基丁酸乙酯、2，4-壬二烯醛、苯乙醛、4-羟基-2,5-二甲基-3（2H）呋喃酮、苯乙醇、2，4-癸二烯醛、5-羟基-2-癸烯酸-δ-内酯、α-合金欢烯、和Z,Z-2-甲基-3,13-十八烷二烯醇。其中，使用CICC40929发酵获得的发酵液制备的天然香精的结果如图4和表4所示，其中表4中所示含量为面积百分含量。

表4.苹果渣发酵天然香精成分

实施例6、紫薯渣培养

将紫薯洗净，放入常压反应釜中，用常温水浸没，加热进行水中蒸馏提取紫薯风味水，收集残留的渣子，获得紫薯渣。

将10g紫薯渣加入到1L水中，于115℃灭菌15分钟，冷却至室温，制备获得紫薯渣培养基。

吸取实施例1中制备的里氏木霉孢子悬浮液各1ml，分别加入到装有50ml浓度为10g/L紫薯渣培养基的挡板三角瓶中，于28℃静置培养5天，分别获得紫薯渣培养发酵液。

按实施例5的方法，分别使用紫薯渣培养发酵液制备相应的天然香精，并对获得的天然香精进行感官评定和成分分析。

感官评定结果显示：本实施例中制备获得的天然香精具有愉悦的甜香和玫瑰花香味，香味浓郁，无异味。

成分分析结果显示，本实施例中制备获得的天然香精均包含9种物质，关键的组成成分是2-己醇和壬醛。

其中，使用CICC40929发酵获得的发酵液制备的天然香精的成分分析结果如图5和表5所示。

表5.紫薯渣发酵天然香精成分

实施例7、椰肉渣培养基

将椰肉和水以重量比为1:5的比例混合，磨成浆，于115℃灭菌15分钟，冷却至室温，制得椰肉渣培养基，其中，椰肉渣的浓度为167g/L。

吸取实施例1制备的孢子悬浮液1ml，加入到装有50ml浓度为167g/L的椰肉渣培养基的挡板三角瓶中，于28℃静置培养5天，获得相应的椰肉渣培养发酵液。

按实施例5的方法，分别使用椰肉渣培养发酵液制备相应的天然香精，并对获得的天然香精进行感官评定和成分分析。

感官评定结果显示：本实施例中制备获得的天然香精均不仅具有椰香，并有愉悦的甜香和奶香味，带有花香，香味浓郁，无异味。

成分分析结果显示，本实施例中制备获得的天然香精的组成成分均包含6种物质，关键的组成成分是2-己醇、辛醛、辛酸和癸酸。

其中，使用CICC40929发酵获得的发酵液制备的天然香精的成分分析的结果如图6和表6所示。

表6.椰肉渣发酵天然香精成分

实施例8、果味豆奶饮料制备

将实施例2发酵所得的果味豆渣风味料（含豆渣的发酵产物）50g进行均质，与100g豆奶进行混合，同时加入0.2g柠檬酸，0.9g山梨酸钾，15g砂糖，0.1g黄原胶，加热至80℃，维持15分钟，灭菌同时伴随搅拌，获得果味豆奶1（豆渣发酵）。

分别将实施例5-7中制备的天然香精1g与30g大豆原浆混合，同时加入0.2g柠檬酸，0.05g山梨酸钾，15g砂糖，0.1g黄原胶，加水最终定量到100g，使用高速剪切机混合均质（10000rpm，3min）加热至80℃，维持15分钟，灭菌同时伴随搅拌，获得果味豆奶2（苹果渣发酵），果味豆奶3（紫薯渣发酵）和果味豆奶4（椰肉渣发酵）。

采用描述法对果味豆奶1-4与普通豆奶进行了感官评价，将评价人员得到的描述结果进行组合，结果显示，与普通豆奶相比，获得的果味豆奶1-4风味独特，具有果香味天然谐调的优点，同时，本实施例中提供的果味豆奶饮料营养丰富，富含小肽及膳食纤维。

