CN104535680A - 测定布帕伐醌注射液中布帕伐醌含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定布帕伐醌注射液中布帕伐醌含量的方法，它属于高效液相色谱法，该方法的色谱条件为：⑴ 用十八烷基键合硅胶为填充剂（250mm×4.6 mm，5μm）的热电Hypersil BDS C18色谱柱；⑵流动相乙腈、水、甲醇、磷酸体积比为125:40:35:1；流动相的流速为流速1.0mL/min；进样体积为10μL，柱温35℃；⑶紫外检测器的检测波长为251nm。本发明的测定方法操作简单，具有快速、准确、重复性好、稳定性好、专属性强等优点。本发明适用于布帕伐醌注射液中布帕伐醌含量的测定。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，涉及定量测定制剂中布帕伐醌含量的方法，具体地说是一种测定布帕伐醌注射液中布帕伐醌含量的方法。
背景技术
布帕伐醌化学名称为2-[(4-叔丁基环己基)甲基]-3-羟基-1,4-萘二酮，是一种新型的抗梨浆虫药物，对家畜均有治疗作用。布帕伐醌注射液为一种新型的药物，但目前文献对布帕伐醌注射液中布帕伐醌的检测方法鲜有报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题，是要提供一种测定布帕伐醌注射液中布帕伐醌含量的方法，该方法属于高效液相色谱法即HPLC法，具有操作简单、快速、准确、重复性好、稳定性好、专属性强等优点。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种测定布帕伐醌注射液中布帕伐醌含量的方法，它属于高效液相色谱法，色谱条件为：
⑴十八烷基键合硅胶为填充剂250mm×4.6 mm，5μm的热电Hypersil BDS C18色谱柱；
⑵流动相体积比为乙腈：水：甲醇：磷酸=125:40:35:1；
⑶紫外检测器的检测波长为251nm。
作为本发明的一种限定，所述磷酸溶液浓度为85%。
作为本发明的另一种限定，所述流动相的流速为1.0mL/min；进样体积为10μL，柱温35℃。
本发明通过建立的上述方法，来测定布帕伐醌注射液中布帕伐醌的含量，能够达到分析准确的目的。
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：本发明采用HPLC法检测布帕伐醌注射液中布帕伐醌的含量，操作简单，快速、重复性好、稳定性好、专属性强，具有较高的检测灵敏度和准确度。
本发明适用于对布帕伐醌注射液中布帕伐醌的含量进行HPLC法测定。
附图说明
图1为本发明实施例溶剂干扰性试验的HPLC图；
图2为本发明实施例空白辅料干扰性试验的HPLC图；
图3为本发明实施例布帕伐醌对照品HPLC图；
图4为本发明实施例布帕伐醌样品HPLC图；
图5为本发明实施例对照品进样量为2μL线性测定的HPLC图；
图6为本发明实施例对照品进样量为5μL线性测定的HPLC图；
图7为本发明实施例对照品进样量为10μL线性测定的HPLC图；
图8为本发明实施例对照品进样量为20μL线性测定的HPLC图；
图9为本发明实施例对照品进样量为40μL线性测定的HPLC图。
本发明下面将结合说明书附体及具体的实施例作进一步详细说明。
具体实施方式
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业渠道得到。
实施例 一种测定布帕伐醌注射液中布帕伐醌含量的方法
本实施例属于高效液相色谱法，其色谱条件为：
⑴十八烷基键合硅胶为填充剂热电Hypersil BDS C18色谱柱（250mm×4.6 mm，5μm）；
⑵流动相由乙腈、水、甲醇与质量浓度为85%的磷酸组成，它们之间的体积比为乙腈：水：甲醇：磷酸=125:40:35:1，流动相的流速为1.0mL/min；进样体积为10μL，柱温35℃；
⑶紫外检测器的检测波长为251nm。
一、本发明方法的建立过程
1、仪器与试剂
1.1、仪器：岛津LC-2010A高效液相色谱仪（LC-2010型号紫外检测器，LC-2010型号泵，LC-2010柱温箱，LC-2010自动进样器），LCsolution色谱工作站；
1.2、试剂：
甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），磷酸（优级纯，需要配置为质量浓度为85%的溶液），水（二次去离子水），布帕伐醌注射液（样品，河北科星药业有限公司生产），布帕伐醌对照品（批号：1402081，Sigma生产，含量为99.5%）。
2、含量测定方法的建立
2.1、溶液的配制
①稀释液为体积比为80：:20的乙腈和水。
②对照品溶液的配制：精密称取布帕伐醌对照品25mg，置于100mL容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀后制得对照品溶液N。
