CN104531752B - 共转化基因Anti‑Dxr和Anti‑Fpps培育高青篙素含量青蒿的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公布了一种共转化基因Anti‑Dxr和Anti‑Fpps培育高青篙素含量青蒿的方法。该方法是将Dxr和Fpps两个基因通过植物表达载体导入青蒿中,筛选得到花蕾青蒿素含量高的青蒿，具体步骤:从青篙中克隆Dxr基因和Fpps基因,构建含Dxr基因和Fpps两个基因的植物表达载体,用根癌农杆菌介导,将Dxr基因和Fpps基因转入青篙并培育筛选再生植株，获得花蕾青篙素含量提高的转基因青篙植株。在非转化对照青篙CK含量为6.20mg/g干重时,本发明得到的基因工程青篙植株中花蕾青篙素含量最高17.40mg/g干重,其含量是非转化对照青篙含量的2.81倍,本发明的方法对于以青篙为原料的药厂节约成本具有重要意义。

Description

共转化基因Anti-Dxr和Anti-Fpps培育高青篙素含量青蒿的 方法

技术领域

本发明涉及利用基因工程培养植物领域，具体是一种利用转基因技术培育高青蒿素含量的青蒿的方法。

背景技术

青蒿(Artemisiae annieL.)，菊科，艾属。学名黄花蒿，别名臭蒿、香蒿、苦蒿。生长于山坡、林缘及荒地，为一年生草本。老百姓用于消暑、头痛、退热和感冒等的治疗.提取青蒿素则是利用青蒿地上部分叶片和未开放的花蕾，提取生产的有效生理活性成分如青蒿素等产品，是低毒、高效、速效的抗疟新药(中国药典,2005；钟国跃,等，2007)。青蒿野生资源丰富，但青蒿素含量不高，加大了制药厂提取青蒿素的制药成本，除利用传统育种方法，近年来研究利用基因工程方法提高青蒿的青蒿素含量，培育高青蒿素含量的转基因品种成为热点。

研究表明,每年世界上有超过100万人死于疟疾。疟原虫耐药性,使得抗疟药物氯喹的药物效果受限,而青蒿素对疟疾具有低毒和速效的特点。目前青蒿素是公认有效的治疗疟疾首选药物,这使得提取青蒿素的原材料青蒿需求量非常大。随着目前生物工程合成途径研究的深入,利用转基因工程提高青蒿中青蒿素含量成为研究热点。转基因技术成为提高青蒿素含量的可行途径之一。Chen等利用在青蒿中能够过量表达PEP基因,转化的青蒿植株中青蒿素含量比对照高3-5倍。Teoh等认为cyp71av1基因在青蒿素生物合成途径中是关键的限速基因，并从特异cDNA中克隆到cyp71av1基因。Ro等也克隆cyp71av1基因及其氧还伴侣基因cpr,并将cyp71av1基因和cpr基因导入酵母并成功地提高了青蒿素含量。文献中有利用AOC基因(唐克轩，等)以及ADS,CYP71AV1,CPR(唐克轩，等)三个基因通过根瘤农杆菌介导获得转基因青蒿的报道，均是利用目的基因提高青蒿素含量的方法。

