CN104542277B - 一种慈姑组培苗快速繁殖方法及培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种慈姑组培苗快速繁殖培养方法和培养基配方，该方法将脱毒的慈姑外植体培养3周后接种入间歇浸没式生物反应器中，利用间歇浸没式培养方法，持续输入过滤空气，使用不添加糖的液体继代培养基对慈姑组培苗进行培养。本发明采用半自动化，减少了人工操作，降低了组培苗的污染率，并大大提高了慈姑组培苗的增殖率。本发明采用匍匐茎做外植体，采集保存方便，减少慈姑球茎用种量、降低了生产成本和劳动力成本，可在短时间内获得大量组培苗，生产周期缩短，效率高，适于工厂化生产。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种慈姑组培苗快速繁殖方法及培养基。
背景技术
慈姑(Sagittaria trifoliaL.)属泽泻科慈姑属多年生水生草本植物，以其球茎供食用,为冬春蔬菜供应淡季的主要水生蔬菜之一。慈姑具有较高的药用和保健价值，性味苦甘、微寒、无毒，有凉血、止血、解毒、消肿之功效。产品主要出口销往东南亚国家，近几年国内外市场销量大增，产品供不应求，种植慈姑已成为农民增收有效途径之一。
目前慈姑生产上多采用可食用球茎无性繁殖，用种量大,成本高，且球茎不耐储存。慈姑组织培养仅有初步的研究报道，目前主要采用传统的固体培养基培养，操作过程中需要大量的手工劳动，而且由于慈姑的内生菌污染十分严重,继代培养2～3次后仍不断出现污染,增殖率低，不利于慈姑的快速繁殖。可见，降低慈姑内生菌污染是一个亟待解决的难题。
间歇浸没式生物反应器主要是利用液体培养基以经过过滤的空气压力为动力对植物组培苗进行间歇式的浸没培养，这种培养方式减少培养环节，同时减少人工耗费，降低生产成本，基于这种优势，国内外利用间歇浸没式生物反应器进行研究的植物种类不断增多，但是目前尚未有使用间歇浸没式生物反应器进行慈姑组织培养的报道。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的发明人经过创造性的劳动，发明了一种慈姑组培苗快速繁殖方法及培养基，该方法利用间歇浸没式生物反应器及相应的培养基配方进行慈姑的组织培养，污染率低，增殖率高。
为实现上述目的，本发明提供了一种慈姑组培苗快速繁殖方法，该方法使用间歇浸没式生物反应器进行慈姑的组织培养，包括以下步骤：
(1)取慈姑外植体，经脱毒后在固体培养基中培养3周，再接种入间歇浸没式生物反应器中；
(2)利用间歇浸没式培养方法，使用液体继代培养基对慈姑组培苗进行培养；其中，所述液体继代培养基的配方为：MS+NAA 0.3～1.0mg/L+6-BA1.0～2.5mg/L，pH值为5.0～5.4。
优选地，步骤(1)中所述的慈姑外植体为慈姑匍匐茎茎尖,长度为1～2cm。
优选地，步骤(1)中所述的慈姑外植体的脱毒方法为：将慈姑外植体浸没于含洗衣粉水中，冲洗30min，晾干后，用75％乙醇30s，0.1％升汞10min消毒，后用无菌水冲洗3～5次。
优选地，步骤(1)中所述的固体培养基配方为：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA0.5mg/L，固体培养基中蔗糖浓度为30g/L，琼脂3.8g/L，pH值为5.8～6.2；脱毒后的慈姑外植体在固体培养基中的培养条件为：培养温度25～28℃，光照10h/d,黑暗14h/d，光照强度1000～1500lx。
优选地，在步骤(1)中，将脱毒后的慈姑外植体在固体培养基中培养3周后，接入间歇浸没式生物反应器中，接种密度是8～15株/L。
优选地，在步骤(2)中所述的液体继代培养基的配方为：MS+NAA 0.5mg/L+6-BA2.5mg/L，pH值为5.0～5.4。
优选地，在步骤(2)中，间歇浸没式培养的培养条件为：每8小时浸没20分钟，浸没的同时保持持续输入过滤空气，连续培养6周。
优选地，在步骤(2)中，间歇浸没式培养的环境条件为：光照强度1800lx，光照20h/d，黑暗4h/d，充气泵气压0.05～0.08Mpa，温度28±2℃。
本发明还提供了一种慈姑组培苗间歇浸没式培养的液体继代培养基，该液体继代培养基的配方为：MS+NAA 0.3～1.0mg/L+6-BA 1.0～2.5mg/L，pH值为5.0～5.4；进一步地，所述液体继代培养基的配方优选为：MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 2.5mg/L，pH值为5.0～5.4。