③样品溶液的配制：精密量取样品5.00mL（相当于布帕伐醌250mg）置于50mL的容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取稀释后的溶液5mL，置于100mL的容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀后制得样品溶液M。
2.2、波长的选择
根据布帕伐醌的紫外光吸收特性，测定了其水溶液在紫外光下的吸收图谱，布帕伐醌在波长为251nm有很好的吸收，因此确定251nm作为其检测波长。
2.3、溶剂和空白辅料的干扰性试验
为了排除色谱图中有溶剂和空白辅料干扰布帕伐醌峰的出现，现对单独的溶剂和空白辅料进行专属性试验，以增加检测的准确性。
①溶剂的影响：稀释液过0.45μm滤膜，得样品1。
②空白辅料的影响：按照制剂配方中规定的比例，除布帕伐醌外，加入其它辅料制成样品，精密量取此样品5mL置于50mL的容量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取稀释后的溶液5mL，置于100mL的容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀后制得样品2。
按照上述的色谱条件进样，分别量取样品1和样品2各10μL进样，记录色谱图，如图1和图2所示。
从图1中可以看出，溶剂的色谱曲线接近于基线，并且没有干扰峰出现，表明溶剂对布帕伐醌的测定没有影响。
从图2中可以看出，没有干扰峰出现，表明空白辅料对布帕伐醌的测定没有影响。
③布帕伐醌的定性试验：取2.1项中的溶液N和溶液M各10μL，按照上述色谱条件进样，记录色谱图（如图3和图4所示），从图中可以看出样品中布帕伐醌的主峰保留时间和对照品图中布帕伐醌的主峰保留时间一致。
2.4、样品含量的测定
将2.1项中配置好的对照品溶液N，取10μL进样，另取三批配置好的样品溶液M，每批样品做两个平行，各取10μL按上述色谱条件进样，记录各主峰面积并按外标法计算布帕伐醌的含量，结果见表1所示，根据试验测定结果，布帕伐醌均在标示量的90.0%-110.0% 范围内，说明此检测方法可靠。
表1 样品测定结果
2.5、线性关系及范围的考察
取2.1项中的对照品溶液N 2μL、5μL 、10μL、20μL 、40μL, 按照上述色谱条件注入液相色谱仪中，记录色谱图。
图5-图9为上述不同进样量的对照品溶液的HPLC图，计算浓度与峰面积之间的线性关系，得到回归曲线与回归方程，并以峰面积（A）对进样量（C）进行线性回归，得布帕伐醌标准线性方程为：A=932356C+166733；R=1.0，结果表明，布帕伐醌在0.05024mg/ml-1.0048mg/ml范围内线性良好，对照品线性范围测定结果如表2所示。
表2 对照品线性范围测定结果
2.6、精密度试验的考察
取5份2.1项中的对照品溶液N各10μL, 按照上述色谱条件注入液相色谱仪，连续进样5次,并计算该方法的精密度。
测试结果如表3所示，测得布帕伐醌的相对标准偏差RSD＜2%，表明本方法的精密度良好。
表3 精密度试验结果
2.7、稳定性试验的考察
取2.1项中的对照品溶液N和样品溶液M分别放置0h、2h、4h、6h、8h后进样测定,每个时间段分别连续进样2次，具体试验结果如表4所示，计算得出布帕伐醌平均峰面积的相对标准偏差RSD﹤2%，由此说明供试品溶液在8h内稳定。
表4 稳定性试验结果
2.8、重复性试验的考察
精密量取同一批号布帕伐醌注射液样品5份，测定其含量，结果表明，布帕伐醌平均含量为99.0%，相对标准偏差RSD＜2%。说明方法的重现性良好。具体结果见表5。
表5 精密度试验结果
2.9.1、不添加空白辅料加样回收率的考察
精密量取已知含量的供试品适量5ml(约相当于布帕伐醌25mg)9份,分别置于100mL容量瓶中,分为3组,每组3份,每组分别按相当于标示量的80%,100%,120%的质量浓度精密加入对照品溶液N；用水稀释至刻度,制得加标供试品溶液，分别吸取上述溶液10uL进样测定。按照上述方法，测定布帕伐醌的含量，并按照下式计算回收率，结果如表6所示，结果表明布帕伐醌平均加样回收率为99.4%，RSD为0.36%，说明其回收率合格。
表6 加样回收率试验结果
2.9.2、添加空白辅料加样回收率的考察
精密量取空白辅料溶液5ml共9份,分别置于100mL棕色容量瓶中,分为3组,每组3份共9份,分别置于100mL容量瓶中,分为3组,每组3份,每组分别按相当于标示量的80%、100%、120%的质量浓度精密加入对照品溶液N；用水稀释至刻度,制得加标供试品溶液，分别吸取上述溶液10uL进样测定。按照上述方法，测定布帕伐醌的含量，并按照下式计算回收率，结果如表7所示。，结果表明布帕伐醌平均加样回收率为99.4%，RSD为0.36%，说明其回收率合格。
表7 加样回收率试验结果
3.0、耐用性试验
用不同厂家的色谱柱，对同一样品按上述试验条件进行测定，具体结果见表8，结果表明，理论塔板数良好，分离度、拖尾因子均符合规定，不同的色谱柱测定时，耐用性良好。
表8 耐用性试验结果
二、实测