从中药材青蒿花蕾中提取的青蒿素(Artemisia annua L.)用于抗疟疾,原材料青蒿需求量大,但野生青蒿得青蒿素含量很低,只占青蒿植株干重0.01-0.1％，如何提高青蒿素含量，成为热点课题,通过转基因办法改造提高青蒿素含量是一种有效途径.植物萜类化合物的合成主要通过MVA和DXP两个途径，即甲羟戊酸(mevalonate pathway，MVA)途径和1-脱氧木酮糖5-磷酸合酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase，DXS)或甲基赤藓醇4-磷酸(methylerythritol 4-phosphatepathway，MEP)DXP途径。脱氧木酮糖磷酸盐还原异构酶(1-deoxy-D-1xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR)催化1-脱氧-木酮糖-5-磷酸(DXP)生成2C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(MEP)，是DXP途径的限速酶。DXR是潜在的抗生素、抗疟药物和除草剂的更有效率的靶标位点。由于在细菌、藻类、植物和原生动物中发现DXR，而人体未找到，因此用DXR这一靶标位点研制抗菌和抗疟药物成为可能。法呢基二磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase，FPPS)是异戊烯基转移酶，FPPS催化2个IPP分子和1个DMAPP分子头尾相连缩合形成中间物GPP和终产物FPP。当用植物黄萎病原菌接种到棉花悬浮培养的细胞时，FPPS可大量诱导表达，这与植物在受到侵害时释放萜类化合物的现象相吻合,FPPS是合成倍半萜烯的重要酶。增强Dxr和Fpps基因活性，可以提高植株青蒿素的含量，本发明将关键酶基因Dxr和Fpps基因双转化青蒿，提高青蒿中的青蒿素合成，获得高青蒿素含量的基因工程青蒿品种，为培育高青蒿素含量的青蒿提供一种新的方法。本发明旨在构建Dxr基因和Fpps基因的植物表达载体,并获得重组工程植株,利用转基因技术培育高青蒿素含量的青蒿奠定基础.

发明内容

针对现有生产中对高青蒿素含量青蒿的需求，本发明所要解决的技术问题是在青蒿基因组中导入能增加青蒿素合成的基因，并增强其原有基因的表达，获得转基因青蒿新品系，以提高其青蒿素合成能力，使其花蕾中能超量蓄积青蒿素，使这种转基因青蒿品系成为工业化大规模生产的原材料。

L-脱氧木酮糖磷酸盐还原异构酶(L－phenylalanin ammonia-lyase，Dxr)和法呢基二磷酸合酶tyrosinase，Fpps)，均是青蒿植株合成青蒿素的关键酶。增强Dxr和Fpps活性，可以提高植株青蒿素的含量，本发明将关键酶基因Dxr和Fpps基因双转化青蒿，提高青蒿中的青蒿素合成，获得高青蒿素含量的基因工程青蒿品种，为培育高青蒿素含量的青蒿提供一种新的方法。

为实现本发明目的而采用的技术方案是这样的，共转化基因Anti-Dxr和Anti-Fpps培育高青篙素含量青蒿的方法，包括如下步骤：

1)克隆脱氧木酮糖磷酸盐还原异构酶的基因片段，记为Dxr基因片段，并将Dxr基因片段构建成Anti-Dxr基因植物表达载体；

2)克隆法呢基二磷酸合酶的基因片段，记为Fpps基因片段，并将Fpps基因片段构建成Anti-Fpps基因植物表达载体；

3)利用转基因技术将Anti-Dxr和Anti-Fpps导入青蒿，获得包含Dxr基因和Fpps基因的青蒿植株。该步骤中可以采用如下两种方式进行培育获得包含Dxr基因和Fpps基因的青蒿植株：将Anti-Dxr和Anti-Fpps分别导入不同的青蒿，分别获得Dxr转基因青蒿与Fpps转基因青蒿，然后将Dxr转基因青蒿与Fpps转基因青蒿进行杂交，获得包含Dxr基因和Fpps基因的F1代青蒿植株；采用电击法将Anti-Dxr和Anti-Fpps导入同一根癌农杆菌EHA101，然后采用农杆菌介导法将所述癌农杆菌EHA101导入青蒿，构成包含Dxr基因和Fpps基因的青蒿植株。

本发明可以对所述的F1代植株进行人工筛选，以获得稳定表达Anti-Dxr基因和Anti-Fpps基因的高青蒿素含量的青蒿植株。在青蒿基因组中导入Anti-Dxr和Anti-Fpps基因，使青蒿合成青蒿素过程中产生调控性，具有比原先更高效地合成青蒿素的特性并获得青蒿素含量高的青蒿。