本发明通过以上技术方案，实现了以下有益效果：
(1)本发明的液体继代培养基不添加糖，并将pH值调整至5.0～5.4；相比添加糖的传统培养基，本发明的培养基降低了污染率，同时由于pH值相比传统的培养基偏酸性，有利于抑制细菌的生长，但不影响植株的生长；本发明减少了人工操作，降低了人工操作过程中的人为污染；通过以上方式，使慈姑组培苗污染率降低至16％，大大低于传统组培方法的慈姑组培苗污染率60％；
(2)使用适合慈姑特点的培养条件、培养环境和培养基，改变光照温度等环境因子，将光照时间由传统光照的每天16h提高至20h，温度提高到28±2℃，通过提高植株光合作用，自身积累更多养分，保证植株正常生长；利用间歇浸没的方法使植株充分接触营养液，吸收效果好，液体的不断搅动防止有害物质的积累及次生代谢产物积累的危害，提高了慈姑组培苗的增殖率，增殖系数达18.4，高于传统的组培方式其增殖系数4.3。本发明大大提高了慈姑组培苗的增殖率；
(3)本发明方法采用慈姑匍匐茎无性繁殖，节约用种，采集保存方便且污染率低，可在短时间内获得大量组培苗，使生产周期缩短，效率更高，更适于工厂化生产。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1
取长度为1cm的慈姑匍匐茎茎尖，浸没于含洗衣粉水中，冲洗30min，晾干后，用75％乙醇30s，0.1％升汞10min消毒，后用无菌水冲洗3次；将脱毒后的慈姑外植体接种入固体培养基中培养3周，其中，固体培养基的配方为：MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.5mg/L，蔗糖浓度为30g/L，琼脂3.8g/L，pH值为5.8；脱毒后的慈姑外植体在固体培养基中的培养条件为：培养温度25℃,光照10h/d,黑暗14h/d，光照强度1000lx；再将慈姑组培苗接种入间歇浸没式生物反应器中，接种密度是8株/L；利用间歇浸没式培养方法，使用液体继代培养基对慈姑外植体进行培养，其中，液体继代培养基的配方为：MS+NAA0.3mg/L+6-BA 1.0mg/L，pH值为5.0；间歇浸没式培养的培养条件为：每8小时浸没20分钟，浸没的同时保持持续输入过滤空气，连续培养6周；间歇浸没式培养的环境条件为：光照强度1800lx，光照20h/d，黑暗4h/d，充气泵气压0.05Mpa，温度26℃。
实施例2
取长度为2cm的慈姑匍匐茎茎尖，浸没于含洗衣粉水中，冲洗30min，晾干后，用75％乙醇30s，0.1％升汞10min消毒，后用无菌水冲洗5次；将脱毒后的慈姑外植体接种入固体培养基中培养3周，其中，固体培养基的配方为：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L，蔗糖浓度为30g/L，琼脂3.8g/L，pH值为6.2；脱毒后的慈姑外植体在固体培养基中的培养条件为：培养温度28℃,光照10h,/d,黑暗14h/d，光照强度1500lx；再将慈姑组培苗接种入间歇浸没式生物反应器中，接种密度是15株/L；利用间歇浸没式培养方法，使用液体继代培养基对慈姑外植体进行培养，其中，液体继代培养基的配方为：MS+NAA 1.0mg/L+6-BA2.5mg/L，pH值为5.4；间歇浸没式培养的培养条件为：每8小时浸没20分钟，浸没的同时保持持续输入过滤空气，连续培养6周；间歇浸没式培养的环境条件为：光照强度1800lx，光照20h/d，黑暗4h/d，充气泵气压0.08Mpa，温度30℃。
实施例3
取长度为1.5cm的慈姑匍匐茎茎尖，浸没于含洗衣粉水中，冲洗30min，晾干后，用75％乙醇30s，0.1％升汞10min消毒，后用无菌水冲洗4次；将脱毒后的慈姑外植体接种入固体培养基中培养3周，其中，固体培养基的配方为：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L，蔗糖浓度为30g/L，琼脂3.8g/L，pH值为6.0；脱毒后的慈姑外植体在固体培养基中的培养条件为：培养温度26℃,光照10h/d,黑暗14h/d，光照强度1250lx；再将慈姑组培苗接种入间歇浸没式生物反应器中，接种密度是8株/L；利用间歇浸没式培养方法，使用液体继代培养基对慈姑外植体进行培养，其中，液体继代培养基的配方为：MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 2.5mg/L，pH值为5.2；间歇浸没式培养的培养条件为：每8小时浸没20分钟，浸没的同时保持持续输入过滤空气，连续培养6周；间歇浸没式培养的环境条件为：光照强度1800lx，光照20h/d，黑暗4h/d，充气泵气压0.06Mpa，温度28℃。