按照以下方法对4批布帕伐醌注射液中布帕伐醌进行含量测定：利用热电Hypersil BDS C18色谱柱（250mm×4.6 mm，5μm）；将1250mL、400mL、350mL混合后，与质量浓度为80%磷酸10mL混合均匀后为流动相；检测波长为251nm；流速为1.0mL/min，柱温35℃，进样量10μL，理论塔板数按照布帕伐醌峰计算不小于5000，主峰与杂质峰的分离度符合要求，拖尾因子小于1.05。
a.对照品溶液的配制：精密称取布帕伐醌对照品25mg，置于100mL容量瓶中，用体积比为80：20的乙腈和水混合后的稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀后制得对照品溶液N1。
b.样品溶液的配制：精密称量取样品5mL（相当于布帕伐醌250mg）置于50mL的容量瓶中，用体积比为80：20的乙腈和水混合后的稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取稀释后的溶液5mL，置于100mL的容量瓶中，用上述稀释液稀释至刻度，摇匀后制得样品溶液M1。
在本发明的色谱条件下，取上述对照品溶液和样品溶液各10μL，进样，记录色谱图主峰面积，以外标法按照峰面积计算布帕伐醌的含量，布帕伐醌的主峰保留时间为15.3min。具体的测定结果见表9。
表9 布帕伐醌含量的测定
Claims (3)
1.一种测定布帕伐醌注射液中布帕伐醌含量的方法，其特征在于它为高效液相色谱法，该方法的色谱条件为：
⑴十八烷基键合硅胶为填充剂250mm×4.6 mm，5μm的热电Hypersil BDS C18色谱柱；
⑵流动相体积比为乙腈：水：甲醇：磷酸=125:40:35:1；
⑶紫外检测器的检测波长为251nm。
2.根据权利要求1所述的测定布帕伐醌注射液中布帕伐醌含量的方法，其特征在于：所述磷酸溶液的浓度为85%。
3.根据权利要求1或2所述的测定布帕伐醌注射液中布帕伐醌含量的方法，其特征在于所述流动相的流速为1.0mL/min；进样体积为10μL，柱温35℃。
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Application publication date: 20150422 Assignee: HEBEI GREENLAND ANIMAL PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Assignor: HEBEI KEXING PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Contract record no.: X2024980002827 Denomination of invention: Method for determining the content of bupivacazone in bupivacazone injection Granted publication date: 20170111 License type: Common License Record date: 20240314 Application publication date: 20150422 Assignee: Hebei jianjiale duck industry Co.,Ltd. Assignor: HEBEI KEXING PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Contract record no.: X2024980002825 Denomination of invention: Method for determining the content of bupivacazone in bupivacazone injection Granted publication date: 20170111 License type: Common License Record date: 20240313 Application publication date: 20150422 Assignee: Shijiazhuang Huifeng Animal Health Products Co.,Ltd. Assignor: HEBEI KEXING PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Contract record no.: X2024980002822 Denomination of invention: Method for determining the content of bupivacazone in bupivacazone injection Granted publication date: 20170111 License type: Common License Record date: 20240313 |