通过对青蒿基因组进行的上述改造，可大幅度提高青蒿花蕾中青蒿素的含量，使之成为工业化大规模生产青蒿素的原材料。

本发明用于作为Anti-Dxr基因和Anti-Fpps基因受体亲本的青蒿素含量相对高的青蒿是同一品种。在青蒿中导入Dxr基因和Fpps基因可以提高青蒿中青蒿素的含量，在普通植株青蒿素含量为6.20mg/g干重时,本发明得到的转基因青篙植株中花蕾青篙素含量最高17.40mg/g干重,其含量是非转化对照青篙含量的2.81倍。本发明获得的稳定青蒿植株可以广泛种植，对于以青篙为原料的药厂可以节约其提取青蒿素的成本。

附图说明

图1植物双元表达载体载体结构图。

图中为pCAMBIA2301-Dxr or Fpps载体构建示意图。

图2为候选转基因植株的PCR特异性扩增结果示意图，

图中M标示Marker,V为仅转染Vector，三泳道为3株不同对照植株。P为候选阳性植株(Positive Plants),即转染Dxr和Fpps基因的阳性植株，三泳道为3株不同株系转基因植株。

图3为阳性转基因植株与对照植株株花蕾青蒿素含量的数据统计数据图，图中，Vector表示对照，Dxr+Fpps表示候选转基因植株。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但不应该理解为本发明上述主题范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的保护范围内。

材料：采用高青蒿素含量的常规野生青蒿，2008年来源于重庆秀山县，在重庆医药高等专科学校以高青蒿素为目标常规选育了5代。

菌株和质粒:E.coli JM109,pMD 18-T载体,质粒载体pBI121,质粒载体pCAMBIA2301,根瘤农杆菌C58C1。

酶和化学试剂:DNA Taq聚合酶、小牛肠碱性磷酸酶、T4-DNA连接酶购自Sigma公司；限制性内切酶XbaⅠ和SacⅠ,限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ,PCR Marker购自亚辉生物术公司，PCR引物由Sangon生物技术公司合成，随机引物标记试剂盒购自华美生物技工程公司。

分子生物学技术

除另有说明外，所有分子生物学技术一般按Sambrook T等在分子克隆实验手册(Sambrook T,TanaKa K,Monma T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.ColdSpring Harbor Laboratory press,New York,1989)中提供的方法进行。

步骤与结果:

DNA的提取。青蒿DNA提取参照文献[11]按照CTAB法从上部嫩片中提取，略有改动。取嫩叶5g加液N研磨快速转入2ml EP管中，加1ml65℃水浴预热的CTAB提取缓冲液，混匀，3000r/min，离心10min.吸取上清液，加入酚：氯仿各0.5ml溶液,离心15min；上清液，加氯仿4℃离心15min，重复上述步骤除尽蛋白层为止。取上清液体，-20℃沉淀离心15min，用70％乙醇洗涤沉淀2次，-70℃保存备用。

下列实施例中未作特别说明的均按照常规实验条件进行，如分子克隆采取SAMBROOK.T等编著的实验手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory PreSS,1989)中描述条件,或采取制造厂商提供的试剂盒要求之条件进行。

材料:植物材料:采用青蒿素含量相对高的青蒿(Artemisiae annieL.)品种。

实验步骤：

1.Dxr基因片段的克隆，该Dxr基因片段的DNA序列为SEQ ID NO.1。

包括两对引物，引物设计为：

第一轮扩增用引物的上游引物SEQ ID NO.3：

5′-TCGGCTCTCATCTCTTCTCTCTTTTCCT-3′

第二轮扩增用引物的上游引物SEQ ID NO.4：

5′-TCCGTGGATCCGCAATCACATTTCTTAT-3′

第一轮扩增用引物的下游引物SEQ ID NO.5：

5′-CATCGAGCAAAGCGCGCCACT-3′

第二轮扩增用引物的下游引物SEQ ID NO.6：

5′-AAGCAGGATAGCCACAGA-3′。

PCR反应体系：总体积40μL，25mmol/L Mg²⁺2μL、3mmol/L dNTP 2μL、15×buffer 2μL、引物2μL、模板2μL、Tag酶0.3U，补足体积用去离子水(dH₂O)。用一对外引物(SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.5)进行第1轮PCR,扩增条件：96℃预变性5min，92℃变性35s、54℃退火45s、72℃延伸90s，35个循环后，72℃再延伸10min,第一轮产物为模板，以引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6进行第2轮PCR。扩增条件：96℃预变性5min，92℃变性30s、60℃退火45s、72℃延伸60s，35个循环后，72℃再延伸10min。