以上实施例中，MS培养基的各组分的质量浓度为：硝酸钾1900mg/L、硝酸铵1650mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、七水硫酸镁370mg/L、二水合氯化钾440mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、四水合硫酸锰22.3mg/L、七水合硫酸锌8.6mg/L、二水合钼酸纳0.25mg/L、五水合硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水合硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L。
对照例使用传统固体组培方法进行慈姑外植体组织培养
使用固体组培方法进行慈姑外植体组织培养，培养方法和培养基参考:朱红莲柯卫东汪李平。慈姑茎尖组织培养与快速繁殖，中国蔬菜，2006(3):15-17。
结果：
1、慈姑组培苗污染率对比
将对照例和实施例3重复3次，计算组培苗污染率，取平均数进行对比
表1慈姑组培苗污染率对比
| 方法 | 接种数/瓶 | 污染数/瓶 | 污染率/％ |
| 对照例 | 10 | 6 | 60 |
| 实施例3 | 10 | 1.7 | 16.7 |
2、慈姑组培苗增殖率对比
将对照例和实施例3重复3次，培养至6周时，计算组培苗增殖率，取平均数进行对比
表2慈姑组培苗增殖率对比
| 方法 | 接种密度/ | 增殖芽数/ | 增殖系数 |
| 芽 | 芽 | ||
| 对照例 | 8 | 34 | 4.25 |
| 实施例3 | 8 | 147 | 18.4 |
Claims (6)
1.一种慈姑组培苗快速繁殖方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)取慈姑外植体，经脱毒后在固体培养基中培养3周，再接种入间歇浸没式生物反应器中；
(2)利用间歇浸没式培养方法，使用液体继代培养基对慈姑组培苗进行培养；其中，所述液体继代培养基的配方为：MS+NAA 0.3～1.0mg/L+6-BA 1.0～2.5mg/L，pH值为5.0～5.4；
其中，所述的慈姑外植体为慈姑匍匐茎茎尖,长度为1～2cm；
其中，步骤(1)中所述的慈姑外植体的脱毒方法为：将慈姑外植体浸没于含洗衣粉水中，冲洗30min，晾干后，用75％乙醇30s，0.1％升汞10min消毒，后用无菌水冲洗3～5次。
2.按照权利要求1所述的一种慈姑组培苗快速繁殖方法，其特征在于：步骤(1)中所述的固体培养基配方为：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA0.5mg/L，固体培养基中蔗糖浓度为30g/L，琼脂3.8g/L，pH值为5.8～6.2；脱毒后的慈姑外植体在固体培养基中的培养条件为：培养温度25～28℃,光照10h/d,黑暗14h/d，光照强度1000～1500lx。
3.按照权利要求1所述的一种慈姑组培苗快速繁殖方法，其特征在于：在步骤(1)中，将脱毒的慈姑外植体在传统培养基中培养3周后，再接种入间歇浸没式生物反应器中，接种密度是8～15株/L。
4.按照权利要求1所述的一种慈姑组培苗快速繁殖方法，其特征在于：在步骤(2)中所述的液体继代培养基的配方为：MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 2.5mg/L，pH值为5.0～5.4。
5.按照权利要求1所述的一种慈姑组培苗快速繁殖方法，其特征在于：在步骤(2)中，间歇浸没式培养的培养条件为：每8小时浸没20分钟，浸没的同时保持持续输入过滤空气，连续培养6周。
6.按照权利要求1所述的一种慈姑组培苗快速繁殖方法，其特征在于：在步骤(2)中，间歇浸没式培养的环境条件为：光照强度1800lx，光照20h/d，黑暗4h/d，充气泵气压0.05～0.08Mpa，温度28±2℃。
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