实施例9、制作雪梨风味的人造奶油

将实施例3中所得的发酵产物0.5kg离心获得上清液，与1.5kg牛奶一同加入到水相罐中，并加入2g柠檬酸，9g山梨酸钾，加热至80℃，维持15分钟，边搅拌边灭菌。

将8.5kg新西兰无水乳脂加入到油相罐中，边加热边搅拌，并加入68g单甘酯，10g卵磷脂，0.004g β-胡萝卜素，加热60℃，搅拌维持15分钟。

将水相罐中料液通过袋式过滤器过滤，加入到油相罐，乳化15分钟，形成乳化液。

乳化液再次经过袋式过滤器过滤后，经过板式换热器灭菌。

乳状液由柱塞泵泵入急冷机，在结晶筒内迅速结晶，再进入捏合机对物料剧烈搅拌捏合，并慢慢形成10kg雪梨风味的人造奶油。

放置15℃，熟化，由此得到雪梨风味的人造奶油。

使用本发明的方法制备的发酵风味料或天然香精不仅可以作为香料，添加至蔬菜汁、水果原浆、冰淇淋、和饮料（包括但不限于豆奶、汽酒等）中，还可将该其用作烘焙食品（包括但不限于面包，蛋糕，饼干，奶糖，爆米花，植脂末，糖果，膨化食品等）的风味底料，或者以液体香精（即发酵上清液或浓缩液）或香精的形式加入至油脂中，制备果味油脂（包括但不限于家庭或食品工业用的调和油、人造奶油、无水酥油、酥皮油、液态酥油、黄油、餐桌奶油等），这些产品形式可包括但不限于为液态、块状、粉状、片状、颗粒状等。该发酵风味料或天然香精还可用于日化行业中，例如作为洗发水、香皂、香水、护肤品等的调香剂。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种制备天然香精的方法，所述方法包括使用里氏木霉（Trichoderma reesei）发酵果蔬渣；和从发酵液提取天然香精。优选地，所述方法还包括在提取天然香精后进行纯化步骤。

2.一种制备风味料的方法，所述方法包括使用里氏木霉（Trichoderma reesei）发酵果蔬渣；和从发酵液提取风味料。优选地，所述方法还包括在提取风味料后进行纯化步骤。

3.一种制备风味提取液的方法，所述方法包括使用里氏木霉（Trichoderma reesei）发酵果蔬渣。优选地，所述方法还包括从所述发酵产物制备风味提取液。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，所述里氏木霉是保藏号为NBRC31326、GIM3.498、GIM3.538、CBS383.78、CICC40358、CICC40360、CICC40929、CICC41491、CICC41493的里氏木霉中的一种。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述果蔬渣为苹果渣、葡萄渣、紫薯渣、红薯渣、椰子渣、芹菜渣、番茄渣、黄瓜渣、青椒渣、甜椒渣、苦瓜渣、柠檬渣、胡萝卜渣、芦荟渣、菠萝渣和/或豆渣中的一种或多种。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法制备的天然香精、风味料或风味提取液。

7.权利要求6所述的天然香精、风味料或风味提取液用于制备蔬菜汁、水果原浆、冰淇淋、饮料、烘焙食品、果味油脂或日化产品的用途。

8.包含权利要求6所述的天然香精、风味料或风味提取液的产品，所述产品为蔬菜汁、水果原浆、冰淇淋、饮料、烘焙食品、果味油脂、或日化产品。

9.里氏木霉（Trichoderma reesei）用于制备天然香精、风味料或风味提取液的用途。

10.如权利要求7所述的用途，所述里氏木霉是保藏号为NBRC31326、GIM3.498、GIM3.538、CBS383.78、CICC40358、CICC40360、CICC40929、CICC41491、CICC41493的里氏木霉中的一种。