先用引物(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5)扩增到了约730bp的DNA片段，再以此为模板，用引物(SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6)扩增到了一个1800bp的DNA片段，与预期DNA扩增片段长度相符，经1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，PCR回收产物与pMD 18-T载体连接，连接物转化E.coli JM109感受态细胞，随机挑取抗性克隆，碱裂解法小批量提取质粒DNA。然后将酶切以及PCR鉴定后的阳性克隆测序。比对挑选序列一致的重组子pDxr作为进一步工作之用。

2.Anti-Dxr(反义Dxr)基因植物表达载体的构建

pBI-Dxr植物表达载体的构建：用限制性内切酶XbaⅠ和SacⅠ双酶切含有目的基因的重组子pDxr；从pDxr中分离Dxr基因片段。用相同的酶XbaⅠ和SacⅠ双酶切质粒载体pBI121，并回收大片段pBI121，将上述酶切得到的两种基因片段连接后转化E.coli JM109感受态细胞，提取质粒，对重组质粒进行酶切鉴定，并将经过鉴定的重组质粒命名为pBI-Dxr。

将重组质粒pBI-Dxr用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切，回收约3.8kb小片段，并将此片段用T4DNA聚合酶连接到相同酶切的质粒载体pCAMBIA2301上，重组质粒具有基因片段Dxr，该片段位于CaMV 35S启动子下游，对重组质粒进行酶切鉴定，将经过鉴定的重组质粒命名pCB-Dxr。

重组质粒pCB-Fpps的构建步骤与上述方法同。

Fpps基因片段克隆第一轮引物为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8，第二轮引物为SEQID NO.9、SEQ ID NO.10，序列如下：

第一轮扩增用引物的上游引物SEQ ID NO.7：

5′-TCTTCATCTCTCTATCAAACTGACA-3′

第一轮扩增用引物的下游引物SEQ ID NO.8：

5′-TGGCACATCCACAAGAACAT-3′

第二轮扩增用引物的上游引物SEQ ID NO.9：

5′-CATCCTCCAAAAGCACTACGT-3′

第二轮扩增用引物的下游引物SEQ ID NO.10：

5′-CAGCTGTCCGACACTTATTCTGTA-3′。

3.利用重组质粒pCB-Dxr和pCB-Fpps分别将其含有的Dxr和Fpps基因导入青蒿基因组

①将上述制备的pCB-Dxr质粒采取电击法转化根瘤农杆菌C58C1:将pCB-Dxr导入根瘤农杆菌C58C1，获得C58C1/pDxr。实施步骤根据英文影印版5《拟南芥实验手册》(Detlefweigel and Jane GlaZebrook.化学工业出版社.2004)，采用Biorad公司电穿孔仪上自带的Agrobaterium(农杆菌)电击程序。以上导入植物表达载体的农杆菌用于青蒿的转化。pCB–Fpps电击法转化根瘤农杆菌C58C1方法与上述步骤同。

②青蒿的转化以及再生：首先进行农杆菌的转化，制备农杆菌感受态和转化，将转化的农杆菌菌液涂布在含有卡那霉素60Lg/mL,利福平30Lg/mL,链霉素30Lg/mL的固体YEP培养基平板上,28℃培养18～24h,接种培养新鲜单菌落的转化和非转化农杆菌,分别提取质粒DNA,并以提取的质粒DNA为模板实施PCR扩增,用PCR的方法鉴定.引物为上述克隆Dxr(or Fpps)基因的引物，设置的对照(CK)中除未加插入目的DNA片段外,其它的成分与处理一致。PCR扩增程序:96℃5 min,92℃45s、65℃45s、72℃45s,35循环,72℃5min.琼脂糖凝胶电泳后观察。

③青蒿外植体的转化：采用叶盘法对青蒿进行转化。从青蒿无菌苗上部选取幼片,切成0.6cm×0.6cm小叶片,利用转化的农杆菌菌液浸泡8min,用无菌滤纸吸干净多的菌液,接种再附加含有2mg/L6-BA的MS培养基,在(25±1)℃培养6～7d，期间保持黑暗中。然后转至具有480mg/L羧苄青霉素(Cb)和12mg/L潮霉素的MS培养基上进行抗性筛选。再培养3-4周，挑选两端长出小愈伤下胚轴，逐渐长出绿色抗性芽和白色非抗性芽。等嫩芽长到约lcm长，转到具有相同抗生素的生根培养基，等2周后生根长成完整的青蒿小植株。小植株经过炼苗、移栽、生长、发育过程并生产种子。

4.转基因青蒿的鉴定

采取PCR方法测定外源基因在转化再生植株中的存在。Anti-Dxr转基因青蒿的PCR扩增:利用GUS基因的两端引物来进行PCR扩增。

SEQ ID NO.11：5′一GTCGCGCAAGACTGTAACCA-3′

SEQ ID NO.12：5′一CGGCGAAATTCCATACCTG-3′。

提取再生青蒿DNA为模板，PCR扩增.Anti-Dxr转基因青蒿扩增出了与含Anti-Dxr基因的重组质粒PCR扩增片段相同的条带，而对照CK没有相应扩增带。Anti-Dxr与Anti-Fpps鉴定引物分别为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6与SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10.Anti-Fpps转基因青蒿鉴定方法与上述相同。

5.Dxr转基因青蒿与Fpps转基因青蒿杂交法

借鉴水稻传统田间杂交种植方法，双列杂交，即Dxr转基因青蒿与Fpps转基因青蒿分别作为父母本各杂交一次，注意调节父母本播种期以利于花期相遇。具体步骤如下：

①行距窝距为均为35×35cm，母本种植4行，间隔2行父本。制种田块注意与其他野生青蒿隔离，隔离带不低于10m。

②在开花期采取人工辅助授粉，晴天上午10-11：30是授粉效果最好时间段。将父本花粉用竹竿向母本行扇推。

③10下旬-11月上旬在母本植株收获F1代杂交种子。

双转基因青蒿的筛选:F1代种子室内温室出苗，用PCR方法对F1代青蒿植株进行筛选，利用Dxr基因片段引物(SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6)和Fpps基因片段引物(SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.10)以及GUS(SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12)进行PCR扩增，均为阳性的植株为Anti-Dxr+Anti-Fpps双转基因青蒿植株(参见图2)。

6.基因枪转化法对Anti-Dxr/Anti-Fpps基因进行双转

基因双转法：前四步与上述1-4步骤及方法相同，构建获得Anti-Dxr和Anti-Fpps，然后采取电击法导入同一根癌农杆菌EHA101，采用3-②③描述的方法，用带有Dxr和Fpps两个基因的根瘤农杆菌转化青蒿，并采用步骤4所述方法进行PCR检测:对GUS引物和Dxr和Fpps引物PCR扩增均为阳性的青蒿植株同时具有Anti-Dxr基因和Anti-Fpps基因，为Anti-Dxr基因和Anti-Fpps基因双转基因青蒿。

7.转基因青蒿花蕾青蒿素含量的测定

青蒿素含量测定采用仪器“普析通用”高效液相色谱仪(P680A四元低压梯度泵,PDA2100二极管阵列检测器,TCC2100柱温箱,Chromeleon色谱工作站)。色谱条件：本实验采用的是色谱柱:Dikma Kromasil C18 column(10μm,200mm×4.5mm),流动相:甲醇0.01mol/L醋酸钠/醋酸缓冲液(pH＝6.0)(65∶35∶1),流速:0.8ml/min,检测波长:250nm,柱温:32℃。对比测定结果参见图3。

对照和测试样本溶液的制备：置索氏提取器中,加石油醚(30～60℃)35ml,回流提取5h,取提取液,水浴蒸干,残渣用无水乙醇溶解并定容至10ml量瓶中摇匀,取1mL置10ml量瓶中,加入0.2％氢氧化钠溶液4ml,摇匀。用0.08mol/L醋酸缓冲溶液稀释后待测。

标准曲线的制作

将上述对照(标准青蒿溶液)在对应的HPLC色谱条件下分别进样1μL,3μL,5μL,7μL,9μL,11μL记录下图谱及色谱参数,分别以峰面积(Y)对标准品含量(X,μg)拟合回归曲线。研究发现,本发明中青篙素在5-25μg范围内的线性曲线回归方程为:Y＝1.311e+OOOX+5.01e+000,R＝0.98853446。

Claims (5)

1.共转化基因Anti-Dxr和Anti-Fpps培育高青篙素含量青蒿的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)克隆脱氧木酮糖磷酸盐还原异构酶的基因片段，记为Dxr基因片段，并将Dxr基因片段构建成Anti-Dxr基因植物表达载体；

所述Dxr基因片段的DNA序列为SEQ ID NO.1；

2)克隆法呢基二磷酸合酶的基因片段，记为Fpps基因片段，并将Fpps基因片段构建成Anti-Fpps基因植物表达载体；

所述Fpps基因片段的DNA序列为SEQ ID NO.2；

3)利用转基因技术将Anti-Dxr和Anti-Fpps导入青蒿，获得包含Dxr基因和Fpps基因的青蒿植株。

2.根据权利要求1所述共转化基因Anti-Dxr和Anti-Fpps培育高青篙素含量青蒿的方法，其特征在于：所述步骤3)中将Anti-Dxr和Anti-Fpps分别导入不同的青蒿，分别获得Dxr转基因青蒿与Fpps转基因青蒿，然后将Dxr转基因青蒿与Fpps转基因青蒿进行杂交，获得包含Dxr基因和Fpps基因的F1代青蒿植株。

3.根据权利要求1所述共转化基因Anti-Dxr和Anti-Fpps培育高青篙素含量青蒿的方法，其特征在于：所述步骤3)中采用电击法将Anti-Dxr和Anti-Fpps导入同一根癌农杆菌EHA101，然后采用农杆菌介导法将所述癌农杆菌EHA101导入青蒿，构成包含Dxr基因和Fpps基因的青蒿植株。

4.根据权利要求1所述共转化基因Anti-Dxr和Anti-Fpps培育高青篙素含量青蒿的方法，其特征在于：扩增获得所述SEQ ID NO.1序列所用的引物为：

第一轮扩增用引物的上游引物SEQ ID NO.3：

5′-TCGGCTCTCATCTCTTCTCTCTTTTCCT-3′

第二轮扩增用引物的上游引物SEQ ID NO.4：

5′-TCCGTGGATCCGCAATCACATTTCTTAT-3′

第一轮扩增用引物的下游引物SEQ ID NO.5：

5′-CATCGAGCAAAGCGCGCCACT-3′

第二轮扩增用引物的下游引物SEQ ID NO.6：

5′-AAGCAGGATAGCCACAGA-3′。

5.根据权利要求1所述共转化基因Anti-Dxr和Anti-Fpps培育高青篙素含量青蒿的方法，其特征在于：扩增获得所述SEQ ID NO.2序列所用的引物为：

第一轮扩增用引物的上游引物SEQ ID NO.7：

5′-TCTTCATCTCTCTATCAAACTGACA-3′

第一轮扩增用引物的下游引物SEQ ID NO.8：

5′-TGGCACATCCACAAGAACAT-3′

第二轮扩增用引物的上游引物SEQ ID NO.9：

5′-CATCCTCCAAAAGCACTACGT-3′

第二轮扩增用引物的下游引物SEQ ID NO.10：

5′-CAGCTGTCCGACACTTATTCTGTA-3′。